CN104561049A

CN104561049A - 一种表达猪细小病毒vp2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用

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Publication number: CN104561049A
Application number: CN201510031795.7A
Authority: CN
Inventors: 钱平; 李祥敏; 钱苏红; 石林; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用，参照猪细小病毒（PPV）分离株VP2基因序列，人工合成VP2基因，以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒为骨架，将合成的VP2基因连入该质粒，得到一种杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP2，进而得到重组杆粒rBacmid-PPVP2，将杆粒转染sf9细胞，获得重组杆状病毒Ac-PPVP2。重组杆状病毒Ac-PPVP2高效表达PPV？VP2蛋白并成功形成病毒样颗粒。本发明的重组杆状病毒所表达的蛋白制备亚单位疫苗，免疫动物后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能完全保护猪体免受细小病毒强毒的攻击。

Description

一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术和病毒学领域。具体涉及一种猪细小病毒的重组杆状病毒Ac-PPVP2，还涉及一种猪细小病毒的重组杆状病毒Ac-PPVP2的制备方法，还涉及猪细小病毒的重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗的应用。利用本发明的重组杆状病毒表达人工修饰的猪细小病毒VP2基因并组装成猪细小病毒样病毒颗粒VLP，可以用于制备安全有效的猪细小病毒亚单位疫苗。

背景技术

1996年Mary和Mahnel在进行猪瘟病毒组织培养时发现猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)(Mary et al.,1968)，随后1967年Cartwright从***和流产母猪病料中分离鉴定出猪细小病毒，并且证明了它的致病性(Cartwright et al.,1969)。猪细小病毒病是危害全球养猪业的一种重要的繁殖障碍性传染病，尤其是怀孕前的初产母猪，对养猪业造成巨大的经济损失。自上世纪90年代以来，随着养猪业的迅速发展和集约化猪场的大量涌现，PPV感染在我国呈现扩大、上升的趋势。近年来，PPV出现了新的流行特点，PPV与JEV、PCV2、PRRSV和PRV都会发生混合感染，以及PPV、JEV和PRV三种病毒也能混合感染，使得病情复杂化，给临床诊断和防控带来极大困难(黄刚等，2010)。对于PPV必须进行综合防控，以预防为主：(1)坚持自繁自养模式来杜绝PPV从外界传入；(2)严格按照免疫程序做好猪细小病毒的免疫接种工作；(3)定期进行免疫抗体监测；(4)对猪细小病毒病猪必须与健康猪群进行有效隔离和淘汰，对病猪的粪便、污物、饲料必须进行无害化处理，并加强消毒和定期监测；(5)加强饲养管理，认真执行卫生防疫消毒工作等。现阶段对猪细小病毒病的预防和控制主要是使用疫苗,随着分子生物学技术的发展，使得猪细小病毒病疫苗研究正逐渐从传统的灭活和弱毒疫苗向基因工程疫苗过渡。

猪细小病毒(Procine parvovirus，PPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属的成员，其基因组为单链线状DNA分子，基因组编码三种结构蛋白(VP1、VP2和VP3)和三种非结构蛋白(NS1、NS2和NS3)(Xu and Li,2007)。其中结构蛋白VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，VP2基因编码的多肽能自我装配成病毒样颗粒，是良好的抗原转运载体，同时也有很好的免疫原性，能诱导很强的细胞免疫(Adriaan et al.,2006)。PPV相关性疾病给我国养猪业带来巨大经济损失，目前对PPV感染的控制主要通过加强饲养管理和生物安全措施，但是PPV在猪群中感染率较高以及PPV对外界环境的抵抗力较强，因而通过安全有效地疫苗免疫预防PPV感染显得十分重要。近年来发展起来的病毒样颗粒疫苗(Virus likeparticles,VLP)，含有病毒的一个或多个抗原蛋白、具有与病毒粒子相似结构的颗粒，不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导机体产生良好的免疫保护(Li YJ et al.,2007)。

杆状病毒表达***具有操作简单、安全性高，可容纳大片段的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiro et al.,2001)。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。鉴于杆状病毒表达载体的优势和病毒样颗粒疫苗的特性，利用杆状病毒载体表达***在昆虫细胞中大量表达PPV VP2基因，并成功组装成病毒样颗粒VLP，以此制备亚单位疫苗，为PPV感染相关疾病的免疫防制提供重要的候选疫苗株。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种人工修饰合成的猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)VP2基因的cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的是提供一种杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP2，该载体含有3个拷贝PPV免疫原性基因VP2的cDNA序列(SEQ ID NO.1所示序列)和标记基因eGFP。

本发明还有一个目的就是提供一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，该毒株被命名为重组杆状病毒Ac-PPVP2，属于杆状病毒(Baculovirus)，该病毒含有PPV免疫原性基因VP2，该病毒于2013年9月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：V201339，分类命名：重组杆状病毒(Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus)Ac-PPVP2，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的是提供了一种猪细小病毒重组杆状病毒Ac-PPVP2的制备方法，方法简单，易行，适合大规模生产。

本发明还有一个目的是提供了一种猪细小病毒重组杆状病毒Ac-PPVP2在制备亚单位疫苗中的应用，将该病毒免疫动物后可诱导机体产生特异性免疫反应，具备抗PPV强毒特性。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，通过以下步骤制备得到：

1、PPV主要免疫原性基因VP2的人工修饰合成

参照猪细小病毒中国毒株的VP2基因序列(GenBank：AY583318)，根据密码子的偏爱性人工合成PPV的VP2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2、杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP2的构建

以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒为骨架，通过BamHI和EcoRI酶切pFBDPHmHNM1P10eGFP，回收大片段获得pFBDPHmHNM1。通过BamHI和EcoRI分别酶切PPV VP2基因和pFBDPHmHNM1，回收VP2基因和pFBDPHmHN，然后通过连接酶Ligase于16℃进行连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmHNVP2。进而通过SpeI和NotI酶切PPV VP2基因和pFBDPHmHNVP2,回收VP2基因和pFBDPHmHVP2，然后通过连接酶Ligase于16℃进行连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmH2VP2。进而通过SaLI和HindIII分别酶切PPV VP2基因和pFBDPHmH2VP2，回收VP2基因和pFBDPHm2VP2，然后连接，提取重组质粒后酶切鉴定表明获得有3个VP2基因的杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP2。

3、重组病毒杆状病毒Ac-PPVP2的构建

(1)重组杆粒rBac-PPVP2的获得与鉴定

取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP22.0μL与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞(GiBCO BRL公司产品)混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900μL LB液体培养基(氯化钠浓度为10％)，37℃振摇培养4h，按10^-1、10^-2、10^-3稀释后，各取100μL涂布于三抗高盐LB平板(卡那霉素、庆大霉素和四环素，使用浓度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(试剂盒)操作说明书)，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBacmid-VP2。

(2)重组杆状病毒Ac-PPVP2获得

利用脂质体介导转染法，将筛选纯化后的重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞中，于28℃培养，分别在转染后24h、48h、72h利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，在转染72h后收集细胞上清即获得重组杆状病毒Ac-PPVP2，进而在昆虫细胞上接种该重组病毒，第4代时毒价达到1.0×10^8.125，作为毒种置于-80℃保存备用。

至此获得了一株表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，该病毒已于2013年9月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:V201339，分类命名：重组杆状病毒(Recominant Autographa californica multipleNucleopolyhedrovirus)Ac-PPVP2，地址：中国武汉武汉大学。

该重组杆病毒Ac-PPVP2具有与亲本毒株苜蓿银蚊夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)相同的形态学特性和培养特性。

一种猪细小病毒重组杆状病毒Ac-PPVP2在制备亚单位疫苗中的应用，将该疫苗免疫动物后可诱导机体产生特异性免疫反应，具有抗PPV强毒攻击的能力特性。

具体方案详见具体实施方式。

本发明的有益效果是：

1.本发明根据杆状病毒密码子的偏爱性，人工修饰合成了猪细小病毒VP2基因的基因序列。

2.本发明将人工合成的猪细小病毒VP2基因置于杆状病毒pH启动子下表达，提高了外源基因的表达量。***到杆状病毒转移载体上置于杆状病毒pH启动子下表达，因***是3拷贝形式可提高外源基因的表达量。

3.本发明的重组杆状病毒所表达猪细小病毒VP2基因能成功形成猪细小病毒样病毒颗粒(VLPs)。

4.本发明的重组杆状病毒所表达嵌合VLPs制备亚单位疫苗，免疫动物后可诱导机体产生针对猪细小病毒的特异性免疫反应。

附图说明

图1：为一种杆状病毒载体pFBDPHm3VP2的酶切鉴定图谱；

M：15000bp DNA Marker；1&2：pFBDPHm3VP2BamHI和HindIII双酶切。

图2：为一种重组杆粒rBacmid-VP2PCR鉴定示意图；

鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP2转化DH10Bac，蓝白斑筛选阳性菌落，提取杆粒rBacmid-VP2进行PCR鉴定的电泳图片。

M1和M2：DNA Marker

1-5：rBacmid-VP2(M13(F)/VP2(R1)引物的PCR结果)，片段大小约为5100bp

7-10：rBacmid-VP2(VP2(F3)/M13(R)引物的PCR结果)，片段大小约为2500bp

6&11：水对照water control

图3：为一种Western blot分析重组杆状病毒Ac-PPVP2表达VP2蛋白的示意图；

M：蛋白质marker；1：杆状病毒Ac-PPVP2感染sf9细胞后收集细胞的Western blotting；2：sf9细胞后收集细胞的Western blotting

图4：为一种间接免疫荧光分析重组杆状病毒Ac-PPVP2VP2蛋白的表达示意图；

A：未感染的sf9细胞；B：Ac-eGFP感染的sf9细胞；C：Ac-PPVP2感染的sf9细胞；

eGFP：为绿色荧光显微镜下观察；Red：为红色荧光显微镜下观察(CY3)；Merge：红色与绿色荧光显微镜下观察重叠图

图5：为一种重组杆状病毒Ac-PPVP2表达VP2蛋白量的测定。

在刚长成单层的sf9细胞上，以1.0MOI剂量接种重组杆状病毒Ac-PPVP2，感染后96h收毒，SDS-PAGE电泳后定量测定PPV VP2蛋白的表达量，同时和贴壁HF细胞进行了对比实验。

1-3：BSA标准蛋白样品：36.25μg、62.5μg、125μg

5-6：悬浮培养HF cell感染Ac-PPVP2后的样品：92μg/mL

7-8：贴壁培养的HF cellAc-PPVP2后的样品：56μg/mL；

4：正常的sf9细胞对照

图6：为一种重组杆状病毒Ac-PPVP2感染sf9细胞后形成病毒样颗粒的电镜示意图。

重组杆状病毒Ac-PPVP2以3～5pfu/cell的感染剂量接种sf9细胞，72小时后收集病变细胞并超声波裂解和超速离心进行电镜观察，呈典型二十面体对称结构，无囊膜，直径为23～28nm左右，其形态大小均与猪细小病毒粒子相似，表明组装成病毒样颗粒VLPs。

图7：为一种重组杆状病毒Ac-PPVP2表达外源基因的稳定性检测示意图。

将Ac-PPVP2接种sf9细胞进行连续传代至20代。取F5、F7、F9、F11、F13、F15、F17和F20代病毒感染细胞作为检测样品进行Western blot分析VP2蛋白能稳定表达。

M：蛋白marker；1～8：F5、F7、F9、F11、F13、F15、F17和F20代Ac-PPVP2感染sf9细胞样品的Western blot检测结果。

图8：为小鼠免疫后不同时间抗PPV2的ELISA抗体示意图

重组杆状病毒Ac-PPVP2不同佐剂制备的亚单位疫苗、猪细小病毒灭活疫苗(商业化疫苗，阳性对照)以及细胞对照免疫小鼠后0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗PPV2的ELISA抗体水平。

图9：为兔免疫后不同时间抗PPV2的ELISA抗体示意图

重组杆状病毒Ac-PPVP2经ISA206VG佐剂乳化制备的亚单位疫苗、猪细小病毒灭活疫苗(商业化疫苗，阳性对照)以及细胞对照免疫兔体后0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗PPV2的ELISA抗体水平。

表1：为一种猪免疫后不同时期抗PPV的血凝抑制抗体

重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗、猪细小病毒商品化疫苗以及细胞对照免疫仔猪后不同时间点采集血清，检测抗PPV的血凝抑制抗体。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述实际，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。

实施例1：

一种表达人工修饰合成的PPV2的免疫原性基因VP2重组杆状病毒Ac-PPVP2的构建

(一)重组杆状病毒Ac-PPVP2的构建

1、PPV主要免疫原性基因VP2的人工修饰合成

参照猪细小病毒中国毒株的VP2基因序列(GenBank：AY583318)，根据密码子的偏爱性人工合成PPV的VP2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ IDNO.2所示。

2、杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP2的构建

以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒(钱平等，一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重组杆状病毒，专利公开号CN101624580A,专利号ZL200910063217.6)为骨架，通过BamHI和EcoRI酶切pFBDPHmHNM1P10eGFP，回收大片段获得pFBDPHmHNM1。通过BamHI和EcoRI分别酶切PPV VP2基因和pFBDPHmHNM1，回收VP2基因和pFBDPHmHN，然后通过连接酶Ligase于16℃进行连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmHNVP2。进而通过SpeI和NotI酶切PPV VP2基因和pFBDPHmHNVP2,回收VP2基因和pFBDPHmHVP2，然后通过连接酶Ligase于16℃进行连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmH2VP2。进而通过SaLI和HindIII分别酶切PPV VP2基因和pFBDPHmH2VP2，回收VP2基因和pFBDPHm2VP2，然后连接，提取重组质粒后酶切鉴定表明获得有3个VP2基因的杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP2。

3、重组病毒杆状病毒Ac-PPVP2的构建

(1)重组杆粒rBac-PPVP2的获得与鉴定

取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3VP22.0μL与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞(GiBCO BRL公司产品)混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900μL LB液体培养基(氯化钠浓度为10％)，37℃振摇培养4h，按10^-1、10^-2、10^-3稀释后，各取100μL涂布于三抗高盐LB平板(卡那霉素、庆大霉素和四环素，使用浓度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(试剂盒)操作说明书)，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBacmid-VP2，通过两对PCR引物扩增鉴定：M13上游引物(M13F)和PPV F3(PPV F3)，PPV F4上游引物(PPV F4)和M13下游引物(M13R)。

M13F：5’-CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG-3’

M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

VP2(R1)5’-CCCGAATTCTTAGTACAGCTTTCTTGGAATC-3’

VP2(F3)5’-TTGTCGACCACCATGAAGCACAAGGTCAG-3’

其PCR扩增体系如下：10×LA buffer 5.0μl，LA Taq酶0.5μl，杆粒5.0μl，特异性上游引物1.0μl，特异性下游引物1.0μl，dNTPs 2.0μl，ddH2O 35.5μl。反应条件如下：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃3.0min，30个循环；72℃10min，4℃10min。扩增的PCR产物经0.8％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明能够扩增出5100bp和2500bp的两条特异目的带，大小与预期一致，表明在大肠杆菌中外源基因VP2已重组入杆状病毒基因组中，结果如图2所示。

无菌挑取含重组杆粒rBac-PPVVP2的阳性菌落于高盐LB液体培养基中，培养至细菌对数生长期时，收集菌体用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA,25mmol/LTris-Cl(pH8.0))重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH,1％SDS,现用现配)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/L的乙酸钾，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL TE中，可立即使用或-20℃保存，避免反复冻融。

(2)重组杆状病毒Ac-PPVP2获得

利用脂质体介导转染法(按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(试剂盒)操作说明书操作)，将筛选纯化后的重组杆粒rBacmid-VP2经Reagent转染sf9细胞(购自武汉大学中国典型物保藏中心)中，于28℃培养，分别在转染后24h、48h、72h利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，在转染72h后收集细胞上清即获得重组杆状病毒Ac-PPVP2，进而在昆虫细胞上接种该重组病毒，第4代时重组病毒的毒价达到1.0×10^8.125，作为毒种置于-80℃保存备用。

至此获得了一株表达猪细小病毒VP2基因的重组杆状病毒，该病毒于2013年9月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO:V201339，分类命名：重组杆状病毒(Recominant Autographa californica multipleNucleopolyhedrovirus)Ac-PPVP2，地址：中国武汉武汉大学。

(二)、重组杆状病毒Ac-PPVP2外源基因的表达及病毒样颗粒(VLPs)的形成

1、重组杆状病毒Ac-PPVP2表达VP2蛋白的Westerning blot分析

将sf9细胞接种6孔细胞培养板，待细胞长成80-90％单层时，用1个MOI重组杆状病毒Ac-PPVP2接种sf9细胞，感染72小时后90％以上的sf9细胞发生病变，收集病变细胞并超声波裂解。经SDS-PAGE转膜后VP2蛋白多抗为一抗(本实验室制备，将PPV VP2蛋白进行原核表达、纯化后免疫新西兰兔制备)，HRP标记的羊抗兔IgG(Sigma为)二抗进行Western-blotting检测VP2因的表达。结果显示重组病毒Ac-PPVP2感染细胞样品出现一条约67kD的特异条带，而sf9细胞对照组无此特异条带，证实VP2蛋白获得表达，结果如图3所示。

2、间接免疫荧光鉴定外源基因的表达

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒Ac-PPVP2，36h后固定细胞，以PPV VP2蛋白的多克隆抗体(将PPV VP2蛋白进行原核表达、纯化后免疫新西兰兔制备)为一抗，二抗为CY3-羊抗兔IgG(Sigma)进行间接免疫荧光，最后置共聚焦显微镜下观察。感染Ac-PPVP2的sf9细胞中均有很强红色荧光信号，而sf9细胞没有红色荧光信号，表明重组杆状病毒Ac-PPVP2能表达VP2蛋白且具有很好的免疫活性，结果如图4所示。

3、重组杆状病毒VP2蛋白表达量的测定

在刚长成单层的sf9细胞上，以1.0MOI剂量接种重组杆状病毒Ac-PPVP2(病毒感染的细胞约2.4×10⁶个每毫升)，感染后96h收毒，SDS-PAGE电泳后定量测定显示PPV VP2蛋白的表达量约为92微克每毫升(μg/mL)。同时和贴壁HF细胞进行了对比实验，结果显示悬浮HF细胞为扩增目的基因的最佳细胞(如图5所示)。

4、重组杆状病毒Ac-PPVP2表达外源基因的稳定性检测

将重组杆状病毒Ac-PPVP2接种sf9细胞，进行传代至20代。取F1、F2、F5、F10、F15、F20代病毒感染细胞作为检测样品，以PPV VP2蛋白单抗为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot分析，结果显示F1、F2、F5、F10、F15、F20代重组病毒上感染细胞样品均能出现一条约67kD的特异条带，表明VP2蛋白能稳定表达(结果如图7示)。

5、重组杆状病毒Ac-PPVP2在昆虫细胞中形成病毒样颗粒的检测

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒Ac-PPVP2，72小时后收集病变细胞并超声波裂解。在4℃条件下8000g离心30min，然后用蔗糖浓缩到原体积的1/10，上清中即含有表达的VLP颗粒。将上清27,000rpm/min，超速离心3小时，沉淀重悬于2ml的PBS中，并用1ml的注射器反复吹打，然后病毒悬液用20-60％蔗糖密度梯度进行27,00rpm/min超速离心16小时，收集最上层的蛋白带进行电镜观察，结果显示在电子显微镜下观察到大量病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，直径约为25nm，其形态和大小都与PPV全病毒粒子相似，表明成功形成VLPs，结果如图6所示。

实施例2：

重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗的安全性、免疫效力实验

(一)、发明的重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗的安全性试验

1.重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗的制备

以实施例1获得的重组杆状病毒以3-5pfu/cell的感染复数接种(悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM,购自Invitrogen公司)sf9细胞，72h后收集细胞及上清，通过细胞破碎仪处理后离心除去细胞碎片，经7mM的二乙烯亚胺(BEI)灭活36～48小时，加入等量的硫代硫酸钠中和后与油佐剂乳化制备成亚单位疫苗，存储于4℃备用。最终获得的疫苗中外源蛋白PPV VP2蛋白为20微克每毫升(μg/ml)，用于安全性试验。

2.新生仔猪安全性试验

将实验室制备的亚单位疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康1日龄初生仔猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量(一倍剂量为20微克每毫升的疫苗，每头猪注射2毫升)细小病毒油乳剂亚单位疫苗，即每头猪注射4mL的步骤1获得的疫苗；另设4头猪为空白对照。所有仔猪在注射疫苗前以及注射疫苗后1周，每天测量2次体温并观察猪的生长状况、精神和食欲，连续观察14天。疫苗接种当天体温上升0.2-0.5℃，第二天恢复正常，精神和食欲正常，无不良反应，表明疫苗对新生仔猪是安全的。

3.妊娠母猪安全性试验

将实验室制备的亚单位疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康妊娠母猪，妊娠40天时接种，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量(一倍剂量为：20微克每毫升的疫苗，每头猪注射2毫升)细小病毒油乳剂亚单位疫苗，即每头猪注射4mL的步骤1制得的疫苗；另设2头猪为空白对照。疫苗接种后观察体温、精神、食欲和对母猪繁殖性能的影响。结果表明体温、精神和食欲均良好；妊娠母猪在接种该疫苗后，妊娠状况正常，没有出现流产、胎儿溶解等繁殖障碍的临床症状，表明该亚单位疫苗对妊娠母猪是安全的。

(二)、重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗的免疫原性实验

1.重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗免疫对小鼠的免疫原性试验

为了评价上述制备的Ac-PPVP2亚单位疫苗针对猪细小病毒的免疫原性，购买6周龄雌性Ba/bc小鼠18只，随机分成5组，每组6只。PBS阴性组，猪细小病毒灭活商业化疫苗组阳性组(兽药生字(2006)170041059，以下同)，以及ISA201VG、ISA206VG(购自Seppic公司，以下同)和AL(OH)3佐剂分别乳化的Ac-PPVP2亚单位疫苗组。免疫剂量为Ac-PPVP2组每只小鼠免疫3.0微克VP2蛋白；猪细小病毒灭活商业化疫苗组为每只小鼠100微升。免疫途径为后腿肌肉注射，3周后以同样剂量加强免疫一次。首免后0，14，28，40天进行尾静脉采血，评价其免疫效果。

猪细小病毒ELISA抗体试剂盒检测(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)结果显示：重组杆状病毒Ac-PPVP2能够诱导产生针对PPV的ELISA抗体，在首免后抗体水平一直呈升高趋势，二免疫后两周抗体水平达到峰值，之后呈现下降趋势。不同的佐剂对其免疫效果存在一定差异：抗体水平呈现ISA206VG佐剂高于ISA201VG佐剂，而ISA201VG又高于AL(OH)3，免疫28天试验组Ac-PPVP2的AL(OH)3抗体水平与阴性相比没有差异(P>0.05)，其余试验组三种佐剂抗体水平与阴性组相比都存在极显著差异(P<0.01)，但是三种佐剂之间没有差异(P>0.05)，结果如图8示。本发明ISA201VG乳化制备的亚单位疫苗的效果和商业化灭活疫苗的免疫效果相当，但是由于本发明制备的亚单位疫苗是通过生物工程的方法大量表达VP2蛋白，也可以避免在细胞上大量培养细小病毒。

2.重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗对兔的免疫原性试验

根据上述实验方案中重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗免疫对小鼠的免疫原性试验结果显示ISA206为最佳佐剂包油包水双相佐剂，进而利用ISA206乳化制备疫苗在兔体内进一步评价该亚单位疫苗的免疫效果。选购2月龄安全日本长耳大白兔18只，随机分为3组，每组6只。疫苗免疫组为本发明研制的ISA206乳化制备的亚单位疫苗，含有VP2蛋白的量为15.0微克每毫升，阳性对照为科前生物制品股份有限公司生产的猪细小别活疫苗(兽药生字(2006)170041059)；阴性对照的HF细胞。每只兔腿部肌肉注射2mL疫苗(使得VP2蛋白为30.0微克/兔)，阳性对照组同样免疫注射2毫升的商业灭活疫苗，阴性组注射2毫升的HF细胞样品。动物免疫注射首免后28d加强免疫一次。分别在免疫后0、14、28、42、56d耳静脉采血。对分离采集的血清样品猪细小病毒ELISA抗体试剂盒检测(购自武汉科前生物制品有限责任公司)。

结果显示：重组杆状病毒Ac-PPVP2和商业疫苗免疫组都能够诱导产生针对PPV的ELISA抗体，在首免后抗体水平一直呈升高趋势，加强免疫后两周抗体水平达到峰值，之后保持很较高的抗体水平。免疫14d后与阴性组相比都存在极显著差异(P<0.01)，结果如图9示。该亚单位疫苗的效果和商业化灭活疫苗，但是由于该研制的亚单位是通过生物工程的方法大量表达VP2蛋白，可以避免在细胞上大量培养细小病毒，因而具有很好的应用前景。

3、重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗对猪的免疫原性试验

将重组杆状病毒Ac-PPVP2制备的亚单位疫苗免疫3-4月龄的健康育肥猪，每组5头，疫苗颈部肌肉注射ISA206乳化制备的亚单位疫苗，使得PPV VP2蛋白为40微克/猪，免疫2次，间隔4周。同时设灭活疫苗阳性对照和非免疫组阴性对照，分别于免疫前和首免后第2、4、6和8周采集血清，检测PPV血凝抑制抗体。结果显示疫苗免疫后14天，HI抗体达到60，4周达到128，加强免疫后2周和4周，抗体水平得到显著的提升，分别达到289和428。结果如表1所示。虽然该亚单位疫苗诱导产生的抗体水平均略低于灭活疫苗诱导产生的，但是相差不明显，并且均可以满足临床应用要求。

表1：重组杆状病毒Ac-PPVP2灭活疫苗免疫猪抗体水平

注：检测PPV的血凝抑制抗体，HI＞16时判为阳性。

(三)、重组杆状病毒Ac-PPVP2亚单位疫苗的免疫效力性实验

PPV血清抗体阴性6月龄后备母猪(长大二元杂母猪)9头，随机分成3组。分别免疫ISA206佐剂乳化制备的亚单位疫苗，使得VP2蛋白为30微克/猪；猪细小病毒灭活疫苗2毫升/猪阳性组和生理盐水空白对照组。首次免疫28天后，用相同的剂量加强免疫一次，加强免疫21天以后进行配种。母猪妊娠40天时接种1×10^6.0TCID₅₀PPV强毒(博士论文：猪细小病毒基因组序列测定及结构蛋白基因的克隆、表达与基因免疫研究，赵俊龙，2001)，此后观察母猪妊娠情况，待分娩后观察产仔情况。

亚单位疫苗和猪细小病毒灭活疫苗免疫组的母猪在攻毒后妊娠正常。亚单位疫苗免疫组共产下31头活仔，健仔29头，弱仔1头，死胎1头，死胎取样进行PPV PCR检测，结果呈阴性，证实其死亡并非PPV感染造成的；猪细小病毒灭活疫苗免疫组共产下30头活仔，弱仔1头，无死胎；而空白对照组的母猪在妊娠后期的腹围有些变小，分娩后只有5头活仔，弱仔4头，死胎24头。该试验表明，重组杆状病毒Ac-PPVP2制备的亚单位疫苗可以为妊娠母猪提供抵抗PPV强毒攻击的免疫保护。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用

<130> 一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagtgaaa atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca 60

ggaaatgaat ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt 120

gtgtctacag gtagtttcaa taatcaaaca gaatttcaat acttggggga gggcttggtt 180

agaatcactg cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac 240

aaaagaatac atgtactaaa ttcagaatca ggggtggcgg gacaaatggt acaagacgat 300

gcacacacac aaatggtaac accttggtca ctaatagatg ctaacgcatg gggagtgtgg 360

ttcaatccag cggactggca gttaatatcc aacaacatga cagaaataaa cttagttagt 420

tttgaacaag caatattcaa tgtagtactt aaaacaatta cagaatcagc aacctcacca 480

ccaaccaaaa tatataataa tgatctaact gcaagcttaa tggtcgcact agacaccaat 540

aacacacttc catacacacc agcagcacct agaagtgaaa cacttggttt ttatccatgg 600

ttacctacaa aaccaactca atacagatat tacctatcat gcatcagaaa cctaaatcca 660

ccaacataca ctggacaatc acaacaaata acagactcaa tacaaacagg actacacagt 720

gacattatgt tctacacaat agaaaatgca gtaccaattc atcttctaag aacaggagat 780

gaattctcca caggaatata tcactttgac acaaaaccac taaaattaac tcactcatgg 840

caaacaaaca gatctctagg actgcctcca aaactactaa ctgaacctac cacagaagga 900

gaccaacacc caggaacact accagcagct aacacaagaa aaggttatca ccaaacaatt 960

aataatagct acacagaagc aacagcaatt aggccagctc aggtacgata taatacacca 1020

tacatgaatt ttgaatactc caatggtgga ccatttctaa ctcctatagt accaacagca 1080

gacacacaat attatgatga tgaaccaaat ggtgctataa gatttacaat gggttaccaa 1140

catggacaat taaccacatc ttcacaagag ctagaaagat acacattcaa tccacaaagt 1200

aaatgtggaa gagctccaaa gcaacaattt aatcaacagg caccactaaa cctagaaaat 1260

acaaataatg gaacactttt accttcagat ccaataggag ggaaatctaa catgcatttc 1320

atgaatacac tcaatacata tggaccatta acagcactaa acaatactgc acctgtattt 1380

ccaaatggtc aaatatggga taaagaactt gatacagatc taaaacctag actacatgtt 1440

acagctccat ttgtttgtaa aaacaatcca ccaggacaac tatttgtaaa aatagcacca 1500

aacctaacag atgatttcaa tgctgactct cctcaacaac ctagaataat aacttattca 1560

aacttttggt ggaaaggaac actaacattc acagcaaaaa tgagatccag taatatgtgg 1620

aaccctattc aacaacacac aacaacagca gaaaacattg gtaaatatat tcctacaaat 1680

attggtggca taaaaatgtt tccagaatat tcacaactta taccaagaaa attatactag 1740

<210> 2

<211> 580

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Glu Asn Val Glu Gln His Asn Pro Ile Asn Ala Gly Thr Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Arg Gly Ala Gly Gly Val Gly Val Ser Thr Gly Ser Phe Asn Asn

35 40 45

Gln Thr Glu Phe Gln Tyr Leu Gly Glu Gly Leu Val Arg Ile Thr Ala

50 55 60

His Ala Ser Arg Leu Ile His Leu Asn Met Pro Glu His Glu Thr Tyr

65 70 75 80

Lys Arg Ile His Val Leu Asn Ser Glu Ser Gly Val Ala Gly Gln Met

85 90 95

Val Gln Asp Asp Ala His Thr Gln Met Val Thr Pro Trp Ser Leu Ile

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Ala Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Ser Asn Asn Met Thr Glu Ile Asn Leu Val Ser Phe Glu Gln Ala

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Ile Thr Glu Ser Ala Thr Ser Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Ile Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Thr Lys Pro Thr Gln Tyr

195 200 205

Arg Tyr Tyr Leu Ser Cys Ile Arg Asn Leu Asn Pro Pro Thr Tyr Thr

210 215 220

Gly Gln Ser Gln Gln Ile Thr Asp Ser Ile Gln Thr Gly Leu His Ser

225 230 235 240

Asp Ile Met Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ala Val Pro Ile His Leu Leu

245 250 255

Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ser Thr Gly Ile Tyr His Phe Asp Thr Lys

260 265 270

Pro Leu Lys Leu Thr His Ser Trp Gln Thr Asn Arg Ser Leu Gly Leu

275 280 285

Pro Pro Lys Leu Leu Thr Glu Pro Thr Thr Glu Gly Asp Gln His Pro

290 295 300

Gly Thr Leu Pro Ala Ala Asn Thr Arg Lys Gly Tyr His Gln Thr Ile

305 310 315 320

Asn Asn Ser Tyr Thr Glu Ala Thr Ala Ile Arg Pro Ala Gln Val Arg

325 330 335

Tyr Asn Thr Pro Tyr Met Asn Phe Glu Tyr Ser Asn Gly Gly Pro Phe

340 345 350

Leu Thr Pro Ile Val Pro Thr Ala Asp Thr Gln Tyr Tyr Asp Asp Glu

355 360 365

Pro Asn Gly Ala Ile Arg Phe Thr Met Gly Tyr Gln His Gly Gln Leu

370 375 380

Thr Thr Ser Ser Gln Glu Leu Glu Arg Tyr Thr Phe Asn Pro Gln Ser

385 390 395 400

Lys Cys Gly Arg Ala Pro Lys Gln Gln Phe Asn Gln Gln Ala Pro Leu

405 410 415

Asn Leu Glu Asn Thr Asn Asn Gly Thr Leu Leu Pro Ser Asp Pro Ile

420 425 430

Gly Gly Lys Ser Asn Met His Phe Met Asn Thr Leu Asn Thr Tyr Gly

435 440 445

Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Thr Ala Pro Val Phe Pro Asn Gly Gln

450 455 460

Ile Trp Asp Lys Glu Leu Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg Leu His Val

465 470 475 480

Thr Ala Pro Phe Val Cys Lys Asn Asn Pro Pro Gly Gln Leu Phe Val

485 490 495

Lys Ile Ala Pro Asn Leu Thr Asp Asp Phe Asn Ala Asp Ser Pro Gln

500 505 510

Gln Pro Arg Ile Ile Thr Tyr Ser Asn Phe Trp Trp Lys Gly Thr Leu

515 520 525

Thr Phe Thr Ala Lys Met Arg Ser Ser Asn Met Trp Asn Pro Ile Gln

530 535 540

Gln His Thr Thr Thr Ala Glu Asn Ile Gly Lys Tyr Ile Pro Thr Asn

545 550 555 560

Ile Gly Gly Ile Lys Met Phe Pro Glu Tyr Ser Gln Leu Ile Pro Arg

565 570 575

Lys Leu Tyr Glx

580

Claims

1.一种人工合成的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，重组杆状病毒(Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus) Ac-PPVP2，其保藏编号为CCTCC NO: V201339。

3.包含有3拷贝权利要求1所示序列的pFBDPHm3VP2质粒。

4.权利要求2所述的重组杆状病毒在制备猪细小病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。