CN111876391A

CN111876391A - 猫泛白细胞减少症病毒fpv bj05株及其应用

Info

Publication number: CN111876391A
Application number: CN202010728830.1A
Authority: CN
Inventors: 梁瑞英; 梁琳; 崔尚金
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明提供猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株及其应用。毒株FPV BJ05具有免疫原性好、培养特性好、效价稳定等优点，将FPV BJ05株进行感染性克隆获得带有遗传标记的拯救毒株FPV BJ05C，将拯救毒株接种易感细胞，收获培养物，用β‑丙内脂灭活后，与氢氧化铝佐剂混合乳化制成猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗。实验表明，利用本发明提供的猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗免疫断奶后的健康幼猫能够预防由FPV引起的疾病，此疫苗具有安全、起效快、免疫期持久等优点。

Description

猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品和预防兽医领域，具体地说，涉及猫泛白细胞减少症病毒FPVBJ05株及其应用。

背景技术

猫泛白细胞减少症病毒是无囊膜的单股DNA病毒，是引起猫和猫科动物高度传染性和致死性的病毒。可引起猫及猫科动物泛白细胞减少症(Feline panleukopeniadisease，FPD)。该病毒呈世界流行趋势，被认为是食肉兽细小病毒感染范围最广、致病性最强的一种病毒。该病毒于1928年首次发现，1935年正式命名为猫泛白细胞减少症病毒。FPV通过粪-口途径传播，主要通过接触感染的体液、粪便或其它污染物，还有经跳蚤传播。FPV对环境的抵抗能力较强，在感染的组织样品中至少可以存活一年。污染物是主要的传播源，猫的主人通过鞋子或衣物等将具有高度传染性的病毒传染给室内的猫。18～24h经鼻或口感染，病毒开始在口咽部复制，2～7天后出现病毒血症，病毒复制主要发生在有丝***的组织内，因此，6周龄以上的猫淋巴组织、骨髓和肠粘膜最常受影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫原性好、培养特性好、效价稳定的猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株。

本发明的另一目的是提供猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株的拯救毒株(FPVBJ05C株)在制备疫苗中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopenia virus)FPV BJ05株。发明人于2017年从北京市某动物医院分离到一株猫泛白细胞减少症病毒，从发生呕吐、腹泻、严重出血性肠炎的患病猫粪便中分离获得的。经鉴定为强毒株，驯化后的毒株命名为FPV BJ05株，与分离到的其它毒株相比，其在细胞上的增殖滴度高，对猫的免疫原性好。通过感染性克隆获得FPV BJ05株的拯救毒株FPV BJ05C株(疫苗株)。与野生毒株(FPV BJ05株)相比，通过定点突变加入遗传标记，即FPV BJ05株基因组第2980-2985bp的由CTCAAG突变为CTCGAG，经验证拯救毒株与野生毒株具有相同的生物学特性，经猫肾细胞系(F81)传代后作为疫苗毒种，效价检测用强毒为野生毒株FPV BJ05株第7-10代。该毒株可以引起F81细胞90％以上感染。FPV BJ05株的基因组序列如SEQ ID NO:1所示。

猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus)FPV BJ05株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.19988，保藏日期2020年5月28日。

第二方面，本发明提供所述猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株的拯救毒株(FPVBJ05C株)的以下任一应用：

1)用于制备疫苗；

2)用于制备猫泛白细胞减少症病毒感染以及由其感染所致相关疾病的诊断试剂。

第三方面，本发明提供一种组合物，其包含灭活后的FPV BJ05C株以及药学上可接受的载体。

第四方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第五方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含上述免疫原性组合物。

第六方面，本发明提供一种猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)将猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株进行感染性克隆，获得的拯救毒株接种至易感细胞进行培养，得到病毒液；

(2)将收获的病毒液用β-丙内脂进行灭活；

(3)将灭活后的病毒液与佐剂混合，即得。

前述的方法，步骤(1)包括：生物信息学分析病毒3’和5’端的Y型结构和U型结构，扩增猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株基因组序列(SEQ ID NO:1)，***pBlueScript II(+)载体，构建反向遗传学平台，转染F81细胞，进行病毒拯救，获得拯救毒株，接种至易感细胞(如F81细胞)进行培养，得到病毒液。

优选地，步骤(3)所述佐剂为铝佐剂，优选氢氧化铝佐剂(明矾佐剂)。

前述的方法，步骤(2)包括：将收获的病毒液采用终浓度0.02％～0.05％的β-丙内脂在4～10℃条件下灭活36～48h，期间每隔2h搅拌一次，灭活后病毒液置于37℃水解1～2h。优选地，将收获的病毒液采用终浓度0.03％的β-丙内脂在4℃条件下灭活48h，期间每隔2h搅拌一次，灭活后病毒液置于37℃水解2h。灭活后病毒液置于2～8℃保存。

优选地，所述猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗是由终浓度1000μg/ml的氢氧化铝佐剂和终浓度0.03％的β-丙内脂灭活的猫泛白细胞减少症病毒(FPV BJ05C株)乳化后制得。

乳化工艺采用美国赛默飞公司的商品化的氢氧化铝佐剂作为乳化工艺，佐剂除菌后可直接用于疫苗的乳化制备；佐剂使用前，轻轻摇晃铝佐剂瓶。乳化前将与灭活的同批病毒液解冻混合，在无菌条件下将氢氧化铝佐剂滴入病毒液，佐剂与病毒液的体积比为1:3，使用匀浆机以200r/min搅拌均匀。为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静置约30分钟后分装。

第七方面，本发明提供所述疫苗组合物或者按照上述方法制备的猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗在制备治疗或预防猫泛白细胞减少症病毒感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

所述疾病以患病猫科动物发生突发性双向热、呕吐、腹泻、脱水、明显的白细胞减少及出血性肠炎等为特征。

本发明提供的猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株的拯救毒株FPV BJ05C株具有免疫原性好、培养特性好、效价稳定等优点，且拯救毒株加入遗传标记，便于区分野毒株和疫苗株，将FPV BJ05C株接种易感细胞，收获培养物，用β-丙内脂灭活后，与氢氧化铝佐剂混合乳化制成猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗。实验表明，利用本发明提供的猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗免疫断奶后的健康幼猫能够预防由FPV引起的包括FPD在内的疾病，此疫苗具有安全、起效快、免疫期持久等优点。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株接种F81细胞引起的细胞病变。其中，A：接种72h后产生的细胞病变；B：正常细胞作为阴性对照。

图2为本发明较佳实施例中透射电镜下观察到毒株FPV BJ05C的病毒粒子。

图3为本发明较佳实施例中猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株间接免疫荧光试验结果。其中，A：FPV BJ05C株在F81细胞上培养24h后的荧光检测结果；B：正常对照细胞的荧光检测结果。

具体实施方式

本发明提供猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株及其应用。发明人于2017年从北京市某动物医院分离到一株猪细小病毒，经鉴定为强毒株，驯化后的毒株命名为FPV BJ05株。利用FPV BJ05株通过反向遗传操作操作进行病毒拯救，获得拯救毒株FPV BJ05C，开展了猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗的研制开发工作，拯救出免疫原性好、效价稳定的猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株，选择了最适合该病毒增殖的F81细胞和符合制造疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对生物制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等进行了试验检测，并获得了大量试验数据，证明本疫苗安全有效。在此基础上，进行了中试生产，经过抽样检验，均符合拟定的质量标准，并对中试产品进行了安全试验和效力试验，结果证实本疫苗能有效地预防由猫泛白细胞减少症病毒引起的猫泛白细胞减少症，在实验室试验、中间试制的基础上，本发明研制出了猫泛白细胞减少综合症病毒(FPV BJ05C株)灭活疫苗，结果表明本疫苗能有效地预防由猫泛白细胞减少症病毒引起的猫泛白细胞减少症，进一步验证了本疫苗的各项质量标准。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例使用的猫品种为中华田园猫。

实施例1猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株的培养鉴定

1、毒种来源及标准

根据新生物制品申报要求，结合本发明获得的大量的试验数据，参照《中国兽药典》(2005年版)，对制苗用毒种进行了鉴定。

1.1毒种来源

制作本生物制品用的毒种为猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05通过构建的感染性克隆平台拯救的FPV BJ05C株，FPV BJ05株是发明人于2017年从发病猫粪便中分离驯化后获得，由于这一毒株是从发生典型猫泛白细胞减少症病毒感染的猫粪便中分离获得的，并且与分离到的其它毒株相比在细胞上的增殖滴度高，对猫的免疫原性好，所以选择其用于感染性克隆进行反向遗传操作平台构建，转染F81细胞进行毒株拯救，获得疫苗生产用毒种(FPV BJ05C)，对毒种进行生物学鉴定。效检用强毒为FPV BJ05株第7-10代。该毒种为在F81细胞上传代后的第7代病毒株。

1.2毒种标准

1.2.1红细胞凝集价

取96孔U型微量反应板，用移液器每孔加入25μl PBS(0.01mol/L，pH值7.0-7.4)，第一列各孔中加入25μl抗原，然后将抗原进行倍比稀释，直至第11孔弃去25μl。每孔加入25μl PBS，再加入1％猪红细胞悬液25μl，用微量振荡器混合均匀，室温下作用1h，或4℃冰箱作用2h。判定结果时，以50％红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。结果显示，毒种对猪红细胞凝集价应不低于1:256。

1.2.2病毒含量

以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释，每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，随后加入F81细胞悬液，每孔100μl(细胞密度为2×10⁵/mL，含10％新生牛血清的DMEM)，并设正常细胞培养作为对照，置37℃、含5％的CO₂培养箱中培养，12h后更换2％新生牛血清的维持液，在相同培养条件下继续观察4～5日，并逐日观察细胞病变(CPE)，细胞固缩，聚集，颗粒增多，有的细胞融合、脱落、出现较多空隙则判为CPE。记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果显示，每毫升病毒液不低于10^6.0TCID₅₀。

1.2.3毒力

猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C接种F81细胞，病毒代次为FPV BJ05C的第7-10代细胞毒；攻毒剂量为每毫升病毒含量应不低于10^6.0TCID₅₀；程序是肌肉注射45～60日龄猫5只，2ml/只，同时设对照猫5只，接种后隔离饲养，逐日观察至21日。判定标准是精神沉郁、食欲不振或废绝；腹泻、粪便中有粘液或血液；粪便(1:5稀释)血凝效价不低于1:64，且血凝性能被猫泛白细胞减少症病毒阳性血清抑制。

1.2.4免疫原性

将毒种同步接种F81细胞进行增殖，收获病毒液，用终浓度0.03％的β-丙内脂灭活后，加入氢氧化铝佐剂至终浓度800ug/ml，混合均匀。用45～60日龄健康易感猫(FPV HI抗体效价不高于1:8)10只，随机分为2组，每组5只。一组皮下注射制备的疫苗1ml，另一组作为对照，不接种。在相同条件下隔离饲喂。21天后采血，收集血清，进行HI效价测定；同时所有猫皮下注射效检用强毒为FPV BJ05株第7-10代培养液(10^6.0TCID₅₀/ml)1m1，每日采集肛拭子，并连续观察21日，对照组5只猫均应发病，判定标准为：精神沉郁、食欲不振或废绝；腹泻、粪便中有粘液或血液；粪便(1:5稀释)血凝效价不低于1:64，且血凝性能被猫泛白细胞减少症病毒阳性血清抑制。HI抗体效价不高于1:8；免疫的5只猫应至少4只健康的活着，HI抗体效价不低于1:32。

1.2.5纯净检验

对建立的猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株的原始种子批第1～5代、基础种子批第6～15代和生产种子批第16～18代进行了细菌、霉菌、支原体检验，并对第3、9和17代次毒种进行了外源病毒的检验，结果表明，本发明建立的原始种子批、基础种子批、生产种子批均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，毒种纯净。

1.2.6特异性

用DMEM细胞培养液将毒种稀释至200TCID₅₀/0.1ml，与等量灭活的抗猫泛白细胞减少症病毒特异性血清等量混匀，置于37℃水浴中孵育1h，同步接种生长良好的F81细胞3瓶(细胞密度以为2×10⁵/ml)，同时设病毒对照、正常细胞对照和阴性血清对照，置37℃、含5％的CO₂培养箱中，培养5～7日。中和病毒组和正常细胞对照组均应不出现细胞病变(CPE)；病毒对照组和阴性血清对照组均应出现CPE。

1.2.7毒种使用代次

将猫泛白细胞减少症病毒拯救毒株FPV BJ05C在F81细胞上连续传35代(即在毒种FPV BJ05C株基础上连续传代30代)，测定了每一代病毒的TCID₅₀，选择第5、10、15、20、25、30、35和40代病毒分别灭活后制成疫苗，各接种健康易感幼犬5只，观察21天并进行攻毒试验。结果表明猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株至少可以传代40代都能保持较高的病毒含量、良好的免疫原性和免疫保护力。第5代以后(包括第5代病毒，即保藏编号为CGMCCNo.19988的病毒株)各代次病毒含量稳定，均不低于10^6.0TCID₅₀，且HA效价均在2⁹以上，已经达到了做疫苗的标准。攻毒试验结果表明，各代次病毒灭活后接种易感幼猫，免疫动物均能抵抗强毒攻击，攻毒幼猫均存活，而对照组均有不同程度的发病或死亡。根据以上结果，为保证生产毒种良好的免疫原性和安全性，本发明确定了病毒的传代最高次数在30代，原始毒种为1～5代，基础毒种为第6～15代，生产用毒种最高传代次数限制在3代(第16～18代)以内。

1.2.8毒种保存期

将猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株的原始种子、基础种子批、工作种子批不同代次毒种进行不同条件对比和增值稳定性检测。结果表明，-70℃保存，冻干毒种保存至30个月，湿毒毒种保存至18个月，病毒含量病毒含量均≥10^6.0TCID₅₀/ml；-20℃保存，冻干毒种保存至30个月，湿毒毒种保存至12个月，病毒含量均≥10^6.0TCID₅₀/ml。在保存期内的毒种，连续传代3次，病毒含量无明显差异，病毒增殖稳定。基于以上结果，为了保证生产疫苗的质量，将猫泛白细胞减少症病毒冻干毒种于-20℃保存期约为30个月，-70℃保存期约为30个月；湿毒毒种于-20℃保存期约为12个月，-70℃以下保存，保存期为18个月左右。

2、生产用细胞

2.1细胞来源

F81细胞购自中国(武汉)典型培养物保藏中心。

2.2细胞的选择

在病毒的培养过程中本发明选用了传代细胞系F81进行病毒增殖，结果病毒在F81细胞上的稳定且增殖滴度高，猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株接种F81细胞72h后产生病变情况如图1所示。

透射电镜下观察到毒株FPV BJ05的病毒粒子见图2。FPV间接免疫荧光试验结果见图3。

2.3细胞系的建立

制苗用细胞系选用F81细胞。传代范围控制在40～55代，本发明建立了原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库。其中原始细胞库：将购入代次为0代的F81细胞连续传代5代，1ml/支，总计30支；基础细胞库：复苏冻存的原始细胞种子，连续传代10次，制备基础细胞种子。1ml/支，总计120支；工作细胞库：将复苏的基础细胞，连续传代10次，制备工作细胞种子，1ml/支，总计250支。对各个代次的细胞都按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒的污染。

2.4细胞系的鉴定

根据现行《中国兽药典》附页中有关“生产、检验用细胞标准”规定进行检验，均符合标准。

实施例2猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗的制备

猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗(FPV BJ05C株)的制备工艺如下。从实验室制备的3批疫苗和中间试制的5批疫苗质检结果来看，用该工艺流程制备的疫苗产品质量稳定，效检结果完全符合所制定的质量标准。

1、病毒液的制备

在病毒繁殖过程中，诸多因素会影响细胞及病毒的增殖。FPV的复制需要宿主细胞的DNA聚合酶，具有旺盛增殖能力并处于有丝***时期的细胞最适宜FPV增殖，因此在进行FPV繁殖时采用与细胞同时接种培养；培养液中血清浓度显著影响着病毒的复制，经过一系列比较试验，选用细胞培养液血清浓度为10％，维持液血清浓度为2％，能够繁殖稳定的，高滴度的病毒液；另外对培养液的pH值、细胞浓度、病毒接种剂量、收毒时间等进行了比较试验，结果显示病毒繁殖时细胞维持液pH值控制在7.2～7.4之间、接毒时细胞浓度选择1×10⁵～5×10⁵个/ml、细胞接毒剂量为1％(v/v)病毒含量为10^6.0TCID₅₀/ml以上的种毒、病毒最佳收获时间为72～96h，均能获得高病毒含量的病毒液。

在本实施例中使用细胞培养液(商品名为1640，购自Gibco公司)中血清浓度为10％，pH值7.3，维持液(商品名为MEM，购自北京华佰泰生物科技有限公司)中血清浓度为2％，接毒时F81细胞浓度为3×10⁵个/ml，按照1％(v/v)的细胞接毒剂量接入病毒含量为10^6.0TCID₅₀/ml的猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05C株，病毒收获时间为72h。

2、灭活工艺

选择终浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的甲醛溶液及终浓度为0.05％、0.03％、0.025％、0.02％的β-丙内脂对FPV BJ05C进行灭活比较试验，试验结果表明，0.025％的β-丙内脂在4℃条件下处理48h后可将猫泛白细胞减少症病毒完全灭活，结果表明β-丙内脂对抗原破坏小，且灭活后37℃水解2h，β-丙内脂毒性消失。FPV抗原加入0.3％的甲醛溶液，经37℃灭活48h亦可达到完全灭活病毒的目的；但甲醛具有强刺激性，如果疫苗中残留游离的甲醛进入动物机体，会产生不良反应。

3、乳化工艺

猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗是由终浓度1000μg/ml的美国赛默飞公司的商品化氢氧化铝佐剂和终浓度0.025％的β-丙内脂灭活的猫泛白细胞减少症病毒(FPV BJ05C株)乳化后得到。佐剂使用前，轻轻摇晃铝佐剂瓶。乳化前将与灭活的同批病毒液解冻混合，在无菌的条件下将氢氧化铝佐剂滴入病毒液至佐剂与病毒液最终体积比为1:3，使用匀浆机以200r/min搅拌均匀；为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静置30min后分装。

4、半成品检验质量标准

4.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.2病毒含量测定

以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释，每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中，每个稀释度做8个重复，随后加入F81细胞悬液，每孔100μl(细胞密度为2×10⁵/mL，含10％新生牛血清的DMEM)，并设正常细胞培养作为对照，置于37℃、含5％的CO₂培养箱中培养，12h后更换2％新生牛血清的维持液，在相同培养条件下继续观察4～5日，并逐日观察细胞病变(CPE)，细胞固缩，聚集，颗粒增多，有的细胞融合、脱落、出现较多空隙则判为CPE。记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果显示，每毫升病毒液不低于10^6.0TCID₅₀。

4.3灭活检验

取灭活后的病毒液，按照10⁰、10^-1、10^-2稀释后，分别按2％的量接种于F81细胞各3瓶(细胞密度以3×10⁵/ml)，37℃、5％CO₂培养观察，同时设病毒对照，连续传代3代。结果无细胞病变。实验室生产的3批半成品均合格。

5、成品检验质量标准

5.1安全检验标准

为了保证疫苗的安全性，本发明对制备的5批疫苗先后进行了健康幼猫、成猫、怀孕猫进行一次单剂量、单剂量重复、一次超剂量的安全性试验。试验结果显示一次单剂量、单剂量重复、一次超剂量接种幼猫、成猫、怀孕猫注射局部均无梗结、红肿等不良性局部反应，按压无痛感，无精神沉郁、食欲减退或废绝、腹泻、体温升高等全身反应；幼猫、成猫接种前、后白细胞总数差异不明显；幼猫体重增加与对照组基本一致，剖检各脏器均无病理变化；怀孕猫妊娠及分娩正常，无流产、早产、死胎及木乃伊胎等情况。结果表明该疫苗一次单剂量、单剂量重复和一次超剂量接种对幼猫、成猫和怀孕猫均安全。

5.2效力检验标准的制定

5.2.1抗体效价与免疫攻毒保护相关性试验

将安全性试验合格的1批猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗(批号201801)，按照不同剂量0.5ml/只份、1ml/只份、2ml/只份分别免疫45～60月龄的健康易感猫(FPV中和效价不高于1:4或HI抗体不高于1:8)各5只，免疫接种21日后连同对照组试验动物分别采血，测定血清中相应抗体效价，同时以10^6.0TCID₅₀/ml FPV BJ05株第5代强毒口服2ml，连续观察21日，结果表明，血清中FPV HI＜1:32的猫全部发病，FPV HI＞1:32的猫，全部抵抗了FPVBJ05株强毒的攻击。根据疫苗免疫抗体效价与攻毒保护相关性研究试验结果，将能够保护猫抵抗FPV强毒攻击的HI抗体效价不低于1:32。

5.2.2最小免疫剂量

将安全性试验合格的3批猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗201801、201802和201803，按照不同剂量0.5ml/只份、1ml/只份、1.5ml/只份、2ml/头份分别免疫45～60日龄的健康敏感幼猫(FPV HI抗体不高于1:8)各10只，另设10只不接种作为对照，于接种前和接种后第7、14、21日分别采血，进行FPV血凝抑制效价测定。接种后21日，口服FPV BJ05株第5代培养物进行攻毒，连续观察21日，记录试验猫攻毒保护情况。根据血清抗体检测情况和攻毒免疫保护效果，将灭活疫苗的最小免疫剂量确定为1.0ml/只份，使用剂量确定为1.0ml/只份。

5.2.3小鼠血清学效力检验与猫血清学效力试验相关性

将实验室生产的3批猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗201801、201802和201803按照0.05ml/只、0.10ml/只、0.15ml/只、0.20ml/只的剂量皮下免疫19～21日龄BALB/c小鼠和45～60日龄的中华田园猫各5只，分别于免疫接种后7日、14日和21日连同对照组试验小鼠和猫，测定HI抗体效价，分析小鼠与猫的HI抗体相关性。结果表明，当以0.1ml/只剂量免疫小鼠时，接种14日后，FPV HI效价不低于1：32，能够达到以1.0ml/只剂量免疫猫同样的免疫效力。因此，在制定产品质量标准时确定可以选择采用检测小鼠血清中FPV HI效价的方法进行疫苗的效力检验，即要求本疫苗以0.1ml/只剂量免疫小鼠后14日，FPV血凝抑制抗体效价不低于1:32，则合格。

6、免疫产生期与免疫持续期试验

将安全性试验合格的3批猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗201801、201802和201803分别免疫健康敏感猫。为进一步掌握免疫效力及免疫持续期，制定合理的免疫程序，保证免疫猫保持高而持久的抗体水平，对免疫猫不同时间进行抗体检测，以掌握其抗体消长规律。

试验结果表明，血清中FPV血凝抑制效价随着时间的延长而不断升高，即免疫后14日即产生抵抗FPV免疫保护力，至2个月时达到高峰，随后缓慢降低至保护水平以下。综合以上实验结果，将疫苗的免疫保护期定为6个月，保护期未攻毒试验结果表明，该疫苗的保护期至少为6个月，因此，疫苗每隔6个月接种一次，以确保免疫效力。

7、母源抗体水平与免疫时期的确定

通过研究断奶后不同时间免疫幼猫血清中保护性抗体的变化情况，确定母源抗体对疫苗免疫的影响，以选择合适的疫苗免疫时间。结果表明，断奶后1周，幼猫的母源抗体水平仍然较高，严重影响疫苗免疫效果；断奶后2～3周，幼猫的母源抗体水平已经降低至较低水平，对疫苗免疫的影响较小，免疫幼猫能建立较好的主动免疫力。因此，根据母源抗体的变化规律以及不同免疫时机免疫猫血清中保护性抗体的变化情况，将疫苗免疫的最佳时机定为断奶后14～21日。

8、免疫频次的确定

本疫苗用于预防猫泛白细胞减少症，免疫期为6个月。1ml/只，皮下注射。根据幼猫母源抗体的持续时间，幼猫断奶后14～21日龄免疫1次，2～3周后加强免疫1次，以后每间隔4周接种一次，连续接种3次，每次1只份，以后每6个月接种一次。

9、疫苗的保存期

本发明对制备的3批灭活疫苗(201801、201802、201803)保存期进行了试验研究，将3批疫苗在2～8℃条件下保存9、12、15、18个月，在各个时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力检测。结果显示，3批疫苗在2～8℃条件下保存18个月性状不发生明显变化，无菌检验和安全性都符合质量标准的要求。效力检验中1801批疫苗保存18个月样品免疫小鼠后有一只小鼠HI抗体效价为1:32。201801和201802批疫苗保存18个月样品免疫猫后均有一只猫HI抗体效价为1:32，但免疫猫平均HI抗体水平为1:64，考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗，本发明将疫苗的保存期定为2～8℃条件下保存15个月。

10、与国内同类商品苗的免疫效力比较

10.1安全性对比试验

用45～60日龄健康易感猫(FPV HI抗体效价不高于1:8)10只，随机分成A和B两组，每组5只，A组皮下注射研制的FPV BJ05C灭活苗，1头份(1ml)/只，B组皮下注射由硕腾公司生产的“妙三多”(猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、泛白细胞减少症三联灭活疫苗，生产批号：1620390A)1头份(1ml)/只，另取5只健康易感猫不接种，作为阴性对照。观察接种猫局部和全身(精神、食欲、体温和粪便等)临床表现，连续观察21日，比较疫苗的安全性。结果表明，在观察期21日内，接种猫各项观察项目均正常，两种疫苗对猫均安全，二者在安全方面无差异。

10.2免疫效果对比试验

将本发明的FPV BJ05C灭活疫苗与“妙三多”分别皮下注射接种45日龄健康易感的中华田园猫(FPV HI抗体不高于1:8)各5只，1ml/头份/只，另取5只45日龄健康易感的中华田园猫不接种，作为阴性对照。分别于免疫前和免疫后7日、14日、21日、30日、2月、4月、6月时采血分离血清，检测免疫猫血清中FPV血凝抑制效价(HI)。结果表明，免疫两种疫苗后2个月左右，免疫猫血清中FPV血凝抑制效价均达到高峰，至免疫后6个月仍维持在较高水平。且6个月检测期内，二者的FPV HI抗体水平差异不显著。但本发明使用的毒株为实验室大量流行病学调查后分离毒株，灭活疫苗与国内流行毒株更匹配，有利于猫泛白细胞减少症的防控。

表1为利用本发明猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗免疫猫，血清HI效价变化情况。

表1免疫猫血清HI效价变化情况

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株及其应用

<130> KHP201110477.3

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5118

<212> DNA

<213> 猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus)

<400> 1

ctttagaacc aactgaccaa gttcacgtac gtatgacgtg atgacgcgcg ctgcgcgcgc 60

tgcctacggc agtcacacgt catacgtacg ctccttgatc agttggttct aaagaatgat 120

aggcggtttg tgtgtttaaa cttgggcggg aaaaggtggc gggctaattg tgggcgtggt 180

taaaggtata aaagacaaac catagaccgt tactgacatt cgcttcttgt ctttgacaga 240

gtgaacctct cttactttga ctaaccatgt ctggcaacca gtatactgag gaagttatgg 300

agggagtaaa ttggttaaag aaacatgcag aaaatgaagc attttcgttt gtttttaaat 360

gtgacaacgt ccaactaaat ggaaaggatg ttcactggaa caactatacc aaaccaattc 420

aaaatgaaga gctaacatct ttaattagag gagcacaaac agcaatggat caaaccgaag 480

aagaagaaat ggactgggaa tcggaagttg atagtctcgc caaaaagcaa gtacaaacct 540

ttgatgcatt aattaaaaaa tgtctttttg aagtctttgt ttctaaaaat atagaaccaa 600

atgaatgtgt ttggtttatt caacatgaat ggggaaaaga tcaaggctgg cattgtcatg 660

ttttacttca tagtaagaac ttacaacaag caactggtaa atggctacgc agacaaatga 720

atatgtattg gagtagatgg ttggtgactc tttgttcggt aaacttaaca ccaactgaaa 780

agattaagct cagagaaatt gcagaagata gtgaatgggt gactatatta acatacagac 840

ataagcaaac aaaaaaagac tatgttaaaa tggttcattt tggaaatatg atagcatatt 900

actttttaac aaagaaaaaa attgtccaca tgacaaaaga aagtggctat tttttaagta 960

ctgattctgg ttggaaattt aactttatga agtatcaaga cagacatact gtcagcacac 1020

tttacacgtt ctaactcctc tgactccgga cgtagtggac cttgcactgg aaccgtggag 1080

tactccagat acgcctattg cagaaactgc aaatcaacaa tcaaaccaac ttggcgttac 1140

tcacaaagac gtgcaagcga gtccgacatg gtccgaaata gaggcagacc taagagccat 1200

ctttacttct gaacaattgg aagaagattt tcaagacgac ttggattaag gtacgatggc 1260

acctccggca aagagagcca ggagaggtaa gggtgtgtta gtaaagtggg gggaggggaa 1320

aaatttaata acttaactaa gtatgtgttt ttttatagga cttgtgcctc caggttataa 1380

atatcttggg cctgggaaca gtcttgacca aggagaacca actaaccctt ttgacgccgc 1440

tgcaaaagaa cacgacgaag cttacgctgc ttattttcgc tctggtaaaa acccatactt 1500

atatttttcg ccagcagatc aacgctttat agatcaaaat aaggacgcta cagattgggg 1560

ggggaaaata ggacattatt tttttagagc taaaaaagca attgctccag tattaactga 1620

tacaccagat catccatcaa catcaagacc aacaaaacca actaaaagaa gtaaaccacc 1680

acctcatatt ttcatcaatc ttgcaaaaaa aaaaaaagcc ggtgcaggac aagtaaaaag 1740

agacaatctt gcaccaatga gtgatggagc agttcaacca gacggtggtc aacctgctgt 1800

cagaaatgaa agagctacag gatctgggaa cgggtctgga ggcgggggtg gtggtggttc 1860

tgggggtgtg gggatttcta cgggtacttt caataatcag acggaattta aatttttgga 1920

aaacggatgg gtggaaatca cagcaaactc aagcagactt gtacatttaa atatgccaga 1980

aagtgaaaat tataaaagag tagttgtaaa taatatggat aaaactgcag ttaaaggaaa 2040

catggctaaa aacaggaatt aactatacta atatatttaa tacttatggt cctttaactg 2100

cattaaataa tgtaccacca gtttatccaa atggtcaaat ttgggataaa gaatttgata 2160

ctgacttaaa accaagactt catgtaaatg caccatttgt ttgtcaaaat aattgtcctg 2220

gtcaattatt tgtaaaagtt gcgcctaatt taacaaatga atatgatcct gatgcatctg 2280

ctaatatgtc aagaattgta acttactcag atttttggtg gaaaggtaaa ttagtattta 2340

aagctaaact aagagcatct catacttgga atccaattca acaaatgagt attaatgtag 2400

ataaccaatt taactatcta ccaaataata ttggagctat gaaaattgta tatgaaaaat 2460

ctcaactagc acctagaaaa ttatattaat atacttacta tgtttttatg tttattacat 2520

atcaactagc acctagaaaa ttatattaat atacttacta tgtttttatg tttattacat 2580

attattttaa gattaattaa attacaacat agaaatattg tacttgtatt tgatatagga 2640

tttagaaggt ttgttatatg gtatacaata actgtaagaa atagaagaac atttagatca 2700

tggttagtag tttgttttat aaaatgtaat tgtaaactat taatgtatgt tgttatggtg 2760

tgggtggttg gttggtttgc ccttagaata tgttaaggac caaaaaaatc aataaaagac 2820

atttaaaact taatggtctc gtatactgtc tataaggtga actaacctta ccataagtat 2880

caatctgtct ttaagggggg ggtgggtggg agatgcacaa tatcagtaga ctgactggcc 2940

tggttggttg ctctgcttaa tcaaccagac cgcgtagcgg tctggttgat taagcgcaac 3000

caaccaggcc agtcagtcta ctgatattgt gcatctccca cccacccccc ccttaaagac 3060

agattgatac ttaaaacagg aattaactat actaatatat ttaatactta tggtccttta 3120

actgcattaa ataatgtacc accagtttat ccaaatggtc aaatttggga taaagaattt 3180

gatactgact taaaaccaag acttcatgta aatgcaccat ttgtttgtca aaataattgt 3240

cctggtcaat tatttgtaaa agttgcgcct aatttaacaa atgaatatga tcctgatgca 3300

tctgctaata tgtcaagaat tgtaacttac tcagattttt ggtggaaagg taaattagta 3360

tttaaagcta aactaagagc atctcatact tggaatccaa ttcaacaaat gagtattaat 3420

gtagataacc aatttaacta tctaccaaat aatattggag ctatgaaaat tgtatatgaa 3480

aaatctcaac tagcacctag aaaattatat taatatactt actatgtttt tatgtttatt 3540

acatatcaac tagcacctag aaaattatat taatatactt actatgtttt tatgtttatt 3600

acatattatt ttaagattaa ttaaattaca acatagaaat attgtacttg tatttgatat 3660

aggatttaga aggtttgtta tatggtatac aataactgta agaaatagaa gaacatttag 3720

atcatggtta gtagtttgtt ttataaaatg taattgtaaa ctattaatgt atgttgttat 3780

ggtgtgggtg gttggttggt ttgcccttag aatatgttaa ggaccaaaaa aatcaataaa 3840

agacatttaa aacttaatgg tctcgtatac tgtctataag gtgaactaac cttaccataa 3900

gtatcaatct gtctttaagg ggggggtggg tgggagatgc acaatatcag tagactgact 3960

ggcctggttg gttgctctgc ttaatcaacc agaccgcgta gcggtctggt tgattaagcg 4020

caaccaacca ggccagtcag tctactgata ttgtgcatct cccacccacc ccccccttaa 4080

agacagattg atacttaaaa caggaattaa ctatactaat atatttaata cttatggtcc 4140

tttaactgca ttaaataatg taccaccagt ttatccaaat ggtcaaattt gggataaaga 4200

atttgatact gacttaaaac caagacttca tgtaaatgca ccatttgttt gtcaaaataa 4260

ttgtcctggt caattatttg taaaagttgc gcctaattta acaaatgaat atgatcctga 4320

tgcatctgct aatatgtcaa gaattgtaac ttactcagat ttttggtgga aaggtaaatt 4380

agtatttaaa gctaaactaa gagcatctca tacttggaat ccaattcaac aaatgagtat 4440

taatgtagat aaccaattta actatctacc aaataatatt ggagctatga aaattgtata 4500

tgaaaaatct caactagcac ctagaaaatt atattaatat acttactatg tttttatgtt 4560

tattacatat caactagcac ctagaaaatt atattaatat acttactatg tttttatgtt 4620

tattacatat tattttaaga ttaattaaat tacaacatag aaatattgta cttgtatttg 4680

atataggatt tagaaggttt gttatatggt atacaataac tgtaagaaat agaagaacat 4740

ttagatcatg gttagtagtt tgttttataa aatgtaattg taaactatta atgtatgttg 4800

ttatggtgtg ggtggttggt tggtttgccc ttagaatatg ttaaggacca aaaaaatcaa 4860

taaaagacat ttaaaactta atggtctcgt atactgtcta taaggtgaac taaccttacc 4920

ataagtatca atctgtcttt aagggggggg tgggtgggag atgcacaata tcagtagact 4980

gactggcctg gttggttgct ctgcttaatc aaccagaccg cgtagcggtc tggttgatta 5040

agcgcaacca accaggccag tcagtctact gatattgtgc atctcccacc cacccccccc 5100

ttaaagacag attgatac 5118

Claims

1.猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株，其特征在于，保藏号为CGMCC No.19988。

2.权利要求1所述FPV BJ05株的拯救毒株的以下任一应用：

1)用于制备疫苗；

3.一种组合物，其特征在于，其包含灭活后的权利要求1所述FPV BJ05株的拯救毒株以及药学上可接受的载体。

4.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求3所述的组合物。

5.一种疫苗组合物，其特征在于，其包含权利要求4所述的免疫原性组合物。

6.猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述猫泛白细胞减少症病毒FPV BJ05株进行感染性克隆，获得的拯救毒株接种至易感细胞进行培养，得到病毒液；

(2)将收获的病毒液用β-丙内脂灭活；

(3)将灭活后的病毒液与佐剂混合，即得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述易感细胞为F81细胞；和/或

步骤(3)所述佐剂为铝佐剂，优选氢氧化铝佐剂。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将收获的病毒液加入终浓度0.02％～0.05％的β-丙内脂在4～10℃条件下灭活36～48h，期间每隔2h搅拌一次，灭活后病毒液置于37℃水解1～2h。

9.权利要求5所述疫苗组合物或者按照权利要求6-8任一项所述方法制备的猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗在制备治疗或预防猫泛白细胞减少症病毒感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病以患病猫科动物发生突发性双向热、呕吐、腹泻、脱水、明显的白细胞减少及出血性肠炎为特征。