CZ211299A3 - Derivát von Willebrandova faktoru, zařízení tento derivát obsahující a způsob isolace proteinů - Google Patents

Description

Derivát von Villebrandova faktoru, zařízení tento derivát obsahující a způsob isolace proteinů

Oblast techniky

Vynález se týká derivátu von Villebrandova faktoru (vVF), zařízení tento derivát obsahujícího a způsobu isolace proteinů,,, které„ se. na vVF vážou.

Dosavadní stav techniky +

Von Villebrandův faktor (vVF) je glykoprotein, který cirkuluje v plasmě v řadě multimerů velikosti asi 500 až 20000 kilodaltonů, Miltimerní formy vVF se skládají ze 250 kD polypeptidových podjednotek, které jsou na sebe napojené přes disulfidové můstky. vVF hraje roli při vazbě krevních ‘destiček na subendothelium poškozených stěn cév, přičemž pouze největší multimery vykazují také hemostatičkou aktivitu. Předpokládalo se, že buňky entothelu sekretují velké polymerní formy vVF a že takové formy vVF, které mají menší molekulovou hmotnost (low molecular weight vVF, LMV), vznikají proteolytickým štěpením.

vVF se tvoří ve vaskulárních entothelových buňkách, které představují hlavní zdroj tohoto plasmového proteinu, ale také se syntetisují v nepatrném podílu megakaryocyty. Biosyntesa vVF je velmi komplexní a resultuje proto ve velkém počtu nejrůznějších vVF molekul s nejrůznější Strukturou, úkoly a vlastnostmi.

»! · ·· ·* ·· »« «· ·· * · · · · · · « · *' · ··· · ·· · • · · · * » · · ··· ··* • « · · » k * · «Μ ·*· »· ·* ·· ··

Toto vede k tomu, že vVF še může vázat na různé receptory, přičemž k nejdůležitějším fyziologickým aktivitám vVF se počítá vazba na proteiny, jako je glykoprotein Ib a glykoproteínový komplex II/IIIa, faktor VIII:C, na thrombocyty a na subendothelium.

Při vazbě vVF na srážecí faktor VIII krve se tvoří faktor VlII-komplex nebo faktor VIII:C/vVF-komplex, který obsahuje faktor VIII:C jako stabilisovaný protein. Nedostatek vVF vede nevyhnutelně také k redukci koncentrace faktoru VIII:C v krvi, neboť nedochází ke stabilisačnímu efektu vVF.

Je známé, že se rekombinantni faktor VIII čistí přes sloupec, obsahující plasmatický von Villebrandův faktor, navázaný na Sepharosu^ (vVF-Sepharose) (Vood a kol., Nátuře 312 (1984), 330-337). Ukázalo se však, že avidita imobllisovaného plasmatického vVF je nízká a proto například není možné získání faktoru VIII s popsanou vVF-sepharosou z roztoku, který obsahuje faktor VIII/vVF-komplex, v přijatelných výtěžcích.

Kromě toho obsahuje tato vVF-sepharosa vedle vVF ještě faktor VIII na základě plasmatického výchozího materiálu, který obsahuje faktor VIII:C/vVF-komplex. Při získávání farmaceutických preparátů však představuje kontaminace plasmatickým faktorem VIII:C veliký problém.

Studie vazby, při kterých byla zkoumána inhibice vazby faktoru VIII na plasmatickém vVF, imobilisovaném na miskách mikrotitračních desek, rekombinantním vVF, ukázaly kromě toho, že rekombinantni vVF může v roztoku dosáhnout ještě horší avidity se zřetelem na vazebného partnera faktor *h ♦ »» ·· w· • Í 44' ·.!, · * · · ♦ * ř ♦ · ··· · · # ·

9 ·« · · ·| · «♦· «· · « « » 4- « · ·*· «·· 4· ·«' ·* ·<

VIII.-C (Leyteakol., Biochem. J., 274 (1991), 257-261). Není tedy tento materiál vhodný pro preparativní získávání faktoru VIII.

Úkolem předloženého vynálezu tedy je poskytnutí chromatograf ického materiálu, se kterým se mohou isolovat proteiny, které se vážou na vVF , i tehdy, když se vVF vyskytuje v roztoku, ze kterého se mají proteiny isolovat. Jinak formulováno, je úkolem předloženého vynálezu poskytnutí materiálu s aviditbu, která je~vyšší**než avidita vVF ve * spojení s jeho vazebnými partnery, obzvláště než avidita vVF ve faktor VIΙ/vVF-komplexu.

Podstata vvnálezu

Výše uvedený úkol byl vyřešen nalezením vVF-derivátu, sestávajícího z vVF , imobilisovaném na partikulárním nosiči nebo nosičovém gelu (nosič), obzvláště na chromatografickém materiálu, který se vyznačuje tím, že vVF je rekombinantní vVF (r-vVF) . Výhodně je vVF-derivát prostý krevního srážecího faktoru VIII a na základě vyloučení anti-vVFprotilátek, prostý xenogeního materiálu, jako jsou protilátky.

Překvapivě se totiž ukázalo, že - na rozdíl od plasmatického vVF - r-vVF má překvapivě vysokou aviditu vůči vVF-vazným proteinům, přestože je vázaný na chromatografickém materiálu.

Kromě toho je r-vVF na rozdíl od plasmatického vVF prostý krevního srážecího faktoru VIII a obzvláště prostý plasmatických proteinů, které by byly při postupu isolace *· ··

1' · · • flflfl flfl · [ · • fl fl^k

• flfl· • · · · flflfl flflfl pro vVF-vazné proteiny rušivé.

Při obzvláštní formě provedení vVF-derivátu podle předloženého vynálezu je r-vVF fixován chemickou vazbou na chromatografický materiál. Tím je zajištěno, že zůstane zachována vysoká avidita vVF-derivátu podle předloženého vynálezu s vysokou stabilitou, což enormě zvýší schopnost použití materiálu podle předloženého vynálezu. Chemickou fixací se dosáhne stabilisace chromatografického materiálu ^překvapivě se neovlivní nativita vVF . Současně se může vyloučit použití odpovídajících protilátek, které zprostředkují vazbu vVF na pevnou fázi. Vazba přes protilátky má nevýhodu v nestabilitě a zvýšení leakage, to znamená vymývání imobilisovaného vVF současně se získáváním vazebného partnera pro vVF .

Avidita vVF-derivátu se může dále zvyšovat cílenou volbou r-vVF-frakce. Překvapivě se ukázalo, že přímo z r-vVF-frakce s nepatrnou primární hemostatickou aktivitou, obzvláště z nízkomolekulární r-vVF-frakce s molekulovou hmotností pod asi 1500000 Da , výhodně pod 1000000 Da , se může vyrobit materiál s vysokou aviditou pro faktor VIII.

Přijatelnost rekombinantního von Villebrandova faktoru ve vysoké čistotě a. neohraničené kvantitě umožňuje široké použití vVF-derivátu podle předloženého vynálezu jako ligandu v áfinitní chromatografií nebo příbuzných afinitnich metodách, při kterých je vázaná molekula spojena s ligandem specifickým vzájemným působením.

r-vVF se exprimuje výhodně v buňkách savců, například v CHO-buňkách. Takovýto vVF je popsán v patentové přihlášce

VO 96/10584. Při čištění r-vVF pomocí například heparin5

fl fl » fl	fl·'1'	flfl »!',	• fl	flfl flfl fl·, · · μ · fl fl.·' ·
fl •	« • flfl
fl flflfl	fl • •fl	fl • ·	fl	fl ·'' • fl*	fl; · • fl ··

afinitni chromatografie vypadávají frakce, které obsahují molekuly s pro vVF poměrně nízkou molekulovou hmotností (až asi 1000000 Dalton). Tyto frakce mají sice samy o sobě relativně nízkou primární hemostatickou aktivitu, jsou ovšem dále schopné vázat vazebné proteiny, které vstupují s vVF do specifických interakcí, například faktor VIII . Vzhledem k tomu, že se pro terapeuticky využívané vVF-koncentráty s vysokým podílem vysokých multimerů tyto vedlejší frakce produkce r-vVF nepoužívají, představují tyto tedy vedlejší produkt, který se podle předloženého vynálezu může použít pro imobilisaci a následující použití imobilisátu pro výrobu afinitní matrice.

Jako chromatografický materiál se podle předloženého vynálezu výhodně používá gel, který má dobré afinitně-chromatografické vlastnosti, to znamená nepatrný zpětný tlak, odpovídající vysokým hodnotám průtoku, vysokou vazebnou kapacitu pro imobilisované ligandy, nepatrná reakce na přechod barvy a možnost desinfekce například hydroxidem sodným.

Kopulace r-vVF na pevnou matricí se provádí tak, že se nezapomíná na vazebné vlastnosti při afinitní chromatografii sé vázajících proteinů. K tomu se mohou překvapivě použít standardní imobilisační techniky, jaké jsou například popsány Voodwardem v Immobilized Cells and Enzymes, IRL. Press, Oxford, Washington (1985). Dále má takovýto chromatográfický gel dobré vlastnosti pro opětovné použití a stabilitu, takže také při opakovaném použití má stejnou vazebnou kapacitu pro isolované molekuly.

Výhodný vVF-derivát obsahuje tedy jako chromatografický materiál organický polymer, obzvláště organický póly6 *

• · flfl fl* ·♦ flfl •f · · · · · · • · fl·· ·' · .· « • fl flfl flfl flflfl flfl· flflfl· · fl • flfl flfl· fl* flfl mer na basi uhlohydrátů. Vhodné gelové matrice, popřípadě R R partikulární nosiče jsou například sephacely , sephadexy , sepharosyR, Fast Flow-Media, High Performance-Media, p p sepharose Big Beads (vše firma Pharmacia), tris-acryl media, spherodex^-media nebo hyper-D^-media (vše firma Sepracor), macropep^-gele (firma BioRad), ale také syntetické polymery, jako je toyopearl^-gele (firma Tosohaas) a fractogele^ (firma Merck).

Aby se zabránilo kontaminacím, obzvláště humánními patogenními viry, podrobí se vVF-derivát podle předloženého vynálezu výhodně zpracování pro inaktivaci virů, takže se může zaručit, že chromatografický materiál při isolaci proteinů, které se vázají na vVF, nemají žádný virus-kontaminační faktor. Zpracování pro inaktivaci virů se provádí výhodně před derivatisací pomocí chemických a/nebo fyzikálních postupů, například zpracováním s tensidy, polyethylenglykoly nebo chaotropy, tepelným zpracováním nebo zpracováním ozářením. Rovněž se ale také může hotový derivát, výhodně v lyofilisované formě, podrobit zpracování, jako je například tepelné zpracování nebo ozáření.

Při výhodné formě provedení se vVF-derivát podle předloženého vynálezu dává k disposici ve formě stabilní pro skladování, obzvláště jako lyofilisát, čímž se dosáhne výrazného ulehčení při prodej i, provozu a při skladování.

Podle dalšího aspektu se týká předložený vynález také zařízení, zahrnujícího zásobník a v něm obsažený vVF-derivát podle předloženého vynálezu, přičemž zásobník má vstupní otvor a výstupní otvor, které jsou uspořádány vhodně pro průtok kapaliny. Prakticky je zařízení podle předloženého vynálezu vytvořeno jako sloupec, obzvláště jakoafinitní • frl fr fr·· ·· • · ·;♦··:

frfr fr· sloupec nebo chromatografický sloupec, které mohou být podle požadavků vytvořeny k disposici jako použitelný produkt ve pro skladování stabilní formě, takže se musí před isolaci proteinů provést pouze ještě botnání materiálu u uživatele .

Předmětem předloženého vynálezu je také způsob isolace proteinů, které se vážou na vVF , který se vyznačuje následujícími kroky :

** . . .. «w ...... . , . .

* , I* _A

- příprava frakce, která obsahuje proteiny, vázající se na vVF ,

- kontaktování frakce s derivátem vVF podle předloženého vynálezu, při kterém se proteiny vážou na vVF-derivát,

- oddělení nenavázaných součástí a

- eluování proteinů z vVF-derivátu.

Tento způsob se může provádět vsázkově, tedy jako batch-způsob, nebo také jako sloupcově chromatografický způsob.

Jako proteiny, které se mohou isolovat způsobem podle předloženého vynálezu, přicházejí v úvahu především fyziologické vazebné proteiny vVF , tedy glykoprotein Ib , glykoprotein IIb/IIIa-komplex, kollagen a obzvláště faktor VIII, ale také rekombinantní deriváty a analogy těchto proteinů, vVF-antigeny, vVF-protilátky, vVF-multimerasy, popřípadě vVF-depolymerasy a dokonce enzymy, které rozeznávají vVF jako substrát a jiné přírodní nebo syntetické peptidy a proteiny, které mají afinitu k vVF . Kromě toho mohou vVF-vázající sacharidy, jako je například heparin, být tímto způsobem, isolovány.

44 44. ·*

4k 4 4 · · · · ι ·

4 44* 4j· 4 4l 4

4' 4 44 4 b 4 444 444

4 4 4 · · • ť *4r «4 4 4 • 444

Na základě vysoké avidity derivátu vVF podle předloženého vynálezu je možné na chromatografickém materiálu podle předloženého vynálezu specificky vázat a získávat isolované proteiny ve výtěžcích více než 60 % , výhodně více než 80 % , většinou výhodně kvantitativních a eluovat je ve vyčištěné formě od derivátu vVF , čímž je možná výroba koncentrátů isolovaných proteinů jednoduchou elucí bez návazného koncentračního kroku.

Způsob podle předloženého vynálezu je vhodný obzvláště pro získávání biologicky aktivních proteinů s aktivitou faktoru VIII , obzvláště plasmatického nebo rekombinantního faktoru VIII a jejich mutantů, popřípadě analogů. Tyto je možno pomocí způsobu podle předloženého vynálezu isolovat zvláště tehdy, když se použije výchozí roztok, který obsahuje faktor VIΙΙ/vVF-komplex.

Eluování proteinů, obzvláště při získávání proteinů faktoru VIII , se provádí výhodně pomocí pufrů, obsahujících draselné ionty.

Obzvláště významná je při tom isolace faktoru VIII z frakcí plasmy, obsahujících faktor VIII , nebo z kapaliny nad buněčnými kulturami z buněk, které faktor VIII exprimují. Při isolaci faktoru VIII z frakcí plasmy je třeba dbát na to, aby fungoval vVF jako nosný protein faktoru VIII , to znamená aby se faktor VIII vyskytoval jako vázaný na vVF . Oddělování faktoru VIII a vVF je jinak možno provést pouze pomocí nákladných metod, například vazbou faktoru VIII na imobilisované, proti faktoru VIII řízené monoklonální, popřípadě polyklonální protilátky, na které se faktor VIII(vVF-komplex váže a potom se vVF cíleně eluuje, bez toho, že by se porušila vazba protilátky s faktorem VIII .

• · ·· ·· ** · • 4 · » Bii · · 4Í 4 4 ·

B · · ·«!«< · · · ·

B B- · · · Β B «4···· · BBBB ·. 4

4·· ·»· ».♦' ·· ·· »·

V následujícím se potom faktor VIII eluuje z chromatografického gelu. Takovéto postupy jsou skutečně nákladné, vedou ale k vysoce čistým preparátům faktoru VIII . Použitím imobilisovaného r-vVF podle předloženého vynálezu s vysokou specifickou vazebnou kapacitou a vysokou aviditou pro faktor VIII se dá komplex faktoru VIII a vVF , vyskytující se ve frakcích plasmy, disociovat, přičemž se faktor VIII váže na imobilisovaný vVF s vyšší aviditou. Tímto způsobem se dá také isolovat z frakce plasmy vysoce čistý faktor VIII, který neobsahuje vVF .

Kromě faktoru VIII se dají na imobilisovaný r-vVF vázat také jiné proteiny s afinitou k vVF a isolovat z komplexních směsí, totiž například faktor VlII-hybridproteiny, obzvláště faktor VlII-heparin-kofaktor II-hybridprotein podle US Ser.No. 08(558,107 nebo faktor VlII-faktor 5-hybridprotein podle VO 90/05570 nebo chimerní humánní/porci nerni faktor VIII podle VO 94/11503 , faktor VIII-mutanty, jako jsou například v AT A 921/96 (factor VIII dB695-R2307Q) popsané faktor VIII-mutanty se substitucí Arg —>

Gin , které mají při neměnné faktor VIII : C-prokoagulatorické aktivitě a vVF-vazebné aktivitě redukovanou vazbu inhibitoru, von Villebrand faktor-odbouratelné enzymy, například vVF-specifická depolymerasa, popřípadě vVF-multimerasa nebo receptory thrombocytů, jako je GPIIb/HIa nebo GPIb/IX-komplex, jejichž poskytnutí v čisté formě je z biochemicko -analytického, diagnostického nebo terapeutického hlediska zajímavé.

V současnosti se specifická isolace terapeutických proteinů provádí pomoci metody imunoafinitní chromatografie. Při tom se na imobilisovanou monoklonální protilátku (která se zpravidla získává z myších buněk) váží isolované

4« 44 • 4 4 • 4 44·

4 4 4

4 4 4

4* »· «4 • 4 4 4

4 4 4 • 4· 4 4·

4 • 4 v 4 molekuly, promyjí se do nepřítomnosti nečistot a potom se eluují ve vysoké čistotě. Nevýhoda použití monoklonálních protilátek spočívá v tom, že tímto se mohou do preparátu zanést myší proteiny, které, pokud se vázané molekuly používají terapeuticky, vedou k vedlejším účinkům, jako je například tvorba protilátek proti myšímu proteinu. Použitím imobilisovaných specifických ligandů lidského původu nebo molekuly, ekvivalentní lidskému proteinu a vyloučením xenogenních protilátek se immanentní problém kontaminace vytečením afinitních sloupců tak dalece redukuje, že v preparátu možné znečištění je rovněž lidského původu a jsou vyloučené uváděné vedlejší účinky, totiž tvorba heterologních protilátek. Další výhoda spočívá v tom, že použitím vysoce specifického ligandu, který není protilátkou, jsou vyloučené nespecifity, které se u protilátek příležitostně vyskytuj i.

Získávání fyziologických vazebných proteinů pro vVF podle předloženého vynálezu má dále výhodu v tom, že vVF vykonává funkci stabilisátoru, popřípadě nosiče, pro svého vazebného partnera. Získávané proteiny jsou proto dokonce během isolace a čištění chráněné před denaturujicími podmínkami, které se eventuelně vyskytují během eluce. Získávané produkty se tedy získají v uvedených vysokých výtěžcích nejen se zřetelem na svoji antigenitu, ale také se zřetelem na svoji aktivitu, popřípadě nativitu.

Další obzvláště výhodný protein, popřípadě proteinový komplex, který se může čistit pomocí vVF-derivátu podle předloženého vynálezu, je vVF-multimerasa, která odbourává vysokomolekulární formy vVF na nízkomolekulární varianty (viz AT A 769/96 a A 770/96). Při tom se může multimerasa vázat na imobilisovaný vVF , který potlačuje derivatisaci ·· «9

9 9 ·

9 9 9 · « 9 9 9 ·

9 >

99

I 9 9 ► 9 99· avšak podporuje odbourávání materiálu podle předloženého vynálezu.

Obzvláště při isolaci vVF-multimerasy se může obzvláště eficientně eluovat pomocí pufru, který obsahuje chelatotvorné látky pro kovové ionty, obzvláště EDTA .

Derivát vVF podle předloženého vynálezu se hodí také pro popřípadě extrakorporální imunadsorpci protilátek, které sou směrovány proti* vVF Tvorba protilátek proti'vVF představuje patologický stav, který se. může vyskytovat jako autoimunitní onemocnění a vede vede k defektům srážení krve se zvýšeným sklonem ke krvácení nebo se může vyskytovat jako vedlejší účinek ošetření pacientů preparáty, obsahujícími vVF . Tvorba funkčně inhibitorické protilátky činí substituční terapii nemožnou nebo vede ke drastickému zvýšení dávek, aby se mohl udržet hemostatický efekt koncentrátu srážecího faktoru. V takovýchto případech se odstraňovaly cirkulující funkční protilátky proti srážecímu faktoru v minulosti plasmaferesou nebo extrakorporální imunadsorpci na proti IgG směrované proteiny, například protein A nebo protein G . Podobný způsob je známý pro odstraňování protilátek, směrovaných proti faktoru VIII, od Nilssona a Berntropa. Při tom se čerpá plasma pacienta přes sloupec s imobilisovaným, rekombinantním faktorem VIII , aby se odstranily faktor VIII-inhibitorické protilátky z krevního oběhu (Nilsson a kol., Thromb. Háemostas. 70(1993), 56 až 59). Zde imobilisovaný ligand je však prostý von Villebrandova faktoru. Odpovídajícím způsobem není možné provádět extrakorporální imunoadsorpci protilátek, směrovaných proti vVF .

Další použití způsobu získávání protilátek podle před12 *1 >·· * fcfc ·« ·* fcfc • · · · • · ·«·· « · fc · • · · · · ♦ 4 fcfcfc fcfcfc • fcfcfcfc fc · fcfc fcfc ·« fcfc fcfc loženého vynálezu spočívá v preparativním získávání polyklonálních nebo monoklonálních anti-vVF-protilátek pro diagnostické účely.

Eluční pufr, který se výhodně používá při eluci protilátek z vVF-derivátu podle předloženého vynálezu, má kyselé pH , obzvláště má hodnotu pH v rozmezí 2 až 5 .

Jedna z podstatných výhod předloženého vynálezu spočívá v tom, že je možné vyčištěni proteinů z každého výchozího materiálu. Obzvláště výhodné výchozí frakce jsou při tom frakce, které jsou odvozené z tělních tekutin savců nebo buněčných kultur. Na základě avidity chromatografického materiálu podle předloženého vynálezu jsou výhodné také frakce, které obsahují vVF a/nebo faktor VIIΙ/vVF-komplex.

Výhodná varianta provedení způsobu podle předloženého vynálezu spočívá v tom, že se provádí za použití zařízení podle předloženého vynálezu se v něm obsaženým vVF-derivátem .

Předložený vynález je blíže objasněn pomocí následujících příkladů a obrázků, na které však není omezen.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 a 2di je znázorněno čištění rekombinantního faktoru VIII pomocí vVF-derivátu podle předloženého vynálezu.

• to * to to* *· »4 to* • · · · · to «·*« · · · ·· · * ·· ··· • · to to · • to toto *· toto

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba rekombinatního von Villebrandova faktoru z CHO-buněk

CHO-buněčný klon, který produkuje řekombinantní von Villebrandův faktor, se vyrobí stejně, jako je popsáno v.FEBS, Lett. 351 (1994), 345 až 348'’*^ Transfekci pomocí pro cDNA humánního furinu kódovaného vektoru (van den Ouweland a kol., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 644) se připraví buněčná linie pro Co-expresi humánního furinu. Takovéto stabilní buněčné klony se ve velkém měřítku fermentují v pěrfusnich reaktorech na microcarrierech (Bluml a kol., In: Spier RE, Griffith JB, Berthold V, eds. Animal cell technology, OxfordLondon: Butterworth-Heinemann, (1994), 267 až 269).

Čištění se provádí dvoustupňovým chromatografickým způsobem podle Thromb. Haemost. 73 (1995), 1160 . Frakce desorbóvaná eluci pomocí chloridu sodného se získává a převede se gelovou filtracípřes sephadex G25 (firma Pharmacia) do pufru, obsahujícího 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 . Potom se preparát Zakoncentruje ultrakoncentraci přes membránu Amicon YM30 (cut-off: 20.000 D) na koncentraci proteinů 3 mg/ml . vVF-Koncentrace v tomto preparátu činí 60 E vVF-antigenu/mg proteinu. Tento preparát neobsahuje žádný faktor VIII na základě vyloučení sera nebo součástí plasmy při výrobě v buněčné kultuře a při čištění.

φφ «φ »·| Φφ • φ φ · ·· • * φ * φ φ φφφ φφφ φ · ·· « ·

Příklad 2

Imobilisace rekombinantniho νοη Villebrandova faktoru

Preparát rekombinantniho vVF z příkladu 1 se zředí pufrem, obsahujícím . 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 , na 1,5 mg/ml . Předaktivovaný gel (Actigel, ALD-Superflow, firma Sterogene), vhodný pro afinitní chromatografii, ^í se excesivne předpromyje pufrem, obsahujícím 20 mM

Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 . Jeden objemový díl předprómytého gelu se smísí s 1,1 objemovým dílem imobilisovaného proteinového roztoku a potom se přidá 0,15 objemového dílu roztoku 0,1 M kyanborhydridu (NaCNBH^) v 0,1 M fosfátového pufru, pH 7,0 . Gel se suspenduje třepáním v tomto pufru a za dalšího třepání se inkubuje po dobu 16 hodin při teplotě místnosti. Potom se gel promyje na slinuté nuči desetinásobným objemem pufru, obsahujícího 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 a pětinásobným objemem pufru, obsahujícího 20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7,5 .

Potom se eqilibruje ještě jednou pěti objemovými díly pufru, obsahujícího 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 ’ a gel sé převede dó chromatografiekého sloupce s dimensí průměr k výšce lože gelu 1 ·.: 4 . Stanovením koncentrace proteinu v roztocích kapaliny nad inkubační směsí, roztoku vVF a afinitního gelu, jakož i promývacích roztoků, oddělených na slinuté nuči, je možno zjistit hodnotu kopulace přes 90 % použitého proteinu.

í Příklad3

Čištění rekombinantniho faktoru VIII

Preparát rekombinantniho faktoru VIII (Recombinate, * ,9 ·« *9 99 ·« • * · *' «99 »999 * 9 «' 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 99 9 9 99 999 999 • 9 99 9 9 9 9 • 9 9 «99 99 99 ·* 9 9 firma Baxter) se rekonstituuje s 10 ml destilované vody. Tento roztok obsahuje 50 IE faktoru VlII/ml , 12 mg humánního albuminu/ml , 1,5 mg polyethylenglykolů 3350/ml , jakož i stopy vVF v pufru histidin-chlorid sodný při fyziologické hodnotě pH . Gelovou filtrací na Sephadexu G25 (firma Pharmacia) se z tohoto roztoku oddělí nízkomolekulární komponenty a získá se směs faktor VIII/vVF/albumin v pufru, obsahujícím 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 . 7 ml tohoto roztoku se potom nanese na sloupec z příkladu 2 s hodnotou toku 0,5 ml/minPotom se při stejné hodnotě toku promýfc vá 10 ml pufru, obsahujícího 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 a dále se eluuje na vVF vázaná frakce faktorů VIII pomocí 250 mM chloridu vápenatého v tom samém pufru. Během celkové chromatografie, prováděné při teplotě místnosti, se frakce shromažďují na objem 500 μΐ a po průchodu sloupcem se stanoví optická hustota při 280 nm. Ve frakcích se následně stanoví pomocí chromogenního testu na. faktor VIII (Immunochrom FVIII : C (firma Immuno)) obsah faktoru VIII . Výsledek je uveden na obr. 1 .

Analysa frakcí ukazuje, žé více než 90 % proteinu je obsaženo ve fázi proteklé sloupcem a v promývacím roztoku, zatímco s touto proteinovou frakcí se eluuje pouze nepatrná část aktivity faktoru VIII (pod 5 %) . Hlavní množství faktoru VIII je možno desorbovat ze sloupce s vysokou čistotou elucí chloridem vápenatým. Získávání faktoru VIII se provádí s výtěžkem více než 90 % .

Příklad 4

Opětná použitelnost afinitního gelu

Po ukončení prvního čištění rekombinantního faktoru • 4 44 ·4 ♦· 44 • · · · · 4 444 4 • · «4444 4 4 * * • · · 4 4 · 4« 44·4·4 • · 4 4 4 4 · 4

444 444 4 4 · 44 44

VIII pomoci afinitní chromatografie se afinitní gel ve sloupci excesivně promyje pufrem, 20 mM Tris, pH 7,5. V promývacím roztoku se stanoví vVF-antigen pomocí ELISA (firma Boehringer, Mannheim) . Nemůže se zjistit žádný vVF-antigen, což je indikátor nepatrné možnosti vytečení afinitního sloupce. Čištění rekombinantního faktoru VIII pomocí afinitní chromatografie na imobilisovaném vVF se opakuje stejně jako v příkladě 3 za identických podmínek.

Eluční diagram je znázorněn na obr. 2 . Eluční profil proteinů a aktivity je srovnatelný až na odchylky měření —........................

k s průběhem první afinitní chromatografie. Může se tedy vycházet z dobré opětné použitelnosti afinitního gelu.

Příklad 5

Vazba anti-von Villebrand faktor-protilátek na imobilisovaném rekombinantním von Villebrandově faktoru

Proti vVF řízená myší monoklonální protilátka (MAb 03768/3, firma Chemicon International, lne.) s koncentrací IgG 7 mg/ml se převede gelovou filtrací přes Sephadex G25 (firma Pharmacia) do pufru, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCI, pH 7,5 . Koncentrace proteinu se nastaví zředěním tím samým pufrem na 0,5 mg/ml. 4 ml tohoto roztoku se čerpá při hodnotě toku 0,5 ml/min přes sloupec imobilisovaného rekombinantního vVF z příkladu 3 a v prošlé kapalině se stanoví optická hustota při 280 nm. Potom se ještě promyje 20 ml Tris-HCl-pufru a dále 10 ml Trls-HCl-pufru, obsahujícího 500 mM chloridu sodného. Při žádném z uvedených promývacich kroků nebyla eluována žádná za zmínku stojící množství proteinu. Potom se eluuje pufrem, 100 mM glycin-hydrochloridu, pH 2,2 . Změnou hodnoty pH se může protein ze sloupce desorbovat. Ze stanovení obsahu IgG vyplývá, že se <* *9 99 9« »» * · · Φ · «φφφ • · * *«« · 9 · * • «9 Φ 9 Φ Φ ΦΦΦ ΦΦΦ ί ... ·ΦΦΦΦφ φφ •9* **· ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ z použitých 2 mg IgG opět zjistí 1,75 mg IgG v glycinovém eluátu. Toto odpovídá výtěžku 88 % . Afinitní sloupec se po elučním kroku s kyselým pufrem pro další použití propláchne 20 mM Tris-HCl-pufru, pH 7,5 .

Příklad 6

Čištění von Villebrand-faktor odbourávajícího enzymu ” vVF-štěpíčí“proteasa z humánní plasmy,' popsaná Furlanem a spol. (Blood 87 (1996), 4223 až 4234) se podle tam popsané metody přečistí pomocí měďchelátové afinitní chromatografie a následující hydrofobní interakční chromatografie na butylsepharose (firma Pharmacia). Eluát z butylsepharosy se lyofilisuje a zakoncentrovány se vyjme do destilované vody. Potom se přepufruje přes Sephadex G25 (firma Pharmacia) proti pufru, 20 mM Tris-HCl, 50 mM chloridu sodného, 10 mM chloridu barnatého, 5 mM PEFA-Block (firma Pentapharm), pH 7,5 . 3 ml tohoto roztoku se nanese na sloupec, obsahující imobilisovaný rekombinantní vVF z příkladu 2 , při hodnotě toku 0,5 ml/min. Potom se promyje 10 ml toho saméo pufru, proti kterému se přepufrovala proteasová frakce a sloupec se potom propláchne dalšími 10 ml pufru, obsahujícího 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 5 mM PEFA-Block (firma Pentapharm), pH 7,5 . Během celé chromatografie se shromažďují frakce vždy 450 μΐ, přičemž do každé zkumavky jímače frakcí se u každé frakce předloží 50 μΐ 1% vodného roztoku bovinního sérového albuminu, aby se stabilisoval vVF-odbourávájící enzym, známý jako labilní. Během chromatografie se měří UV-absorpce při 280 nm a aktivita vVF-odbourávájícího enzymu se stanovuje následujícím způsobem. Preparace rekombinantního vVF z příkladu 1 se přepufruje v pufru, 5 mM Tris-HCl, 1,5 • « • fefe· • * fefefefe • fefe fefe

M močovina, obsahujícím 0,2 % (G/V) bovinního sérového albuminu a převede se na 0,4 vVF E/ml. Alikvotní množství zkoušené frakce 100 gl se smísí vždy s 5 μΐ 50 mM vodného roztoku PPACK a 12,5 gl 200 mM roztoku chloridu barnatého a inkubuje se po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Potom se takto připravený vzorek 1+1 smísí se substrátem (vVF) a dialysuje se po dobu 15 hodin při teplotě 37 °C na plovoucí dialysní membráně (Millipore VSVP) podle metody Maruskyho a Sergeanta (Anal. Biochem. 105 (1980), 403) ^J

- proti pufru, obsahujícímu 5 mM Tris-HCl, 1,5 M močoviny, pH --8,0 .

Potom se dialysát analysuje na svoji vVF zbytkovou aktivitu v ELISA, u které se zjistí kolagenová vazebná ak-₄ tivita vVF , jakož i její antigenita. K tomu se dá do mikrotitrační desky z polystyrenu (96 well, Pierce Reactibindⁱⁿ/aktivováno anhydridem kyseliny maleinové). pro misku 100 gl suspense pepsinem natráveného Typ-III-Collagenu (firma Southern Biotechnology) z humánní placenty v koncentraci 2 gg/ml a inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Potom se zpracuje po dobu 30 minut vždy 150 gl blokovacího pufru (SuperBlock^, firmy Pierce). Potom se vnese vždy 100 gl různých zředění vzorků, obsahujících vVF (25 až 250 ng/ml) a inkubuje se se 100 gl roztoku peroxidasou konjugované anti-vVF-protilátky (Dakopatts P226, zředění 1 : 1000). Potom se přidá 100 gl substrátu (Single Component TMB Peroxidase EIA Substráte, firma Bio-Rad) a barevná reakce se po jedné minutě zředěním 1+1 ukončí pomocí 0,18 M kyseliny sírové. Potom se měří extinkce při 450 nm ELISA-čítačem a stanovuje se koncentrace vzorku vůči zřeďovací řade standardu. Po každém inkubačním kroku se vždy třikrát promyje 150 gl pufru (pufr odpovídající následujícímu stupni).

fl ·* fl* • · · · · · » · · · · • · tfl flflfl · · · ♦ • · · · · · flfl ·«·«·· • * « fl · · · • ·· · · · « fl ·fl flfl ·fl

Používaný pufřový systém :
	Pufr 1	(pro potažení kolagenem a zředění protilátky) ; 8 mM fosforečnanu sodného, 135 mM chloridu sodného, 2,6 mM chloridu draselného, pH 7,3 , 1
’· * r	Pufr 2	(pro zředění vzorku) : odpovídá pufru 1 + 0,05 % Tween 20 a 1 % albuminu

z telecího-sérat pH 7,3 V ' *** ' . ,·· ... »·.

Reciproční hodnota kolagenové vazebné aktivity platí jako přímá míra enzymové aktivity vVF-odbourávajícího enzymu.

Z množství enzymu, naneseného na sloupec s von Villebrandovým faktorem, se nachází asi 50 % v proteklé kapalině a v promývacích roztocích, zatímco asi 50 % aktivity je možno desorbovat elucí pomocí EDTA . Vzhledem k tomu, že však více než 95 % proteinu bylo obsaženo v průtoku a promývacích frakcích chromatografického čištění, mohla být isolovaná enzymová aktivita obohacena a vyčištěna o faktor 5 až 10 v poměru k výchozí surovině.

Příklad7

Čištění plasmatického faktoru VIII

Plasmatický faktor VIII/von Villebrand-faktor-koncentrát (IMMUNATE, firma immuno) se rekonstituuje s 5 ml destilované vody. Tento roztok obsahuje 25 IE faktoru

VIII/ml a 10 E vVF/ml (měřeno pomocí Ristocetin CofaktorMethode) v pufru citrát-glycin-lysin, pH 7,4 . Gelovou

7, * ’ *· »· ··,*· ··· ··«· * · · ···« ·' « » « * · * * ·« ♦ « ··* *«· * · »»·» · « ··· *· ·· ·· ·» ·* filtrací na Sephadexu G25 se přepufruje faktor VIII/von Villebrand-faktor-komplex proti pufru, obsahujícímu 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 . Potom se 3 ml tohoto roztoku nanesou přímo na sloupec z příkladu 2 , Hodnota toku činí 0,1 ml/min. Potom se promyje 30 ml pufru Tris/HCl, pH 7,5 a dáse se eluuje pufrem, obsahujícím 20 mM Tris/HCl a 250 mM CaCl2· Při elucí se frakce shromažďují a stanovuje se optická hustota. Ve frakcích bezprostředně po nanesení elučního pufru je možno naměřit zvýšení UV-absorpce 280 nm •·*οΊ0 % , přičemž'děšóřbovaný protein”je prostý von

Villebrandova faktoru, měřeno v von Villebrand-Faktor-ELISA (Boehringer Mannheim) , zatímco v prvních deseti elučních frakcích mohl být zjištěn obsah faktoru VIII asi 0,2 E/ml stanovením pomocí chromogenního faktor VIII-testu,

Immunochrom FVIII:C (firma Immuno).

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Derivát von Villebrandova faktoru, sestávající z rekombinantního von Villebrandova faktoru, imobilisovaného na partikukárním nosiči nebo nosičovém gelu.
2. 2. Derivát von Villebrandova faktoru podle nároku 1 , vyznačuj “ic^-í se ΐ í m že partikulární nosič nebo nosičovy gel je chromatografický materiál.
3. 3. Derivát von Villebrandova faktoru podle nároku 1 nebo 2,vyznačuj ící se tím, že derivát Villebrandova faktoru je prostý krevního srážecího fasktoru VIII.
4. 4. Derivát von Villebrandova faktoru podle některého z nároků 1 až 3,vyznačuj ící se tim, že rekombiunantní von Villebrandův faktor je na partikulární nosič nebo nosičový gel fixován chemickou vazbou.
5. 5. Derivát von Villebrandova faktoru podle některého z nároků 1 až 4,vyznačuj ící se tím, že rekombiunantní von Villebrandův faktor je odvozen z frakce rekombinantního von Villebrandova faktoru s nepatrnou hemostatickou aktivitou, obzvláště z nízkomolekulární frakce rekombinantního von Villebrandova faktoru.
6. 6. Derivát von Villebrandova faktoru podle některého z nároků 1 až 5,vyznačuj ící se tím, že partikulární nosič nebo nosičový gel je organický polymer, obzvláště organický polymer na uhlohydrátové basi.

   σ* * « < «# • «fl • « ··· • · · » · * * · fl • fl · fl· ·· * · Φ • flfl · •flfl ·«· • « • · ··
7. 7. Derivát von Villebrandova faktoru podle některého z nároků 1 až 6,vyznačuj ící se tím, že rekombiunantní von Villebrandův faktor, popřípadě derivát je virově inaktivován.
8. 8. Derivát von Villebrandova faktoru podle některého z nároků 1 až 7,vyznačující se tim, že se vyskytuje ve formě stabilní pro skladování, obzvláště jako lyofilisát. * · - - ¹
9. 9. Zařízení, zahrnující nádrž a v ní obsažený derivát von Villebrandova faktoru podle některého z nároků 1 až 8 , přičemž nádrž má vstupní a výstupní otvor, které jsou vytvořeny vhodně pro protékání kapalin.
10. 10. Zařízení podle nároku 9 , vyznačující se tím, že nádrž je vytvořena jako afinitní sloupec.
11. 11. Způsob isolace proteinů, které se vázají na von Villebrandův faktor, vyznačující se tím, že se

    - připraví frakce, která obsahuje proteiny, vázající se na von Villebrandův faktor ,

    - kontaktuje se frakce s derivátem von Villebrandova faktoru podle některého z nároků 1 až 8 , přičemž se proteiny ? vážou na tento derivát,

    - oddělí se nenavázané součásti a • - eluují se proteiny z derivátu von Villebrandova faktoru.
12. 12. Způsob podle nároku 11 ,

    4 4 4 i

    44» *44 fr 44 * 4 • 44a 4 4

    4 4 » 44

    4« 44

    4 * 4 4

    4 4 4 4

    444 444

    4 4 vyznačující se tím, že se proteiny eluují z derivátu von Villebrandova faktoru v koncentrované formě.
13. 13 Způsob podle nároku 11 nebo 12 , vyznačující se tím, že se připraví frakce, která obsahuje biologicky aktivní protein s aktivitou faktoru VIII a tento protein se isoluje.
14. 14. Způsob podle některého z nároků 11 až 13 , ‘ vyznačuj “í*c^í^^^s e t i m , že se eluce provádí pomocí pufru, obsahujícího vápenaté ionty.
15. 15. Způsob podle nároku 11 nebo 12 , vyznačující se tím, že se připraví frakce, která obsahuje multimerasu von Villebrandova faktoru a tento protein se isoluje.
16. 16. Způsob podle některého z nároků 11, 12 nebo 15 , vyznačující se tím, že se eluce provádí pomocí pufru, obsahujícího chelatotvornou látku pro kovové ionty, obzvláště kyselinu ethylendiamintetraoctovou.
17. 17. Způsob podle nároku 11 nebo 12 , vyznačující se tím, že se připraví frakce, která obsahuje protilátky proti von Villebrandovu faktoru a tento protein se isoluje.
18. 18. Způsob podle některého z nároků 11, 12 nebo 17 , vyznačující se tím, že se eluce provádí pomocí pufru s kyselým pH , obzvláště v oblasti pH 2 až 5.
19. 19. Způsob podle některého z nároků 11 až 18 , vyznačující se tím, že se připraví frakce, • b b

    * b b b * • > « b

    ··· ·· «· • » b · b b b b ··· »«· • · • b bb která je odvozena z tělní tekutiny savců nebo z buněčné kultury.
20. 20. Způsob podle některého z nároků 11 až 19 , vyznačující se tím, že se připraví frakce, která obsahuje von Villebrandův faktor a nebo komplex faktoru VIII a von Villebrandova faktoru.

    k
21. 21. Způsob podle některého z nároků 11 až 20 , ff*v^L'y znač u^j ic í* se t í‘m , že se proteiny získáI 4 ·>

    vaj i ve výtěžku alespoň 80 % .
22. 22. Způsob podle některého z nároků 11 až 21 , vyznačující se tím, že se provádí za použití zařízení podle nároku 9 nebo 10 ,