CN1446917A - 四环素诱导的gus基因植物花药特异性表达载体 - Google Patents
四环素诱导的gus基因植物花药特异性表达载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1446917A CN1446917A CN 02103788 CN02103788A CN1446917A CN 1446917 A CN1446917 A CN 1446917A CN 02103788 CN02103788 CN 02103788 CN 02103788 A CN02103788 A CN 02103788A CN 1446917 A CN1446917 A CN 1446917A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- gus
- tsiklomitsin
- carrier
- tapetum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 title claims description 18
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 title claims description 18
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 claims 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 17
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 abstract description 12
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 abstract description 11
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 abstract 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 abstract 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 abstract 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 abstract 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 229910000906 Bronze Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000010974 bronze Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N copper tin Chemical compound [Cu].[Sn] KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- XBBAEVVIDHSGKC-UHFFFAOYSA-N [As].[Hg] Chemical compound [As].[Hg] XBBAEVVIDHSGKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
将烟草花药特异性启动子T29与四环素诱导***结合,构建成既受四环素诱导又是花药绒毡层特异表达的TA29-Tx/TetR***。将barnase基因置于该***控制下,施加四环素后,barnase基因在花药绒毡层特异表达,其产物是一种核糖核酸酶,能够是细胞致死,从而破坏了花药绒毡层,导致植物雄性不育,为农业上作物杂交育种雄性不育系的获得开辟了一条崭新的途径。
Description
本发明涉及植物基因工程领域,即将GUS基因置于经过改造的植物花药特异性表达的嵌合启动子TA29-Tx的控制之下,使其在受到四环素诱导后,在植物花药绒毡层中特异表达。利用该嵌合启动子可使目的基因在特定的时间及空间内表达,从而有利于我们研究其基因产物的作用。
TA29是来自烟草samsum-TA29基因的启动子1。该基因的表达是花药特异性的,其产物集中在花药绒毡层中,一般是在减数***后不久就出现,在小孢子有丝***之前含量达到最高,在开花期迅速下降。根据Koltunow等2的研究,TA29启动子的转录控制序列位于其转录起始位点上游的-279~-150bp之间。该段序列是保证TA29基因在花药绒毡层中高效表达所必需的。而-207~-191之间的序列和-165~-158之间的序列是决定TA29特异表达的两个关键序列。试验表明:TA29启动子可以控制外源基因在植物花药中特异性的表达3.4。
Tx是由三个重复序列***CaMV的35S启动子TATA框两侧形成,具体序列如下 其中
序列来源于大肠杆菌(E.coli)四环素抗性操纵子的启动子区。转座子Tn10编码的TetR(tet repressor)蛋白可以与上述操纵序列紧密结合,阻止转录起始复合物的形成,从而达到从转录水平抑制下游基因的表达。
该发明的意图是将TA29启动子和Tx/TetR***的特性结合起来,从而创造一个新的***,可以使目的基因既能够被四环素诱导表达,又仅仅局限在植物花药绒毡层表达。本发明的最终目的是通过构建可被四环素诱导的Barnase基因植物花药特异性表达载体,即TA29-Tx-Barnase,利用基因枪或农杆茵侵染的办法,使此载体整合到能组成型高水平表达TetR蛋白的植物基因组中,当用人为施加四环素诱导后,Barnase基因在植物花药中高效而特异性的表达,破坏花药绒毡层,导致花粉败育,获得植物雄性不育系,从而创造一种利用化学诱导获得植物雄性不育方法,为两系法育种中雄性不育系的获得提供了一条崭新的途径。
本发明主要包括以下几方面技术:一.烟草总DNA的提取(参照王革娇等提供的方法,植物遗传转化技术手册,傅荣昭等1994)5
1.取0.5g新鲜烟草幼叶,加液氮研磨至干粉状,转入事先已放入500μl尿
素缓冲液的离心管中(8M尿素,500mM Tris.Cl pH8.0,350mM NaCl,20mM
EDTA,抽滤灭菌)。
2.摇动离心管,使植物材料于缓冲液充分混合,加入500μl的酚∶氯仿(1∶
1)。充分混匀。
3.10000rpm离心5分钟,收集上清液,转移到一干净的离心管中,加入500
μl的氯仿,重新抽提一遍。
4.转移上清到一干净的离心管中,加入2倍体积冰冷的无水乙醇,混匀,静
置沉淀10分钟。
5.15000rpm离心5分钟,收集沉淀,用75%的乙醇洗涤一遍,室温干燥10
分钟。加入200μl ddH2O溶解。
6.取5μl,用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测、定量。二·花药特异性基因TA29启动子的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)
根据已发表的TA29启动子的全序列,我们选取了该基因5′区-826~-69之间的一段作为目标序列,该序列包含TA29花药特异性表达所必需的-279~-150bp序列。设计P1,P2序列为PCR引物,5’端引物P1:5’---AGGAATTCAGTAATACACTTTTTGGT---3’;3’端引物P2:5’---TACCCGGGCTTTTGTTGGAGCATTTC---3’。反应体系为50μl,其中包括模板DNA 2μl(0.1μg/μl),P1 1μl(25pM),P2 1μl(25pM),10xBuffer 5μl,dNTPs 2μl(2.5mM),ddH2O 38μl,Taq酶1μl。反应程序为94℃预变性2分钟;94℃变性30秒,55℃退火40秒,72℃延伸1分钟,30个循环;然后72℃延伸10分钟,终止反应。三.嵌合启动子的构建
嵌合启动子由两部分组成:TA29启动子,它能使其控制基因在花药绒毡层特异表达;Tx,可以与TetR蛋白紧密结合。当将Tx***到TA29启动子TATA框适当位置,使得嵌合启动子既具有四环素诱导特性,又保持花药绒毡层特异表达特性。四.四环素诱导的GUS基因花药特异性表达裁体的构建
我们以BinHygTx为载体,将TA29启动子和Tx序列串接到该载体的多克隆位点之间,然后在其后加上GUS基因,在GUS基因的下游连上Nos终止子。这样便完成了四环素诱导的GUS基因花药特异性表达裁体的构建。GUS基因的瞬间表达检测表明,此载体不仅受四环素诱导,而且是花药绒毡层特异表达的。该载体是一个双元载体,含有农杆菌T-DNA的左右边界,可以用农杆菌侵染方法导入植物。
图例说明:
在图例(1)中,TA29是以pGT89BN质粒为模板,根据陈潜等6的文章上的序列设计了引物P1,P2,通过PCR方法扩增得到,在其两端分别加上EcoRI和SmaI酶切位点。pGEM-T为一种大肠杆菌质粒载体,Amp为氨苄青霉素抗性,其上的酶切位点标明如图。
图例(2)中,载体pGEM-TA29由pGEM-T构建而来,其多克隆位点中***了TA29启动子。质粒pUCA7-TX是德国Gottingen大学教授C.Gatz惠赠。
图例(3)中,载体pUCA7-TA29-TX由pUCA7-TX构建而来,TX序列恰好位于TA29启动子TATA box框处。
图例(4)中,载体pBI221和pGEM7Zf均为本实验室保存载体。
图例(5)中,载体pGEM-GUS是将pBI221上GUS基因切下,***pGEM7Zf载体多克隆位点构建而成,目的是使GUS基因两端获得新的酶切位点。
图例(6)中,载体pUCA7-TA29-TX和pGEM-GUS分别为上述图例(3)和(5),Bin-Hyg-TX是德国Gottingen大学教授C.Gatz惠赠。将TA29-TX片断和GUS基因分别从pUCA7-TA29-TX和pGEM-GUS上切下,置换掉Bin-Hyg-TX上35S-Tx片断,构建成载体Bin-Hyg-TA29-TX-GUS,即四环素诱导的GUS基因植物花药特异性表达载体。该载体既适合于农杆菌侵染转化,也适合于基因枪转化。
实施例1烟草总DNA的提取(参照王革娇等提供的方法。植物遗传转化技术手册,付荣昭等1994)
1.取0.5g新鲜烟草幼叶,加液氮研磨至干粉状,转入事先已放入500μl
尿素缓冲液的离心管中(8M尿素,500mM Tris.Cl pH8.0,350mM NaCl,20mM
EDTA,抽滤灭菌)。
2.摇动离心管,使植物材料于缓冲液充分混合,加入500μl的酚∶氯仿(1∶
1)。充分混匀。
3.10000rpm离心5分钟,收集上清液,转移到一干净的离心管中,加入500
μl的氯仿,重新抽提一遍。
4.转移上清波到一干净的离心管中,加入2倍体积冰冷的无水乙醇,混匀,
静置沉淀10分钟。
5.15000rpm离心5分钟,收集沉淀,用75%的乙醇洗涤一遍,室温干燥10
分钟。加入200μl ddH2O溶解。
6.取5μl,用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测、定量。
实施例2TA29启动子的PCR扩增与克隆
根据已发表的TA29启动子的全序列,我们选取了该基因5′区-826~-69之间的一段作为目标序列,该序列包含TA29花药特异性表达所必需的-207~-191之间的序列和-165~-158之间的序列。设计P1,P2序列为PCR引物,5’端引物P1:5’---AGGAATTCAGTAATACACTTTTTGGT---3’;3’端引物P2:5’---TACCCGGGCTTTTGTTGGAGCATTTC---3’。反应体系为50μl,其中包括模板DNA 2μl(0.1μg/μl),P1 1μl(25pM),P2 1μl(25pM),10xBuffer 5μl,dNTPs 2μl(2.5mM),ddH2O 38μl,Taq酶1μl。反应程序为94℃预变性2分钟;94℃变性30秒,55℃退火40秒,72℃延伸1分钟,30个循环;然后72℃延伸10分钟,终止反应。
取40ulPCR扩增产物,1%琼脂糖凝胶电泳,将合适大小的条带切下,用DNA片段快速纯化/回收试剂盒(由北京鼎国生物技术发展中心生产)回收PCR扩增产物。将回收的PCR产物与载体pGEM-7Z按摩尔比1∶1的比例混合,加入Gibico公司生产的T4 Ligase于4℃连接过夜。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。
实施例3四环素诱导的GUS基因花药特异性表达载体的构建
1.用EcoRI/SmaI双酶从质粒pGEMT-TA29上切下TA29片段,琼脂糖凝胶电泳、回收。
2.用EcoRI/EcoRV双酶处理质粒pUCA7-Tx,琼脂糖凝胶电泳并回收pUCA7-Tx载体。
3.将上述回收的TA29片断和pUCA7-Tx载体以3∶1的摩尔比混匀,加入T4 DNA连接酶,4℃连接过夜。
4.将连接产物转化处于感受态的大肠杆菌DH5α,在含有70μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜。
5.挑取阳性克隆,提取质粒,通过限制性内切酶图谱分析,确认各个元件都处于正确连接,将该质粒命名为pUCA7-TA29-Tx。
6.将GUS片段(质粒pBI221经SacI酶切,T4 DNA聚合酶补平,再用BamHI酶切获得)***经过BamHI/SmaI双酶处理的pGEM-7Z载体,获得重组质粒pGEM-7ZGUS。
7.将TA29-Tx片段(pUCA7-TA29-Tx质粒经过EcoRI/BamHI双酶处理后获得)和GUS片段(pGEM-7ZGUS质粒经过BamHI/XbaI双酶处理后获得)***经过EcoRI/XbaI双酶切处理的BinHygTx载体中,这样就使得TA29-Tx-GUS片断处于T-DNA的LB和RB之间,可以用根癌农杆菌侵染的方法将此载体转入植物。将该质粒命名BinHyg-TA29-Tx-GUS。略图如下:
实施例4将外源目的基因通过基因枪法转入烟草细胞内的技术
受体材料的准备:烟草TetR2/3(Nicotiana tabacum CV.Wisconsin 38)能组成型高水平表达TetR蛋白。将其种子以70%乙醇灭菌10秒,无菌水洗两遍,再经1‰砷汞灭菌3~5分钟,无菌水洗两遍,然后平铺于含50mg//L Kan、1%琼脂的MS12培养基上,置于培养间(16h光照/每天,25℃)培养。当长至10~15cm时,将其移植到花盆中,置于温室(15~28℃),待烟草刚长出花蕾,取未开花蕾灭菌(方法同烟草种子灭菌同)。将花粉剥出,用无菌刀片将每粒花粉横向切成小片,横切面朝上,置于含MS高渗培养基(MS+0.4mol/L甘露醇)的培养皿中央,范围为直径3cm的圆形,预培养5个小时。其对照材料子房,也经上述同样方法处理。
微粒子弹的准备:称60mg金粉于1ml 70%酒精中,充分涡旋,静置15min,1500rpm离心5min。去上清液,加1ml蒸馏水,充分涡旋,1500rpm离心5min,去上清液,重复三次。将金粉转入1ml50%甘油中,制成60mg/ml的金粉悬浮液。取50μl悬浮液,按顾序加入1μg/μl质粒DNA 5μl、2.5mol/L CaCl2 50μl和0.1mol/L亚精胺20μl,涡旋10min,1500rpm离心5sec,去上清液。250μl 100%乙醇洗一次,涡旋,1500rpm离心5min,去上清液,重复一次。最后,金粉悬浮于60μl 100%乙醇中。
取6μl包被DNA的金粉悬浮液,装备基因枪(PDS-1000型,美国BioRod公司制造),每个培养皿轰击一次,子弹与烟草细胞之间的距离为6cm。轰击后,将培养皿于适宜条件下培养。整个轰击过程在无菌状态下进行。
与本发明相关的参考文献
1.Seurinck,J.et al.,1990,Trends Biochem.Sci.14,450-454
2.A.M.Koltunow,J.Truettner,R.B.Goldberg et al.(1990)Different Temporaland Spatial Gene Expression Patterns Occur During Anther Development.ThePlant Cell 2.1201-1224
3.Mariani,C.et al.,1990,Nature 347,737-741
4.mariani,C.et al.,1992,Nature 357,384-387
5.傅荣昭等,1994,植物遗传转化技术手册,中国科学技术出版社,北京
6.陈潜,汪迎春,张利明等花药特异嵌合启动子的构建及雄性不育转基因拟南芥的获得农业生物技术学报,2001,9(1):62-64
Claims (5)
1.一种质粒载体,含有受四环素诱导、花药特异性表达的嵌合启动子,β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因,终止子和筛选标记基因。其特征在于处于该嵌合启动子控制下的GUS基因,仅在受四环素诱导后才在植物花药绒毡层特异表达。
2.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于GUS基因的5’端组装了受四环素诱导、花药绒毡层特异性表达的嵌合启动子TA29-Tx,该嵌合启动子可以调节GUS基因在受到四环素诱导后在植物花药绒毡层中特异表达。
3.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于在GUS基因的3’端串联组装了增强表达能力的NOS终止子.
4.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于在该载体上组装了HPT-II基因,作为转基因植物的筛选标记,可以用潮霉素筛选;作为转基因微生物的筛选标记,可以用卡那霉素筛选。
5.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征是在该载体上用核糖核酸酶基因(Barnase)置换GUS基因。受到四环素诱导后,Barnase基因在上述嵌合启动子控制下在花药绒毡层高效表达而获得植物雄性不育系。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 02103788 CN1446917A (zh) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | 四环素诱导的gus基因植物花药特异性表达载体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 02103788 CN1446917A (zh) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | 四环素诱导的gus基因植物花药特异性表达载体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1446917A true CN1446917A (zh) | 2003-10-08 |
Family
ID=28048376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 02103788 Pending CN1446917A (zh) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | 四环素诱导的gus基因植物花药特异性表达载体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1446917A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101993878A (zh) * | 2010-10-14 | 2011-03-30 | 南京农业大学 | 一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体 |
CN102816793A (zh) * | 2012-08-22 | 2012-12-12 | 陕西师范大学 | 单载体双向启动的Tet-on诱导表达***及其构建方法和应用 |
-
2002
- 2002-03-25 CN CN 02103788 patent/CN1446917A/zh active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101993878A (zh) * | 2010-10-14 | 2011-03-30 | 南京农业大学 | 一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体 |
CN101993878B (zh) * | 2010-10-14 | 2012-04-18 | 南京农业大学 | 一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体 |
CN102816793A (zh) * | 2012-08-22 | 2012-12-12 | 陕西师范大学 | 单载体双向启动的Tet-on诱导表达***及其构建方法和应用 |
CN102816793B (zh) * | 2012-08-22 | 2014-09-10 | 陕西师范大学 | 单载体双向启动的Tet-on诱导表达***及其构建方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102154364A (zh) | 一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法 | |
CN107142271A (zh) | 在基因打靶中具有高突变效率的PL‑LbCpf1‑RR基因及其应用 | |
CN1225133A (zh) | 标记基因可从其上选择性地去除的用于将基因导入植物的载体 | |
WO2001096583A2 (en) | Removal of selectable markers from transformed cells | |
CN107190019A (zh) | 一种农杆菌介导的麻竹转化方法 | |
CN1446917A (zh) | 四环素诱导的gus基因植物花药特异性表达载体 | |
CN104726489B (zh) | 农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法 | |
CN1888071A (zh) | 川草二号老芒麦转抗虫基因技术 | |
CN107794278B (zh) | 一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法 | |
CN102286527A (zh) | Dreb基因转化红掌的遗传转化方法 | |
CN111286464B (zh) | 一种表达几丁质酶的工程菌及植物促生长应用 | |
CN114736907A (zh) | 扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR及其应用 | |
CN101265480B (zh) | 克服根癌农杆菌介导小麦幼胚褐化的转化方法及其专用培养基 | |
CN101463393A (zh) | 一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法 | |
CN105112423A (zh) | 一种增强桑树抗病能力的miRNA的克隆及其应用 | |
CN103820490B (zh) | 一种使用病毒诱导的基因沉默***培育雄性不育植株的方法 | |
CN113755519B (zh) | 一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法 | |
CN1280626A (zh) | 采前和采后贮藏化合物再转移的抑制 | |
CN1298850C (zh) | 一种能够使转基因植物自主剔除标记基因的方法 | |
CN108179153B (zh) | 农杆菌eha105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法 | |
CN115677839B (zh) | 水稻OsTOPBP1C蛋白及其编码基因的应用 | |
CN112553243B (zh) | CRISPR/xCas9基因编辑***在棉花中的应用 | |
CN1596617A (zh) | 一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用 | |
CN102559703A (zh) | 一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用 | |
CN1392260A (zh) | 采用两套重组***删除特定外源基因的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |