CN1596617A - 一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用，主要步骤包括：以草地早熟禾的种子苗茎尖为材料，离体培养诱导茎尖基部膨大，切取膨大组织转入继代及成丛培养基上诱导丛生芽发生。在继代及成丛培养基上丛生芽块持续增殖，转入成苗培养基和生根培养基后产生完整植株。取适宜生长期的丛生芽块为受体采用基因枪轰击法或农杆菌介导法进行遗传转化，获得转基因植株。在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Silwet L－77处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的早熟禾转基因技术体系。

Description

一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种早熟禾遗传转化体系的方法及应用，属于农业生物技术领域或植物基因工程领域。

背景技术

草地早熟禾(Poa pratensis L.)属冷季型草坪草，是温带地区重要的草种之一。由于它具有色美、抗寒能力强、耐荫、耐修剪等优点，在我国北方地区多被用作建坪草种之一。草地早熟禾亦有自身的缺点，如易受病虫危害，不耐炎热，耐高低温能力差，抗旱力不强等。这些性状在一定程度上都可以通过基因转化的手段得到改良。成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体***的建立。1985年，Vasil在国际草原学大会上第一次提出利用遗传转化技术将其他来源的特定基因导入牧草的可行性，为应用基因工程技术改良牧草，包括提高产量和利用率、增加牧草的抗逆性等奠定了理论基础。通过基因工程技术培育出各种优质高产的牧草和草坪草新品种，对促进无污染绿色养殖业和绿色畜产品的发展以及我国西部地区生态环境建设都会产生深远的影响。

早熟禾遗传转化体系建立的难度较大，主要是由于已有的早熟禾组织培养和植株再生体系不能满足转基因的需要。草地早熟禾的组织培养，国内外主要集中于愈伤组织诱导及其分化方面。早在1984年，McDonnel等以早熟禾(Kentucky bluegrass)成熟胚为外植体，诱导出愈伤组织并再生植株。1986年，Boyd等也报道了以早熟禾成熟胚为材料诱导愈伤组织和植株再生的工作。1988年，Van der Valk等报道了以早熟禾花序为外植体诱导植株再生和以成熟胚为材料诱导愈伤组织的工作。同年，Van der Valk等还报道了建立草地早熟禾的原生质体悬浮培养体系并获得白化苗工作。1989年，Van der Valk等报道了以花序和成熟种子为外植体建立草地早熟禾再生体系，发现花序比成熟种子更易于形成胚性愈伤组织。1991年，Van Ark等也报道了早熟禾成熟胚培养及愈伤组织诱导等工作。1993年，Nielsen等从早熟禾的胚性悬浮细胞再生出绿色植株。1994年，朱根发等以草地早熟禾胚轴及幼穗为外植体，研究了其培养条件和分化能力，发现草地早熟禾成熟胚愈伤组织的胚胎发生能力很差，胚轴也很难诱导出具较高分化能力的愈伤组织，二者均不是理想的外植体；而从幼穗中可以诱导出胚性愈伤组织。1995年，Van derValk等以成熟种子为外植体诱导愈伤组织，发现含有6-BA(6-苄基嘌呤)  的培养基的诱导频率要高于不含6-BA的，不同品种间的诱导率相差很大，通过混合使用2，4-D(2，4--二氯苯氧乙酸)和6-BA可大幅度提高体细胞胚和植株的再生率。同年，Griffia等报道了从早熟禾种子产生的愈伤组织可高频率再生植株，但愈伤组织经过继代培养后植株再生频率迅速下降。1996年，Ke等报道了早熟禾盾片培养再生植株的工作。2003年，佘建明等报道了在继代培养中，早代选择外表呈干燥、紧密、颗粒状的愈伤组织能有效地克服随着继代培养时间的延长愈伤组织再生植株的能力显著下降这一障碍。朱根发等人工作中以幼穗为外植体虽诱导率能达到100％(朱根发等，1994)，但由于取材受季节限制，所以很多人仍采用种子胚为外植体诱导愈伤组织。由于草地早熟禾成熟胚的愈伤组织分化频率偏低和胚性愈伤组织难于继代培养等原因，从而影响了草地早熟禾转基因工作的开展。直到1999年，马忠华等以早熟禾成熟种子为外植体，初步建立了早熟禾的基因转化体系，获得了转抗生素抗性基因的植株。相对于其它植物的遗传转化研究，早熟禾转基因工作仍处在探索阶段。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明以草地早熟禾的种子苗茎尖为试验材料，诱导其基部愈伤化膨大，切取膨大组织，放在继代及成丛培养基上诱导发生丛生芽，丛生芽在继代及成丛培养基上持续增生，提供转基因的受体材料。采用基因枪轰击法或农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株。在此基础上，确立了在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Silwet L-77处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的早熟禾转基因技术体系。

本发明中，茎尖是指十到几十微米的茎尖分生组织(shoot meristem)和大到几十毫米的茎端(shoot tip)；而茎尖分生组织是指顶端生长锥及其邻近的叶原基。丛生小芽是指离体培养茎尖基部膨大组织在继代培养基上产生的丛生小芽及其继代培养物。丛生芽块是指离体培养的丛生小芽和未组织化的***细胞构成的组织块及其继代培养物。

本发明中，转基因受体是指茎尖离体培养产生的丛生芽块及其扩增和继代培养物。

本发明中，农杆菌(Agrobacterium，包括A.tumefaciens和A.rhizogenes)介导的遗传转化程序基本上同石田(Ishida，1996)等报道的。在转染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚类化合物、表面活性剂Silwet L-77(浓度为0-0.3％)和中性单糖(葡萄糖、木糖)，丛生芽块放在悬浮农杆菌的转染液中，在0.95-0.10个大气压(0.95×10⁵Pa-1×10⁴pa)下浸染3-18分钟，然后在培养基上共培养2-15天。转化体在含有适宜抗生素的培养基上抑菌，在加有合适浓度选择剂的培养基上筛选，然后在继代及成丛培养基上分化小苗。

本发明中，基因枪轰击法(particle bomrdment；microprojectile；biolistics；particle gun)是籍高速度的金属微粒将核酸分子引入活细胞中的一种遗传转化技术。最初是美国康乃尔大学萨伏特(Sanford)等研制成功的火药基因枪及转化技术，此后有不同学者研制出的多种基因枪及不断改进的转化技术。本发明研究中所用的基因枪为美国Bio-RAD公司产品，型号为：Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System，按使用说明书操作。轰击参数为：可裂圆片与载体的距离为2.5厘米，载体与阻挡网的距离为0.8厘米，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在3-9厘米间取值。

本发明中，基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。本发明中所用培养基有：

基本培养基：为改良MS培养基(KNO₃ 1900mgL^-1，NH₄NO₃ 1650mgL^-1，CaCl₂·2H₂O 440mgL^-1，MgSO₄·7H₂O 370mgL^-1，KH₂PO₄·H₂O 170mgL^-1，FeSO₄·7H₂O27.8mgL^-1，ZnSO₄·7H₂O 10mgL^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mgL^-1，H₃BO₃ 10mgL^-1，KI0.83mgL^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mgL^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mgL^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mgL^-1，盐酸硫胺素10.0mgL^-1，盐酸吡哆醇1.0mgL^-1，烟酸1.0mgL^-1，甘氨酸2.0mgL^-1，肌醇100.0mgL^-1，生物素0.05mgL^-1，酪蛋白水解物500mgL^-1)，蔗糖30gL^-1，琼脂粉6.5gL^-1，pH5.8-6.0。该培养基用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。

诱导培养基：附加不同植物生长调节物质(激素)组合的基本培养基。对于多数早熟禾基因型而言，2，4-D浓度为0.01-1.0mg.L^-1，6-苄基嘌呤(6-BA)或激动素或玉米素浓度0-5mg.L^-1。采用固体培养基。最适的激素浓度因培养材料的基因型不同而在此范围内变动。

继代及成丛培养基：固体培养基，基本培养基中加入不同组合的植物生长调节物质，2，4-D浓度一般为0-0.2mgL^-1，6-BA或激动素或玉米素浓度为0-3mgL^-1，因早熟禾基因型而变动。

生根培养基：基本培养基加0.002-2.0mgL^-1萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)或吲哚乙酸(IAA)，采用固体培养基，用于无根小苗生根或壮苗培养。最适的激素浓度因培养材料的基因型不同而在此范围内变动。

本发明中，基部膨大诱导培养和丛生芽块培养在20-27℃、500-1000Lx光照(14h/d)下进行。

本发明中，成丛率为继代及成丛培养基上产生丛生芽的组织块数与转入的膨大基部组织块数的比值，再乘以100。

本发明中，植物材料为早熟禾(Poa)，主要为经济价值较大的草地早熟禾(Poapratensis L.)的不同品种，如奖品、新歌来得、橄榄球-A、午夜等。

本发明中，选择剂包括除草剂(绿黄隆、草丁膦、草干膦等)、抗生素(潮霉素、卡那霉素等)。选择剂抗性基因有：除草剂抗性基因如als(突变的乙酰乳酸合成酶基因)、bar(基因)等，抗生素抗性基因如hpt(潮酶素磷酸转移酶基因)、nptII(卡那霉素抗性基因)等。

本发明建立的早熟禾转基因受体体系的方法及应用包括如下步骤：

①种子灭菌和萌发程序及技术，②茎尖培养及其基部愈伤化诱导和培养基(基本培养基、附加成分和激素组合)，③丛生芽发生、继代培养和培养基(基本培养基、附加成分和激素组合)，④以丛生芽块为受体进行遗传转化，包括转化、恢复培养、(抑菌)和筛选程序及技术，⑤小苗生根和移栽技术，⑥转基因植株分子检测技术。

种子灭菌和萌发程序及技术是指：种子用70％酒精灭菌1-5分钟，0.2％升汞10-15分钟，无菌水冲洗3-5次。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子播种在湿润的无菌滤纸上，培养皿封口后放在黑暗或弱光条件下于20-28℃萌发。

茎尖培养及其基部愈伤化诱导技术是指：

种子萌发8-15天后，切取茎尖接种于诱导培养基上培养，诱导基部膨大。诱导培养在弱光下进行，一般需培养20天左右。

虽然茎尖基部出现膨大的频率与诱导培养基中激素变化有关，但在一定范围内，激素浓度对茎尖基部膨大率影响较小，一般为80-100％，但对转入继代及成丛培养基的膨大组织产生丛生芽影响较大。若诱导培养基中2，4-D为0.2mg.L^-1、6-BA 2mg.L^-1，多数基因型的膨大组织成丛率最高，奖品等品种可达75％，每丛芽数也最多，可达15-25个。

诱导基部膨大对光较敏感。在低2，4-D浓度(＜0.1mg.L^-1)、光照强度＞1000Lx时易分化生根，不易分化成丛，光照弱时(500Lx)膨大较易，不易生根。在较合适的2，4-D浓度时，光强约1000Lx时生长良好(膨大组织为淡黄绿色)，比在500Lx(膨大组织偏向白色)时更易成丛，并且每丛芽数也较多。在高浓度2，4-D时，光照强弱对其影响不是很大，膨大均较大，不易生根，但成丛率低。此阶段应在合适2，4-D浓度、光照较强下培养以利于以后成丛。

丛生芽发生及继代培养技术是指：

待茎尖基部膨大后切下直径1-3mm的膨大组织转入继代及成丛培养基上诱导丛生芽发生，一般需培养15-20天。形成丛生芽块后转入继代及成丛培养基上进行增殖培养。在继代培养中，可根据丛生芽块愈伤化程度调整培养基浓度。若未组织化细胞增生旺盛，小芽发育差，适当降低培养基中的2，4-D浓度或提高6-BA等浓度；若未组织化细胞增生慢，小芽迅速发育成苗，适当升高培养基中的2，4-D浓度。

茎尖诱导培养20-25天时取基部膨大组织产生丛生芽的频率最高，每丛芽数也最多，若诱导培养时间延长，成丛率下降，这可能是由于时间太长，部分组织不能吸收培养基中的营养，以致色泽暗淡，有些组织发褐，分化能力也降低。若诱导培养时间偏短，膨大组织产生丛生芽的频率也较低，每丛芽数少，如正在诱导培养基上培养10天，每丛芽数只有1-3个，可能是由于生长点处组织愈伤化低，去分化的细胞太少所致。

不同基因型材料对激素的敏感程度不同，其中对2，4-D的反应差别较大，对奖品和新歌来得来说，当6-BA浓度为2mg.L^-1时，0.2mg.L^-12，4D浓度成丛率最高，每丛芽数最多。而橄榄球在2，4-D浓度为0.5mg.L^-1时效果最好。对于大多数基因型而言，继代及成丛培养基中的激素组合以0.05-0.10mg.L^-12，4-D和2.0-3.0mg.L^-16-BA为宜。当2，4-D浓度较高时，基部容易产生愈伤化组织，丛生芽发生能力低；当2，4-D浓度较低时，小苗易老化，产生新芽少。即使在最适激素浓度下继代培养5次以上，小苗也变老、***，分化能力降低。若要保持早熟禾丛生芽旺盛增殖的状态，可将这些丛生芽块分成单芽或者2-3个小芽/块接种于诱导培养基上诱导基部膨大，然后再转入继代及成丛培养基上诱导丛生芽发生。

在丛生芽块继代培养的的前5-8天，若光照强度＞1000Lx时，组织容易生根，不利于芽的分化，而一旦形成丛生芽后，光照强时促进分化。所以在继代培养后的前5-8天，丛生芽块在弱光(约500Lx)下培养，当长出几个小芽后放于光照强度＞1000Lx下培养，每丛芽数可达15-25个。

小苗生根和移栽技术是指：

小苗在适宜激素组合的生根培养基上诱导生根。当根长2-3cm时，将小苗放在自然光下培养1-2天，然后去掉封口膜炼苗1-2天，于清晨或傍晚移栽入花盆(花盆下为壤土，上部为蛭石)中，每5天浇一次1/2基本培养基无机盐溶液，隔天浇水一次。移栽苗生长温度为15-25℃。

利用本发明建立的转基因受体体系进行遗传转化的程序和方法：

(一)筛选剂浓度的确定

将早熟禾丛生芽切成单芽接种于加有不同浓度筛选剂的继代培养基(若筛选剂为抑制植物细胞某些氨基酸合成的除草剂，则培养基中去掉水解酪蛋白)上，每15天继代培养一次，共继代三代。在每种筛选培养基上接种小苗100-300株，通常取6-10个选择剂浓度。浓度及浓度梯度因选择剂种类和受体材料基因型不同而变化。连续筛选3代后统计小苗存活率。以未转基因小苗接近全部死亡的选择剂浓度为转化细胞的筛选浓度。

(二)遗传转化

可选用农杆菌中介法或基因枪轰击法。

A、以农杆菌为中介进行遗传转化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有植物选择标记基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为170-180rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体基本培养基洗涤，再离心收集。再将菌体用1/2浓度的液体基本培养基悬浮，稀释5-20倍，添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmolL^-1和表面活性剂Silwet L-77(浓度为0-0.3％)后用于转化。

将早熟禾丛生芽切至暴露出芽尖生长点，放入上述菌液中浸染并附以0.95-0.10个大气压(0.95×10⁵Pa-1×10⁴Pa)处理，浸染3-18分钟。然后用无菌滤纸吸去菌液，将丛生芽块转入继代及成丛培养基上共培养2-3天，再转到加有抗生素头孢霉素(Cefotaxime)250mgL^-1或羧苄青霉素(Carb)500mgL^-1的培养基上于黑暗中培养，抑制细菌生长。在抑菌培养基上丛生芽块逐渐恢复生长，10-15天后再转入含有选择剂的筛选培养基上筛选，连续筛选3代，每代15-20天。

若用不同农杆菌菌株，适宜的转化参数有明显差异。选用LBA4404时，当菌液浓度OD₆₀₀＝0.4-0.6，感染时间为4-6分钟时，丛生芽块在恢复培养中的存活率高，转基因植株比例较高。

B、采用基因枪轰击法转化丛生芽块

1、DNA包裹微弹和基因枪轰击

1)、从宿主菌中提取带有目标基因的质粒并进行纯化，提取和纯化采用标准程序及方法(参见《分子克隆》)。质粒质量为OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7-1.8之间。质粒DNA浓度稀释为1μg/μl，于-20℃保存备用。

2)、称取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一个Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇剧烈涡旋3-5分钟，然后静置15分钟，室温下15000rpm离心5秒后去除上清液。

3)、加1ml无菌水，剧烈涡旋1分钟，静置1分钟，室温下15000rpm离心5秒后去除上清液。此步骤重复3次。

4)、第三次洗涤后的金粉，加50μl 50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹。该制备液室温可贮存2周)。

5)、使用时涡旋5分钟打破金粉凝集。

6)、分散后金粉依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5molL^-1 CaCl₂、20μl 0.1molL^-1亚精胺，边旋涡边加样。

7)、继续旋涡2-3分钟，静置1分钟。

8)、15000rpm离心2秒后弃上清液，加140μl 70％乙醇。

9)、静置沉淀，15000rpm离心2秒后弃上清液。

10)、加48μl无水乙醇，轻弹管壁数次，低速下涡旋2-3秒，然后取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

11)、在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的基本培养基，然后将丛生芽块(0.3-0.5cm大小，继代培养后7-12天)高密度放入培养皿中。

12)、用基因枪轰击丛生芽块，每皿轰击1-2次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6-9cm。其它参数按使用说明书取值。

2、转化后丛生芽组织块的筛选和培养

1)、轰击后丛生芽块在暗中恢复培养2-3天，然后将它们转入成分不变的新培养基中培养3周。此期丛生芽块生长良好，转入的目标基因得到充分表达。

2)、将恢复培养后丛生芽块转入加有选择剂(抗生素或除草剂)的继代成丛培养基上进行筛选培养，连续筛选三代，每代15-20天。

(三)、转基因植株的再生和移栽

从选择培养基上挑选出三代筛选后存活的组织块转移到无选择剂的继代及成丛培养基上诱导丛生芽形成，并通过在继代及成丛培养基上继代培养一次获得较大的丛生芽及小苗。从丛生芽块上切取2-3厘米的小苗转入生根培养基中诱导生根。在生根培养基上，当小苗根长到2-3cm时放在自然光下培养1-2天，然后去掉封口膜炼苗1-2天，于清晨或傍晚移栽转基因植株的移栽和田间管理同普通试管苗。

(四)转基因植株的分子生物学检测

提取转化植株叶片DNA，根据目标基因或/和选择标记基因的DNA序列设计PCR引物。通过PCR检测初步确定转基因植株。取PCR阳性的植株进行Southern印迹法鉴定，探针取自目的基因片段。

本发明能获得大量的具有很强植株再生能力的丛生芽块，可从绝大多数基因型中高效获得转基因植株，且再生植株体细胞无性系变异小，多数植株生长发育正常。本发明的特点在于：1)大幅度减少基因型障碍，可诱导绝大多数基因型的早熟禾茎尖基部产生膨大组织进而产生丛生芽块，2)培养细胞的转化频率较高，3)取材不受季节限制，4)转基因植株绝大多数保持原基因型的特征特性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：丛生芽块的诱导和继代培养：取草地早熟禾品种奖品的种子用70％酒精灭菌1-2分钟，0.2％升汞(氯化汞)10分钟，无菌水冲洗4次，播种在湿润的无菌滤纸上萌发，12天左右切取茎尖放在诱导培养基(加入2，4-D 0.2mgL^-1，6-BA 2mgL^-1)上培养，诱导基部膨大，膨大率为100％。在诱导培养基上培养20天后，切下茎尖基部膨大组织(直径1-3mm)转入继代及成丛培养基(取2，4-D 0.1mgL^-1，6-BA 2mgL^-1)上诱导丛生芽发生，15-20天后，多数膨大基部分化出丛生芽，成丛率为75％左右，每丛芽数多为15-20个。将丛生芽块分割后转入继代及成丛培养基上，丛生芽块细胞迅速增生，一般15天继代培养一次。若要获得较大小苗，去掉继代及成丛培养基中2，4-D，保留2mgL^-16-BA。在24±2℃、500-1000Lx光照(14h/d)下培养离体茎尖和茎尖基部膨大物及丛生芽块。

筛选剂浓度的确定：将除草剂绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25％)水溶液过滤灭菌后，加入(培养基温度低于50℃时)去掉酪蛋白水解物的诱导培养基中。绿黄隆浓度分别为0、2、4、5、6、7mgL^-1，即6个梯度浓度。将诱导出的奖品丛生芽切成单芽后放入含有不同浓度绿黄隆的培养基上培养，每种选择培养基上接种小苗100株。每15天继代培养一次，共连续筛选三代。根据筛选后的存活率，确定奖品小苗的除草剂绿黄隆筛选浓度为5-6mgL^-1。在此浓度下小苗存活率约为5％左右。

农杆菌介导的遗传转化：将带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌LBA4404放在附加抗生素的LB培养基中27℃下震荡培养，使细菌处于对数生长期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)。然后离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体基本培养基洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmolL^-1和表面活性剂Silwet L-77 0.02％的1/2浓度的液体基本培养基悬浮，稀释10-20倍用于转化。将继代培养8天的丛生芽块切至暴露出芽尖生长点，放入菌液中浸染4-6分钟，并附以0.5×10⁵Pa负压处理。转染后组织块用无菌滤纸吸干后转入继代及成丛培养基(6-BA2mgL^-1)培养2-3天，然后转入加有抗生素头孢霉素250mgL^-1的抑菌培养基抑制农杆菌生长，10-15天后再转入含绿黄隆6mg L^-1的筛选培养基筛选3代，每代15天。然后将抗性组织块转入继代及成丛培养基上分化小苗。小苗在无激素的培养基上生根长大。生根小苗移入花盆，每5天浇灌一次1/2基本培养基的无机盐溶液，隔天浇水一次。移栽成活的小苗取叶片用于分子生物学检测。经PCR和Southern印迹法分析，转化率(产生转基因植株的芽块数/农杆菌感染的芽块数*100)为5％左右。

实施例2

丛生芽诱导和继代培养：程序同实施例1，但早熟禾品种为新哥来得。选用的继代及成丛培养基中的激素组合为2，4-D 0.07mgL^-1、6-BA 3mgL^-1。

筛选剂浓度的确定：筛选剂为潮霉素。潮霉素水溶液过滤灭菌后，加入诱导培养基中，浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14mgL^-1，即8个梯度浓度。筛选程序和方法同实施例1。根据筛选后的存活率，确定新哥来得小苗的潮霉素筛选浓度为10mgL^-1。在此浓度下小苗存活率约为3％左右。

基因枪轰击法转化丛生芽块：

质粒为pCAMBIA1300-hpt-antiport。提取和纯化采用标准程序及方法(参见《分子克隆》)。质粒质量为OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7-1.8之间。质粒DNA稀释为1μg/μl。

微弹制备和基因枪轰击

1)、称取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一个Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇后剧烈涡旋3-5分钟，然后静置15分钟。室温下15000rpm离心5秒，去除上清液。

2)、加1ml无菌水，剧烈涡旋1分钟，静置1分钟，室温下15000rpm离心5秒，去除上清液。此步骤重复3次。

3)、无菌水洗涤后的金粉，加50μl 50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)。该制备液可室温贮存2周，使用时涡旋5分钟打破金粉凝集。

4)、分散后金粉依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5molL^-1 CaCl₂、20μl 0.1molL^-1亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2-3分钟，静置1分钟。

5)、15000rpm离心2秒，弃上清液。加140μl 70％乙醇，静置，15000rpm离心2秒后弃上清液。

6)、加48μl无水乙醇，轻弹管壁数次，低速下涡旋2-3秒，然后取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

7)、在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的继代及成丛培养基，然后将丛生芽块(0.2-0.4cm大小，继代培养后8天)高密度放入培养皿中。

8)、用基因枪轰击丛生芽组织块，每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6-9cm。其它参数按使用说明书取值。

轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达，然后转入加有10mgL^-1潮霉素的培养基上连续筛选3代，存活的组织块在无潮霉素的继代及成丛培养基上恢复培育10-20天，部分组织块产生小苗。

转化小苗的生根、移栽和分子生物学检测同实施例1。

Claims (6)

1、一种建立早熟禾转基因受体体系的方法，其特征在于：

①种子萌发小苗的茎尖离体培养和基部膨大组织的诱导及培养基，②培养茎尖基部膨大组织诱导丛生芽及培养基，③丛生芽块继代培养，④以丛生芽块为受体进行遗传转化及受体组织继代培养时间和转化参数；

所述的转基因受体体系是指茎尖离体培养产生的丛生芽块及其扩增和继代培养物；丛生芽块是指离体培养茎尖在含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-苄基嘌呤)的培养基上产生的由丛生小芽和未组织化细胞组成的组织块及其继代培养物。

2、按照权利要求1所述的建立早熟禾转基因受体体系的方法，其特征在于，用于茎尖离体培养的诱导培养基含有酪蛋白水解物500mg L^-1，2，4-D 0-2.0mg L^-1，激动素(KT)或6-BA 0.1-5.0mg L^-1；用于丛生芽诱导和丛生芽块继代的继代及成丛培养基含有酪蛋白水解物500mg L^-1，2，4-D 0-1.0mg L^-1，激动素(KT)或玉米素或6-BA0.1-4.0mg L^-1；生根培养基含有激动素(KT)或6-BA0.001-2.0mg L^-1，萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)或吲哚乙酸(IAA)0.002-2.0mg L^-1。

3、按照权利要求1所述的建立早熟禾转基因受体体系的方法，其特征在于，离体茎尖取自无菌萌发的种子，待小苗长到3-5厘米时，切取茎尖接种到诱导培养基上，于弱光下诱导茎尖基部膨大，然后将膨大组织切下转移到继代及成丛培养基上诱导丛生芽发生，丛生芽块在继代及成丛培养基上增殖，小苗在生根培养基上生根长大。

4、根据权利要求1限定的早熟禾转基因受体体系的应用，其特征在于，用基因枪轰击法或农杆菌介导法进行丛生块遗传转化，转化后材料恢复培养后，在抑菌或/和在选择培养基上连续筛选，通过加压筛选获得转基因细胞及丛生芽块，进而再生出转基因植株。

5、按照权利要求1或4限定的早熟禾转基因受体体系的应用，其特征在于，取继代后培养7-12天的丛生芽块作为转基因受体。

6、按照权利要求1或4限定的早熟禾转基因受体体系的应用，其特征在于，采用农杆菌介导法在0.95-0.10个大气压(0.95×10⁵Pa---1×1.0⁴Pa)下进行遗传转化，在菌液中加入浓度为0-0.3％的表面活性剂Silwet L-77。