CN1544942A - 人多囊蛋白－1定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学免疫学检测技术领域，是一种用于定量检测人体体液中多囊蛋白－1含量的试剂盒。本发明利用抗人多囊蛋白－1 N端单克隆抗体和抗人多囊蛋白－1 N端多克隆抗体，采用免疫学技术建立了定量检测体液及组织裂解液中多囊蛋白－1含量的双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)方法。通过比较体液中多囊蛋白－1含量的差异，判断是否患有常染色体显性遗传性多囊肾病，对临床诊断该病具有重要参考价值，为及早防治该病提供了一个有效途径。

Description

人多囊蛋白-1定量检测试剂盒

                                技术领域

本发明涉及医学免疫学检测技术领域，是一种用于定量检测人体液中多囊蛋白-1含量的双抗体夹心ELISA试剂盒。

                                背景技术

常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是人类最常见的致死性单基因遗传病之一，累及所有种族，在世界范围的发病率为1/500~1/1000，在全球约有1300万人受累。其特征是双侧肾囊肿呈进行性发生并增大，疾病逐渐进展，常在患者中年后期即发展为终末期肾衰竭。ADPKD引起的肾衰竭占肾脏替代治疗患者总数的10％以上。这种囊性疾病危害甚大，不仅发生在肾脏，也常累及肾外器官，引发多囊肝、胰管及胆管扩张、结肠憩室、颅内动脉瘤、心脏瓣膜异常等。

国际上至今对ADPKD的临床诊断指标还没有统一标准，多根据家族史、临床表现，结合影像学检查结果做出诊断。患者常因常规体检的影像学检查发现本病，发现时肾脏囊肿往往已非常明显。基因诊断结果确切可靠，但技术条件、辅助检查设备要求较高，操作繁琐，目前临床上还没有一个ADPKD的体液诊断指标，迫切需要一个简单、方便、易于推广、敏感和特异的临床诊断ADPKD的检测方法。

                            发明内容

鉴于ADPKD是由于16号染色体的PKD1基因和(或)4号染色体的PKD2基因突变引起的，其85~90％的发生系由于PKD1的编码产物——多囊蛋白-1(PC-1)的结构和功能异常所致。所以，可以通过定量检测体液中PC-1的含量，初步诊断ADPKD。PC-1是一个分子量约460kD的跨膜糖蛋白，由1个庞大的胞外区(N端)、11个跨膜区和1个相对小的胞浆尾(C端)组成。胞外区所拥有的众多复杂的蛋白基序决定了PC-1的胞外部分对其行使正常的生理功能的重要性。本发明从胞外区的N端着手对PC-1进行检测。

本发明利用抗人多囊蛋白-1 N端单克隆抗体和抗人多囊蛋白-1 N端多克隆抗体，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)方法，制备了双抗体夹心PC-1-ELISA试剂盒，用该试剂盒定量检测人体液中PC-1的含量。通过比较体液中PC-1含量的差异判断是否患ADPKD，为及早防治该病提供一个重要的参考依据。

本发明试剂盒的主要试剂为抗PC-1 N端单克隆抗体MA7B1(已包被在酶标板上)和抗PC-1 N端多克隆抗体PAPC1，用于制备两种抗体的抗原均为PC-1胞外区N端融合蛋白PC-1-e2，该融合蛋白对应于PC-1的第46~202位氨基酸残基。通过检测样品中PC-1 N端的含量，就可以代表PC-1在受检样品中的水平。

本发明试剂盒组成如下：

1.96孔酶标板1块，其已包被抗人PC-1 N端单克隆抗体MA7B1，包被浓度5μg/ml。

2.样品稀释液1瓶，5ml，其为含0.05％吐温-20和1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液。

3.检测抗体工作液1瓶，10ml，其含抗人PC-1 N端多克隆抗体PAPC1 1μg/ml。

4.酶标抗体工作液1瓶，10ml，其含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。

5.底物稀释液1瓶，20ml，其含pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和过氧化氢(H₂O₂)。

6.终止液1瓶，5ml，其为2M H₂SO₄。

7.洗涤液(20×)1瓶，50ml，其为含1.0％吐温-20的pH7.4磷酸盐缓冲液。

8.标准品2管，每管含PC-1-e2冻干粉400ng。

9.邻苯二胺(OPD)片3片，每片2mg。

10.坐标纸1张。

本发明试剂盒酶标板和各试剂的制备以及用本试剂盒检测人体液样品中PC-1含量的方法详见具体实施方式部分。

                          具体实施方式

人PC-1定量检测试剂盒中各试剂的制备及来源

1.标准品蛋白即融合蛋白PC-1-e2的制备

标准品蛋白为人PC-1 N端融合蛋白PC-1-e2冻干粉，该蛋白对应于人PC-1胞外区N端的flank-LRR-flank区和部分WSC区的第46∽202位氨基酸残基，纯度在97％以上。该标准品蛋白的制备过程详见2003年9月25日申请的发明专利“人多囊蛋白-1 N端融合蛋白PC-1-e2”，专利申请号为03151184.8。现将其制备过程简述如下：

(1)制备人肾组织总RNA

取新鲜的健康成人肾组织，用上海华舜公司总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取总RNA。

(2)合成引物

根据已知的人类PKD1 cDNA序列(GenBank L33243)，设计并合成引物。

正向引物： 其5′端引入BamH I酶切位点

反向引物： 其5’端引入Hi ndIII酶切位点

(3)RT-PCR扩增PKD1e2基因

以人肾组织总RNA为模板，用上述引物通过RT-PCR扩增编码PC-1 N端flank-LRR-flank区和部分WSC区的PKD1 cDNA序列PKD1e2基因，其全长474bp。

(4)构建表达载体pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2

将融合蛋白表达载体pQE30(德国Qiagen公司产品，其阅读框的5′端含连续编码6个组氨酸的核苷酸序列)和PKD1e2基因分别用BamH I和HindIII双酶切，将两种酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，然后转化感受态大肠杆菌M15，其转化子重组质粒通过BamHI/HindIII双酶切和DNA序列分析鉴定，重组表达载体为pQE30-PKD1e2，工程菌为M15/pQE30-PKD1e2。

(5)融合蛋白PC-1-e2的诱导表达

工程菌M15/pQE30-PKD1e2在LB培养基中37℃培养过夜，以1∶20体积比接种在2×YT培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.5~0.6，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM/L，32℃诱导表达4~5小时。经破菌和Ni-NTA Agarose纯化后，行SDS-PAGE电泳，显示表达的融合蛋白分子量为19.0kD，即为融合蛋白PC-1-e2。

(6)融合蛋白PC-1-e2的纯化及SDS-PAGE分析

4℃离心收集步骤(5)诱导表达后的菌体，经8M/L尿素裂解液(pH8.0)充***解后离心，将上清与50％Ni-NTA Agarose(德国Qiagen公司产品)混合，用8M尿素pH梯度缓冲液(pH6.3，pH5.9，pH4.5)洗涤并洗脱融合蛋白PC-1-e2。12％SDS-PAGE分析融合蛋白PC-1-e2，经蛋白薄层扫描分析，该融合蛋白占菌体总蛋白的47.11％。

(7)融合蛋白PC-1-e2的冻干分装

将纯化的融合蛋白PC-1-e2用Lowry法定量，分装于数个1.5ml塑料离心管中，使每管PC-1-e2含量为400ng，然后用冻干机冻干至成为冻干粉，置4℃保存。

2.样品稀释液的配制

样品稀释液为含0.05％吐温-20和1％牛血清白蛋白的磷酸盐(PBS)缓冲液(pH7.4)。其配制方法如下：

(1)配制PBS缓冲液(pH7.4)：

   NaCl                                    8.0g

   KH₂PO₄                               0.2g

   Na₂HPO₄□12H₂O                      2.9g

   KCl                                     0.2g

   双蒸水       加至                      1000ml

  调pH值至7.4

(2)配制含0.05％吐温-20和1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液

  吐温-20                                  500μl

  牛血清白蛋白                             10g

  PBS           加至                      1000ml

  分装成5ml/瓶，置4℃保存。

3.酶标抗体工作液的配制

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，购自美国Sigma公司。将该抗体原液用样品稀释液稀释10,000倍后分装于瓶中，每瓶10ml，置4℃保存。

4.底物稀释液的配制

(1)配制磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)：

   0.1M柠檬酸(19.2g/1000ml)                24.3ml

   0.2M Na₂HPO₄(28.4g/1000ml)          25.7ml

   双蒸水                                  50ml

(2)配制底物稀释液：在上述100ml磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中加入30％H₂O₂160μl，混

   匀后分装，每瓶20ml，置4℃保存。

5.终止液的配制

终止液为2M H₂SO₄。取H₂SO₄22.2ml，缓慢加入177.8ml双蒸水中。分装成每瓶5ml。

6.洗涤液(20×)的配制

洗涤液为含1.0％吐温-20的20×PBS缓冲液(pH7.4)。其配制方法如下：

NaCl                                   160.0g

KH₂PO₄                              4.0g

Na₂HPO₄□12H₂O                     58.0g

KCl                                    4.0g

吐温-20                                10ml

双蒸水         加至                    1000ml

调pH值至7.4，分装成50ml/瓶。当配制工作液时只需将浓缩液作20倍稀释。

7.单克隆抗体MA7B1的制备及96孔酶标板的包被和封闭

捕获抗体为鼠源抗人PC-1 N端单克隆抗体MA7B1(抗体亚型为IgG1，纯度在97％以上)。其制备采用杂交瘤技术，方法详见2003年9月25日申请的发明专利“抗人多囊蛋白-1 N端单克隆抗体MA7B1”，专利申请号为03151183.X。现将其制备过程简述如下：

(1)免疫Balb/C小鼠

将前面所述的融合蛋白PC-1-e2按常规皮下免疫雄性Balb/C小鼠，多次免疫至小鼠多抗血清的效价达1∶6,000~1∶10,000时即可用于制备单克隆抗体。

(2)单克隆抗体MA7B1的制备

取上述免疫成功的Balb/c小鼠脾脏细胞在聚乙二醇4000(PEG 4000)诱导下与骨髓瘤细胞株SP2/0进行细胞融合，HAT选择性培养筛选出融合细胞，用间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA法)筛选出分泌抗PC-1 N端抗体的杂交瘤细胞，再以有限稀释法进行克隆化培养，得到稳定分泌抗PC-1 N端单克隆抗体MA7B1的杂交瘤细胞株7B1。按常规将该株7B1杂交瘤细胞接种于同系小鼠腹腔，诱导产生腹水，抽取腹水，通过亲和层析法纯化，得到纯化的IgG₁型抗体MA7B1。将抗体做冻干处理后得MA7B1冻干粉，置-80℃保存。8.抗体包被和封闭96孔酶标板

96孔酶标板购自丹麦NUNC公司，抗体的包被和封闭过程如下：

(1)包被酶标板

①配制酶标板包被缓冲液：

   Na₂CO₃                            1.59g

   NaHCO₃                              2.93g

   双蒸水加至                           1000ml

   调pH值至9.6。

②再用包被缓冲液将单克隆抗体MA7B1冻干粉稀释至终浓度5μg/ml(Lowry法蛋白定

  量)，将其作为捕获抗体在酶标板每孔加100μl进行包被，置4℃过夜。包被过的酶标

  板密封后可在4℃条件下保存6个月。

(2)封闭

将酶标板按常规用1×洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。再每孔加200μl封闭液(pH7.4的含1％BSA的PBS缓冲液)，37℃湿盒封闭2小时或4℃过夜。

9.检测抗体工作液的配制

检测抗体为兔源抗人PC-1 N端多克隆抗体PAPC1(纯度在95％以上)。为标准品蛋白PC-1-e2免疫新西兰大白兔后得到的抗血清的纯化物。其制备过程详见2003年9月25日申请的发明专利“抗人多囊蛋白-1 N端多克隆抗体PAPC1”，专利申请号为03151182.1。

现将其制备过程简述如下：

将前面所述的融合蛋白PC-1-e2皮下免疫3只雌性新西兰大白兔(代号分别为A、B、C)，多次免疫至兔多抗血清的效价达1.5×10⁵~2.0×10⁵，取兔血清，再用亲和层析法行IgG纯化，得到纯化的多克隆抗体PAPC1。此后，将抗体用Lowry法定量，分装后冻干处理得冻干粉，置-80℃保存。配制抗体工作液时，将冻干粉用样品稀释液稀释至浓度为1μg/ml，分装成每瓶10ml。

10.邻苯二胺(OPD)片

3片，每片2mg，购自上海华美生物技术公司。

人PC-1定量检测试剂盒标准曲线的建立

建立检测人PC-1含量的标准曲线，这是制备、组装定量检测人PC-1含量的双抗体夹心ELISA试剂盒的关键一步。具体操作步骤如下：

(一)相关试剂的配制

1.洗涤液：将前面所述的20×洗涤液用双蒸水作20倍稀释，并调pH值至7.4。

2.底物溶液：取前面所述的底物稀释液5ml，加入2mg OPD片，即为40％邻苯二胺(OPD)-H₂O₂溶液，临用前新鲜配制，配后立即使用。

(二)标准曲线的建立

1.标准品PC-1-e2的稀释和加样

将用单克隆抗体MA7B1包被好的酶标板用洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。用抗体稀释液按一定梯度稀释PC-1-e2冻干粉，共稀释8个浓度：1000.00ng/ml、500.00ng/ml、250.00ng/ml、125.00ng/ml、62.50ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、0.00ng/ml。每种浓度的PC1-e2吸取100μl加入到上述MA7B1抗体包被孔中(每种浓度做8个复孔)，37℃湿盒温育2小时。

2.滴加检测抗体PAPC1

将酶标板用洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。在含标准品PC-1-e2的酶标板孔中每孔加检测抗体PAPCI 100μl，37℃湿盒温育60分钟。

5.滴加酶标抗体

将酶标板用洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。酶标板每孔加酶标抗体工作液(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)100μl，37℃湿盒温育60分钟。

6.显色反应及光密度值的检测

将酶标板用洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。酶标板每孔加入40％OPD底物溶液100μl，在震荡器上低频震荡15秒，室温避光反应15分钟后，每孔滴加50μl终止液，5分钟内用酶联检测仪测定OD₄₉₂值。

7.建立标准曲线

以标准品(PC-1-e2)浓度1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、0.00ng/ml为横坐标，以相应浓度的OD₄₉₂减去空白值后为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线，该曲线线性范围较理想。该试剂盒除有8个孔用于建立标准曲线外，共可检测88份体液标本。

用本发明试剂盒检测ADPKD患者及正常对照组体液中PC-1含量的方法

一、体液标本的制备

全血标本置4℃冰箱过夜，低温离心机(4℃)3000g离心10分钟，收集血清，分装后-80℃保存。对于尿液和肝、肾囊肿中囊液标本，均在4℃，3000g离心10分钟，收集上清，分装后于-80℃保存。

二、ADPKD患者及正常对照组体液中PC-1的定量检测

1.准备试剂

(1)洗涤液：将20×洗涤液用双蒸水做1∶20稀释。

(2)标准品液配制：使用前在标准品管内加入200μl双蒸水溶解，PC-I-e2溶液浓度为2ng/μl。

(3)底物工作液的配制：使用前将OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加溶液5ml。

2.标准品的加样

酶标板上设标准孔8孔，每孔先各加样品稀释液100μl，再于第1孔加标准品PC-1-e2溶液100μl，混匀后用加样器吸出100μl移至第2孔。依次作对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔中吸出100μl弃去，每孔均为100μl。第8孔为空白对照。37℃湿盒温育2小时。

3.体液标本的加样

按需设待测样品孔若干，将体液标本分别加入待测样品孔，上样量均为100μl/孔，阴性对照孔加入等体积抗体稀释液，加样后置37℃湿盒温育2小时。

4.滴加检测抗体

将上述酶标板用洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。在酶标板每孔加入100μl检测抗体工作液，37℃湿盒温育60分钟。

5.滴加酶标抗体

将上述酶标板用洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。再加酶标抗体工作液100μl/孔，37℃湿盒温育60分钟。

6.显色反应及光密度值的检测

将上述酶标板用洗涤液洗3次，每次3~5分钟，甩干。酶标板每孔加底物工作液100μl，在震荡器上低频震荡15秒，室温避光反应15分钟，每孔滴加50μl终止液，5分钟内用酶联检测仪测定标准品和待测样品OD₄₉₂值。

7.结果计算与判断

(1)建立标准曲线：以标准品PC-1-e2的浓度(0.00、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00ng/ml)为横坐标，酶标仪测得的OD₄₉₂值减去空白值后为纵坐标，建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度的升高，测得的OD₄₉₂值也随之升高。

(2)体液标本样品检测值的计算：根据检测样品OD₄₉₂值减除空白值后在上述标准曲线上查出相应PC-1含量。如空白孔OD₄₉₂平均值为0.201，检测样品OD₄₉₂值为0.54，减去空白值后为0.339，该值在标准曲线上对应的PC-1含量为82.68ng/ml。

本发明试剂盒质检相关指标的检测

1.线性范围：该试剂盒检测PC-1含量的线性范围为370pg/ml~1000ng/ml。

2.回收率：将60ng/ml的PC-1-e2加入检测样品中，回收率为98.94％(n＝8)。

3.批内差异：平均为12.02％。

4.批间差异：平均为13.15％。

5.敏感性：检测ADPKD尿液标本敏感性为91.25％，检测ADPKD血清标本敏感性为91.67％。

6.特异性：检测正常组尿液特异性为90.10％；检测正常组血清特异性为88.7％。

经临床试用，该试剂盒检测110例正常人和101例ADPKD患者血清PC-1以及114例正常人和120例ADPKD患者尿液PC-1的结果如表1所示。

             表1 血清和尿液中PC-1的检测结果( x±s，ng/ml)

                    正常人              ADPKD患者                 P

血清(ng/ml)    98.76±37.36(n＝111)  53.19±16.90(n＝101)      ＜0.05

尿液(ng/ml)    47.31±35.71(n＝114)  222.10±146.22(n＝120)    ＜0.05

n：例数

表1结果显示：ADPKD患者尿液中PC-1含量明显高于正常人，差异显著(p＜0.05＝；ADPKD患者血清中PC-1含量明显低于正常人，差异显著(p＜0.05＝。以上结果表明，利用本发明试剂盒能定量检测出体液标本中PC-1的含量，对临床检测ADPKD具有较高的敏感性和特异性，对诊断该病具有重要参考价值，为及早防治该病提供了一个有效途径。

Claims (2)

1.一种人多囊蛋白-1定量检测试剂盒，其组成如下：

(1)96孔酶标板1块，已包被抗人多囊蛋白-1N端单克隆抗体MA7B1；

(2)样品稀释液1瓶，5ml，其为含0.05％吐温-20和1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液；

(3)检测抗体工作液1瓶，10ml，其含抗人多囊蛋白-1N端多克隆抗体PAPC1 1μg/ml；

(4)酶标抗体工作液1瓶，10ml，其含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔1gG；

(5)底物稀释液1瓶，20ml，其含pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和过氧化氢；

(6)终止液1瓶，5ml，为2M H₂SO₄；

(7)洗涤液(20×)1瓶，50ml，其为含1.0％吐温-20的pH7.4磷酸盐缓冲液；

(8)标准品2管，每管含PC-1-e2冻干粉400ng；

(9)邻苯二胺片3片，每片2mg；

(10)坐标纸1张。

2.权利要求1所述的人多囊蛋白-1定量检测试剂盒在检测常染色体显性遗传性多囊肾病中的应用。