CN109609468B - 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法 - Google Patents

一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109609468B
CN109609468B CN201811508839.0A CN201811508839A CN109609468B CN 109609468 B CN109609468 B CN 109609468B CN 201811508839 A CN201811508839 A CN 201811508839A CN 109609468 B CN109609468 B CN 109609468B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
porcine pseudorabies
gene
vaccine
prv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811508839.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109609468A (zh
Inventor
周远成
林艳
代洪波
王雪涛
廖果
邝声耀
阴文奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Livestock Bioengineering Co ltd
Original Assignee
Livestock Bioengineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Livestock Bioengineering Co ltd filed Critical Livestock Bioengineering Co ltd
Priority to CN201811508839.0A priority Critical patent/CN109609468B/zh
Publication of CN109609468A publication Critical patent/CN109609468A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109609468B publication Critical patent/CN109609468B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16721—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法，涉及动物生物制品领域。本发明提供六基因缺失的猪伪狂犬病毒的保藏编号为CGMCC No：16290。该六基因缺失的猪伪狂犬病毒缺失六个基因，致病性被去除，其免疫原性被有效保留，使用该猪伪狂犬病毒制备的疫苗，可诱导机体产生更高级剂量的干扰素，在紧急免疫接种方面具有更好的免疫效果。

Description

一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备 方法
技术领域
本发明涉及猪伪狂犬病疫苗领域，具体而言，涉及一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称奥耶斯基氏病(Aujeszky's disease,AD)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)所引起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。猪是该病的天然宿主、主要储存宿主和传染源，无论是新生仔猪、育肥猪，还是成年种猪，都受到PR的威胁。其表现症状为：2周龄内仔猪感染后死亡率很高，可达100％，可出现腹泻、呕吐、共济失调、角弓反张、四肢泳动等神经症状，最后麻痹、衰竭死亡；断奶仔猪也能引起死亡，但主要表现为呼吸***症状，也有部分猪出现神经症状、腹泻、呕吐等，耐过的仔猪往往发育不良，成为僵猪；育肥猪感染后则大多数伴有体温升高，呼吸困难，偶有神经症状，一般不发生死亡；成年猪感染后不发病或仅表现为体温升高等轻微症状，呈隐形感染，耐过后主要表现生长发育迟缓，饲料报酬降低等，并可长期带毒或排毒，成为最危险的传染源；妊娠母猪感染后会导致流产、产死胎、木乃伊胎等；该病还可引起种猪不育、公猪睾丸肿胀、母猪返情、屡配***等。
伪狂犬病毒只有一个血清型，但不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异。疫苗接种是有效防制猪伪狂犬病最经济、有效的方法。但现有的猪伪狂犬病疫苗的免疫效果并不理想。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒，该猪伪狂犬病毒是经人工改造后得到的，其缺失六个基因，致病性被去除，其免疫原性被有效保留，使用该猪伪狂犬病毒制备的疫苗，可诱导机体产生更高级剂量的干扰素，在紧急免疫接种方面具有更好的免疫效果。
本发明的另一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒的应用。
本发明的另一目的在于提供一种猪伪狂犬病疫苗，该疫苗由上述六基因缺失的猪伪狂犬病毒制成，其具有较好的免疫效果。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述猪伪狂犬病疫苗的方法。通过该方法制得的猪伪狂犬病疫苗，具有较好的免疫效果。
本发明是这样实现的：
2011年前后在全国范围了出现了新的猪伪狂犬病疫情，主要表现为突发性大面积种猪流产，育肥猪致死性感染，猪群gE抗体阳性率突然升高，部分猪场gE抗体阳性率高达100％。疫情爆发的不同地区，免疫状况不同而呈现出不同的临床表现。免疫状况较好的猪场，大多无明显临床症状，但猪群gE阳性率突然升高；免疫状况较差的猪场，主要表现为种猪的大面积流产、仔猪腹泻、育肥猪呼吸道症状与急性死亡。新疫情爆发以后全国多个实验室分离到新的猪伪狂犬病毒流行毒株，经过致病力实验、免疫保护实验和分子流行病学等研究，一致认为新流行的猪伪狂犬毒株在主要毒力基因gE、gI基因，以及与免疫保护相关的基因gB、gC、gD上存在多个位点的变异。我国不同地区分离的新流行毒株，与目前广泛使用的猪伪狂犬病活疫苗Bartha K61毒株位于不同的基因亚型，动物试验与中和抗体检测均证实，Bartha K61毒株对我国当前流行的猪伪狂犬病毒保护效果较弱，本发明使用新分离的变异毒株构建了TK、gE、gI、11K、28K和gG等6个基因缺失的伪狂犬病活疫苗，与市场上使用的TK/gE/gI、gE/gI基因确实疫苗相比较，该疫苗能够诱导机体产生更高级剂量的干扰素，在紧急免疫接种方面具有更好的效果。使用流行毒株构建的基因缺失疫苗能够为仔猪提供100％免疫保护。
基于此，一方面，本发明提供了一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒，该猪伪狂犬病毒缺失如下基因：TK、gE、gI、11K、28K和gG。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，其保藏编号为CGMCC No：16290。
本发明提供的猪伪狂犬病毒是在伪狂犬病毒PRV-FJ株的基础上缺失了TK、gE、gI、11K、28K和gG六个基因，经过基因编辑后得到本发明六基因缺失的猪伪狂犬病毒。
该毒株于2018年08月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名：猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；保藏编号：CGMCC NO.16290。
将上述6基因缺失猪伪狂犬病毒按照108TCID50/只的剂量肌肉注射小鼠和家兔均不引起动物发病和死亡。使用5×108TCID50病毒液滴鼻和肌肉注射1日龄仔猪，不引起1日龄仔猪发病，该六基因缺失猪伪狂犬病毒毒株不具有致病性。此外，采用该六基因缺失猪伪狂犬病毒毒株制成的疫苗，经免疫原性试验验证，使用由疫苗后，可诱导机体产生更高级剂量的干扰素，gE抗体检测结果为阴性，gB抗体呈阳性，中和抗体值得到提高。
另一方面，本发明提供了上述六基因缺失的猪伪狂犬病毒在制备伪狂犬病疫苗中的应用。
再一方面，本发明提供了一种猪伪狂犬病疫苗，其包括如上所述的六基因缺失的伪狂犬病毒以及稳定剂。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述稳定剂包括：低聚糖、氨基酸、明胶和蛋白酶解物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述低聚糖为蔗糖和海藻糖的组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，氨基酸为谷氨酸钠。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，蛋白酶解物为水解乳蛋白。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，按质量体积比计，所述稳定剂含有：5％-10％蔗糖(即100ml稳定剂中含有5-10g的蔗糖，后文同此)、1％-5％海藻糖、1％-5％谷氨酸钠以及2％-10％水解乳蛋白，0.5％-1％的明胶，余量为水。
另一方面，本发明提供了一种如上所述的猪伪狂犬病疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
步骤(a)：将上述的六基因缺失的猪伪狂犬病毒接种适宜细胞，收获病毒液；
步骤(b)：将收获的病毒液与稳定剂混合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述制备方法还包括步骤(c)：将病毒液与稳定剂的混合溶液经真空冷冻干燥制成成品的猪伪狂犬病疫苗。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述稳定剂包括：低聚糖、氨基酸、明胶和蛋白酶解物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述低聚糖为蔗糖和海藻糖的组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，氨基酸为谷氨酸钠。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，蛋白酶解物为水解乳蛋白。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，按质量百分比计，所述稳定剂含有：5％-10％蔗糖、1％-5％海藻糖、1％-5％谷氨酸钠以及2％-10％水解乳蛋白，0.5％～1％的明胶，余量为水。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(a)中，所述病毒液与稳定剂按照1：1-1：10的比例混合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述适宜细胞为BHK21细胞、ST细胞、293T细胞、PK15细胞、Vero细胞或MDBK细胞，优选为BHK21细胞。
采用本发发明提供的备方法，可以制得猪伪狂犬病疫苗，该疫苗含有上述的六基因缺失的猪伪狂犬病毒，其致病性被去除，其免疫原性被有效保留，使用该疫苗具有较好的免疫效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为免疫后猪α干扰素检测结果。
图2为免疫后28日gB/gE和中和抗体检测结果，注：gB/gE抗体检测，S/N值小于0.6为阳性，大于0.7为阴性，0.6至0.7为可疑。
图3为攻毒保护试验体温曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
人工改造伪狂犬病毒
1、毒株
PRV-FJ株，由畜禽传染病四川省重点实验室从2015年福建猪伪狂犬发病猪病料中分离获得；发病猪主要表现为体温升高，食欲不佳，打喷嚏等症状。PRV-FJ株以107TCID50/头的剂量感染28日龄断奶仔猪，无神经症状，攻毒后7天全部死亡。
ST细胞与293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养(Gibco公司)。
2、重组载体构建
人工合成SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，然后将SEQ ID NO.1定向克隆到pEGFP-C1载体的Ase1酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI，将SEQ ID NO.2定向克到pEGFP-gI的Mlu1酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI28K。将SEQ ID NO.3定向克隆到pUC57载体的EcoR1和HindIII酶切位点之间，将其命名为pUC-TK。
3、基因编辑载体构建
使用表1引物按照LentiCRISPR v2载体(Addgene公司)说明书方法构建TK、gE、gG基因编辑的载体，分别命名为载体psgRNA-TK、psgRNA-gE、psgRNA-gGA和psgRNA-gGB。
gRNA只是将病毒核酸切割开，TK对应的gRNA将TK切割开以后与pUC-TK发生重组，从而缺失TK基因部分序列，gE gRNA切割开病毒基因组以后与pEGFP-gI28K发生重组，从而缺失gI、gE、11K、28K基因。psgRNA-gGA和psgRNA-gGB两个联合起来切割掉gG的一个片段从而缺失gG基因。
伪狂犬病毒中TK和gG单独在某个位置，而gI、gE、11K和28K四个基因相邻，因此使用一个gRNA和相应的同源序列可以同时缺失4个基因。
表1 gRNA构建引物信息
Figure BDA0001899351310000071
4、重组病毒构建
按照常规方法提取PRV-FJ株基因组DNA；将PRV-FJ基因组DNA(3μg)、pUC-TK质粒(5μg)和psgRNA-TK质粒(5μg)混合后参照Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长状态良好的293T细胞，转染后37℃培养至出现细胞病变。取病毒上清接种BHK21细胞，挑选单个病毒嗜斑。取挑选的病毒嗜斑接种BHK21细胞，收获病毒液，按照常规方法提取病毒DNA，使用引物TKF：CATCCTCCGGATCTACCTCGACGGC和TKR：CACACCCCCATCTCCGACGTGAAGG参照Lyophilized HS Taq PCR Master Mix(TAKARA)试剂盒说明书进行PCR扩增，选择扩增片段约为680bp的样品进行序列测定。将序列测定后纯化病毒rPRV-FJ-delTK。
按照常规方法提取rPRV-FJ-delTK基因组，取提取的基因组DNA(3μg)、pEGFP-gI28K质粒(5μg)和psgRNA-gE参照Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长状态良好的293T细胞，转染后37℃培养至出现细胞病变。取病毒上清接种ST细胞，挑取绿色荧光嗜斑，进行三轮嗜斑纯化，将纯化病毒命名为rPRV-FJ-del5gene-EGFP。
将pCDNA3.1-CRE载体参照Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长良好的293T细胞，转染后24小时接种rPRV-FJ-del5gene-EGFP病毒，出现细胞病变后取细胞上清接种ST细胞，挑取无荧光嗜斑，进行三轮嗜斑纯化，将纯化病毒命名为rPRV-TIE18株。
取质粒psgRNA-gGA(2μg)和psgRNA-gGB(2μg)转染生长良好的293T细胞，转染后37℃培养，24小时接种rPRV-TIE18株，继续37℃培养至出现细胞病变。收集病毒液上清进行嗜斑克隆，挑选单嗜斑接种BHK21细胞，收获病毒上清。按照常规方法提取病毒DNA，然后使用gGup：GCACCTGATCGACCTCATCC和gG-Down：AAGATGGACACCCGGTGAGA参照Lyophilized HS TaqPCR Master Mix(TAKARA)试剂盒说明书进行PCR扩增，选择扩增片段低于1860bp的样品进行序列测定。将序列测定后缺失了SEQ ID NO.4的病毒样品命名为PRV-TIE18G。
5、重组病毒的保存
将鉴定后的PRV-TIE18G病毒按照常规方法接种BHK21细胞，培养至出现CPE后收获病毒上清，分装后-80℃保存，记为F0代。该毒株于2018年08月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名：猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；保藏编号：CGMCC NO.16290。
实施例2
PRV-TIE18G细胞适应性与纯净性检验
取保存的PRV-TIE18G病毒，常规方法接种BHK21细胞，培养至出现CPE后收获病毒上清。将PRV-TIE18G病毒连续传代至F5。以BHK21细胞进行病毒TCID50测定。按照《中国兽药典》(2015版)附录记载的方法对不同代次病毒进行无菌、支原体、外源病毒检验。
表2 PRV-TIE18G细胞适应性与纯净性检验
病毒代次 F0 F1 F2 F3 F4 F5
病毒含量(TCID<sub>50</sub>/ml) 10<sup>7.6</sup> 10<sup>8.25</sup> 10<sup>8.0</sup> 10<sup>8.4</sup> 10<sup>8.4</sup> 10<sup>8.16</sup>
无菌检验 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
支原体检验 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
外源病毒检验 无污染 无污染 无污染 无污染 无污染 无污染
PRV-TIE18G病毒F0代病毒含量为107.6TCID50/ml；连续传代至F5代，F1代至F5代的病毒含量均在108.0TCID50/ml以上。无菌检验、支原体检验结果均为阴性，外源病毒检验结果显示均无外源病毒污染。
实施例3
PRV-TIE18G的致病性试验
1～3日龄PRV抗体阴性仔猪35头，随机分为6组分别标记为A、B、C、D、E、F、G组，选用PRV-TIE18G病毒F1代，按照下表(表3)进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日。
表3 PRV-TIE18G和PRV-FJ对初生仔猪的致病性试验
组别 攻毒毒株 毒种代次 攻毒剂量 攻毒方式 备注
A PRV-TIE18G F1 10<sup>8</sup>TICD<sub>50</sub> 滴鼻接种
B PRV-TIE18G F1 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub> 滴鼻接种
C PRV-TIE18G F1 10<sup>8</sup>TICD<sub>50</sub> 肌肉注射
D PRV-TIE18G F1 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub> 肌肉注射
E DMEM培养液 \ 2.0ml 滴鼻+肌肉注射 空白对照
F PRV-FJ F6 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub> 滴鼻
G PRV-FJ F6 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub> 肌肉注射
攻毒后每日观察并测定仔猪体温，观察是否出现伪狂犬病临床症状和死亡。结果如下表3。结果显示PRV-TIE18G滴鼻和肌肉注射攻毒组均未出现体温升高和其他临床症状，而滴鼻和肌肉注射攻毒PRV-FJ的仔猪在攻毒后第二天有仔猪出现体温升高(见图3)、打喷嚏等症状，攻毒后第3天仔猪死亡，在攻毒后第4天全部死亡。空白对照组未出现任何临床症状，试验整个过程中均正常。
表4 PRV-TIE18G和PRV-FJ对初生仔猪的致病性试验结果统计
组别 发热 呼吸道症状 神经症状 死亡数量
A 0/5 0/5 0/5 0/5
B 0/5 0/5 0/5 0/5
C 0/5 0/5 0/5 0/5
D 0/5 0/5 0/5 0/5
E 0/5 0/5 0/5 0/5
F 5/5 5/5 0/5 5/5
G 5/5 4/5 0/5 5/5
实施例4
猪伪狂犬病活疫苗PRV-TIE18G的制备方法如下：
常规传代BHK21细胞，按照《中国兽药典》2015版本记载方法对传代BHK21细胞进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验和外源病毒检验。
使用检验合格的BHK21细胞按照常规方法扩大培养至15L转瓶，待细胞长满单层后将培养基吸出，按照0.5％的比例接种PRV-TIE18G种毒，37℃吸附30分钟，然后每个转瓶添加1000ml DMEM无血清培养液。
37℃继续培养，每隔12小时观察一次。观察到细胞病变达到90％以上时，收获转瓶内病毒液。使用10um滤芯进行过滤出去细胞碎片后2～8℃保存。按照《中国兽药典》2015版记载的方法测定病毒液的TCID50。
按照蔗糖5％、海藻糖2％、水解乳蛋白6％、谷氨酸钠3％、明胶0.85％的比例配制冻干保护剂。115℃高压灭菌30分钟后室温保存备用。将冻干保护剂和病毒液按照1：1的比例混合后定量分装至10ml西林瓶，加盖后置于冻干机内，经预冷、干燥过程冻干疫苗。冻干压盖并置于2～8℃保存。
取冻干后的疫苗按照《中国兽药典》2015版进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和病毒含量测定。
实施例5
猪伪狂犬病活疫苗PRV-TIE18G的免疫原性
选用3-4周龄猪伪狂犬病毒抗原抗体阴性仔猪20头，随机分为A、B、C、D四组，每组5头。按下表(表5)进行肌肉注射免疫接种，免疫后1-7日，每日采血进行猪α干扰素检测；免疫后28日采血分离血清进行PRV gB(IDEXX)、gE(IDEXX)、中和抗体(PRV-FJ中和)检测；免后28日采血后，每头试验猪滴鼻接种PRV-FJ(107TICD50/头)进行攻毒保护试验。
表5 PRV-TIE18G免疫原性试验分组
组别 毒株 代次 免疫剂量 攻毒毒株 攻毒剂量
A PRV-TIE18G F1 10<sup>5.0</sup>TICD<sub>50</sub> PRV-FJ 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub>
B PRV-TIE18G F5 10<sup>5.0</sup>TICD<sub>50</sub> PRV-FJ 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub>
C Bartha-K61 \ 10<sup>5.5</sup>TICD<sub>50</sub> PRV-FJ 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub>
D DMEM \ 2.0ml PRV-FJ 10<sup>7</sup>TICD<sub>50</sub>
2个PRV-TIE18G免疫组，免后第2天至第6天在血液中检测到猪α干扰素；Bartha-K61与对照组接种前至接种后第7天，均未在血液中检测到猪α干扰素(图1)。免后28日，2个PRV-TIE18G免疫组与Bartha-K61免疫组的gB抗体均5/5阳性；gE抗体均5/5阴性；对照组gB、gE均5/5阴性。2个PRV-TIE18G免疫组的对PRV-FJ的中和抗体水平比Bartha-K61免疫组更高，对照组无中和抗体(图2)。
免疫后28日进行攻毒保护试验，2个PRV-TIE18G免疫组均未出现发热症状，精神、食欲正常，连续观察14日全部存活；Bartha-K61免疫组1/5出现发热与食欲减退，连续观察14日存活4头，死亡1头；对照组全部出现发热症状，均出现精神不振、食欲减退，观察14日死亡3头。
表6 PRV-TIE18G免疫原性试验攻毒保护试验结果统计
组别 发热 精神食欲不振 神经症状 死亡数量 结果
A 0/5 0/5 0/5 0/5 5/5保护
B 0/5 0/5 0/5 0/5 5/5保护
C 1/5 1/5 0/5 1/5 4/5保护，1/5死亡
D 5/5 5/5 0/5 5/5 5/5发病，5/5死亡
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川华神兽用生物制品有限公司
<120> 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1151
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcgtgaaca tcctcaccga cttcatggtg gcgctccccg aggggcaaga gtgcccgttc 60
gcccgcgtgg accagcaccg cacgtacaag ttcggcgcgt gctggagcga cgacagcttc 120
aagcggggcg tggacgtgat gcgattcctg acgccgttct accagcagcc cccgcaccgg 180
gaggtggtga actactggta ccgcaagaac ggccggacgc tcccgcgggc ctacgccgcc 240
gccacgccgt acgccatcga ccccgcgcgg ccctcggcgg gctcgccgag gcccaggccc 300
cggccccggc ccaggccccg gccgaagccc gagcccgccc cggcgacgcc cgcgcccccc 360
ggccgcctgc ccgagccggc gacgcgggac cacgccgccg gggggcgccc cacgccgcga 420
cccccgaggc ccgagacgcc gcaccgcccc ttcgccccgc cggccgtcgt gcccagcggg 480
tggccgcagc ccgcggagcc gttcccgccc cggaccaccg ccgcgccggg cgtctcgcgc 540
caccgctcgg tgatcgtcgg cacgggcacc gcgatgggcg cgctcctggt gggcgtgtgc 600
gtctacatct tcttccgcct gaggggggcg aaggggtatc gcctcctggg cggtcccgcg 660
gacgccgacg agctaaaagc gcagcccggt ccgtagcctc cgcagtaccg gcgtcgatga 720
tgatggtggc gcgcgacgtg acccggctcc ccgcggggct cctcctcgcc gccctgaccc 780
tggccgccct gaccccgcgc gtcgggggcg tcctcttcag gggcgccggc gtcagcgtgc 840
acgtcgccgg cagcgccgtc ctcgtgcccg gcgacgcgcc caacctgacg atagacggga 900
cgctgctgtt tctggagggg ccctcgccga gcaactacag cgggcgcgtg gagctgctgc 960
gcctcgaccc caagcgcgcc tgctacacgc gcgagtacgc cgccgagtac gacctctgcc 1020
cccgcgtgca ccacgaagcc ttccgcggct gcctgcgcaa gcgcgagccg ctcgcccggc 1080
gcgcgtccgc cgcggtggag gcgcgccggc tattaatata acttcgtata gcatacatta 1140
tacgaagtta t 1151
<210> 2
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atctcccccg gctcgctggc cctgctgccg cgcgccgtgc gccccgtcgt gcggacgcgg 60
tccgacccca cggcgccgtt ctacatcacc accgagacgc acgagctgac gcggcgcccc 120
ccggcggacg gctcgaagcc cggggagccc ctcaggatca gcccaccccc gcggctggac 180
acggagtggt cgtccgtcct gaacgggatc cagtacctga actcgggggc ccggggcacg 240
gcccccgtcc acctgtggat cctgggcgcc gccgacctct gcgaccaggt gctcctggcc 300
gcctcccgca gcaccgccgc cggagcctcc cacgcccaga cgggcgcgcg cctgacccgg 360
cgccggcccg ggctgacgga cgccgacgcc ctggacgtga tcgtcgccgg gatccaggcg 420
acccgcgcca tgttcgcgcg ggtccacaac cgctcctggc gccacgccgg cgagtggacg 480
gaggccctgc actcccagat cgtgacccgg ggcgacgtgc gccggcgccg aggcgggcgc 540
ggcaacggac gcgagcgcgc cccgcgatgt accatctcct agacggcagg atctctccgc 600
gtcccccacc cccccaaaaa acaaacaata aacgctctcg ctctggcacc cgatgacacg 660
cctccgtcct ctctctccct cccactgacg ccacccctcc cctcgccgac aacgccatcg 720
tcgcccggcg tcggccggac cggcggttct ccccccaccc cgtccccccc caccccgtcc 780
ccccccaccc ctgcccccgc ttcgtccgac tctcgccccc cgcgggaggg ttccgcggct 840
cgctccccgt ctcatccccc cgtctcatcc ccccgtctca ctcccatctc cctccctcca 900
ccccgtctca tccccccatc tcccttcccc acgagggccg ggaggggaaa aaacgcccga 960
gagacgagag agttgaggtt cgagcggcgg gccgccgtg 999
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccactgcccg ggtgatggcg ctcggcgggg cgctgtacgt gcccgagccg atggcgtact 60
ggcgcactct gttcgacacg gacacggtgg ccggtattta cgatgcgcag acccggaagc 120
agaacggcag cctgagcgag gaggacgcgg ccctcgtcac ggcgcagcac caggccgcct 180
tcgcgacgcc gtacctgctg ctgcacacgc gcctggtccc gctcttcggg cccgcggtcg 240
agggcccgcc cgagatgacg gtcgtctttg accgccaccc ggtggccgcg acggtgtgct 300
tcccgctggc gcgcttcatc gtcggggaca tcagcgcggc ggccttcgtg ggcctggcgg 360
ccacgctgcc cggggagccc cccggcggca acctggtggt ggcctcgctg gacccggacg 420
agcacctgcg gcgcctgcgc gcccgcgcgc gcgccgggga gcacgtggac gcgcgcctgc 480
tcacggccct gcgcaacgtc gacctggggc cctcgccgcg cgtctgcgcc gcggccgtgg 540
cggcgcagac gcgcggcatg gaggtgacgg agtccgcgta cggcgaccac atccggcagt 600
gcgtgtgcgc cttcacgtcg gagatggggg tgtgaccctc gcccctccca cccgcgccgc 660
ggccagatgg agaccgcgac ggaggcaacg acgacggcgt gggagggggc tcggggcgcg 720
tataaagcta tgtgtatgtc atcccaataa agtttgccgt gcccgtcacc atgcccgcgt 780
cgtccgtgcg cctcccgctg cgcctcctga ccctcgcggg cctcctggcc ctcgcggggg 840
ccgccgccct cgcccgcggc gcgccgcagg gtgggccgcc ctcgccgcag gggggtcccg 900
cgcccaccgc ggcgcccgcg cgcgggccca ccctgttcgt cctggtcggc gacggctccg 960
cgtggttcgt cttccagctc ggcgggctgg gggcgctcaa 1000
<210> 4
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcgtggtccg caccgtcgtg gccagagagg cccctcggga gctctgctac ggccaccccg 60
tccacgacga ccggcggccc gtcgggcccg cgaccgacgc ccagcccgtg aacccgctcg 120
cccccgccaa cgccaccggg acggactact ctcgcggctg cgagatgcgc ctcctggatc 180
cgcctctcga cgtatcgtcc cgctcctcgg accccgtcaa cgtgaccgtc gcctggttct 240
ttgacggcgg ccactgcaag gtgcccctcg tccaccgcga gtactacggc tgccccgggg 300
acgccatgcc ctccgtcgag acgtgcaccg gcgggtactc gtacacccgc acgcgcatcg 360
acaccctgat ggagtacgcc ctcgtgaacg ccagcctcgt gctgcagccc gggctgtacg 420
acgccggcct gtacatcgtc gtgctcgtct ttggcgacga cgcctacctc ggcaccgtct 480
ccctgtcggt ggaggccaac ctggactacc cctgcggcat gaagcacggg ctcacgatca 540
cccgccccgg ggccaccctc ccacccatcg cccccacggc cggcgaccac cagcgctggc 600
gcgggtgctt cccctcga 618

Claims (9)

1.一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No：16290。
2.权利要求1所述的六基因缺失的猪伪狂犬病毒在制备伪狂犬病疫苗中的应用。
3.一种猪伪狂犬病疫苗，其特征在于，其包括权利要求1所述的六基因缺失的猪伪狂犬病毒以及稳定剂。
4.一种如权利要求3所述的猪伪狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤(a)：将权利要求1所述的六基因缺失的猪伪狂犬病毒接种适宜细胞，收获病毒液；
步骤(b)：将收获的病毒液与稳定剂混合。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述稳定剂包括：低聚糖、氨基酸、明胶和蛋白酶解物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述低聚糖为蔗糖和海藻糖的组合；氨基酸为谷氨酸钠；蛋白酶解物为水解乳蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，按质量百分比计，所述稳定剂含有：5％-10％蔗糖、1％-5％海藻糖、1％-5％谷氨酸钠以及2％-10％水解乳蛋白，0.5％～1％的明胶，余量为水。
8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述病毒液与稳定剂按照1：1-1：10的比例混合。
9.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述适宜细胞为BHK21细胞、ST细胞、293T细胞、PK15细胞、Vero细胞或MDBK细胞。
CN201811508839.0A 2018-12-10 2018-12-10 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法 Active CN109609468B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811508839.0A CN109609468B (zh) 2018-12-10 2018-12-10 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811508839.0A CN109609468B (zh) 2018-12-10 2018-12-10 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109609468A CN109609468A (zh) 2019-04-12
CN109609468B true CN109609468B (zh) 2020-06-30

Family

ID=66008564

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811508839.0A Active CN109609468B (zh) 2018-12-10 2018-12-10 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109609468B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154733A (zh) * 2020-01-09 2020-05-15 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种伪狂犬病毒弱毒株及应用
CN112501133B (zh) * 2020-12-01 2022-05-24 山东信得科技股份有限公司 一种伪狂犬病毒qd株三基因缺失致弱株
CN114657151B (zh) * 2022-02-25 2024-03-12 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 猪伪狂犬病病毒gE/gI/TK基因缺失疫苗株及其构建方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996029396A1 (en) * 1995-03-23 1996-09-26 Syntro Corporation Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof
CN1477192A (zh) * 2002-08-19 2004-02-25 华中农业大学 表达猪细小病毒vp2基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法
CN1523103A (zh) * 2003-09-08 2004-08-25 华中农业大学 一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法
CN101457215A (zh) * 2008-12-01 2009-06-17 华中农业大学 重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用
CN104830810A (zh) * 2015-05-15 2015-08-12 山东信得科技股份有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE/gI三基因缺失株
CN104862286A (zh) * 2014-08-22 2015-08-26 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN104877972A (zh) * 2015-05-15 2015-09-02 山东信得科技股份有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒gE/gI双基因缺失株及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103756977B (zh) * 2013-12-11 2016-01-06 姜平 猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用
CN104152416B (zh) * 2014-01-03 2018-09-07 中国农业科学院上海兽医研究所 伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用
CN105018433B (zh) * 2014-04-18 2019-01-15 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996029396A1 (en) * 1995-03-23 1996-09-26 Syntro Corporation Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof
CN1477192A (zh) * 2002-08-19 2004-02-25 华中农业大学 表达猪细小病毒vp2基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法
CN1523103A (zh) * 2003-09-08 2004-08-25 华中农业大学 一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法
CN101457215A (zh) * 2008-12-01 2009-06-17 华中农业大学 重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用
CN104862286A (zh) * 2014-08-22 2015-08-26 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN104830810A (zh) * 2015-05-15 2015-08-12 山东信得科技股份有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE/gI三基因缺失株
CN104877972A (zh) * 2015-05-15 2015-09-02 山东信得科技股份有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒gE/gI双基因缺失株及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Conversion of US3-encoded protein kinase gene from pseudorabies virus in a diploid gene located within inverted repeats by genetic recombination between the viral genome isomers.;A Fernandez等;《Virus Reasearch》;19990630;第61卷(第2期);全文 *
伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gG-/LacZ-突变株的构建;陈焕春等;《病毒学报》;20010331;第17卷(第1期);第69页 *
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨;方六荣等;《病毒学报》;20040930;第20卷(第3期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109609468A (zh) 2019-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104862286B (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
JP4667507B2 (ja) イヌインフルエンザを治療するワクチンおよび方法
CN101633909B (zh) 预防猪感染猪繁殖与呼吸综合征的减毒活疫苗
CN105087506B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
JP6096176B2 (ja) ブタウイルス感染の予防のための混合ワクチン
EP2271663B1 (en) Novel avian astrovirus
CN109609468B (zh) 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法
CN110387354B (zh) 伪狂犬病病毒传代致弱毒株及其应用
CN113943714B (zh) 一种猫杯状病毒毒株及其应用
KR20120016282A (ko) 마이코플라스마　하이오뉴모니에의 온도 감수성 백신 균주 및 그의 용도
CN105018433A (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
US10633637B2 (en) Pestivirus vaccines for congenital tremors
CN1929859A (zh) 抗睾丸bvdv感染的疫苗接种方法
CN109735504B (zh) 犬瘟热病毒弱毒疫苗株及其应用
CN108251382A (zh) 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
CN109337874B (zh) 一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗
KR20110123748A (ko) 미코플라스마 갈리셉티쿰 제형
CN111073863B (zh) 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
CN110713987B (zh) 一种重组基因vii型新城疫病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法及应用
CN105018436A (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
RU2603255C9 (ru) ШТАММ А №2155/Забайкальский/2013 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А
RU2741639C1 (ru) Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная
CN115634288A (zh) 一种犬冠状病毒弱毒株及其应用
RU2553219C1 (ru) ШТАММ ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 610225 No.6, Muke Road, xihanggang Avenue, Southwest Airport Economic Development Zone, Shuangliu District, China (Sichuan) pilot Free Trade Zone, Chengdu, Sichuan Province

Applicant after: Livestock Bioengineering Co., Ltd

Address before: 610000 Chengdu, Sichuan Shuangliu District, Southwest China Airport Economic Development Zone, West Hang Kong Road, animal husbandry Road No. 6

Applicant before: Sichuan Huashen Animal Biolog Products Co., Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant