CN102286527A - Dreb基因转化红掌的遗传转化方法 - Google Patents

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CN102286527A
CN102286527A CN2011102527044A CN201110252704A CN102286527A CN 102286527 A CN102286527 A CN 102286527A CN 2011102527044 A CN2011102527044 A CN 2011102527044A CN 201110252704 A CN201110252704 A CN 201110252704A CN 102286527 A CN102286527 A CN 102286527A
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滕年军
陶清良
陈发棣
陈琳
房伟民
蒋甲福
陈素梅
刘兆磊
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Abstract

本发明属于分子育种领域，公开了DREB基因转化红掌的遗传转化方法。该方法是将红掌无菌愈伤组织切开后用含有重组质粒pCAMBIA1301-DREBa的农杆菌液侵染10min，共培养3d、抑菌培养5d、筛选培养获得具潮霉素抗性的生根苗。经PCR检测证实外源基因已转入红掌基因组DNA中。本发明首次针对红掌建立了其遗传转化体系，为红掌分子育种工作提供了理论基础和实验依据，将有效推动其分子育种进程。

Description

DREB基因转化红掌的遗传转化方法
技术领域
本发明属于分子育种领域，涉及DREB基因转化红掌的遗传转化方法。
背景技术
红掌为天南星科花烛属多年生草本植物，原产哥伦比亚南部，是世界名贵花卉。红掌具有艳丽的佛艳苞，花期长、周年开花、叶片蜡质，是观叶观花俱佳的室内观赏植物。红掌夜间生长适温在18-20℃，白天为25℃左右。在夏季，如夜间室温度超过25℃或白天室内温度超过30℃时，而在冬季，如夜间室温度低于12℃或白天室温度低于18℃时，则会出现叶片失去光泽、发黄，佛艳苞花期变短，易枯萎，还会引起叶腐病，严重影响其生长和观赏价值。为此，在夏季期必须采取人为降温措施，而在冬季则必须人为进行加温，使得室内温度适宜红掌的生长，然而降温和加温都显著地增加了红掌生产成本。因此，筛选、培育耐高温和低温的红掌新品种有着巨大的实用价值和经济意义。
近年来，随着植物基因工程的发展，分子育种克服了常规育种的种种限制，为利用新的基因资源改良红掌品种提供了新的手段和途径。农杆菌介导法以其操作简单，费用低，效率高，***DNA片段大，稳定性好，转基因拷贝数低等优点，已成为转基因策略中的首选方法。
DREB转录因子作为一类在植物抵抗非生物胁迫中起关键作用的转录因子家族，以其能够激活多个功能基因的表达，从而提高植物综合抗性的优点成为研究的热点，在植物抗逆分子育种中具有巨大的潜在利用价值。近年来，通过导入DREB基因来改良作物的抗逆性，已经在油菜、烟草、番茄、小麦和菊花等作物中获得成功，但利用DREB基因转化红掌的研究还未见报道。主要原因是红掌的遗传转化极易受到各种因素影响，例如愈伤组织的预培养时间、农杆菌的侵染时间、愈伤组织与农杆菌的共培养时间及抑菌培养时间等等，这些因素直接影响着红掌的转化成功率。因此，***深入研究其遗传转化条件，建立专门针对红掌的遗传转化体系，可为红掌分子育种工作提供理论基础和实验依据，有效推进红掌分子育种进程。
发明内容
本发明的目的是提供DREB基因转化红掌的遗传转化方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
DRB基因转化红掌的遗传转化方法，包括如下步骤：
1)无菌愈伤组织的获得：
取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.1mg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小一致的愈伤组织，将愈伤组织表层去掉后切割成片状，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基；
2)农杆菌悬浮液制备中：
将***目的基因DREB的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，取经酶切验证含有所述重组质粒pCAMBIA1301-DREBa的农杆菌LBA4404-DREBa菌液制备农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液，用于下一步的遗传转化；
3)遗传转化
选取步骤1)中在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基中诱导45天大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，在相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；然后将愈伤组织在步骤2)制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染10min，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为26±2℃、黑暗条件下共培养3天；之后转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+AS 100μmg/L培养基中抑菌培养5天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；再转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L筛选培养基中进行抗性筛选6个月，温度26±2℃，光照时间为16h/d，具有潮霉素抗性的愈伤组织将长出不定芽点；
4)抗性愈伤组织筛选
切取步骤3)中经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L上，在温度为26±2℃，光照时间为16h/d的条件下培养，待不定芽长至2.0-3.0cm时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+IBA 0.1mg/L+Hyg 7mg/L中培养，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+IBA 0.1mg/L培养基中正常生根；
5)转基因植株的获得
待步骤4)得到的具有潮霉素抗性的植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，，设计并合成SEQ ID No.3所示的正向引物Hyg-F和SEQ ID No.4所示的反向引物Hyg-R，以抗性植株的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR鉴定结果能够扩增出950bp条带的抗性植物为转入目的基因DREBa成功的转基因红掌植株。
其中，所述的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa通过如下方法构建：
①DREBa基因克隆
以菊花品种‘钟山红枫’RNA为模板，以SEQ ID No.1所示的正向引物DREBa-F和SEQ IDNo.2所示的反向引物DREBa-R进行RT-PCR扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF，用琼脂糖凝胶电泳回收纯化长度为872bp的RT-PCR目的产物片段，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg/L氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃，16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃，16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证，DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF序列如SEQ ID No.5所示。②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建
用BamH I和Kpn I双酶切连接了DREBa基因的T-载体，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃，16h，提取质粒，经BamHI和KpnI双酶切鉴定得到pCAMBIA1301-DREBa重组质粒。
所述的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液的通过如下方法制备：将农杆菌LBA4404-DREBa菌液于YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃，48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，震荡速度200r/min，至农杆菌LBA4404-DREBa长至对数生长期即OD600为0.5时，将LBA4404-DREBa菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用。
步骤1)中切割为片状的愈伤组织的大小优选为0.3～0.8cm×0.3～0.8cm×0.1～0.3cm。
有益效果：
1.本发明针对根癌农杆菌介导的红掌转基因存在的基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、转化细胞不易成苗等问题，专门对DREB基因转化红掌的遗传转化条件进行了***深入研究，提供了一套适用于红掌的DREB基因遗传转化体系，为红掌分子育种奠定基础。
2.遗传转化体系建立，对影响遗传转化的条件如预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间、抑菌培养时间进行了考察，获得了最佳遗传转化组合：预培养时间分别为0、3、5、7天，试验结果表明7天的愈伤成活率最高；农杆菌侵染时间分别为5、10、15、20分钟，试验结果表明10分钟时浸染效果最佳；红掌愈伤组织与农杆菌共培养时间分别为1、2、3、5天，试验结果表明3天时成活率最高；抑菌培养时间分别为1、3、5、7、9天，试验结果表明5天时抑菌效果最佳。因此，理想的遗传转化体系中预培养时间为7天，农杆菌侵染时间为10分钟，红掌愈伤组织与农杆菌共培养时间为3天，抑菌培养时间为5天。
3.在筛选方式上，针对红掌对筛选抗生素(潮霉素)敏感的问题，采用了高选择压长时间筛选抗性芽点，无选择压恢复抗性芽分化和生长，再高选择压筛选抗性不定芽并结合生根筛选的多次筛选方法，取得了较好效果，提高了转化体再生率。
4.在抑菌培养方法上，基于抑菌抗生素(头孢霉素)对红掌愈伤组织再生的强烈抑制作用，经筛选确定了遗传转化中使用的最适抑菌抗生素(头孢霉素)浓度以抑制农杆菌过度生长，在有效抑制农杆菌滋生的同时获得较高的转化体再生率。
附图说明
图1红掌外植体类型对愈伤组织诱导的影响
A.诱导茎段产生的愈伤组织；B.诱导叶柄产生的愈伤组织；C.诱导叶片产生的愈伤组织。
图2不同激素浓度与组合对红掌茎段愈伤组织诱导的影响
A.1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA；B.1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；C.1/2MS+1.0mg/L 6-BA。
图3不同浓度IBA对红掌茎段愈伤组织诱导的影响
A.1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA；B.1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA；C.1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.15mg/L IBA。
图4不同浓度潮霉素对红掌愈伤组织分化和芽再生的影响
A：0mg/L潮霉素；B：5mg/L潮霉素；C：10mg/L潮霉素；
D：20mg/L潮霉素；E：30mg/L潮霉素；F：50mg/L潮霉素。
图5红掌转基因的过程
A：预培养；B/C/D：抗性芽生长的过程。
具体实施方式
实施例1 无菌愈伤组织的获得：
1)外植体选择
采用茎段、叶片、叶柄在继代培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L上诱导愈伤组织，40天后供实验用。培养条件为：温度24～26℃，光照强度40μmol·m-2·s-1，12h/12h光暗交替。结果：茎段作为外植体进行组织培养芽诱导率最高，最为成功(表1，图1)。
表1：不同外植体对红掌的愈伤诱导
  外植体   芽诱导率
  茎段   98
  叶片   22
  叶柄   8
2)不同激素条件对红掌的茎段愈伤组织的影响
取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L中分别加入0.1mg/l IBA，0.1mg/l NAA激素诱导愈伤组织，并以不加激素的1/2MS+6-BA1.0mg/L诱导愈伤组织为对照。研究发现，不同激素条件下红掌的茎段愈伤组织分生能力存在差异，其中在培养基1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.1mg/l IBA中诱导的茎段愈伤组织分生能力最强，因此选择1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.1mg/l IBA作为继代培养基(表2，图2)。
表2  不同激素条件对红掌的茎段愈伤组织的影响
  愈伤组织调节剂(mg/)   不定芽再生率
  1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.1mg/l IBA   90
  1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.1mg/l NAA   70
  1/2MS+1.0mg/l 6-BA   40
3)不同浓度IBA激素对红掌愈伤组织的影响
不同浓度IBA激素是影响红掌愈伤组织的重要激素，考察不同浓度的IBA激素对红掌愈伤组织的影响，结果显示愈伤组织效果最高是1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.1mg/l IBA(表3，图3)。
表3  不同浓度IBA激素对红掌愈伤组织的影响
  愈伤组织调节剂/(mg/l)   愈伤组织率/％
  1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.05mg/lIBA   75
  1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.1mg/l IBA   90
  1/2MS+1.0mg/l 6-BA+0.15mg/l IBA   70
因此，获得红掌无菌愈伤组织的最佳方法是：取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小一致的愈伤组织，将愈伤组织表层去掉后切割成片状，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L培养基。
实施例2 农杆菌遗传转化
1)潮霉素(Hgy)浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响
选取大小一致的愈伤组织和芽，接种于含有不同浓度潮霉素的诱导培养基中，其浓度分别为0、5mg/L，10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L、二周更换一次新鲜培养基，45天后观察统计结果，见表5。表5表明：在很低的浓度下，潮霉素对红掌愈伤组织分化和芽生长的抑制作用不明显，愈伤组织的分化率达到92％，且芽生长健壮；但当浓度达到30mg/L时，愈伤组织周边有褐化现象，芽生长缓慢；随着潮霉素浓度的升高，抑制作用与其浓度呈正比，50mg/L时，愈伤组织褐化死亡，芽叶色发黄变白，植株茎段软弱，呈负增长状态(图4)。在植物遗传转化的筛选过程中，筛选抗生素的浓度既要能有效的抑制非转化细胞的生长，又不能影响转化细胞的正常生长和分化。因此，实验愈伤组织和芽采用的筛选浓度应20mg/L(表4)。
表4  潮霉素(Hgy)浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响
  Hgymg/L   接种数   愈伤组织褐死率％   不定芽再生率％
  0   25   0.0   92
  5   25   2.5   65
  10   25   88   50
  20   25   90   33
  30   25   97   10
  50   25   100   0.0
2)头孢霉素(Cef)抑菌效果及对不定芽再生的影响
取已经切好的红掌无菌苗的愈伤组织，在事先备好的农杆菌菌液中浸泡10min，吸去多余菌液后置于培养基上黑暗条件下共培养3天，然后转至添加一定浓度梯度头孢霉素的培养基中培养，温度为26±2℃，光照时间为16h/d，头孢霉素浓度分别为0、50mg/L、100mg/L、300mg/L、400mg/L、700mg/L，二周更换一次新鲜培养基，45天后观察统计结果。本实验表明头孢霉素质量浓度为400mg/l完全抑制农杆菌生长，同时不定芽再生率为25％(表5)。因此，在实验中使用的头孢霉素(Cef)浓度为400mg/l。
表5  头孢霉素(Cef)抑菌效果及对不定芽再生的影响
  Cef(mg/L)   接种数(块)   细菌生长情况   不定芽再生率％
  0   25   菌落布满容器   0.0
  50   25   菌落布满容器   0.0
  100   25   菌落布满容器   0.0
  300   25   少量菌落   75.0
  400   25   完全抑制   25.0
  700   25   完全抑制   0.0
3)预培养时间对红掌愈伤组织转化的影响
将在MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L培养基中诱导的愈伤组织切割成0.5cm×0.5cm×0.1cm大小的片状，接种在相同的诱导培养基上分别预培养0、3、5、7天然后用农杆菌菌液感染愈伤组织，共培养，再转入抑菌和筛选培养基中。实验重复三次，60天后统计筛选转化率。试验结果表明预培养7天的愈伤成活率极显著高于其它预培养时间的愈伤组织。因此，红掌愈伤组织在转化前预培养的最佳时间以7天为宜(表6)。
表6  预培养时间对红掌愈伤组织转化的影响
  预培养时间(天)   初接种数(块)   抗性愈伤率(％)   抗性芽分化率(％)
  0   25   0.0   0.0
  3   25   33.0   20.0
  5   25   50.0   40.0
  7   25   70.0   80.0
4)农杆菌菌液浸染时间对红掌愈伤组织转化的影响
在愈伤组织预培养时间、农杆菌菌液浓度等条件确定的情况下，浸染时间对红掌转化率有着重要的影响。试验结果表明：浸染10分钟时，愈伤组织的成活率极显著高于其它浸染时间的愈伤组织，且芽分化率也最高。愈伤组织浸染菌液时间过短，农杆菌因没有充分接触伤口，在共培养时农杆菌生长缓慢，转化效率低；浸染时间过长，农杆菌生长过快，愈伤组织因农杆菌毒害缺氧而腐烂死亡(表7)。
表7  农杆菌菌液浸染时间对红掌愈伤组织转化的影响
 浸染时间(min)   初接种数(块)   抗性愈伤率(％)   抗性芽分化率(％)
  5   25   75.0   0.0
  10   25   30.0   65.0
  15   25   18.0   25.0
  20   25   5.0   0.0
5)共培养时间对红掌愈伤转化的影响
共培养是农杆菌将其携带有外源基因的T-DNA整合到植物的细胞中实现遗传转化的重要过程。因此，适当的共培养时间是农杆菌能否将外源基因成功转化的关键。当农杆菌附着在外植体后，并不立即产生转化，只有在创伤部位生存16小时后，才能诱发“肿瘤”。共培养时间过短，农杆菌感染植物细胞的效率偏低，在筛选培养基上外植体分化频率也就偏低，共培养时间过长，外植体会因为农杆菌过度生长而死亡。试验结果表明，红掌愈伤组织与农杆菌共培养3天时成活率最高，为75％，芽分化率也最高(表8)。共培养天数对成活率影响的卡方检测结果表明，共培养时间的长短，对愈伤组织的成活率有显著的影响。随着共培养时间的增长，芽分化率也愈高。
表8  共培养时间对红掌愈伤转化的影响
  共培养时间(天)   接种数(块)   抗性愈伤率(％)   抗性芽分化率(％)
  1   25   0.0   0.0
  2   25   65.0   50.0
  3   25   80.0   75.0
  5   25   0.0   0.0
6)抑菌培养时间对愈伤组织转化效率的影响
实验发现随着时间的延长，农杆菌大量滋生，后即难以控制，导致大部分愈伤组织切断死亡。抑菌培养时间以5天为宜(表9)。
表9  抑菌培养时间对愈伤组织转化效率的影响
  抑菌培养时间(天)   接种数   抗生愈伤率(％)   抗生芽分化率(％)
  0   30   0.0   0.0
  1   30   2.6   0.0
  3   30   7.2   4.6
  5   30   48   15.8
  7   30   52   5.6
  9   30   66   0.0
综上所述，农杆菌LBA4404-DREBa转化红掌愈伤组织的最佳遗传转化条件是：选取在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基中诱导45天大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，在相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d。然后在步骤2)制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染10min，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为26±2℃、黑暗条件下共培养3天；之后转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+AS 100μmg/L培养基中抑菌培养5天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；再转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L筛选培养基中进行抗性筛选6个月，温度26±2℃，光照时间为16h/d，具有潮霉素抗性的愈伤组织将长出不定芽点。
实施例3 IBA浓度对根分化的影响
经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBA 1.0mg/L上，在温度为26±2℃，光照时间为16h/d的条件下培养，待不定芽长至2.0-3.0cm时，切下不定芽接种在添加IBA浓度分别为0mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L的1/2MS培养基上。结果表明，添加IBA浓度为0.1mg/L时，生根较快，二周左右即有根发生，根粗壮且数量多；随着激素浓度升高，根发生时间也随之延长，尤其当IBA浓度超过1.0mg/L时，根不仅很难发生，而且极易愈伤化，根尖膨大、发黄。因此，IBA浓度为0.1mg/L时为最适浓度，生根培养基的配方为1/2MS+IBA 0.1mg/L。
实施例4
1)无菌愈伤组织切开片的获得
材料为继代于1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L培养基上的红掌组培苗，切取带有一对嫩叶的茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小较一致的愈伤组织，切除表层后将愈伤组织切割成0.5cm×0.5cm×0.1cm的片状，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L培养基上。
2)农杆菌悬浮液制备
菊花‘钟山红枫’DREBa基因的克隆、植物表达载体构建与农杆菌转化
①DREBa基因克隆与连接
以菊花品种‘钟山红枫’(中国菊花研究网，http://www.chrysanthemum.ch)RNA[总RNA提取方法参照[萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南(第三版)(上册)，北京科学出版社]为模板进行RT-PCR(Reverse transcription PCR，以RNA为模板反转录合成双链cDNA的PCR)扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF[洪波等，AtDREB1A基因在菊花中的异源表达提高了植株对干旱和盐渍胁迫的耐性，中国科学C辑，2006，36(3)：223-231]，扩增引物如下(下划线部分为酶切位点，BamH I和Kpn I分别为酶切正向引物和反向引物的内切酶)：
BamH I
正向引物：5′-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3′(SEQ ID No.1)
Kpn I
反向引物：5′-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3′(SEQ ID No.2)
扩增体系(25μL)：10×buffer 2.5μL，25mM MgCl21.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，20μM正向引物1.0μL，20μM反向引物1.0μL，Taq酶1U，Template cDNA 1.0μL，ddH2O 16.0μL。
扩增程序：95℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，35cycles；72℃10min。4℃保存。
用琼脂糖凝胶电泳回收纯化以上RT-PCR目的产物片段872bp，与T-载体(T-easy Vector)连接后转化大肠杆菌DH5a感受态，进行LB+50mg/L氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃和16h，挑取白色克隆接种于LB液体培养基进行培养，培养条件为37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证；
②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建与DH5a转化
用BamH I和Kpn I双酶切连接到T-载体的DREBa基因，电泳回收目的片段，与用BamHI和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5a感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取质粒，BamHI和KpnI双酶切鉴定pCAMBIA1301-DREBa重组质粒；
③pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体农杆菌转化与鉴定
pCAMBIA1301-DREBa重组质粒采用液氮冷冻法[朱锦辉，根癌农杆菌感受态细胞的制备以及质粒ProkII对其转化的研究，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2006，34(7)：92-95]转化农杆菌LBA4404感受态菌株，于YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃，48h，挑取单克隆于YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃，12h，震荡速度200r/min，采用碱裂解法(杨献光，碱裂解法提取质粒DNA的研究，生物技术通报，2006，6：24-26)提取重组质粒并进行双酶切检测。经酶切验证含有pCAMBIA1301-DREBa重组质粒的农杆菌LBA4404-DREBa菌液则可用于下一步的叶盘侵染。添加终浓度20％(体积比)的甘油至农杆菌LBA4404-DREBa菌液，-80℃长期保存；
将-80℃保存的农杆菌LBA4404-DREBa菌液常温化冻后于YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃，48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，震荡速度200r/min，至农杆菌LBA4404-DREBa长至对数生长期即OD600为0.5时，将LBA4404-DREBa菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用；
3)遗传转化体系建立
在超净工作台上，选取在MS+6-BA 1mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基中诱导45天、大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，于相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d。在上述制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染10min，随后用滤纸吸干愈伤组织，再将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为26±2℃、黑暗条件下共培养3天；之后转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+AS 100mg/L培养基中抑菌培养5天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；再转入MS+6-BA 1mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L筛选培养基中进行抗性筛选6个月，温度26±2℃，光照时间为16h/d。
切取上一步经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L上，在温度为26±2℃，光照时间为16h/d的条件下培养，待不定芽长至2cm左右长时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+IBA 0.1mg/L+Hyg 7.0mg/L，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+IBA 0.1mg/L培养基中正常生根；红掌从预培养到抗性芽生长的过程见图5。
4)转基因植株的获得
待抗性植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA。根据潮霉素磷酸转移酶基因HPT两端序列合成扩增反应引物Hyg-F(正向引物)和Hyg-R(反向引物)
Hyg-F：5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′(SEQ ID No.3)
Hyg-R：5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′(SEQ ID No.4)
分别以上述得到的抗性植株和未转化的野生植株的DNA为模板，以Hyg-F和Hyg-R为引物，进行PCR扩增，PCR鉴定结果显示抗性植株在近1000bp下方扩增出一条清晰的条带，未转化野生植株则没有扩增出相应的条带，扩增产物经测序分析表明与潮霉素磷酸转移酶基因HPT核苷酸序列一致(950bp)，证实外源基因已转入红掌基因组DNA中。
Figure IDA0000087414030000011
Figure IDA0000087414030000021

Claims (4)

1.DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：
1)无菌愈伤组织的获得：
取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.1mg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小一致的愈伤组织，将愈伤组织表层去掉后切割成片状，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基；
2)农杆菌悬浮液制备中：
将***目的基因DREB的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，取经酶切验证含有所述重组质粒pCAMBIA1301-DREBa的农杆菌LBA4404-DREBa菌液制备农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液，用于下一步的遗传转化；
3)遗传转化
选取步骤1)中在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基中诱导45天大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，在相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；然后将愈伤组织在步骤2)制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染10min，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为26±2℃、黑暗条件下共培养3天；之后转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+AS 100μmg/L培养基中抑菌培养5天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；再转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L筛选培养基中进行抗性筛选6个月，温度26±2℃，光照时间为16h/d，具有潮霉素抗性的愈伤组织将长出不定芽点；
4)抗性愈伤组织筛选
切取步骤3)中经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L上，在温度为26±2℃，光照时间为16h/d的条件下培养，待不定芽长至2.0-3.0cm时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+IBA 0.1mg/L+Hyg 7mg/L中培养，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+IBA 0.1mg/L培养基中正常生根；
5)转基因植株的获得
待步骤4)得到的具有潮霉素抗性的植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，，设计并合成SEQ ID No.3所示的正向引物Hyg-F和SEQ ID No.4所示的反向引物Hyg-R，以抗性植株的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR鉴定结果能够扩增出950bp条带的抗性植物为转入目的基因DREBa成功的转基因红掌植株。
2.根据权利要求1所述的DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于所述的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa通过如下方法构建：
①DREBa基因克隆
以菊花品种‘钟山红枫’RNA为模板，以SEQ ID No.1所示的正向引物DREBa-F和SEQ IDNo.2所示的反向引物DREBa-R进行RT-PCR扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF，用琼脂糖凝胶电泳回收纯化长度为872bp的RT-PCR目的产物片段，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg/L氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃，16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃，16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证，DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF序列如SEQ ID No.5所示；
②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建
用BamH I和Kpn I双酶切连接了DREBa基因的T-载体，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃，16h，提取质粒，经BamH I和KpnI双酶切鉴定得到pCAMBIA1301-DREBa重组质粒。
3.根据权利要求1所述的DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于所述的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液的通过如下方法制备：将农杆菌LBA4404-DREBa菌液于YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃，48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，震荡速度200r/min，至农杆菌LBA4404-DREBa长至对数生长期即OD600为0.5时，将LBA4404-DREBa菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用。
4.根据权利要求1所述的DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于步骤1)中切割为片状的愈伤组织的大小为0.3～0.8cm×0.3～0.8cm×0.1～0.3cm。
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