CN104726489B - 农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法 - Google Patents
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Abstract
一种农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法，由无菌胚剥离、制备转化液、震荡侵染、制备转基因棉花、转基因植株鉴定步骤组成。在无菌胚剥离中，将30％双氧水与无菌水配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/3～1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，让棉花胚受伤；在制备转化液步骤中，诱导液由乙酰丁香酮与硫酸镁制成，乙酰丁香酮能够诱导农杆菌Vir基因活化，提高外源基因整合的效率；在震荡侵染步骤中，转化液中加入Silwet L‑77和MS液体培养基，使农杆菌更大范围覆盖在棉花胚上。本发明具有易于筛选、棉花的生长周期短、易于操作、转化效率等优点。
Description
技术领域
本发明属于转基因棉花技术领域，具体涉及到一种利用农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花方法的建立。
背景技术
棉花是重要的纤维作物，纤维产量占世界总纤维产量的40％，陆地棉的种植量达到总棉花的90％。棉籽是仅次于大豆、菜籽的含油类的植物种子，因此棉花在经济作物中占重要地位。
通过转基因技术提高棉纤维的品质，提高棉籽产油率是培育棉花新品种的重要手段。1987年，通过农杆菌侵染子叶下胚轴转化法，首次获得棉花转基因植株，随后又出现粒子轰击胚悬浮细胞法和花粉管通道法获得转基因棉。其中农杆菌侵染子叶下胚轴转化法不受时间、季节的限制，外源基因多拷贝整合概率低，转化效率较高等优点而受广大研究者青睐，也是目前较为常用的一种棉花转基因方法，但该方法也有一定的局限性，如：易受棉种品系限制，不同品系的棉花再生能力不同；组织生长周期长，从下胚轴到再生植株通常需8到18个月不等；且畸形苗多，容易出现细胞变异、器官变异等变异体；再生植株的种子活力低等缺陷。因此，需要一种方便、快捷，转化效率高、适用性广的棉花转基因新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有棉花转基因技术的缺点，提供一种方便、快捷，转化效率高的农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
(1)无菌胚剥离
将30％双氧水与无菌水按体积比为1：9混合配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，1000mL基础培养基由下述原料配比：
混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，分装在培养皿中，自然冷却，制备成基础培养基。
(2)制备转化液
在LB液体培养基中加入100mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、100mg/L链霉素、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404，LB液体培养基与50mg/mL卡那霉素、50mg/mL利福平、50mg/mL链霉素、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404的体积比为1：0.002：0.001：0.002：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养22～24小时，制备成OD600为1.2～1.6的菌液，5000转/分钟离心10分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和诱导液，混匀，菌体与MS液体培养基、诱导液的体积比为1：10：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养20分钟，得到转化液。
GFP表达载体用重组质粒pBI121-GFP转化到农杆菌LBA4404中得到重组农杆菌，所述重组质粒pBI121-GFP是将pBI121的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为GFP的序列得到的重组质粒，上述的100mL的LB液体培养基由下述原料配比：
混匀，调pH为6.5，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成；上述的100mL MS液体培养基由下述原料配比：
蔗糖 2g
MS培养基 0.443g
水 加至100mL
混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成；上述的诱导液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁按体积比为1：1混合制成。
(3)震荡侵染
在转化液中加入Silwet L-77和MS液体培养基，Silwet L-77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：4000～6000：4000～6000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚。
(4)制备转基因棉花
基础培养基在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素，混匀，基础培养基与50mg/mL卡那霉素、500mg/mL头孢霉素的体积比为1：0.002：0.001，配制成筛选培养基，分装入培养皿，将含有农杆菌的棉花胚移入培养皿，放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3天，选择长势优良的棉苗移入促生根培养基的组培瓶中，促生根培养基由基础培养基在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入1.25mg/L 6-苄基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素，混匀，基础培养基与1.25mg/mL 6-苄基嘌呤、0.5mg/mL萘乙酸、50mg/mL卡那霉素、500mg/mL头孢霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.002：0.001，配制完成后，分装到组培瓶中，将种有棉花幼苗的组培瓶放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3周，选取真叶为绿色的棉花幼苗嫁接到生长2～3周的棉花砧木上，获得转基因棉花。
(5)转基因植株鉴定
对嫁接1～3个月的棉花幼苗绿色真叶提取DNA进行PCR分子检测，测序；对嫁接1～3月棉花幼苗的真叶提取RNA，反转录为cDNA，进行PCR分子检测，嫁接1～3个月棉苗进行荧光观测。
在本发明的震荡侵染步骤(3)中，在转化液中加入Silwet L-77和MS液体培养基，Silwet L-77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：5000：5000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚。
由于采用了在无菌胚剥离中，将30％双氧水与无菌水按体积比为1：9混合配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/3～1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，由于棉花胚受到切割损伤，有利于农杆菌吸附和侵染；在制备转化液步骤中，诱导液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁制成，乙酰丁香酮能够诱导农杆菌Vir基因活化，提高外源基因整合的效率；在本发明的震荡侵染步骤中，在转化液中加入Silwet L-77和MS液体培养基，能增加细胞表面通透性，促进农杆菌对棉花胚细胞的转化。本发明克服了农杆菌介导的侵染子叶下胚轴转化法中对棉花品系的限制及生长周期长的缺点，本发明具有易于操作、易于筛选、转基因棉花的生长周期短、转化效率高等优点。
附图说明
图1是在24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养20天的棉苗照片。
图2是嫁接苗生长1个月棉苗真叶DNA水平PCR检测结果照片。
图3是嫁接苗生长1个月棉苗真叶RNA水平PCR检测结果照片。
图4是嫁接1个月棉苗用倒置荧光显微镜观测荧光结果照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例胚系转化获取转基因棉花的方法由下述步骤组成：
1、无菌胚剥离
将30％双氧水10mL和无菌水90mL在灭菌的三角瓶内混合，配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，1000mL基础培养基由下述原料配比：
混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，分装在培养皿中，自然冷却，制备成基础培养基。
2、制备转化液
在LB液体培养基10mL中加入50mg/mL卡那霉素20μL、50mg/mL利福平10μL、50mg/mL链霉素20μL、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404 1000μL，LB液体培养基与100mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、100mg/L链霉素、GFP表达载体的农杆菌LBA4404的体积比为1：0.002：0.001：0.002：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养22～24小时，制备成OD600为1.2～1.6的菌液，5000转/分钟离心10分钟，去除上清液，收集菌体，取1mL菌体，加入MS液体培养基10mL和诱导液100μL，混匀，菌体与MS液体培养基、诱导液的体积比为1：10：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养20分钟，得到转化液。
上述GFP表达载体用重组质粒pBI121-GFP转化到农杆菌LBA4404中得到重组农杆菌，所述重组质粒pBI121-GFP是将pBI121的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为GFP的序列得到的重组质粒。pBI121植物表达载体购于北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：MP-091；GFP的基因序列号为GenBank:AB303068.1。上述的100mL的LB液体培养基由下述原料配比：
混匀，调pH为6.5，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成。上述的100mL MS液体培养基由下述原料配比：
蔗糖 2g
MS培养基 0.443g
水 加至100mL
混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成。上述的诱导液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁按体积比为1：1混合制成。
3、震荡侵染
取转化液10mL中加入Silwet L-77 2μL和MS液体培养基10mL，Silwet L-77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：5000：5000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚。Silwet L-77购于加拿大GEHealthcare Bio-Sciences AB公司，产品目录号为MB-K5762。
4、制备转基因棉花
基础培养基200mL在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入50mg/mL卡那霉素0.4mL、500mg/mL头孢霉素0.2mL，混匀，基础培养基与100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的体积比为1：0.002：0.001，配制成筛选培养基，分装入培养皿，将含有农杆菌的棉花胚移入培养皿，放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3天，选择长势优良的棉花幼苗移入促生根培养基的组培瓶中，促生根培养基由基础培养基200mL在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入1.25mg/mL6-苄基嘌呤0.2mL、0.5mg/mL萘乙酸0.2mL、50mg/mL卡那霉素0.4mL、500mg/mL头孢霉素0.2mL，混匀，基础培养基与1.25mg/L6-苄基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.002：0.001，配制成，分装到组培瓶中，将装有棉花幼苗的组培瓶放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3周，可观察到棉花幼苗真叶为绿色，如图1所示，由图1可见，在24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养20天的棉苗能够在含有100mg/L卡那抗性的培养基的组培瓶中生长，可初步筛选出阳性转基因棉苗。将真叶为绿色的棉花幼苗嫁接到生长2～3周的棉花砧木上，获得转基因棉花。
5、转基因棉苗鉴定
对棉花幼苗真叶提取DNA进行PCR分子检测，测序，具体步骤如下：
提取野生型棉花幼苗及嫁接棉花幼苗真叶为绿色的植株叶片DNA，并同时设置pBI121质粒为阳性对照，根据质粒上的GFP基因设计一对引物进行PCR扩增。
PCR扩增引物：
上游引物：5′-CCGGCTCGTATGTTGTGTGGA-3′；
下游引物：5′-AAGTTGGGTAACGCCAGGGT-3′。
PCR扩增体系：上下游引物20mmol/L各1μL，2×Taq PCR Mix 7.5μL，0.1-0.25μg/μL的模板1μL，去离子水补足体系至15μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。
PCR的扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，有目的条带为2016bp的样本含有GFP基因，结果如图2所示，第1泳道为DNA maker，由上至下条带大小依次为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；第2泳道为阴性对照(野生型中24)；第3～8泳道为六株初步筛选出的阳性转基因棉苗；第9泳道为阳性对照(pBI121)；由图2可见，初步筛选出的阳性转基因棉花幼苗和阳性对照(pBI121)均可扩增出目的条带，经过PCR分子检测六株初步筛选出的阳性转GFP的棉苗在DNA水平含有目的基因，进一步确定为阳性转基因棉苗。将目的条带回收，送测序公司测序，测序结果见SEQ ID No.3。结果表明外源GFP基因转入阳性转基因棉花幼苗中。
对绿色真叶提取RNA，反转录为cDNA，进行PCR分子检测；
提取野生型棉花幼苗和嫁接棉花幼苗真叶RNA，反转录为cDNA，分子检测程序同上，结果如图3所示，第1泳道为DNA maker，条带同上；第2泳道为阴性对照(野生型中24)；第3、4泳道为其中两株确定为阳性转基因棉苗；第7泳道为阳性对照(pBI121)；由图3可见，进一步筛选出的转基因棉苗和阳性对照(pBI121)均可扩增出目的条带，经过PCR分子检测两株阳性转GFP的棉苗在RNA水平含有目的基因，阳性转基因棉花幼苗中外源基因能够在RNA水平表达。
采集嫁接一个月棉花幼苗真叶，置于倒置荧光显微镜下，在490nm蓝光激发光下观察GFP荧光的表达，观测结果如图4所示。由图4可见，棉花幼苗真叶中有绿色荧光，在蛋白水平棉苗真叶中的GFP成功表达了绿色荧光蛋白。
实施例2
本实施例胚系转化获取转基因棉花的方法由下述步骤组成：
在无菌胚剥离步骤1中，将30％双氧水10mL和无菌水90mL在灭菌的三角瓶内混合，配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/3子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，基础培养基的原料配比和制备方法与实施例1相同。
在制备转化液步骤2中，在LB液体培养基10mL中加入50mg/mL卡那霉素20μL、50mg/mL利福平10μL、50mg/mL链霉素20μL、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404 1000μL，GFP表达载体用重组质粒pBI121-GFP转化到农杆菌LBA4404中得到重组农杆菌，所述重组质粒pBI121-GFP是将pBI121的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为GFP的序列得到的重组质粒，LB液体培养基与100mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、100mg/L链霉素、GFP表达载体的农杆菌LBA4404的体积比为1：0.002：0.001：0.002：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养22～24小时，制备成OD600为1.2～1.6的菌液，5000转/分钟离心10分钟，去除上清液，收集菌体，取菌体1mL，加入MS液体培养基5mL和诱导液50μL，混匀，菌体与MS液体培养基、诱导液的体积比为1：5：0.05，28℃、200转/分钟振荡培养20分钟，得到转化液。LB液体培养基、MS液体培养基、诱导液的原料配比以及制备方法与实施例1相同。
在震荡侵染步骤3中，取转化液5mL中加入Silwet L-77 1.25μL和MS液体培养基5mL，Silwet L-77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：4000：4000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚。
其它步骤与实施例1相同，制备成胚系转化获得转基因棉花。
实施例3
本实施例胚系转化获取转基因棉花的方法由下述步骤组成：
在无菌胚剥离步骤1中，将30％双氧水10mL和无菌水90mL在灭菌的三角瓶内混合，配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，基础培养基的原料配比和制备方法与实施例1相同。
在制备转化液步骤2中，在LB液体培养基10mL中加入50mg/mL卡那霉素20μL、50mg/mL利福平10μL、50mg/mL链霉素20μL、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404 1000μL，GFP表达载体用重组质粒pBI121-GFP转化到农杆菌LBA4404中得到重组农杆菌，所述重组质粒pBI121-GFP是将pBI121的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为GFP的序列得到的重组质粒，LB液体培养基与100mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、100mg/L链霉素、GFP表达载体的农杆菌LBA4404的体积比为1：0.002：0.001：0.002：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养22～24小时，制备成OD600为1.2～1.6的菌液，5000转/分钟离心10分钟，去除上清液，收集菌体，取菌体1mL，加入MS液体培养基15mL和诱导液200μL，混匀，菌体与MS液体培养基、诱导液的体积比为1：15：0..2，28℃、200转/分钟振荡培养20分钟，得到转化液。LB液体培养基、MS液体培养基、诱导液的原料配比以及制备方法与实施例1相同。
在震荡侵染步骤3中，取转化液12mL中加入Silwet L-77 2μL和MS液体培养基12mL，Silwet L-77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：6000：6000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚。
其它步骤与实施例1相同，制备成农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花。
Claims (2)
1.一种农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法，其特征在于由下述步骤组成：
（1）无菌胚剥离
将30%双氧水与无菌水按体积比为1：9混合配制成消毒液，棉种脱绒放入消毒液中，25℃、浸泡24小时，取出种子放在培养皿内，切掉种皮和1/2子叶，剩余的棉花胚放入含有基础培养基的培养皿中，1000mL基础培养基由下述原料配比：
蔗糖 20g
MS培养基 4.43g
琼脂 5g
水 加至1000mL
混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，分装在培养皿中，自然冷却，制备成基础培养基；
（2）制备转化液
在LB液体培养基中加入100mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、100mg/L链霉素、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404，LB液体培养基与50mg/mL卡那霉素、50mg/mL利福平、50mg/mL链霉素、含有GFP表达载体的农杆菌LBA4404的体积比为1：0.002：0.001：0.002：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养22～24小时，制备成OD600为1.2～1.6的菌液，5000转/分钟离心10分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和诱导液，混匀，菌体与MS液体培养基、诱导液的体积比为1：10：0.1，28℃、200转/分钟振荡培养20分钟，得到转化液；
GFP表达载体用重组质粒pBI121-GFP转化到农杆菌LBA4404中得到重组农杆菌，所述重组质粒pBI121-GFP是将pBI121的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为GFP的序列得到的重组质粒，上述的100mL的LB液体培养基由下述原料配比：
胰蛋白胨 1g
酵母提取物 0.5 g
NaCl 1g
水 加至100mL
混匀，调pH为6.5，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成；上述的100mLMS液体培养基由下述原料配比：
蔗糖 2g
MS培养基 0.443g
水 加至100mL
混匀，调pH为5.8～6.3，0.07MPa、115℃在高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟制成；上述的诱导液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁按体积比为1：1混合制成；
（3）震荡侵染
在转化液中加入Silwet L-77和MS液体培养基，Silwet L-77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：4000～6000：4000～6000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚；
（4）制备转基因棉花
基础培养基在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素，混匀，基础培养基与50mg/mL卡那霉素、500mg/ mL头孢霉素的体积比为1：0.002：0.001，配制成筛选培养基，分装入培养皿，将含有农杆菌的棉花胚移入培养皿，放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3天，选择长势优良的棉苗移入促生根培养基的组培瓶中，促生根培养基由基础培养基在0.07MPa、115℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌15分钟，冷却至45～50℃，加入1.25mg/L 6-苄基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素，混匀，基础培养基与1.25mg/mL 6-苄基嘌呤、0.5mg/mL萘乙酸、50mg/mL卡那霉素、500mg/mL头孢霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.002：0.001，配制完成后，分装到组培瓶中，将种有棉花幼苗的组培瓶放入24±1℃、光照强度为24000lux、湿度为51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，培养2～3周，选取真叶为绿色的棉花幼苗嫁接到生长2～3周的棉花砧木上，获得转基因棉花；
（5）转基因植株鉴定
对嫁接1～3个月的棉花幼苗绿色真叶提取DNA进行PCR分子检测，测序；对嫁接1～3月棉花幼苗的真叶提取RNA，反转录为cDNA，进行PCR分子检测，嫁接1～3个月棉苗进行荧光观测。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法，其特征在于：在震荡侵染步骤（3）中，在转化液中加入Silwet L-77和MS液体培养基，Silwet L-77与MS液体培养基、转化液的体积比为1：5000：5000配制成侵染液，将制备的棉花胚放入侵染液，28℃、200转/分钟振荡培养3小时，得到含有农杆菌的棉花胚。
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