CN102994458B

CN102994458B - 猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用

Info

Publication number: CN102994458B
Application number: CN201210486730.8A
Authority: CN
Inventors: 田志军; 彭金美; 安同庆
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2012-11-26
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-11-26
Also published as: CN102994458A

Abstract

本发明公开了一株猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用。本发明分离得到的一株猪伪狂犬病病毒强毒株，命名为HeN1，其微生物保藏编号为CGMCC NO.6656，在该强毒株HeN1基础上缺失gE基因获得了基因缺失疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺，其微生物保藏编号为CGMCC NO.6657。本发明的强毒株可制备成灭活疫苗（单苗或联苗），基因缺失疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺可制备成活疫苗或灭活疫苗（单苗或联苗）等，都可有效预防或治疗猪伪狂犬病，也可将其制备成诊断猪伪狂犬病的诊断试剂。本发明基因缺失疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺具有安全性好、保护效率高、利于鉴别诊断等优点。

Description

猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及一株病毒强毒株以及在其基础上获得的基因缺失疫苗株，尤其涉及一株猪伪狂犬病病毒强毒株HeN1、由该强毒株HeN1缺失gE基因获得的基因缺失疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺，本发明还涉及HeN1和疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺在预防或治疗猪伪狂犬病中的应用，本发明属于生物医药领域。

背景技术

伪狂犬病（Pseudorabies，PR又名Aujeszky's disease，AD)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的多种家畜、野生动物、伴侣动物和实验动物的一种急性传染病。在自然条件下，本病最常见于猪、牛、羊、犬、猫和鼠类。伪狂犬病病毒除对猪以外，对所有易感动物都是致死性病程。对猪主要表现为神经症状、流涎、呼吸困难、繁殖障碍、生长停滞、失重及高死亡率。哺乳仔猪感染伪狂犬病的临床表现最为典型、严重和一致，均出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100%；随着年龄增长死亡率逐渐下降，成猪仅为2%，但一般情况下成猪感染不发病，而呈隐形经过，仅见打喷嚏、咳嗽、体温升高等轻微症状；妊娠母猪感染伪狂犬病毒可引起流产、死胎、产弱仔和木乃伊化胎儿；对公猪可引起***炎。该病具有高度的传染性，一旦在猪群中发现，将很快通过空气和接触经呼吸道传播给其他猪只和猪场，近来的研究表明伪狂犬病病毒还可以通过乳汁和生殖道感染。

在规模化猪场，PR是常规免疫防控对象。利用强弱毒鉴别ELISA进行的血清流行病学调查发现，基因缺失疫苗免疫后仍有一定比例的猪场和猪只存在野毒抗体，并偶有病毒分离的报道。由于造成的经济损失有限，并未引起足够重视。但近一年来，有多个使用常规疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似PR流行的现象，主要表现为母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。将送检的组织进行PCR鉴定和病毒分离，证明猪场确实存在PRV野毒感染。目前本实验室已经从河南、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等省猪场送检的病料中检测到PRV野毒。由于PRV基因组较大，约145kb，我们从各猪场送检样品中通过PCR扩增PRV的gE基因进行了测序，结果表明各猪场流行毒株的这两个基因高度同源，同源性在99%以上，与PRVKaplan株（匈牙利，GenBank登录号JQ809328）同源性最低，为97.5%。

免疫接种是防控PRV的最有效方法。我国于上世纪70年代从匈牙利引进了PRVBartha k61株，该病毒是世界上公认的优良疫苗株，国内规模化猪场大都应用该疫苗，PR也得到了很好的控制。但现在的情况是，PR发病猪场都按照常规程序免疫过该疫苗，是否新流行毒株存在抗原变异导致免疫猪不能有效抵抗该病毒？我们利用血清中和试验和绵羊的免疫接种试验证实，Bartha k61免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离病毒，而且免疫Bartha k61的绵羊也不能完全抵抗新病毒的攻击。因此急需开发新的安全有效的PRV疫苗以应对新流行的毒株。

发明内容

本发明目的之一是提供一株猪伪狂犬病病毒强毒株。

本发明目的之二是提供一株由该猪伪狂犬病病毒强毒株经基因工程方法缺失gE基因并***EGFP标记的弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对于PRV新流行毒株具有良好的保护效力。

本发明目的之三是提供一种预防或治疗猪伪狂犬病的疫苗组合物。

本发明的上述目的分别是通过以下技术方案来实现的：

从我国河南省疑似PRV感染的某猪场采集病猪的脑组织，提取组织基因组DNA，利用PRV gE特异性引物进行PCR鉴定（图1），将阳性脑组织匀浆液进行离心、过滤取滤液冻存待用。Vero细胞在37℃下培养48h形成单层后，每瓶接种1ml滤过的病料悬液上清，吸附1h后，换含2%胎牛血清的DMEM培养液继续在37℃下培养，观察3～4天有无细胞病变产生（图2）。当60～70%细胞出现CPE变化时收毒，将有病变的毒株传2～3代后用PRV gE的特异性引物进行PCR扩增和病毒粒子电镜观察鉴定。试验表明利用PRV gE特异性引物能够扩增到预期大小的片段，将该片段测序后与GenBank上发表的序列进行比较，其同源性在97%以上，其序列结果为SEQ ID NO:2所示。将培养物进行电镜观察，可以观察到病毒粒子呈圆形，有中空和实心两种特征，有的有囊膜有的无囊膜（图3）。根据上述结果证明，该分离毒株为PRV，命名为HeN1株，分类命名伪狂犬病病毒，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6656，保藏日期为2012年10月12日。BALB/c小鼠接种PRV HeN1株后出现了典型的伪狂犬病症状：用嘴啃咬注射部位，导致局部被毛脱落、皮肤出血、严重者后肢被咬断，注射病毒含量在10^3.0-10^6.0TCID₅₀的小鼠在接种后60h内死亡。通过计算PRV HeN1对BALB/c小鼠的LD₅₀为237TCID₅₀。注射DMEM培养液的对照鼠无异常表现。SPF断奶仔猪接种PRV HeN1株后只出现一过性发热反应，体温达到41℃，持续3-5天，此外无其他临床发病症状和剖检变化。

利用微量中和试验和绵羊的免疫攻毒试验证实新分离毒株（PRV HeN1株）与疫苗株Bartha k61之间存在抗原差异。结果发现Bartha k61接种猪产生的中和抗体水平与HeN1接种猪相比普遍较低，其能50%中和自身病毒的血清稀释度均在1:40以内，对新分离病毒HeN1的中和能力更低，50%中和病毒的血清稀释度在1∶10左右。HeN1接种猪在感染后2周就能产生高水平的中和抗体，50%中和病毒的血清稀释度均在1:80以上，而且对两种病毒的中和能力都较高。

通过基因克隆技术以PRV HeN1株的部分gI和Us2基因作为同源臂，以及绿色荧光蛋白基因（EGFP）作为筛选标记构建了转移载体质粒pUCUsAB-EGFP，将PRVHeN1基因组和转移载体共转染Vero细胞，经过4轮噬斑纯化和鉴定证实获得了缺失gE基因同时***EGFP标记的重组伪狂犬病病毒rPRV-gE^--EGFP⁺。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病病毒rPRV-gE^--EGFP⁺的生长特性进行研究，结果发现重组病毒rPRV-gE^--EGFP⁺在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒HeN1株相比没有明显差别，说明缺失和***没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rPRV-gE^--EGFP⁺在Vero细胞上盲传12代，绿色荧光蛋白仍能够稳定表达，通过PCR鉴定可以检测到***的外源片段和***位点两侧的病毒基因序列，表明所获得的重组病毒rPRV-gE^--EGFP⁺能够稳定遗传。

因此本发明还提出了一株猪伪狂犬病病毒疫苗株，其特征在于所述的疫苗株是在所述的猪伪狂犬病病毒强毒株的基础上，通过基因工程方法缺失gE基因并***EGFP标记得到的。

在本发明的一个具体实施例中，***序列及其侧翼核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

在本发明的一个具体实施例中，所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株，命名为rPRV-gE^--EGFP⁺，分类命名伪狂犬病病毒，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6657，保藏日期为2012年10月12日。。

通过对PRV HeN1株以及rPRV-gE--EGFP⁺的免疫效力进行评价发现，HeN1接种猪相比Bartha k61接种猪产生的中和抗体水平高；rPRV-gE^--EGFP⁺免疫后对双城株和HeN1株都具有良好的保护效果，而Bartha k61免疫羊不能完全抵抗新分离毒株HeN1株的攻击，因此rPRV-gE^--EGFP⁺可以作为疫苗候选株以应对新出现的疫情。

因此，再进一步的，本发明还提出了一种治疗或预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于：由所述的猪伪狂犬病病毒强毒株灭活后的产物或猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。

更进一步的，本发明还提出了所述的猪伪狂犬病病毒强毒株在制备预防或治疗猪伪狂犬病药物中的用途。及

所述的猪伪狂犬病病毒强毒株在制备诊断或检测猪伪狂犬病药物中的用途。及所述的基因缺失疫苗株在制备预防或治疗猪伪狂犬病药物中的用途。及

所述的基因缺失疫苗株在制备诊断或检测猪伪狂犬病药物中的用途。

本发明的强毒株可制备成灭活疫苗（单苗或联苗），基因缺失疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺可制备成活疫苗或灭活疫苗（单苗或联苗）等，都可有效预防或治疗猪伪狂犬病，也可将其制备成诊断猪伪狂犬病的诊断试剂。本发明基因缺失疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺具有安全性好、保护效率高、利于鉴别诊断等优点。

附图说明

图1某猪场送检脑组织样品的PCR鉴定；

1:阴性对照,2-8:送检样品9:阳性对照,10:DNA marker

图2脑组织匀浆液感染Vero细胞产生的细胞病变；

A：正常Vero细胞；B:受感染的Vero细胞

图3病毒粒子的电镜观察；

图4两株病毒诱导中和抗体水平比较；

A:注射PRV Bartha k61株的猪血清.

B:注射PRV HeN1株的猪血清.

图5rPRV-gE^--EGFP⁺的重组位点示意图；

图6pUCUsAB-EGFP的酶切鉴定。

M:DL15000；1.BamH I酶切质粒pUCUsAB-EGFP

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内

实施例1猪伪狂犬病病毒强毒株（PRV HeN1株）的分离鉴定

实施例2PRV HeN1株与疫苗株Bartha k61之间存在抗原差异

1）利用微量中和试验和绵羊的免疫攻毒试验证实新分离毒株（PRV HeN1株）与疫苗株Bartha k61之间存在抗原差异。中和试验操作方法：12头40日龄的SPF猪，其中5头肌注1mL含10^7.0TCID₅₀的灭活的PRV HeN1株，5头肌注1mL含10^7.0TCID₅₀的Bartha k61株，另2头注射DMEM培养液作为对照，于接种前及接种后每周采血分离血清，在接种后5周剖杀。采用固定病毒稀释血清法测定疫苗Bartha k61接种猪血清和HeN1接种猪血清对两株病毒（Bartha k61和HeN1）的中和效价。病毒量为100TCID₅₀/孔，血清为Bartha k61和HeN1分别接种SPF猪后在不同时间点采集，56℃灭活30min备用。结果发现Bartha k61接种猪产生的中和抗体水平与HeN1接种猪相比普遍较低，其能50%中和自身病毒的血清稀释度均在1:40以内，对新分离病毒HeN1的中和能力更低，50%中和病毒的血清稀释度在1∶10左右（图4A）。HeN1接种猪在感染后2周就能产生高水平的中和抗体，50%中和病毒的血清稀释度均在1:80以上，而且对两种病毒的中和能力都较高（图4B）。

2）绵羊的免疫保护试验：6-8月龄绵羊14只，PRV中和抗体检测为阴性。随机分为四组，A、C组（每组4只)每只肌肉注射0.2头份（每头份病毒含量为10^5.0TCID₅₀）的PRV Bartha k61疫苗，B、D组（每组3只）作为攻毒对照。免疫后14天，A、B组每只羊肌肉注射1mL含1000LD₅₀的PRV HeN1株，C、D组每只羊肌肉注射1mL含1000LD₅₀的PRV双城株（PRV-S）。攻毒前采血检测。A、C组共8只绵羊在用PRV Bartha k61疫苗免疫后14天采集血清，利用IDEXX试剂盒检测抗PRV gB抗体（gB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），A组有3只抗体阳性，C组有4只抗体阳性。攻毒后9天内，对照羊全部发病并死亡，HeN1攻毒组2只发病死亡（表1）。发病羊表现为瘙痒、角弓反张等神经症状。

表1Bartha k61疫苗免疫羊对不同毒株的攻毒保护效果

组别

绵羊数

疫苗株

攻击用毒株

攻毒前抗体阳性数

发病数

死亡数

保护数

A

4

Bartha k61

HeN1

4/4

2/4

B

3

HeN1

3/3

0/3

C

4

Bartha k61

S

3/4

0/4

4/4

D

3

S

3/3

0/3

实施例3基因缺失疫苗株rPRV-gE^--EGFP⁺的构建

通过基因克隆技术以PRV HeN1株的部分gI和Us2基因作为同源臂，以及绿色荧光蛋白基因（EGFP）作为筛选标记构建了转移载体质粒pUCUsAB-EGFP（重组位点如图5所示，转移载体酶切鉴定如图6），将PRV HeN1基因组和转移载体共转染Vero细胞，按照磷酸钙转染试剂盒的说明书进行，预先在60mm皿中培养Vero细胞使之形成单层，在转染前3h更换新鲜的培养液，将4μg病毒基因组DNA和10μg转移载体pUCUsAB-EGFP混匀，再加入2M CaCl₂，使其终浓度为0.24M，混和均匀，将此DNA-CaCl₂混和物再加入到含有等体积的2XHBS的新管中，混匀后室温作用20min，加入到Vero细胞培养皿中，将转染后的Vero细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，转染后12h用15％的DMSO对转染的细胞进行休克，待有绿色荧光的噬斑出现时，铺上1％的低熔点琼脂糖，并挑取单个噬斑于-80℃冻融一次后，以10倍倍比稀释接种到预先培养成单层的Vero细胞六孔板中，继续挑取带绿色荧光的噬斑重复进行纯化。经过4轮噬斑纯化和鉴定证实获得了缺失gE基因同时***EGFP标记的重组伪狂犬病毒rPRV-gE^--EGFP⁺。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rPRV-gE^--EGFP⁺的生长特性进行研究，结果发现重组病毒rPRV-gE^--EGFP⁺在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒HeN1株相比没有明显差别，说明缺失和***没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rPRV-gE^--EGFP⁺在Vero细胞上盲传12代，绿色荧光蛋白仍能够稳定表达，通过PCR鉴定可以检测到***的外源片段和***位点两侧的病毒基因序列，表明所获得的重组病毒rPRV-gE^--EGFP⁺能够稳定遗传，该毒株（rPRV-gE^--EGFP⁺）已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6657，保藏日期为2012年10月12日。

实施例4rPRV-gE^--EGFP⁺的免疫效力评价

6-8月龄绵羊22只，PRV中和抗体检测为阴性。随机分为六组，A、B组（每组4只）每只肌肉注射0.2头份（每头份病毒含量为10^5.0TCID₅₀）的PRV Bartha k61疫苗，C、D组（每组4只）每只肌肉注射0.2头份（每头份病毒含量10^5.0TCID₅₀）的rPRV-gE^--EGFP⁺，E、F组（每组3只）作为攻毒对照。免疫后14天，A、C、E组每只羊肌肉注射1mL含1000LD₅₀的PRV HeN1株，B、D、F组每只羊肌肉注射1mL含1000LD₅₀的PRV双城株（PRV-S）。攻毒前采血检测。A、B、C、D组共16只绵羊在用PRV Bartha k61疫苗和rPRV-gE^--EGFP⁺免疫后14天采集血清，利用IDEXX试剂盒检测抗PRV gB抗体，所有羊抗体均为阳性。攻毒后7天内，对照羊全部发病并死亡，发病羊表现为瘙痒、角弓反张等神经症状。其他组发病和死亡情况见表2，从攻毒结果可以看出，Bartha k61免疫羊不能完全抵抗新分离毒株HeN1株的攻击，而rPRV-gE^--EGFP⁺免疫后对双城株和HeN1株都具有良好的保护效果，因此rPRV-gE^--EGFP⁺可以作为疫苗候选株以应对新出现的疫情。

表2rPRV-gE^--EGFP⁺免疫羊对不同毒株的攻毒保护效果

Claims

1.一株猪伪狂犬病病毒（Porcine Pseudorabies Virus，PRV）强毒株，命名为HeN1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6656。

2.一株猪伪狂犬病病毒疫苗株，其特征在于所述的疫苗株是在权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒强毒株的基础上，通过基因工程方法缺失gE基因并***EGFP标记得到的。

3.如权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株，其特征在于***序列及其侧翼核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求2或3所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株，其特征在于所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株，命名为rPRV-gE^--EGFP⁺，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6657。

5.一种治疗或预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于：由权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒强毒株灭活后的产物和药学上可接受的佐剂组成。

6.一种治疗或预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于：由权利要求2-4任一项所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。

7.权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒强毒株在制备预防或治疗猪伪狂犬病药物中的用途。

8.权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒强毒株在制备诊断或检测猪伪狂犬病药物中的用途。

9.权利要求2-4任一项所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株在制备预防或治疗猪伪狂犬病药物中的用途。

10.权利要求2-4任一项所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株在制备诊断或检测猪伪狂犬病药物中的用途。