CN1477192A - 表达猪细小病毒vp2基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人工构建的伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，PrV)和猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)的主要结构基因VP₂。在缺失了主要毒力基因(TK)和病毒增殖非必需基因(gG)的伪狂犬病毒基因组中，定位***猪细小病毒的VP₂基因，使其位于伪狂犬病毒的强晚期启动子下游，***的外源基因编码的蛋白具有良好的免疫原性，可以刺激猪产生抵抗猪细小病毒和猪伪狂犬病毒两种强毒攻击的保护性免疫反应。本发明还包括重组的伪狂犬病毒Pseudorabies virus，HzauAVL－PRppvV－VP2；保藏在CGMCC，保藏日期：2002年8月16日，保藏编号：CGMCC：0788－2，用其制备的疫苗及其制备方法。

Description

表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法

技术领域

本发明属于病毒学技术领域，具体涉及一种人工构建的伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗株(PrV TK^-/gG^-/VP₂ ⁺)，它的基因组存在两处基因突变，导致TK和gG基因失活，并利用DNA重组方法，在gG启动子下游定位***了一个外源基因，该外源基因是猪细小病毒的主要结构基因VP₂。

本发明还涉及所述的重组基因工程疫苗及其该疫苗的制备方法。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PrV)感染猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物引起的急性传染病，猪是该病毒的贮存者和传播者。(Mettenleiter et al.，Comp Immu Microbiol Infect Dis.1991，14：151-163)除猪以外的其它动物呈散发形式，发病后通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等热型症状，均为致死性感染。该病对猪呈爆发流行，危害主要表现在：(1)母猪流产，产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍综合征，临床以产死胎为主。(2)新生仔猪大量死亡，15日龄以内仔猪死亡率为100％。(3)断奶仔猪发病死亡，表现为拉稀，作划水样或转圈运动，口吐白沫、痉挛和搔痒等症状。(4)引起种猪不育。公猪发生睾丸肿胀、萎缩，失去种用能力。母猪表现为不发情、返情、屡配***等。(5)育肥猪表现为慢性呼吸道症状、增重迟缓、饲料报酬降低、推迟上市的时间，少数病例出现神经症状甚至死亡情况。

PrV一般经鼻咽部感染动物，并在感染局部的粘膜内增殖，然后经淋巴循环或神经纤维移行，一般认为病毒经神经通路到达脑而引起中枢神经功能紊乱，或在嗅球，三叉神经中建立潜伏感染。(Nauwynck等，In proceeding of PRRVS and Aujeszky’sDisease.1999，321-322)较强毒力的毒株还可扩散全身，并表现嗜组织特性，例如生殖道。PrV除了具有强烈的神经嗜性外，潜伏感染性也是其重要特征。Stevens等首次报道了HSV在大鼠中的潜伏感染(Science.1971，2669-2673)，Sabo和Rajcajm报道了PrV在猪的三叉神经节中发生潜伏感染，并检测到在猪的其它组织中也具有这种现象(Acta Virol.1976，20：208-214)。潜伏感染期间，具有感染性的病毒粒子并不存在，但病毒基因组的一部分仍在活跃转录，潜伏感染中发生的转录也有蛋白质的翻译，这种蛋白质调节神经元的存活，进而影响潜伏感染与再激活之间的平衡。Osorio认为组织培养的MDBK(Main-Darby Bovine Kidney)细胞感染PrV后，可以产生典型的细胞凋亡Osorio(Osorio.In proceeding of PRRVS and Aujeszky’s Disease.1999，323)。利用鼻腔接种PrV造成猪的急性感染，在三叉神经节组织中，浸润的淋巴细胞发生典型的细胞凋亡，而神经组织细胞未发生凋亡，表明PrV可在不同类型的细胞中可以诱导或抑制细胞凋亡的发生，在急性感染PrV的动物的神经组织中，细胞的凋亡被抑制，这正是PrV逃避免疫和建立潜伏感染的一种重要机制(Aleman et al.，JVirol.2001，25：469-479)。

伪狂犬病毒的基因组为线状双链DNA，长约150kbp，G+C含量高达74％，整个基因组至少编码70-100个蛋白，其中胸苷激酶(Thymidine Kinase，TK)基因位于UL区，全长963bp，编码320个氨基酸，催化脱氧胸苷磷酸化。TK基因与PrV的毒力有关，是伪狂犬病毒的一个主要毒力基因，与病毒的潜伏感染有关，已有证据表明它对病毒在中枢神经的增殖十分重要(Kit S等，Am J Vet Res.1985，46：1359-1367；Nunberg et al.，JVirol.1989，63：3240-3249)。TK基因是病毒增殖所非必需的，缺失病毒株与野毒一样能正常增殖，而且不存在毒力返强的危险(Yokyama等，Virol.1991，185：55-65)。gG糖蛋白不存在于病毒囊膜上，而是分泌到感染细胞外，编码该蛋白的gG基因也是伪狂犬病毒增殖的非必需基因，缺失后，不影响病毒的增殖，突变病毒株具有很好的免疫原性，接种动物后可产生保护性免疫反应，但是不产生抗gG的抗体，因此可以作为区分免疫动物和野毒感染动物的一个标志，有利于建立无伪狂犬病感染的猪群，并最终为根除该病提供了有用的工具。

众所周知，Mayr和Mahnel于1966年进行猪瘟病毒组织培养时首次发现猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)，开始认为是培养细胞内潜伏感染的病毒，Cartwright(1967)在对猪的繁殖障碍的病因学研究中，从病料中分离出了猪细小病毒，从而首次证实了该病毒的致病作用。猪细小病毒是细小病毒科细小病毒属的成员之一，也是猪繁殖障碍的主要病原之一，在世界范围内广泛流行，其危害主要表现为感染母猪，尤其是初产母猪流产、产死胎、木乃伊胎等，而其它年龄的猪感染后不表现明显的临床症状。在组织培养物中，同时存在空衣壳病毒和完整的病毒粒子。等将空衣壳病毒和完整的PPV病毒粒子按不同比例混合后接种猪睾丸细胞，结果发现，无论是细胞内还是细胞外成熟的病毒粒子数量均降低，同时血凝效价也大大降低，且抑制程度和PPV的空衣壳粒子数量直接相关(Choil et al.，Arch Virol.1987，96：75-87)。此外，用PPV空衣壳病毒粒子以不同的浓度处理细胞，再用完整病毒粒子感染细胞，同样发现病毒的增殖受到严重抑制。

PPV属于自主型细小病毒，基因组为单链线状DNA，共有两个开放阅读框架，一个编码非结构蛋白，另一个编码结构蛋白(VP1、VP2)，其中VP₂是构成病毒粒子的主要衣壳蛋白，约占病毒衣壳蛋白总量的80％，细小病毒的主要抗原决定簇位于VP₂上。血清学试验证实，VP₂可以诱导产生血凝抑制抗体及中和抗体。此外，VP2蛋白还具有独特的生物学活性，其在体外表达后，不仅具有良好的抗原性，而且可以自我装配成病毒样粒子(Virus-Like Patricles VLP)，具有与全病毒相似的特征，例如：其形态呈二十面立体对称结构，直径23nm左右，可以凝集豚鼠红细胞，将其接种动物后可以诱导产生强烈的免疫应答，可以抵抗PPV强毒的攻击，体外表达的VP₂多肽能自我包装成病毒粒子的特性为重组多价亚单位疫苗的研究打下了坚实的基础。分别将PPV VP₂和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸及乙肝病毒HBSAg的抗原决定簇区相连，利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的CTL反应，在体内持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的相应病毒攻击。这些结果说明PPV VP₂不仅是PPV的主要免疫原性蛋白，而且可以作为携带外源抗原决定簇多肽的蛋白质转运载体，为多价重组疫苗的研究创造了良好的条件(Sedlik等，Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：7503-7508；Sedliket等，J Virol.1999，73：2739-2744)。

伪狂犬病和猪细小病毒病，在世界各地造成了巨大的经济损失，严重地危害了养猪业的发展，研究发现疫苗免疫接种是预防和控制这两种疾病的发生、减少经济损失的关键。目前研制成功的有各自的弱毒活疫苗和灭活疫苗，疫苗的广泛使用不仅可以减少发病，而且可使PrV野毒潜伏感染再激活的现象大大降低。其中弱毒活疫苗易于生产，成本低廉，非常适合规模化养猪的需求。以前在研制弱毒活疫苗时常采用的方法是理化因素诱导及在培养细胞上连续大量传代而产生致弱病毒，这些均是不能控制的病毒突变，导致疫苗组成是非同源的混合物，其中含有未知毒力和未知保护力的变异病毒，而且这样致弱的病毒还存在毒力返强的危险。

随着生物技术的飞速发展，对病毒结构及复制水平等方面的深入研究和基因工程技术大量应用于生物制品的研制中，通过对病毒基因组中的特殊区域进行改变，导致病毒致病性的减弱，克服了以前获得弱毒疫苗过程中的缺陷，更加简便快速、具有目的性地获得准确和稳定的弱毒疫苗。

为了适应规模化养猪，降低生产成本，减少免疫接种对猪的应激反应(应激反应：可以导致机体抵抗力下降，生长缓慢，并会诱发多种疾病的发生。)，需要大力研制多价疫苗，达到一针防多种疾病的目的。传统的多价疫苗多为灭活疫苗，将多种灭活的病原或病原成分混合，然后制成多价疫苗。这样研制的多价疫苗为了保证每种病原的抗原量，必然导致接种剂量的提高，不利于临床应用。

关于病毒载体的研究一直集中在痘苗病毒、腺病毒和疱疹病毒(Moss等，Ann RevImmunol.1987，5：305-324；Piccini等  Adv Vieus Res.1988，34：43-64；Berker.Biotech.1988，6：6003-6020；Shih等，Proc Natl Acad Sci USA.1984，81：5867-5870；Van Zijl等，J Virol.1991，65：2761-2765；；Kit等，Vaccine，1991，9：564-572)。由于PrV基因组庞大，具有较多的增殖非必需基因和非编码区，在这些区域缺失或***外源基因不会影响PrV的复制，例如TK、gG基因，并且PrV具有广泛的宿主范围，以PrV为载体研制重组二价或多价疫苗防止动物多种疾病成为可能，确保了本发明的研制成功。

发明内容：

本发明的任务在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的就是提供编码猪细小病毒主要免疫原性基因VP2的DNA序列。

本发明的另一个目的是提供一种人工构建的表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒株(例如：TK-/gG-/VP2+)制备的基因工程二价疫苗，以克服常规多价疫苗的缺点，解决多次免疫接种的弊端。采用本发明的疫苗可以同时防制猪细小病毒病和伪狂犬病毒病。

本发明的另一个目的是提供制备该伪狂犬病毒和猪细小病毒重组基因工程疫苗的方法。本发明通过以下技术方案实现：

一种来源于猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的基因工程疫苗毒株，该毒株是重组的猪伪狂犬病毒：Pseudorabies virus，HzauAVL-PRppvV-VP2；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2002年8月16日，保藏编号：CGMCC：0788-2。

来源于猪细小病毒的编码主要免疫原性蛋白VP₂的DNA序列，该序列如序列表SEQ IDNo：1所示：atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca ggaaatgaat      60ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt gtgtctacag     120gtactttcaa taatcaaaca gaatttcaat acttggggga gggcttggtt agaatcactg     180cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac aaaagaatac     240atgtactaaa ttcagaatca ggggtggcgg gacaaatggt acaagacgat gcacacacac     300aaatggtaac accttggtca ctaatagatg ctaacgcatg gggagtgtgg ttcaatccag     360cggactggca gttaatatcc aacaacatga cagaaataaa cttagttagt tttgaacaag     420caatattcaa tgtagtactt aaaacaatta cagaatcagc aacctcacca ccaaccaaaa     480tatataataa tgatctaact gcaagcttaa tggtcgcact agacaccaat aacacacttc     540catacacacc agcagcacct agaagtgaaa cacttggttt ttatccatgg ttacctacaa     600aaccaactca atacagatat tacctatcat gcatcagaaa cctaaatcca ccaacataca     660ctggacaatc acaacaaata acagactcaa tacaaacagg actacacagt gacattatgt     720tctacacaat agaaaatgca gtaccaattc atcttctaag aacaggagat gaattctcca     780caggaatata tcactttgac acaaaaccac taaaattaac tcactcatgg caaacaaaca     840gatctctagg actgcctcca aaactactaa ctgaacctac cacagaagga gaccaacacc     900caggaacact accagcagct aacacaagaa aaggttatca ccaaacaatt aataatagct     960acacagaagc aacagcaatt aggccagctc aggtaggata taatacacca tacatgaatt    1020ttgaatactc caatggtgga ccatttctaa ctcctatagt accaacagca aacacacaat    1080ataatgatga tgaaccaaat ggtgctataa gatttacaat ggattaccaa catggacact    1140taaccacatc ttcacaagag ctagaaagat acacattcaa tccacaaagt aaatgtggaa    1200gagctccaaa gcaacaattt aatcaacagg caccactaaa cctagaaaat acaaataatg    1260gaacactttt accttcagat ccaataggag ggaaatctaa catgcatttc atgaatacac    1320tcaatacata tggaccatta acagcactaa acaatactgc acctgtattt ccaaatggtc    1380aaatatggga taaagaactt gatacagatc taaaacctag actacatgtt acagctccat    1440ttgtttgtaa aaacaatcca ccaggacaac tatttgtaaa aatagcacca aacctaacag    1500atgatttcaa tgctgactct cctcaacaac ctagaataat aacttattca aacttttggt    1560ggaaaggaac actaacattc acagcaaaaa tgagatccag taatatgtgg aaccctattc    1620aacaacacac aacaacagca gaaaacattg gtaactatat tcctacaaat attggtggca     1680taagaatgtt tccagaatat tcacaactta taccaagaaa attatactag aaataactct     1740gtaaataaaa actcagttac ttggttaatc atgtactact atcattgtat acttcaataa     1800aaataaattg taaaatcaat aaaactaagt tacttagttt ctgtatacct atactag        1857

一种表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒基因工程二价疫苗，它含有前述的重组猪伪狂犬病毒Pseudorabies virus，HzauAVL-PRppvV-VP2；保藏在CGMCC，保藏日期：2002年8月16日，保藏编号：CGMCC：0788-2。

一种制备表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒基因工程二价疫苗的方法，它含有所述的重组猪伪狂犬病毒：Pseudorabies virus，HzauAVL-PRppvV-VP2；保藏在CGMCC，保藏日期：2002年8月16日，保藏编号：CGMCC：0788-2，所述的方法还包括：利用PCR技术扩增得到猪细小病毒的VP2基因，同时在其两端各引入一个BamH I酶切位点，从而将其***到转移载体pUSK中获得pUSK-VP2转移载体，通过脂质体介导的转染，将pUSK-VP2载体与伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组DNA共转染PK-15细胞，待出现细胞病变后收集病毒液，空斑纯化，同时用PCR检测方法鉴定得到的重组病毒。在对获得的重组病毒进行生物学特性的鉴定以后，制备成冻干活疫苗，然后再通过动物试验评价其安全性和免疫原性，最终获得表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒疫苗。

本发明涉及的TK^-/gG^-/LacZ⁺亲本株(即本发明保藏的毒株Pseudorabies virus，HzauAVL-PRppvV-VP2的亲本)来源于猪伪狂犬病毒鄂A株(Pseudorabies virus)，该毒株由华中农业大学动物病毒研究室分离、鉴定(陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998，29(2)，151-156)，它是从爆发伪狂犬病的猪场分离到的一株在细胞培养物上增殖滴度高，免疫原性强的强毒株。TK^-/gG^-/LacZ⁺重组病毒活疫苗的TK基因缺失了205bp，gG基因发生大片段***缺失，毒力大大降低，能在分化细胞中复制，但在未分化的神经细胞中的复制被阻止或限制，接种后即使发生潜伏感染，也不易被激活。本疫苗株不但对育肥猪、仔猪十分安全有效，即使对初生仔猪也十分安全，可产生坚强的保护力，而且可用于仔猪的超前免疫，具有很好的预防和治疗效果。此外，PrV Fa TK^-/gE^-/gI^-/LacZ⁺对绵羊、牛、犬等动物十分安全。

本发明的多价疫苗研究的新方案是将弱毒活疫苗株作为病毒活载体，表达其它病原的保护性免疫原蛋白。当重组活载体病毒接种动物后，其表达的外源蛋白类似于自然感染产生的，会诱导产生体液和细胞免疫应答，可以达到一次接种同时抵抗多种疾病的目的。为了同时防制伪狂犬病毒和猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍等病害，利用基因工程技术将PPV的主要免疫原性基因VP₂，***到伪狂犬病毒TK^-/gG^-/LacZ⁺疫苗株的基因组中，使其位于gG启动子的下游，表达后与gG蛋白起始的少数氨基酸形成融合蛋白。由于***的VP₂基因本身具有终止密码和poly(A)序列，而没有与gG蛋白末端序列融合，所以表达的VP₂蛋白的生物学特性没有改变，同时gG蛋白依然得不到表达。该疫苗可以作为根除伪狂犬病毒和猪细小病毒的标记疫苗(标记疫苗免疫的动物，可以利用相应的鉴别诊断方法，与野毒感染的动物相区分)。参见图1所示。

序列表、附图及其说明：

序列表SEQ ID No：1显示了猪细小病毒VP2基因的DNA序列。

图1：是伪狂犬病毒鄂A株的基因组示意图。

图2：

图3：是表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/VP2+株的Southern-blotting分析结果。

图中：A：Southern-blotting分析；B：在0.3％琼脂糖凝胶上的电泳；1、BamHI酶切TK-/gG-/VP2+株的基因组；2、BamH I酶切TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组；3、DL15000 DNA Marker

图4：重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺株表达猪细小病毒VP₂蛋白的SDS-PAGE、Western-blotting分析结果。

图中：A：TK-/gG-/VP2+株表达VP2蛋白的SDS-PAGE分析；B：TK-/gG-/VP2+株表达VP2蛋白的Western-blotting分析；M：蛋白质Marker；1：感染TK-/gG-/VP2+株的PK-15细胞；2：感染TK-/gG-/LacZ+株的PK-15细胞 3.正常的PK-15细胞

图5：重组伪狂犬病毒粒子放大图。

图中：A：重组伪狂犬病毒粒子的放大图；B：VP2蛋白形成的病毒样颗粒放大图。

图中的实线黑箭头所指为重组伪狂犬病毒粒子；

白色箭头所指为VP2蛋白形成的病毒样颗粒；虚线黑箭头所指为PK-15细胞的核膜。

下面通过实施例和具体的操作步骤进一步描述重组伪狂犬病毒HzauAVL-PRppvV-VP2(本发明在实验中重组伪狂犬毒株的代号为：TK^-/gG^-/VP₂，下同)疫苗的构建及毒株的生物学特性；

具体实施方式：

                            实施例1VP2基因的克隆、测序：

在猪肾传代细胞(IBRS-2)上增殖PPV，采用同步接种方法，即在分散细胞的同时按培养液的1/10接种PPV种毒，在接毒后30～36h停止培养，离心收集感染细胞，然后提取猪细小病毒RF-DNA  (引自Moliter T W，Joo H S，Coliett M S.Virol，1984，137：241-254)。为了获得PPV VP2全基因，根据Bergeron等报道的PPV基因组序列，设计了一对PCR引物寡核苷酸，其序列如下：

    上游引物：5’-TTAGGATCCCAATGAGTGAAAATGTGGAAC-3’

    下游引物：5’-TACAGGATCCGTAAACACATGAGAGCTTG-3’上下游引物中分别包含一个BamH I限制性内切酶位点，而且上游引物中的BamH I位点有利于将VP2基因准确的***到转移载体中，使其位于gG启动子下游形成融合表达盒。PCR反应采用50μL反应体系，其组份如下：

                  10×PCR缓冲液    5μL

                  10μM P₁        2μL

                  10μM P₂        2μL

                  25mM MgCl₂      7μL

                  10mM dNTPs       1μL

                  5U/μL Taq酶     0.5μL

                  RF-DNA模板       5μL

                  灭菌双蒸水       27.5μL按如下程序进行扩增：95℃3min后，再进行95℃1min→58℃1min→72℃2min，30个循环，最后72℃延伸10min终止反应。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳确定后，将得到的VP2基因克隆到pMD-18载体中，采用双脱氧末端终止法测得其序列。参见图1所示。

                             实施例2pUSK-VP2转移载体的构建：

按常规方法构建载体。利用BamH I酶切pUSK载体，待琼脂糖凝胶电泳确定酶切完全后，无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，待乙醇挥发完全加水溶解，用CIAP去磷酸化，1％琼脂糖凝胶电泳后回收。BamH I酶切VP2基因的PCR产物，回收后与经酶切、去磷酸化的pUSK载体混合，在T₄ DNA连接酶作用下连接，然后将连接产物转化DH₅α大肠杆菌，小量制备质粒、酶切鉴定并确定其连入方向，从而获得pUSK-VP2转移载体。如图2所示。

                              实施例3重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺的构建：

在IBRS-2细胞上增殖PrV TK^-/gG^-/LacZ⁺亲本株，提取其基因组DNA由于PrV的基因组DNA中只存在一个EcoR I酶切位点，而且位于gG基因中。用EcoR I将PrVTK^-/gG^-/LacZ⁺的基因组DNA酶切成两段，应用脂质体介导转染技术将其与pUSK-VP₂转移载体共转染IBRS-2细胞，通过发生同源重组将VP2全基因转入到PrV TK、gG双基因缺失株的基因组DNA中，同时置换出了LacZ基因，待产生细胞病变后收毒。将病毒液接种于PK-15细胞，用含1％低熔点琼脂糖的DMEM(例如美国GIBCO公司产品)维持液覆盖，于37℃ 5％CO₂的条件下培养，当刚出现细胞病变时，用0.01％的中性红染色1h，由于病变细胞不能着色，而正常细胞被染成红色，从而出现圆点状空斑，挑取单个空斑接种PK-15细胞扩大培养，利用PPV VP2基因的PCR检测方法鉴定阳性重组病毒，如此进行三次纯化，最后利用LacZ基因的PCR检测方法不能检测到PrV TK^-/gG^-/LacZ⁺株的存在，从而确定病毒液中只含有重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺。

                              实施例4

重组伪狂犬病毒HzauAVL-PRppvV-VP2(TK^-/gG^-/VP₂ ⁺)株的生物学特性及其鉴定：参照(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，第二版.金冬雁，黎孟枫，侯云德等译校，《分子克隆实验指南》，北京，科学出版社，1998)中的方法进行Southern-blotting、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定，并在透射电子显微镜下，观察同一细胞内重组病毒的形态以及外源蛋白VP₂获得表达后自行形成的病毒样颗粒。

Southern-blotting鉴定：提取重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺株的基因组DNA用BamHI酶切后，在0.3％的琼脂糖凝胶上30伏电泳6小时后，按常规方法转移到醋酸纤维素膜上，80℃烤膜后备用。PCR扩增VP₂基因中一段约445bp的DNA片段，DNA回归试剂盒回收后，用地高辛标记与检测试剂盒标记，作为VP₂基因的DNA探针，置于-20℃保存备用。最后按常规方法，将VP₂基因的DNA探针与备用的醋酸纤维素膜杂交，结果如图3所示。试验结果表明，BamH I酶切的TK^-/gG^-/VP₂ ⁺株基因组DNA泳道有明显的杂交带，而BamH I酶切的TK^-/gG^-/LacZ⁺株基因组DNA泳道则没有，证实VP₂基因已***到了亲本株的基因组中。

SDS-PAGE和Western-blotting鉴定：将重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺株接种于刚长成单层的PK-15细胞，16小时后收集病变细胞。按常规方法制备样品、进行SDS-PAGE和Western-blotting，结果如图4所示。经过SDS-PAGE分析，感染TK^-/gG^-/VP₂ ⁺株的PK-15细胞泳道，在约64kD处发现一条特异性带，Western-blotting分析发现其可以与猪细小病毒阳性血清反应，出现一条杂交带，而两个对照泳道中则没有，表明猪细小病毒VP₂蛋白得到了表达。

电镜观察：感染重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺株的PK-15细胞，待出现病变后收集细胞，按常规方法制备超薄冰冻切片，利用H7000透射电子显微镜进行观察并照相(图5)，结果显示，同一个细胞内出现了两种大小差异很大的病毒颗粒。大的病毒颗粒有囊膜，大多分布在胞浆，其形态大小与伪狂犬病毒一致。小的病毒颗粒为空壳，呈二十面立体对称，无囊膜，在细胞核内呈晶格状排列，与杆状病毒表达猪细小病毒VP₂蛋白形成的病毒空壳相似。这些结果，有力地证实重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺株在PK-15细胞中表达了猪细小病毒VP₂蛋白。

重组伪狂犬病毒株HzauAVL-PRppvV-VP2是本发明所构建的以伪狂犬病毒双基因缺失株TK^-/gG^-/LacZ为病毒载体，将猪细小病毒的主要免疫原性基因VP₂***到伪狂犬病毒双基因缺失株TK^-/gG^-/LacZ的基因组中，人工构建得到的二价弱毒疫苗株。其遗传稳定性和生物学特性与亲本毒株鄂A株没有差异。重组病毒有囊膜、核酸为双链DNA，病毒颗粒直径为120-180nm，对***、氯仿及胰蛋白酶敏感，于56℃30min可以完全灭活。在PK-15细胞上的TCID₅₀仍可以达到10^-8.0/mL。将重组病毒连续在PK-15细胞上传30代，其增殖滴度没有明显的变化，可以稳定的表达猪细小病毒VP2蛋白。

该重组病毒需要在猪肾继代细胞(PK-15)上增殖和检测存活情况，PK-15细胞的培养基为含10％犊牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(美国GIBCO公司产品)，pH范围为6.8-7.2，于37℃培养。可采用超低温冻结和/或真空冷冻干燥保藏。

                              实施例5伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗的制备：

将获得的重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/VP₂ ⁺进行鉴定，30次传代后发现其遗传性稳定，外源蛋白可以稳定表达，并具有良好的生物学活性。该疫苗株在猪肾传代细胞上的增殖滴度达到10^8.0TCID₅₀，经过筛选，采用制备简便的鸡胚成纤维细胞增殖疫苗病毒，其增殖滴度达到10^7.0TCID₅₀。将疫苗种毒按1/10的比例接种鸡胚成纤维细胞，细胞病变后收集合格的病毒液，加入明胶保护剂(每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌)，按常规方法冻干制成疫苗。

                              实施例6伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗的安全性：

将30只伪狂犬病血清学阴性的健康Balb/C小白鼠，随机分为三组，其中两组分别接种TK^-/gG^-/VP₂ ⁺疫苗和PrV鄂A株(亲本株)，另一组作为空白对照组，观察14天。接种疫苗的和对照组的小白鼠精神食欲均正常，无异常表现；而接种强毒(PrV鄂A株)的小白鼠，从接种后72小时开始死亡，到144小时全部死亡，表明该基因重组疫苗对小白鼠是安全的(表1)。表1伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗对Balb/C小白鼠的安全性试验组别              动物数(只)          死亡数(只)         平均死亡时间(小时)接种TK^-/gG^-/VP₂ ⁺组   10                  0                       0接种PrV鄂A株组           10                  10                      116.2±45.9空白对照组               10                  0                       0

将TK^-/gG^-/VP₂ ⁺疫苗疫苗接种15日龄的仔猪，部分出现轻度的发热反应，两天后恢复正常，在此期间仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，可以检测到伪狂犬病毒中和抗体及猪细小病毒血凝抑制抗体。PrV鄂A株(强毒株)接种的仔猪，第二天全部呈现发热反应，持续一周，并有一头死亡，剖解发现具有典型的伪狂犬病病理变化，而对照组既没有体温升高，也没有异常临床表现。

TK^-/gG^-/VP₂ ⁺疫苗接种和未接种的妊娠母猪，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎等，证实该疫苗对妊娠母猪是安全的。

                              实施例7伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗的免疫原性测试：

在后备母猪配种前15天接种伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗(TK^-/gG^-/VP₂ ⁺)，然后在妊娠42天、60天分别接种PPV(猪细小病毒)中国株强毒和PrV(伪狂犬病毒)鄂A强毒株，妊娠母猪均未出现明显的临床症状，精神食欲均正常，并可以检测到高水平的血清伪狂犬病毒中和抗体及猪细小病毒血凝抑制抗体，而且没有出现水平传播现象。免疫猪在分娩时未出现死胎、木乃伊胎，所产仔猪均健康存活。接种PPV中国株强毒的对照妊娠母猪，部分出现胎儿重吸收，腹围减小妊娠终止，其余的产下木乃伊胎及少数弱仔。接种PrV鄂A强毒株的对照妊娠母猪，虽然产下了活仔，但是仔猪随后发生腹泻、呕吐和神经症状等，生长不良并伴有死亡。这些结果表明，该伪狂犬病毒和猪细小病毒基因工程二价疫苗(TK^-/gG^-/VP₂ ⁺)，可以保护妊娠母猪同时抵抗PPV中国株强毒和PrV鄂A强毒株的攻击，从而防制这两种疾病。

                      序列表<110>华中农业大学<120>表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法<160>1<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>1857<212>DNA<213>猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)<220><220><221>gene<222>(1)...(1857)<220><221>CDS<222>(1)...(1857)<400>1atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca ggaaatgaat      60ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt gtgtctacag     120gtactttcaa taatcaaaca gaatttcaat acttggggga gggcttggtt agaatcactg     180cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac aaaagaatac     240atgtactaaa ttcagaatca ggggtggcgg gacaaatggt acaagacgat gcacacacac     300aaatggtaac accttggtca ctaatagatg ctaacgcatg gggagtgtgg ttcaatccag     360cggactggca gttaatatcc aacaacatga cagaaataaa cttagttagt tttgaacaag     420caatattcaa tgtagtactt aaaacaatta cagaatcagc aacctcacca ccaaccaaaa     480tatataataa tgatctaact gcaagcttaa tggtcgcact agacaccaat aacacacttc     540catacacacc agcagcacct agaagtgaaa cacttggttt ttatccatgg ttacctacaa     600aaccaactca atacagatat tacctatcat gcatcagaaa cctaaatcca ccaacataca     660ctggacaatc acaacaaata acagactcaa tacaaacagg actacacagt gacattatgt     720tctacacaat agaaaatgca gtaccaattc atcttctaag aacaggagat gaattctcca     780caggaatata tcactttgac acaaaaccac taaaattaac tcactcatgg caaacaaaca     840gatctctagg actgcctcca aaactactaa ctgaacctac cacagaagga gaccaacacc     900caggaacact accagcagct aacacaagaa aaggttatca ccaaacaatt aataatagct     960acacagaagc aacagcaatt aggccagctc aggtaggata taatacacca tacatgaatt    1020ttgaatactc caatggtgga ccatttctaa ctcctatagt accaacagca aacacacaat    1080ataatgatga tgaaccaaat ggtgctataa gatttacaat ggattaccaa catggacact    1140taaccacatc ttcacaagag ctagaaagat acacattcaa tccacaaagt aaatgtggaa    1200gagctccaaa gcaacaattt aatcaacagg caccactaaa cctagaaaat acaaataatg    1260gaacactttt accttcagat ccaataggag ggaaatctaa catgcatttc atgaatacac    1320tcaatacata tggaccatta acagcactaa acaatactgc acctgtattt ccaaatggtc    1380aaatatggga taaagaactt gatacagatc taaaacctag actacatgtt acagctccat    1440ttgtttgtaa aaacaatcca ccaggacaac tatttgtaaa aatagcacca aacctaacag    1500atgatttcaa tgctgactct cctcaacaac ctagaataat aacttattca aacttttggt    1560ggaaaggaac actaacattc acagcaaaaa tgagatccag taatatgtgg aaccctattc    1620aacaacacac aacaacagca gaaaacattg gtaactatat tcctacaaat attggtggca    1680taagaatgtt tccagaatat tcacaactta taccaagaaa attatactag aaataactct    1740gtaaataaaa actcagttac ttggttaatc atgtactact atcattgtat acttcaataa    1800aaataaattg taaaatcaat aaaactaagt tacttagttt ctgtatacct atactag       1857SEQ ID NO.1

Claims (4)

1、一种来源于猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的基因工程疫苗毒株，其特征在于，该毒株是重组猪伪狂犬病毒：Pseudorabies virus，HzauAVL-PRppvV-VP2；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2002年8月16日，保藏编号：CGMCC：0788-2。

2、来源于猪细小病毒的编码主要免疫原性蛋白VP2的DNA序列，该序列如序列表SEQID No：1所示：atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca ggaaatgaat      60ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt gtgtctacag     120gtactttcaa taatcaaaca gaatttcaat acttggggga gggcttggtt agaatcactg     180cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac aaaagaatac     240atgtactaaa ttcagaatca ggggtggcgg gacaaatggt acaagacgat gcacacacac     300aaatggtaac accttggtca ctaatagatg ctaacgcatg gggagtgtgg ttcaatccag     360cggactggca gttaatatcc aacaacatga cagaaataaa cttagttagt tttgaacaag     420caatattcaa tgtagtactt aaaacaatta cagaatcagc aacctcacca ccaaccaaaa     480tatataataa tgatctaact gcaagcttaa tggtcgcact agacaccaat aacacacttc     540catacacacc agcagcacct agaagtgaaa cacttggttt ttatccatgg ttacctacaa     600aaccaactca atacagatat tacctatcat gcatcagaaa cctaaatcca ccaacataca     660ctggacaatc acaacaaata acagactcaa tacaaacagg actacacagt gacattatgt     720tctacacaat agaaaatgca gtaccaattc atcttctaag aacaggagat gaattctcca     780caggaatata tcactttgac acaaaaccac taaaattaac tcactcatgg caaacaaaca     840gatctctagg actgcctcca aaactactaa ctgaacctac cacagaagga gaccaacacc     900caggaacact accagcagct aacacaagaa aaggttatca ccaaacaatt aataatagct     960acacagaagc aacagcaatt aggccagctc aggtaggata taatacacca tacatgaatt    1020ttgaatactc caatggtgga ccatttctaa ctcctatagt accaacagca aacacacaat    1080ataatgatga tgaaccaaat ggtgctataa gatttacaat ggattaccaa catggacact    1140taaccacatc ttcacaagag ctagaaagat acacattcaa tccacaaagt aaatgtggaa    1200gagctccaaa gcaacaattt aatcaacagg caccactaaa cctagaaaat acaaataatg    1260gaacactttt accttcagat ccaataggag ggaaatctaa catgcatttc atgaatacac    1320tcaatacata tggaccatta acagcactaa acaatactgc acctgtattt ccaaatggtc    1380aaatatggga taaagaactt gatacagatc taaaacctag actacatgtt acagctccat    1440ttgtttgtaa aaacaatcca ccaggacaac tatttgtaaa aatagcacca aacctaacag    1500atgatttcaa tgctgactct cctcaacaac ctagaataat aacttattca aacttttggt    1560ggaaaggaac actaacattc acagcaaaaa tgagatccag taatatgtgg aaccctattc    1620aacaacacac aacaacagca gaaaacattg gtaactatat tcctacaaat attggtggca    1680taagaatgtt tccagaatat tcacaactta taccaagaaa attatactag aaataactct    1740gtaaataaaa actcagttac ttggttaatc atgtactact atcattgtat acttcaataa    1800aaataaattg taaaatcaat aaaactaagt tacttagttt ctgtatacct atactag       1857

3、一种表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒基因工程二价疫苗，其特征在于，它含有权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒Pseudorabies virus，HzauAVL-PRppvV-VP2；保藏在CGMCC，保藏日期：2002年8月16日，保藏编号：CGMCC：0788-2。

4、一种制备表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒基因工程二价疫苗的方法，其特征在于，它含有如权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒：Pseudorabies virus，HzauAVL-PRppvV-VP2；保藏在CGMCC，保藏日期：2002年8月16日，保藏编号：CGMCC：0788-2，所述的方法还包括：利用PCR技术扩增得到猪细小病毒的VP2基因，同时在其两端各引入一个BamH I酶切位点，从而将其***到转移载体pUSK中获得pUSK-VP2转移载体，通过脂质体介导的转染，将pUSK-VP2载体与伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组DNA共转染PK-15细胞，待出现细胞病变后收集病毒液，空斑纯化，同时用PCR检测方法鉴定得到的重组病毒。在对获得的重组病毒进行生物学特性的鉴定以后，制备成冻干活疫苗，然后再通过动物试验评价其安全性和免疫原性，最终获得表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒疫苗。

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