CN1298850C - 一种能够使转基因植物自主剔除标记基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。利用λ噬菌体attP特异重组位点以及其重组酶基因INT，构建植物转化载体pAMF，它含有重组酶基因INT、目的基因和选择标记基因，INT由地米塞松特异诱导型启动子驱动，和选择标记基因共同位于两个attP位点之间，目的基因位于attP位点外侧。通过农杆菌转化或其他方法获得该载体的转化植株或愈伤。转化植株自交纯化后，地米塞松诱导INT表达特异切除两attP位点间的标记基因和本身，自交后从其分离后代中选无标记基因植株。或利用地米塞松诱导愈伤使INT表达，特异切除两位点间的INT本身和标记基因，切除标记基因的愈伤无标记基因抗性，选取非抗性愈伤诱导成苗即为无标记基因的转基因植株，最后经过PCR或Southern分子检测确认。

Description

一种能够使转基因植物自主剔除标记基因的方法

                                   技术领域

本发明公开了一种能够使转基因植物中自主剔除标记基因的方法，属于植物基因工程领域。本发明具体涉及相关基因和结构元件的分离克隆、相关载体构建、植物遗传转化以及无标记基因转基因植株的田间筛选和分子鉴定等方法。目的主要在于创造一种全新高效的方法，剔除转基因植物体所携带的标记基因，获得只含有目的基因的转基因植株，提高转基因农产品的生物安全性。

                                   背景技术

植物转基因过程中，由于外源DNA被植物细胞吸收和整合进入植物基因组的频率很低，为了有效的选择、识别和鉴定转化的细胞和植株，导入目的基因的同时，需要引入选择标记基因以赋予受体植物特定的抗性。目前，所用的标记基因主要是编码抗生素或除草剂的基因。随着转基因植物的获得，标记基因已不再具有利用价值，但它仍在植物中不断指导相应的酶合成，消耗细胞资源，而且标记基因的生物安全问题也对消费心理也形成一定压力。开发无标记基因或剔除标记基因的转基因***，创造无标记基因的转基因植物具有重要意义。

目前，获得无标记基因转基因植物的方法可归纳为回避策略和剔除策略两大类，前者包括无标记基因转化法、生理代谢基因选择法、目的基因载体与标记基因载体共转化法，后者包括标记基因切除法。无标记基因转化法需借助PCR扩增直接对获得的非选择再生苗进行检测鉴定，后期选择工作量大，费用高，局限性大。生理代谢基因选择法需转入的生理代谢相关基因，影响植物个体发育，也不宜采用。较为实用的是后两种方法，即双载体共转化法和标记基因切除法(即位点特异重组法)等。

位点特异重组法是将标记基因置于特定重组位点之间，通过相应的特异识别该位点的重组酶催化，产生特异重组或特异切除，利用此特性可将标记基因剔除。在转基因植物标记基因的剔除过程中，利用重组位点和重组酶的特点构建特异植物转化载体***，即将标记基因置于T-DNA片段上的两个特异重组位点间，同时将相应的重组酶基因构建到另一个植物转化载体上，得到的两种转化植株杂交，重组酶基因表达实现标记基因的特异切除。目前主要发现了来源于微生物的五类位点特异重组***，即细菌噬菌体P1的Cre-loxP***、酵母质粒FLP-FRT***、Zygosaccharomyces rouxii的R/RS***、Mu噬菌体的Gin-gix重组酶***以及λ噬菌体attB-P***。

Cre-loxP***的lox位点由34bp特异序列构成，其中有8bp是核心序列，Cre重组酶是一个38.5KD的蛋白质，专一性的识别和催化两loxP位点之间序列的重组。利用了Cre-loxP特异位点重组***切除转基因植物中的标记基因已在烟草、拟南芥等植物上获得成功(Gleave，A.p，Mitra，D.S.and Morris，B.A.M.，1999，Selectable marker-free transgenic plants without sexual crossing：transient expression of Crerecombinase and use of a conditional lethal dominant gene.Plant Mol.Biol.40，223-235)(Zuo J，Niu Q.W.，2001，Chemical-regulated，site-specific DNA excision in transgenic plants.Nature Biotech.19：157-161)。但有报道指出，在Cre-loxP***中引入瞬时表达Cre重组酶的切除并不彻底、效率很低，还需要再一轮的组培再生过程，因此其可行性较差(Zuo J，Niu Q.W.，2001，Chemical-regulated，site-specific DNA excision intransgenic plants.Nature Biotech.19：157-161)。

酵母FRT位点也是由34bp特异序列构成，其中8bp是核心序列，FLP是48KD的其专一重组酶蛋白。Lloyd等(1994)将酵母的FLP-FRT位点重组***应用于烟草，实验发现，FLP重组酶在植物组织中具有表达活性，可切除GUS标记基因，但重组酶表达效率较低，(Lloyd，A.M.，Davis，R.W.，1994，Functionalexpression of the yeast FLP/FRT site-specific recombination system in Nicotiana tabacum.Mol.Gen.Genet.242：653-657)。而Zygosaccharomyces rouxii的R/RS***和Mu噬菌体的Gin-gix重组酶***，则与Cre-loxP和FLP-FRT***相似，但在植物中还未见应用的报道。

以上方法不仅效率低，而且均需要通过重组酶切除与后代的分离选择过程，周期较长，工作量大。利用λ噬菌体attB-P***不仅可以实现标记基因的自主剔除，且周期短，便于人为控制，还可以应用于无性繁殖植物。attB位点的序列段较短(21bp)，核心序列7bp，attP位点由352bp特异序列构成，同attB位点一样，核心序列也为7bp。λ-att重组酶基因(INT)，可特异识别attB和att-P位点并进行位点间序列的特异切除。

目前，利用att特异位点进行载体构建和基因克隆的申请专利仅有一项，是本申请人剔除一项发明创造，改发明的名称为“一种位点重组反向克隆基因的方法及其利用”，申请号：01130855.9，改发明与本发明不同。利用att特异位点自主重组实现标记基因的剔除的文献检索到一篇，但其效率很低(Zubko E，ScuttC，Meyer P.，2000，Intrachromosomal recombination between attP regions as a tool to remove selectable markergenes from tobacco transgenes.Nature Biotech.18：442-445)，没有申请专利。迄今为止引入INT重组酶识别att位点切除标记基因的研究在植物上还未见相关报道和专利申请。

                                     发明内容

本发明的目的在于利用λ噬菌体attP特异重组位点以及其重组酶基因INT，构建特殊的植物转化载体并转化植物，使转基因植物能自主剔除本身携带的标记基因，获得只含有目的基因的转基因植株，有利于提高转基因农产品的生物安全性。

本发明通过下列方案实施：

一种能够使转基因植物自主剔除标记基因的方法，利用λ噬菌体识别序列(attP)特异重组位点及其重组酶基因(INT)，构建植物转化载体pAMF，通过根癌农杆菌或其他植物遗传转化方法获得该载体的转化植株或愈伤组织。转化植株自交选择获得纯合，经地米塞松诱导后，从其自交分离后代中选择剔除标记基因的植株；获得的愈伤可通过地米塞松诱导，选取非抗性愈伤诱导成苗获得无标记基因转基因植株；通过PCR或Southern杂交分子鉴定方法进一步确认。

能够使转基因植物自主剔除标记基因的方法按照下列步骤：

(1)根据λ噬菌体基因组序列设计引物：分别获得重组酶基因及其识别序列(attP)。扩增INT的正反引物分别是：INTF：5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′，INTB：5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′，扩增attP位点的正反引物分别是：attPF：5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′，attPB：5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′：

(2)构建植物转化载体pAMF：以pBI121质粒为基本载体，对其以PmeI酶切并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接后定名为pPBIP。以SdaI对pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端补平并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接后即构建成载体pMFB；

将质粒pTA7002进行SpeI酶切后用T4DNA聚合酶末端补平，以XhoI进行第二酶切，切胶回收；质粒pMDTINT以SacI酶切后用T4DNA聚合酶补平末端，以SalI进行第二酶切，切胶回收小片段；两者回收产物连接，命名为pTAINT。

对pTAINT进行SdaI和StuI双酶切后T4DNA聚合酶补平末端，切胶回收小片段；对pMFB以HindIII酶切后T4DNA聚合酶补平末端，切胶回收；两者回收产物连接从而将标记基因与重组酶基因一同构建至位点特异性重组识别序列之间，其中重组酶基因由地米塞松特异诱导表达，命名为pAMF，其中的GUS可替换成任意目的基因；

(3)植物的遗传转化与纯化：

通过基因枪或农杆菌介导方法，利用构建的植物转化载体进行转化，获得转基因植株，再通过筛选抗生素或筛选除草剂喷施法，进一步自交纯化选择，获得该基因纯合的单株或株系；

(4)标记基因的剔除：

利用地米塞松诱导愈伤组织后，选取非抗性愈伤组织诱导成苗，即为剔除标记基因的转基因植株；或通过对获得的纯合转基因植株喷施地米塞松诱导，然后对其自交后代的幼苗喷施相应的选择抗生素(例如在本发明的其中一个实施例番茄中，所采用的抗生素为100mg/L卡那霉素)，选择对该抗生素敏感的植株，即为剔除标记基因的植株。

(5)分子鉴定：

根据目的基因和标记基因设计特异引物或合成特异探针，同时对获得的植株进行PCR扩增或Southern杂交检测，标记基因为阴性而目的基因呈阳性的植株即为剔除标记基因的转基因植株。

更详细的操作步骤如下列所述：

1.λ噬菌***点特异性重组***所需元件的克隆。

根据λ噬菌体基因组序列(美国生物技术信息中心基因注册号：NC_001416)设计引物，分别获得重组酶基因(INT)及其识别序列(attP)。扩增INT的正反引物分别是：INTF：5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′INTB：5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′attP位点的正反引物分别是：attPF：5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′attPB：5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′

PCR反应体系为：在20μL反应体系中，分别加入13.65μL ddH₂O，1.5mM/L MgCl₂，0.2mM/LdNTPs，0.5μM/L正向和反向引物，0.25μLλ噬菌体裂解物，0.5UTqDNA聚合酶。扩增INT的反应循环参数为：94℃预变性3min，然后94℃1min，62℃1min，72℃1min30s，反应30个循环，最后72℃延伸10min。扩增attP反应循环参数：94℃预变性3min，然后94℃1min，56℃1min，72℃40s，反应30个循环，最后72℃延伸10min。

INT和attP的PCR特异片段经切胶回收。前者片段回收产物与pMD18-T载体(Takara公司)连接，而后者回收产物和pGEM-T Easy载体(Promega公司)连接，分别转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒进行酶切后电泳分析鉴定，获得***目的片段的重组克隆，分别命名为pMDTINT和pGTP。进一步序列分析证明，重组克隆pMDTINT和pGTP中***片段分别为INT和attP位点。其序列分别如下：

INT序列(1071bp)：

ATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGA

CGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGAATCGCTAACACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACA

CAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGA

ATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAA

AAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACACTGAGCGATGCATTCCG

AGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCAGCAAAATCAGAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCT

GACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAG

TTGGTGATTTATGCGAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCC

AACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCA

TCTACTCGTCGCGAACCGCTTTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATC

CGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAA

GTCGGACACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAA。

②attP序列为(353bp)：

GATTGCGAGGCTTTGTGCTTCTCTGGAGTGCGACAGGTTTGATGACAAAAAATTAGCGCAAGAAGACAAAAATCACCTTGCGCTAATGCTC

TGTTACAGGTCACTAATACCATCTAAGTAGTTGATTCATAGTGACTGCATATGTTGTGTTTTACAGTATTATGTAGTCTGTTTTTTATGCA

AAATCTAATTTAATATATTGATATTTATATCATTTTACGTTTCTCGTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTT

ATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGATTTCAATTTTGTCCCACTCCCTGCC。

2.构建表达载体：

构建植物转化载体pAMF。pAMF的T-DNA区内含有λ噬菌体重组酶基因(INT)、选择标记基因和目的基因，INT和标记基因位于两个λ噬菌***点特异性重组位点attP正向重复序列之间，目的基因位于两attP外侧。其中重组酶基因(INT)由地米塞松诱导启动子pDEX驱动(如图2)。

(1)pMFB的T-DNA区含有目的基因(图中为GUS，可替换成任何目的基因)和选择标记基因(可以是任何选择标记基因)，选择标记基因位于λ噬菌***点特异性重组位点attP正向重复序列之间。其构建具体步骤如下：以pBI121质粒(美国生物技术信息中心注册号：AF485783)为基本载体，对其以PmeI酶切并CLAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段。并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接从而将片段attP***pBI121的PmeI位点，定名为pPBIP。以SdaI对pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端补平并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接从而将attP***pPBIP的SdaI位点，构建成载体pMFB。

(2)质粒pTA7002进行SpeI酶切后用T4DNA聚合酶末端补平，以XhoI进行第二酶切，切胶回收。质粒pMDTINT以SacI酶切后用T4DNA聚合酶补平末端，以SalI进行第二酶切，切胶回收小片段。两者回收产物连接从而将INT构建至pTA7002的诱导性启动子下游，命名为pTAINT。

(3)对pTAINT进行SdaI和StuI双酶切后T4DNA聚合酶补平末端，切胶回收小片段。对pMFB以HindIII酶切后T4DNA聚合酶补平末端，切胶回收。两者回收产物连接从而将标记基因与重组酶基因一同构建至位点特异性重组识别序列attP之间，其中重组酶基因(INT)由地米塞松特异诱导表达，命名为pAMF，其中的GUS可替换成任意目的基因。

3.植物的遗传转化：

通过农杆菌介导或其他转基因方法把pAMF转入植物，获得转化愈伤组织或转基因植株，转基因植株纯化，获得纯合的转基因植株或株系。

农杆菌介导的遗传转化获得转基因番茄的步骤如下：准备无菌苗子叶或下胚轴外植体，于KCMS上烟草悬浮细胞看护培养过夜(也可不用看护培养)。用以MS0.2稀释至O.D.≈0.3的农杆菌浸染外植体5分钟，滤纸吸干，回接到预培养基(看护培养基)共培养2天，转移到选择再生培养基，待再生芽长至1cm左右，转移至生根培养基。生根后炼苗移栽。

转基因植株纯化步骤如下：对于pAMF转化的植株，收获第一代种子即T1代。由于T1代进行了分离，利用选择抗生素喷施法对转基因植株的T1代植株进行了筛选，具有该抗生素抗性的植株为含有转基因的纯合与杂合植株，从T1代抗性植株上按单株收获种子，即T2代。继续利用抗生素喷施法选择T2代植株，在T2代不再分离的株系，证明其对应的T1代植株为纯合单株，该株系为纯合株系。

4.标记基因的剔除：

如果是转化的愈伤组织，可利用地米塞松诱导，使INT重组酶表达，识别attP位点，特异切除两位点间的重组酶本身和标记基因，切除标记基因的愈伤组织不具有标记基因相应的抗性，选取非抗性愈伤诱导成苗，即为剔除标记基因的转基因植株。

如果获得了纯合的转基因植株，则通过喷施地米塞松诱导植株或种子，使INT重组酶表达，识别attP位点，特异切除两位点间的重组酶本身和标记基因。切除标记基因的植株不具有标记基因相应的抗性，在选择诱导植株的自交后代中即可选择出来。即通过幼苗期间喷施一定浓度的相应的选择抗生素(如卡那霉素或除草剂)，不具备抗性的植株通常出现白斑，这些植株即是剔除标记基因的植株。

5.分子鉴定

根据目的基因和标记基因设计特异引物或合成特异探针，同时对获得的植株进行PCR扩增或Southern杂交检测，标记基因为阴性而目的基因呈阳性的植株即可确定为剔除标记基因的转基因植株。具体步骤可参见图1所示。

                                  附图说明

图1.是本发明的流程图；

图2.本发明的可自主剔除标记基因的植物转化载体pAMF，GUS可替换成目的基因；

图3.本发明的可自主剔除标记基因NPTII的植物转化载体pAMF1，目的基因为GNA；

图4.本发明的可自主剔除标记基因NPTII的植物转化载体pAMF2，目的基因为CHITINASE；

图5.本发明实施例1分子鉴定结果，图中1--未剔除标记基因的纯合植株，2--剔除标记基因植株；380bp片段：GNA片段，740bp片段：标记基因NPTII片段。

图6.本发明实施例2分子鉴定结果，1、2：：未剔除标记基因的纯合植株，3：剔除标记基因植株；1180bp片段：p35S-CHITINASE嵌合基因片段，740bp片段：标记基因NPTII片段，400bp片段：INT片段。

                             具体实施方式

实例1：无标记抗蚜虫转基因(GNA)油菜植株的获得

同翅目蚜虫不仅咬伤作物，堵塞气孔，更为严重的是，由于伤口导致病原体侵染，引起作物多种病害。据统计，蚜虫是100多种不同病毒病害的传播载体。雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalid Agglutinin，GNA)来源与植物雪花莲，其表达产物专一抵抗同翅目昆虫，对人和高等动物无害。目前该基因由水稻韧皮部特异表达启动子驱动，已经转移到水稻、番茄等作物中，具有良好的抗蚜虫和抗病毒病效果。获得无标记基因转GNA的油菜步骤如下：

1.、构建载体：

利用本发明的载体pAMF进行改造，把水稻韧皮部特异启动子RSs1与GNA构建成嵌合基因，替换pAMF中的目的基因及其启动子，选择标记基因NPTII和INT位于两个attP位点之间，INT由地米塞松诱导型启动子驱动。该载体命名为pAMF1。

2.、油菜遗传转化

利用根癌农杆菌介导的遗传转化法，把pAMF1载体中T-DNA区段导入油菜，以卡那霉素为选择抗生素，获得转基因植株；

3、转基因植株的纯化

根据孟得尔的基因分离定律，利用选择标记基因为筛选标记，通过卡那霉素喷施法(50mg/L)，在T1代中选择出纯合的单株和株系；

4、标记基因的剔除

对纯合单株喷施地米塞松诱导表达，切除NPTII和INT本身，该单株进行自交，通过叶面喷施50mg/L的卡那霉素，后代中选择对于卡那霉素没有抗性的植株；

5、分子鉴定

选取对卡那霉素没有抗性的植株，提取DNA，以NPTII、INT和GNA特异引物进行扩增，GNA鉴定为阳性而NPTII和INT鉴定为阴性的植株即为无标记基因的转GNA油菜植株。PCR鉴定结果图5。

实例2：无标记基因抗真菌病害转基因(几丁质酶基因，CHITINASE)番茄材料的选育

几丁质酶基因编码产物为几丁质酶EC.3.2.11.14是以几丁质(聚乙酰氨基葡萄糖)为底物的一种水解酶几丁质酶，可以分为不同的类别，总体上可分为酸性几丁质酶和碱性几丁质酶两大类。几丁质是许多病原真菌菌丝细胞壁的组成成分，几丁质酶一方面可以直接降解真菌菌丝顶端的几丁质从而抑制真菌的生长，另一方面则通过降解几丁质后释放大量的寡糖，寡糖作为激发子诱导植物产生抗病反应，从而有效抵挡病原真菌的进攻。因此，植物几丁质酶对于防治农作物真菌性病害具有重要意义。

1.、构建载体：

利用本发明的载体pAMF进行改造，把CHITINASE基因替换pAMF中的目的基因，选择标记基因NPTII和INT位于两个attP位点之间，INT由地米塞松诱导型启动子驱动。该载体命名为pAMF2。

2.、番茄遗传转化：

利用根癌农杆菌介导的遗传转化法，把pAMF2载体中T-DNA区段导入番茄，以卡那霉素为选择抗生素，获得转基因植株；

3、转基因植株的纯化：

根据孟得尔的基因分离定律，利用选择标记基因为筛选标记，通过卡那霉素喷施法(100mg/L)，在T1代中选择出纯合的单株和株系；

4、标记基因的剔除：

对纯合单株喷施地米塞松诱导表达，切除NPTII和INT本身，该单株进行自交，后代中选择对于卡那霉素没有抗性的植株；

5、分子鉴定：

提取对卡那霉素没有抗性的植株DNA，以NPTII、INT和CHITINASE特异引物进行扩增，CHITINASE鉴定为阳性而NPTII和INT鉴定为阴性的植株即为无标记基因的转CHITINASE番茄植株。PCR鉴定结果如图6。

Claims (1)

1、一种能够使转基因植物自主剔除标记基因的方法，其特征在于，利用λ噬菌体特异重组位点attP及其重组酶基因INT，制备出植物转化载体pAMF，通过根癌农杆菌或其他植物遗传转化方法获得该载体的转化植株或愈伤组织，使转化植株自交选择获得纯合，经地米塞松诱导后，从其自交分离后代中选择剔除标记基因的植株；获得的愈伤通过地米塞松诱导，选取非抗性愈伤诱导成苗获得无标记基因转基因植株；通过PCR或Southern杂交分子鉴定方法进一步确认。

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