CN1434727A - 血管发生和血管通透性调节剂及抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明描述调节组织中血管通透性(VP)的方法，其中使用Src或修饰的Src蛋白、Yes蛋白或修饰的Yes蛋白、Src家族酪氨酸激酶蛋白抑制剂和可表达Src或修饰Src蛋白的核酸。本发明也描述抑制VP的方法，其中使用无活性Src或Yes蛋白或其混合物、或CSK蛋白或修饰CSK蛋白、或编码这些蛋白的核酸，或者使用Src家族酪氨酸激酶化学抑制剂如：PP1、PP2、PD173955、AGL1872、PD162531、根赤壳素R2146和格尔德霉素，或增强VP的方法，其中使用活性Src或Yes蛋白或其混合物、或编码这些蛋白的核酸。相关组合物和制造物也在此公开。

Description

血管发生和血管通透性调节剂及抑制剂

相关申请的交叉参考

本申请要求以下申请的优先权：美国专利申请序列号09/470,881，1999年12月22日递交，和09/538,248，2000年3月29日递交，两申请都要求国际专利申请号PCT/US99/11780的优先权，该申请指定***合众国，于1999年5月28日递交，并要求1998年5月29日递交的专利序列号60/087,220的美国临时申请的优先权。政府权利声明

此处公开的一些工作部分地受NIH拨款支持，NIH代表***合众国，因此***合众国政府对本发明可能有某些权利。

发明领域

本发明一般地涉及医学领域，并具体地涉及调节和抑制血管通透性(VP)的方法和组合物。

发明背景

血管发生是组织血管生成的过程，其中包括新生血管生长入组织内，又被称作新血管生成。该过程由内皮细胞和平滑肌细胞的浸润介导，据信以三种方式中的任一种进行：可从已有血管出芽形成，由前体细胞从头发育形成新血管(血管生成(vasculogenesis))，或已有小血管扩大直径。Blood et al.， Bioch.Biphys.Acta，1032：89-118(1990)。要启动血管发生，首先内皮细胞必须解离并穿过血管基膜，其方式类似于肿瘤细胞在浸润和转移形成中使用的方式。尽管在伤口愈合和黄体生长周期中也能看到，在成年或成熟组织中一般没有血管发生。见，例如，Moses et al.， Science，248：1408-1410(1990)。

在新生儿生长中血管发生是一个重要过程，同时在伤口愈合中也很重要，另外它还在许多临床疾病的发病机理中起作用，包括组织炎症、关节炎、肿瘤生长、糖尿病视网膜病、视网膜新血管生成引起的黄斑变性等。这些伴随血管发生的临床表现被称为血管发生性疾病。Folkman et al.， Science，235：442-447(1987)。

已有建议抑制血管发生对限制肿瘤生长将是一种有益的疗法。已有建议通过以下途径抑制血管发生：(1)抑制“血管发生分子”如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的释放，(2)中和血管发生分子，如用抗βbFGF抗体，(3)使用玻连蛋白受体的抑制剂α_vβ₃，和(4)抑制内皮细胞对血管生成刺激的应答。后一种策略已经引起注意，Folkmanet al.， Cancer Biology，3：89-96(1992)，描述了几种内皮细胞应答抑制剂，包括胶原酶抑制剂，基膜更新抑制剂，angiostaticsteroids，真菌源的血管发生抑制剂，血小板因子4，血小板反应素，关节炎药物如D-青霉胺和gold thiomalate，维生素D₃类似物，α-干扰素等，它们可用于血管发生。其它建议的血管发生抑制剂见Blood etal，. Bioch.Biophys.Acta.，1032：89-118(1990)，Moses et al.，Science，248：1408-1410(1990)，Ingber et al.， Lab.Invest.，59：44-51(1988)，和美国专利No.5,092,885，No.5,112,946，No.5,192,744，No.5,202,352，No.5,753,230和No.5,766,591。然而，前述参考文献中所描述的血管发生抑制剂不包括Src蛋白。

已有报道血管发生依赖于血管整合素和细胞外基质蛋白间的相互作用。Brooks et al.， Science，264：569-571(1994)。进一步，已有报道血管生成性血管细胞的程序性细胞死亡(凋亡)由这种相互作用引发，它将被血管整合素α_vβ₃的某种拮抗剂抑制。Brooks et al.，Cell，79：1157-1164(1994)。近期有报道基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与玻连蛋白受体(α_vβ₅)的结合可用α_vβ₅拮抗剂抑制，并由此抑制蛋白酶的酶促功能。Brooks et al.，Cell，85：683-693(1996)。已经鉴定α_v整合素是血管生成性血管中存活的内皮细胞中的重要成分。特定整合素α_v的整合素拮抗剂阻断不同生长因子诱导的血管发生途径。例如，血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管发生被整合素α_vβ₅拮抗剂阻断，而碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管发生被整合素α_vβ₃拮抗剂阻断。

脑血管***的特征是具有高度限制性的血脑屏障，阻止小分子渗入周围脑组织。哺乳动物血脑屏障的特性受到药理学研究的特别关注，由于高度限制性的血脑屏障，常规条件下很多药物不能穿过血管***进入脑组织。本发明中意外发现，通过血管渗漏血量的测量发现，VP可以受Src或Yes的调节。进一步，VP与血管发生及其它病理症状相关。炎症诱导的血管通透性增加与水肿和肿胀有关。

VEGF诱导的血管发生需要Src酪氨酸激酶活性，但bFGF诱导的血管发生则不需要，表明这两种途径中的调节和活化信号存在显著差异，鸡胚和小鼠模型中都是如此。Eliceiri et al.， Molecular Cell，4：915-924(1999)。

由肿瘤细胞血管生成信号引起的血管通透性改变提供了一个检验癌症相关信号途径的模型，然而，由损伤、疾病或其它血管创伤引起的血管通透性改变是组织损伤相关血管渗漏及水肿的主要原因。例如，与脑血管意外(CVA)或其它脑或脊髓组织中的血管损伤相关的脑血管疾病是神经疾病的最常见原因，也是残疾的主要来源。典型地，在CVA区域中脑或脊髓组织的破坏包括血管渗漏和/或水肿。典型地，CVA可以包括脑缺血、正常脑血流中断引起的损伤；由于血流瞬间干扰引起的脑供血不足；由于颅内或颅外动脉血管栓塞引起的梗死；出血；和动静脉畸形。缺血性中风和脑出血可突然发生，该事件的影响一般反映了脑损伤的面积。(见The Merck Manual，16^th ed.Chp.123，1992)。

除CVA之外，中枢神经***(CNS)感染或疾病也能影响脑和脊髓中的血管，并能引起炎症和水肿，正如以下例子，细菌性脑膜炎，病毒性脑炎和脑脓肿形成。(见The Merck Manual，16^th ed.Chp.125，1992)。全身性疾病状况也能弱化血管并导致血管渗漏和水肿，如糖尿病、肾病、动脉硬化等。因此，血管渗漏和水肿是关键的病理表现，这不同于并独立于癌症，它需要与多种损伤、创伤或疾病状况相关的有效的特异性治疗干预。

我们发现，选择性抑制Src家族酪氨酸激酶活性可减少与组织中VP增加相关的损伤或创伤，同时导致与血管渗漏和/或水肿相关的病理学改善。

发明概述

本发明目的是通过酪氨酸激酶Src调节血管通透性(VP)，酪氨酸激酶Scr此处也一般称作Src，或酪氨酸激酶Yes，此处也一般地称作Yes，或通过选择性抑制Src家族酪氨酸激酶活性调节血管通透性。

从而，本发明的一个方面包括调节哺乳动物靶组织中VP的药物组合物。本发明的组合物含有有治疗效果的VP调节量的酪氨酸激酶蛋白Src和Yes的混合物，它们处于可药用载体中。

在含有活性Src和Yes激酶蛋白的组合物中，预期的调节是加强或增加靶组织中血管的通透性。当所需的Src蛋白为活性激酶时，优选的Src是Src-A。另一种优选的活性Src蛋白中，其527位氨基酸残基是除了酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸以外的任一种氨基酸残基。优选的活性Yes蛋白具有野生型人Yes如Yes-1蛋白的激酶活性。另一种优选的活性Yes蛋白中，其中使激酶失活的磷酸化位点被突变，使之消除或最小化磷酸化失活，这与Src的527位氨基酸残基突变成除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸以外的任一种氨基酸残基相似。

当组合物中含有无激酶活性的Src和Yes蛋白时，预期的调节是抑制或降低靶组织中血管通透性。当需要无活性Src蛋白时，优选的Src是Src 251。进一步优选的无活性Src是Src K295M。与野生型蛋白相比，优选的无活性Yes蛋白其激酶活性降低。

本发明进一步的方面是一种药物组合物，其中含有有治疗效果的VP调节量的核酸，它们可以表达酪氨酸激酶蛋白Src和Yes，该核酸用适当的可药用载体转染进靶细胞。编码Src或Yes蛋白的可表达核酸可含有描述Src或Yes蛋白的整体或一部分的核酸片段。当转染进靶细胞时，靶细胞转录并翻译该核酸序列以表达所需蛋白。

当所需调节是加强或增加靶组织中血管通透性时，编码Src的核酸将编码具有活性的Src，同时编码Yes的核酸将编码具有活性的Yes激酶蛋白。一旦转染进靶宿主细胞，宿主细胞将表达这些核酸。编码Src的核酸优选编码活性Src A蛋白。进一步优选的编码Src的核酸编码突变的活性Src，其中所表达Src蛋白527位氨基酸残基是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸以外的任一种氨基酸残基。编码Yes的核酸优选编码野生型蛋白，或经修饰以消除或抑制Yes蛋白的失活磷酸化位点的蛋白，其修饰方式类似于所述Src的527位氨基酸残基突变。

当所需调节是抑制或降低靶组织血管通透性时，编码无活性Src的核酸优选编码Src 251蛋白。进一步优选的编码无活性Src的核酸编码无活性Src K295M。优选编码无活性Yes的核酸编码的蛋白其激酶活性降低。

可以预知，本发明组合物可含有核酸混合物，其中每种核酸可含有一种可表达Src或Yes基因。另外可以预知，单个核酸中可以同时含有编码Src蛋白的核酸和编码Yes蛋白的核酸。为精确调节靶组织中的血管发生和VP，本发明的药物组合物可含有活性或无活性酪氨酸激酶蛋白Src、或酪氨酸激酶蛋白Yes的混合物。与之相似，本发明药物组合物可含有核酸的混合物，它们能表达活性或无活性酪氨酸激酶蛋白Src、或酪氨酸激酶蛋白Yes。

根据本发明的教导，用不同量的一种酪氨酸激酶，共同给予较多量的另一种酪氨酸激酶，可精确调节。在这种实施方案中，根据本发明的教导，采用差异可表达启动子或其它此类调节元件，低表达的一种酪氨酸激酶基因可与高表达的另一种酪氨酸激酶基因共同给药。在这种实施方案中，可以实现血管发生增加，而同时也保持、最小化或降低VP，这是通过使用一种低表达的活性Src基因，并结合使用另一种高表达的无活性yes基因而实现的。用不同的表达载体、或单个组合的表达载体可以实现这种共同给药。与之类似，使用一种低表达的无活性Src基因，并结合使用另一种高表达的活性yes基因，可以使血管发生减少，同时也保持、加强或增加VP。使用各种高/低和src/yes的组合，同时并选择启动子元件的活性以及诱导型启动子，可以进行进一步调节。

可以预知，单个src和yes基因可置于相同或不同的调节核酸序列，例如但不限于增强子、阻遏物和启动子元件的调控之下。当从单个载体上可以表达两个或更多蛋白时，可以预知独立蛋白基因的转录调控可受相同调控元件的控制。也可以预知转录调控也可受两个或更多独立操作的调节元件的影响。调节元件本领域已知，它可以是组成型活性或诱导型元件、增强子、启动子、抑制子等核酸序列。

可以预知，本发明的核酸组合物可含有病毒和/或非病毒性基因转移载体，其中包含编码Src和/或Yes蛋白的核酸片段。逆转录病毒和非病毒性基因转移和表达载体本领域已知，下面将简单描述。

优选核酸编码Src-A蛋白，另一种优选的活性Src蛋白是527位氨基酸残基是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任一种氨基酸残基的一种Src蛋白。

可以预知，根据本发明的教导，根据所需调节水平、以及对血管发生和VP所需的调节作用，Src和Yes蛋白的混合物、和/或编码这种蛋白的核酸可以同时含有活性和无活性形式的蛋白。

提供Src或Yes蛋白的组合物可包含纯化蛋白、天然蛋白的生物活性片段、重组生产的Src或Yes蛋白或蛋白片段或融合蛋白，或表达Src或Yes蛋白的基因/核酸表达载体，或它们的混合物。

当Src或Yes蛋白被灭活或抑制时，调节作用是抑制VP。在Src或Yes蛋白有活性或被活化的部位，调节作用是加强VP。

本发明包含治疗哺乳动物组织的方法，其中使用含有治疗作用的、VP调节量的Src或Yes蛋白的组合物，或其组合。在本发明方法中，将Src和Yes酪氨酸激酶蛋白、或能表达这种蛋白的核酸表达载体给予组织，该组织具有对VP调节有反应的疾病状况。

在所需的治疗上有效的VP调节作用是增加或加强VP的部位，可以考虑给予活性形式的Src蛋白和/或Yes蛋白。与之相似，该方法因而包括给予编码活性或无活性形式Src蛋白和/或Yes蛋白的可表达核酸。

待治疗组织可以是其中的VP需要调节的任何组织。使有效量的所需调节组合物与靶组织接触，并允许有足够接触时间使药物中的蛋白或核酸成分进入靶组织，从而实现治疗性处理。对于抑制VP，在出现有害血管渗漏的地方治疗疾病组织是有效的。这样的组织包括发炎组织，与中风、心肌梗死或其它正常血流阻断相关的组织，遭受再狭窄的组织等。

对于加强作用，治疗有肢体缺血的患者是有效的，这些患者由于糖尿病或其它状况而造成肢体循环障碍，或用于穿过血脑屏障加强给药入脑。有不愈合的长期伤口的患者因此可从血管细胞增殖和新血管生成中受益，就像调节VP以进行治疗一样。

本发明的进一步的方面是含有包装材料及其所述包装材料中所包含的药物组合物的制造物，其中所述药物组合物可以调节疾病组织中血管通透性，其中所述包装材料含有标签，它表明所述药物组合物可通过调节血管通透性用于治疗疾病情况，且其中所述药物组合物含有治疗有效量的酪氨酸激酶蛋白Yes，它位于可药用载体中。该实施方案包括活生或无活性形式的Yes蛋白，以及编码活性或无活性Yes蛋白的核酸。逆转录病毒和非病毒基因转移/表达载体都可以包含编码Yes蛋白的核酸片段，Yes蛋白可以是活性或无活性形式，或同时含有活性或无活性形式。当活性和无活性形式蛋白激酶基因都存在时，可以考虑基因在分别的诱导型启动子调节下根据需要允许其交替表达。

本发明的进一步方面是这种制造物，其中药物组合物含有治疗上有效的VP调节量的酪氨酸激酶蛋白Src和Yes，它们位于可药用载体中。制造物包装上标明其加强VP调节作用，Src和Yes是活性形式。优选的活性Src是Src-A蛋白。另一种优选的活性Src蛋白其527位氨基酸残基是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任一种氨基酸。

本发明的进一步方面是含有药物组合物的制造物，其中所述药物组合物含有治疗上有效的VP调节量的无活性酪氨酸激酶蛋白Src和Yes蛋白，它们位于可药用载体中，其中所需调节作用是失活或抑制VP。优选的无活性Src是Src 251蛋白。另一种优选的无活性Src蛋白是Src K295M。

与之相似，本发明的进一步方面是这种制造物，其中药物组合物含有能表达酪氨酸激酶蛋白Src和Yes的核酸，它们位于适当的药物载体中。本制造物的药物组合物中优选的核酸成分编码活性Src蛋白，其中所需调节作用是加强或激活VP。进一步可以考虑编码活性Yes蛋白的核酸。优选的活性Src是Src-A蛋白。另一种优选的编码活性Src的核酸，该Src蛋白527位氨基酸残基是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任一种氨基酸。另外也可考虑构建同时表达yes和src的单个核酸，或独立调节，或在相同的启动子、增强子、抑制子、阻遏物或其它合适的调节性核酸序列的转录控制下。

血管渗漏和/或水肿与血管通透性的有害性改变相关，与此相关的组织损伤可用Src家族酪氨酸激酶抑制剂改善。要达此目的，可将调节血管通透性有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂给予需要这种治疗的组织。由此可减弱由于血管渗漏或水肿引起的组织损伤。

特别地，本发明提供一种抑制受疾病损害的组织中血管通透性增加的方法，该疾病与血管渗漏和/或水肿相关，该方法将治疗有效的血管通透性抑制量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂和可药用载体一起，与所述组织相接触。在优选实施方案中，Src特异的酪氨酸激酶抑制剂被施用于组织。

可用这种方法治疗涉及有害损伤诱导的血管通透性增加的任何病理状况，以及由于血管渗漏或水肿引起的组织损伤。这种病理事件可包括血管损伤，如物理结扎、阻断、分离、堵塞、创伤等。其它全身性病理事件如动脉硬化、糖尿病视网膜病变，由于微生物感染引起的炎症性疾病、关节炎等也可用本发明的方法进行适当治疗。

通过改善由于血管渗漏增加和/或与其相关的水肿引起的组织损伤，本发明的方法可用于治疗脑血管疾病或创伤。特别地，本发明的方法可用于改善与血管内皮细胞生长因子(VEGF)-诱导的Src介导的血管通透性增加有关的组织损伤。然而，本发明的方法不限于VEGF-诱导的血管通透性增加，作为对其它调节信号的反应，也适于调节Src家族酪氨酸激酶介导的血管通透性增加。

特别地，通过抑制酪氨酸激酶Src，(此处一般也称为Src)，以及密切相关的酪氨酸激酶Yes，(此处一般也称为Yes)，可特异性调节治疗组织以抑制与损伤或疾病相关的血管通透性增加。

对本发明目的合适的Src家族酪氨酸激酶抑制剂选自下组的化学抑制剂：PP1，PP2，PD173955，AGL1872，PD162531，根赤壳素R2146，和格尔德霉素。Src家族酪氨酸激酶的其它化学抑制剂也适用于本发明的方法。

组织中的血管通透性也可通过向组织中给予作为一种蛋白质抑制剂的Src家族酪氨酸激酶抑制剂来调节，如无活性Src蛋白如SrcK295M或Src 251，或无活性Yes蛋白，或活性c-端Src激酶(CSK)蛋白。

适于调节组织中血管通透性的还有编码Src家族酪氨酸激酶抑制剂蛋白，如无活性Src、无活性yes或活性CSK蛋白的核酸。Src家族酪氨酸激酶活性的这些核酸抑制剂可以包括一或多种逆转录病毒表达载体，非病毒表达载体等。这些核酸抑制剂可含有适当的调节信号，如给定核酸上一或多个可表达核酸片段的启动子或增强子。

本发明的进一步方面中，制造物含有包装材料及其包含于所述包装材料内的药物组合物，其中所述药物组合物可以调节受疾病状况损害的组织中的血管通透性。包装材料含有一个标签，上面标明所述药物组合物可用于治疗血管渗漏或水肿相关的疾病情况，且药物组合物含有可药用载体中的治疗有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂。

作为药物组合物的一部分，本发明的一种制造物可包含一种化学抑制剂即Src家族酪氨酸激酶抑制剂。特别地，优选的Src家族酪氨酸激酶化学抑制剂选自下组：PP1，PP2，PD173955，AGL1872，PD162531，根赤壳素R2146，和格尔德霉素，或具有类似Src抑制活性的化合物。最优选的抑制剂是PP1。

本发明的一种制造物也包括所述药物组合物，其中含有一种Src家族酪氨酸激酶蛋白质类抑制剂，该抑制剂是一种无活性Src蛋白如Src K295M或Src 251，无活性Yes蛋白，或活性CSK蛋白。

另外，药物组合物也可含有编码Src家族酪氨酸激酶抑制剂的核酸，它位于可药用载体中。在这种药物组合物中，所述核酸编码的抑制剂可以是无活性Src蛋白，如Src K295M或Src 251，无活性Yes蛋白，或活性CSK蛋白。

制造物可以包括一或多种药物组合物，其中包含治疗性Src家族酪氨酸激酶抑制剂，或亚治疗量的多种Src家族酪氨酸激酶抑制剂，它们位于可药用载体中。

本发明制造物中的药物组合物可含有一或多种亚治疗作用的VP调节量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂的混合物，它们对接受治疗的组织共同提供VP降低作用。制造物中的药物组合物可根据所需调节作用而变化，同时包装上的标签也随之作相应变化。

制造物中的药物组合物可根据所需调节或抑制作用而变化，同时包装上的标签也随之作相应变化。

附图简述

附图构成本公开的一部分，其中：

图1是鸡c-Src的cDNA序列，它是内含子缺失的完全编码序列，由Takeya et al.， Cell，32：881-890(1983)首次描述。该序列可由GenBank访问号J00844获得。其中包含1759个核苷酸，蛋白编码区的起始和终止核苷酸位置分别是112和1713(SEQ ID NO：2)。

图2是图1中所示鸡c-Src编码序列所编码的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：3)。

图3是人c-Src cDNA序列，由Braeuninger et al.， Proc.Natl. Acad.Sci.，USA.，88：10411-10415(1991)首次描述。该序列可由GenBank访问号X59932 X71157获得。其中包含2187个核苷酸，蛋白编码区的起始和终止核苷酸位置分别是134和1486(SEQ ID NO：4)。

图4是图3中所示人c-Src编码序列所编码的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：5)。

图5表示实施例4描述的bFGF或VEGF激活内源性Src。本图上部给出用bFGF和VEGF对内源性c-Src激活倍数的体外激酶测定的结果。本图下部是用抗Src抗体为探针作加样对照在相等Src和IgG浓度下的激酶测定印迹。

图6表示实施例4所描述的逆转录病毒介导的c-Src A基因表达对鸡CAM血管发生的作用。9日龄鸡CAM暴露于RCAS-Src A(有活性的突变c-Src)或对照RCAS-GFP(绿色荧光蛋白；一种荧光指示蛋白)逆转录病毒或缓冲液中72小时。图6A定量血管发生水平，图6B表示对应于每个处理组的代表性显微照片(4×)，用立体显微镜拍摄。

图7表示c-Src A的逆转录病毒表达激活血管MAP激酶磷酸化。图7A表示VEGF或PMA处理30分钟或c-src A逆转录病毒感染48小时的10日龄鸡CAM的组织提取物，NT代表没有处理。从等价量的总蛋白提取物中免疫沉淀Src，并用FAK-GST融合蛋白作为底物对Src进行体外免疫复合物激酶测定，随后电泳并转移到硝酸纤维素膜上。取几份上述全组织裂解液用抗磷酸化ERK抗体作免疫印迹，测量内源性ERK的磷酸化。图7B表示用空对照RCAS或包含SRC A的RCAS感染的10日龄CAM。两天后，解剖CAM，低温保存于OCT并切成4μm切片。切片用抗磷酸化ERK抗体(New England Biolabs)免疫染色，漂洗，然后用山羊抗兔FITC偶联的二抗检测。用冷却CCD相机(PrincetonInst.)获取荧光图像。

图8表示VEGF、而不是bFGF诱导的血管发生选择性需要Src活性。9日龄鸡CAM暴露于RCAS-Src 251或对照RCAS-GFP逆转录病毒或缓冲液20小时，然后在存在或不存在bFGF或VEGF的条件下再孵育72小时。按上述方法定量图8A的血管发生水平，图8B表示用立体显微镜拍摄的代表性光学显微照片(6×)。图8C表示用抗Src抗体作探针的印迹结果，以确证与空对照处理相比较Src 251在转染细胞中的表达。

图9表示逆转录病毒将RCAS-Src 251递送到人肿瘤的结果。图9A的显微照片表示用Bio Rad激光共聚焦扫描显微镜(横条＝500μm)形成光学切片检测感染RCAS-GFP(RCAS-绿色荧光蛋白)的人成神经管细胞瘤肿瘤片段仅在肿瘤血管(箭头)中表达GFP。图9B表示局部施用逆转录病毒处理肿瘤的数据，它们在切除并称出湿重后继续生长3或6天。数据表示为肿瘤重量(从50mg肿瘤起始重量起)变化的平均值±两个平行测定的SEM。图9C是代表性显微照片，表示从胚胎手术切除的成神经管细胞瘤肿瘤(横条＝350μm)。下面是每个肿瘤的高倍放大图，详细显示每个肿瘤的血管***(横条＝350μm)。箭头所指是RCAS-Src251处理肿瘤的血管破坏处。

图10是RCASBP(RCAS)载体构建体(SEQ ID NO：1)的限制性酶切图。

图11是单字母表示被编码的人c-Yes蛋白的氨基酸残基序列(SEQID NO：8)。

图12表示编码人c-Yes蛋白的cDNA的核酸序列。序列的GenBank访问号是M15990。其中包含4517个核苷酸，蛋白编码区的起始和终止核苷酸位点分别是208和1839，并翻译成图11所示的氨基酸(SEQID NO：7)。

图13表示鼠皮下血管发生模型中逆转录病毒递送Src 251和CSK的结果。图13A表示检测flk表达的免疫印迹结果。图13B表示在VEGF和bFGF刺激条件下flk测定的免疫印迹结果。图13C是在存在GFP、Src 251、或CSK逆转录病毒的条件下用VEGF和bFGF刺激处理后，CD34阳性血管数(在20×放大的三个随机视野中的平均值)的柱状图。

图14表示在缺失Src、fyn、和Yes的小鼠皮肤里用改进Miles测定VEGF对VP作用的结果。图14A是被处理耳朵的照片，图14B是刺激多种缺陷型小鼠的试验结果图，图14C表示处理后洗脱的Evan’s蓝染料量。

图15表示Src+/-、Src-/-、野生型(WT)、和PP1处理的野生型小鼠中梗塞的相对大小。PP1处理是1.5mg/kg体重。

图16表示对照和PP 1处理的小鼠脑的序贯MRI扫描图，图中显示PP1处理的动物(右侧)比对照动物(左侧)脑梗塞更少。

发明详述

A.定义

氨基酸残基：通过在肽键处对多肽化学消化(水解)而形成的氨基酸。此处所述的氨基酸残基优选是“L”构型。然而，“D”构型残基可取代任一个L-氨基酸残基，只要多肽还保留所需功能特性。NH₂指多肽氨基端的游离氨基，COOH指多肽羧基端的游离羧基。与标准多肽命名法(描述于 J.Biol.Chem.，243：3552-59(1969)并在37 CFR§1.822(b)(2)之下采用)一致。

应该说明此处所有氨基酸残基序列从左到右方向与常规从氨基端到羧基端的方向一致。进一步应该说明，氨基酸残基序列起始和终止点的破折号表示连接到其它的一个或多个氨基酸残基的肽键。

多肽：指在连续氨基酸残基的α-氨基和羧基之间由肽键互相连接的氨基酸残基的线性序列。

肽：此处指如多肽中互相连接的不超过约50个氨基酸残基的线性序列。

环状肽：指一种具有杂原子环结构的化合物，其中包括如典型肽中一样的几个酰胺键。该环状肽可以是homodetic“头至尾”环化的线性多肽，其中线性肽的N端与线性肽的C端羧基形成酰胺键，或者可以包含一个环结构，其中聚合物是heterodetic并且含有酰胺键和/或其它键以关闭该环，如二硫桥、硫酯、硫代酰胺、胍基等。

蛋白质：指如多肽中一样互相连接的超过50个氨基酸残基的线性序列。

副合蛋白：指包含至少两个不同多肽结构域的多肽，它们由典型肽键操作性连接(“融合”)，其中这两个结构域对应自然界没发现融合的肽。

合成肽：指化学产生的氨基酸残基链，它们由肽键连在一起，它在天然存在的蛋白及其片段中不存在。

B.一般问题

本发明一般地涉及：(1)以下发现：VEGF诱导的VP特异地由酪氨酸激酶蛋白Src和Yes介导，且VP可通过提供活性或无活性Src或Yes蛋白调节，以分别加强或抑制血管发生；(2)进一步的发现：通过抑制Src家族酪氨酸激酶活性，与创伤相关的血管渗漏和/或水肿、以及损伤相关的血管通透性增加的疾病可以被特异地调节和改善；和(3)以下发现：体内给予Src家族酪氨酸激酶抑制剂可降低与癌症或血管发生无关的由于疾病或损伤相关血管通透性增加导致的组织破坏。

该发现很重要，因为血管通透性在多种疾病过程中起作用，且与血管发生、新血管的形成相关。当疾病状况下的组织生长依赖于血管发生时，需要抑制血管发生从而抑制患病组织生长。通过同时抑制VP，可以更有效地抑制血管发生。当损伤组织生长和愈合依赖于血管发生时，需要加强或促进VP以及血管发生，并由此促进组织愈合和生长。

当新血管的生长是疾病组织相关病理状况的原因或对其有促进作用时，抑制VP并从而抑制血管发生将减少疾病的有害作用。通过抑制血管发生相关的VP，可以干预疾病，改善症状，在一些病例中还可以治愈疾病。

某些情况下，希望增加VP以增加全身给药时药物递送的效能。血脑屏障是一种术语，描述紧密调节VP，并因此使药物从循环中进入脑中最少，甚至对小分子也是如此。通过调节相关血管VP来选择性和特异性调节血脑屏障通透性的能力将允许给药，否则药物将不能通过循环进入脑组织。

与之相似，许多中风引起的病理状况和损伤由于VP突然增加而激化，因此特异性调节VP的能力允许新型和有效的治疗，以减少中风的副作用。

本发明的方法有效，部分原因是该疗法对VP有高度选择性而不涉及其它生物学过程。

本发明部分涉及以下发现，血管发生由酪氨酸激酶Src介导，而且可通过提供活性或无活性Src蛋白分别加强或抑制血管发生，从而调节血管发生。

该发现很重要，因为血管发生、新血管形成在多种疾病过程中起作用。当疾病相关组织生长要求血管发生时，需要抑制血管发生从而抑制患病组织生长。当损伤组织生长和愈合要求血管发生时，需要加强或促进VP以及血管发生，并由此促进组织愈合和生长。

当新血管的生长是疾病组织病理状况的原因或对其有促进作用时，抑制血管发生将减少疾病的有害作用。通过抑制血管发生，可以干预疾病，改善症状，在一些情况下还可以治愈疾病。

与疾病和新血管生成相关的组织将受益于血管发生的抑制性调节，这些例子包括类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、炎症性疾病、再狭窄等。当需要新血管生长以支持有害组织生长时，抑制血管发生将减少组织血液供应并因此有助于减小基于供血需求的组织团。这些例子包括肿瘤生长，其中持续需要新血管生成以便肿瘤生长超过几毫米厚度，并建立实体瘤的转移。

在认为新血管生长有助于组织愈合时，加强血管发生将有助于愈合。这类例子包括肢体缺血患者的治疗，由于糖尿病或其它原因，他们肢体的循环很差。另外也包括具有不愈合的慢性伤口的患者，他们可受益于血管细胞增殖的增加和新血管生成。

本发明的方法之所以有效，部分原因是该疗法对血管发生有高度选择性而不涉及其它生物学过程。

如前所述，血管发生包括多种过程，涉及到组织中新血管生成，包括“出芽”、血管生成、或血管扩大，所有这些血管发生过程都受Src蛋白影响。除了创伤愈合、黄体形成和胚胎发生，据信大多数血管发生过程与疾病过程有关，因此使用本治疗方法对疾病有选择性且没有有害副作用。

本发明也部分涉及以下发现，通过抑制Src家族酪氨酸激酶活性，与创伤相关的血管渗漏和/或水肿、以及损伤相关的血管通透性增加的疾病可以被特异地调节和改善。特别地，本发明涉及以下发现，体内给予Src家族酪氨酸激酶抑制剂可减少由于疾病或损伤相关血管通透性增加导致的组织破坏，这种增加与癌症或血管发生无关。

当使用Src家族酪氨酸激酶抑制剂调节VEGF诱导的VP增加时，特异性抑制Src家族激酶活性改善由血管渗漏和/或水肿引起的周围组织破坏，然而Src家族激酶信号被活化。

血管通透性涉及多种不依赖于与血管发生直接关联的疾病过程。例如，许多中风诱导的病理状况和破坏是由血管损伤导致的VP突然增加引起的，因此特异性调节VP的能力将允许新型和有效的治疗，以减少中风的副作用。

疾病或损伤诱导血管渗漏和/或水肿，这种组织将受益于用Src家族激酶抑制剂进行特异性抑制调节，这类例子包括类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、炎症性疾病、再狭窄等。

头或脊柱损伤及其他心血管意外典型地由缺血或出血性事件引起，这是神经***疾病及相关损伤的主要原因。脑水肿或血管渗漏源自这类损伤，是威胁生命的病理状况，引发脑和脊髓(中枢神经***；CNS)的***性和播散性破坏，在此情况下特异性调节血管渗漏和水肿的组织破坏作用是非常有用的。

CNS感染、脑膜炎、大脑炎和脑炎都能导致包括脑水肿在内的不利病理状况。用减少血管渗漏或水肿的特异性疗法可补充潜在感染的治疗。

已有报道，用VEGF受体IgG融合蛋白***性中和VEGF蛋白可减小大脑缺血之后的梗塞大小，这种作用归因于VEGF介导的血管通透性降低。N.van Bruggen et al.， J.Clin.Inves.104：1613-1620(1999)。然而，VEGF不是血管通透性增加的关键介质，而现已发现Src正是。

涉及Src介导的血管通透性增加，并因此Src是用本发明方法和组合物治疗的合适靶点的其他疾病和状况包括：脑出血，脑和脊髓创伤，组织缺氧引起的脑和脊髓损伤；CNS炎症性疾病：病毒或细菌感染(例如脑膜炎，HIV脑病)，自身免疫病(例如多发性硬化)；血脑屏障通透性慢性增加的疾病(例如阿耳茨海默病)；在需要组织灌注和供氧暂时减少的外科手术中用作保护剂；成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；类风湿性关节炎；和糖尿病视网膜病。

C.Src家族酪氨酸激酶蛋白

本发明使用的酪氨酸激酶蛋白可根据使用目的而变化。名词“Src蛋白”或“Src”都是指此处所述的多种形式的酪氨酸激酶Src蛋白，可以活性或无活性形式存在。名词“Yes蛋白”或“Yes”都是指此处所述的多种形式的酪氨酸激酶Yes蛋白，可以活性或无活性形式存在。另外，在上下文描述中，也提到编码Src或Yes的核酸遗传序列或基因。名词“Src家族”指一组酪氨酸激酶，它们在功能和氨基酸序列上与Src相关。

“活性Src蛋白”指加强血管发生或VP的各种形式Src蛋白中的任一种。测量加强血管发生或VP的测定描述于此，但不应理解为限制。如果血管发生或VP水平比测定***中没加入这种蛋白的对照水平高出至少10％、优选高出25％、更优选高出50％，这种蛋白被认为是有活性的。

测量加强血管发生的优选测定法是用RCAS病毒载体的CAM测定，它描述于实施例中，其中通过数分支点来计算血管发生指数。

测量加强VP的优选测定法是在小鼠中用Evan’s蓝染料所做的Miles测定，它描述于实施例中，其中VP用从血管中渗漏的Evan’s蓝染料的量测量。

优选的活性Src或Yes蛋白都表现出酪氨酸激酶活性。例证性活性Src或Yes蛋白描述于实施例中，且包括Src-A和Yes-1。

“无活性Src蛋白”指抑制血管发生或VP的各种形式的Src蛋白的任一种。“无活性Yes蛋白”指抑制VP的各种形式Yes蛋白中的任一种。测量抑制VP增加的测定描述于此，但不应理解为限制。如果血管发生水平比测定***中没加入外源Src蛋白的对照水平低至少10％、优选低25％、更优选低50％，这种Src蛋白被认为是无活性的。

如果VP水平至少与测定***中没加入外源Src或Yes蛋白的对照水平相同，或低10％、优选低25％、更优选低50％，这种Src或Yes蛋白被认为是无活性的。

测量抑制血管发生的优选测定法是用RCAS病毒载体的CAM测定，它描述于实施例中，其中通过数分支点来计算血管发生指数。

测量抑制VP的优选测定法是在小鼠中用Evan’s蓝染料作的Miles测定，它描述于实施例中，其中VP用从血管中渗漏的Evan’s蓝染料的量测量。

优选的无活性Src或Yes蛋白都表现出酪氨酸激酶活性降低。例证性无活性Src蛋白描述于实施例中，且包括Src-251和Src K295M。

用于本发明的Src蛋白可用多种方法中的任一种生产，其中包括从包括组织在内的天然来源分离，用重组DNA表达和纯化生产等。通过向有关组织中引入基因治疗***，然后在组织中表达蛋白，也可“原位”提供Src和/或Yes蛋白。

可用多种本领域已知的方法制备编码Src或Yes蛋白的基因，在此方面不应理解为对本发明的限制。例如，公知Src的自然史包括多种同源物，可来自哺乳动物、鸟类、病毒等物种，用cDNA克隆方法从表达该蛋白的任一组织很容易克隆该基因。用于本发明的优选Src是细胞蛋白，如称为c-src的哺乳动物或鸟类的同源物，特别优选的是人c-src。用于本发明的优选Yes是人细胞蛋白，c-src，特别优选的是人c-yes-1，它编码如图11所示的氨基酸序列。图11中蛋白Yes-1由图12所示的核酸序列的一个片段编码，并指称为编码区片段。

D.表达Src或Yes蛋白的重组DNA分子和表达***

本发明描述几个专用于本发明的核苷酸序列。这些序列包括编码用于本发明Src蛋白的序列，和构建的用于表达Src蛋白的各种DNA片段、重组DNA(rDNA)分子和载体。这些序列也包括编码用于本发明Yes蛋白的序列，和构建的用于表达Yes蛋白的各种DNA片段、重组DNA(rDNA)分子和载体。

本发明的DNA分子(片段)因此可含有编码整个结构基因、结构基因片段或基因组合和此处进一步描述的转录单位的序列。

优选的DNA片段是这样一段核苷酸序列，它编码此处定义的一种Src或Yes蛋白，或同时编码这两种蛋白，或其中的生物活性片段。

优选Src和Yes的氨基酸残基序列和核苷酸序列描述于实施例中。

优选DNA片段编码的氨基酸残基序列与对应于此处描述的一种Src或Yes蛋白的氨基酸残基序列或其一部分基本相同，且优选基本由其组成。代表性和优选DNA片段进一步描述于实施例中。

蛋白或多肽的氨基酸残基序列直接相关于编码该蛋白的结构基因的脱氧核糖核酸(DNA)序列的遗传密码。因而，结构基因或DNA片段可由其编码的氨基酸残基序列，也即蛋白或多肽来定义。

遗传密码的一个重要和公知的特征是其简并性。也即，对于大多数用于制造蛋白的氨基酸，超过一种编码核苷酸三联体(密码子)可编码或指定一种特定的氨基酸残基。因此，多个不同的核苷酸序列可编码一种特定的氨基酸残基序列。这些核苷酸序列被认为在功能上是等价的，因为在所有生物体内它们可导致生成相同的氨基酸残基序列。偶尔，嘌呤或嘧啶的甲基化变体可掺入给定核苷酸序列。然而，这种甲基化在任何情况下并不影响编码关系。

核酸是任何的多核苷酸或核酸片段，无论是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，即RNA或DNA，或其类似物。在优选实施方案中，核酸分子形式是双螺旋DNA片段，即DNA片段，尽管对于某些分子生物学方法优选单链DNA或RNA。

DNA片段可由很多方法生产，包括化学合成和重组方法，优选用克隆法或聚合酶链式反应(PCR)。编码部分Src蛋白的DNA片段很容易用化学技术合成，例如，磷酸三酯法，Matteucci et al.， J.Am.Chem. Soc.，103：3185-3191，1981，或自动合成法。另外，用公知方法很容易制备更大DNA片段，如合成一组定义该DNA片段的寡核苷酸，随后杂交并连接寡核苷酸以形成完整片段。替代的方法包括在认为含有编码Src蛋白成员的cDNA文库中，用一对寡核苷酸引物通过PCR分离优选的DNA片段。

当然，通过化学合成，用适当碱基取代那些编码天然氨基酸残基序列的碱基，可进行任何需要的修饰。该方法众所周知，且很容易用于生产此处描述的各种不同“修饰”的Src蛋白。

进一步，用定位或随机诱变可修饰主要由编码Src或Yes蛋白的结构基因组成的DNA片段，以引入任何需要的取代。

1.克隆Src或Yes基因

可用多种生化方法从合适的基因组DNA或信使RNA(mRNA)来源克隆本发明的Src或Yes基因。可根据描述于实施例的本领域公知的常规方法克隆这些基因。

适用于本发明方法的克隆Src或Yes基因的核酸来源包括cDNA文库形式的基因组DNA或信使RNA(mRNA)，它们来自被认为表达这些蛋白的组织。优选的组织是人肺组织，尽管可以使用任何其它合适的组织。

优选的克隆方法包括用标准方法制备cDNA文库，并用基于此处描述核苷酸序列的成对寡核苷酸引物进行PCR扩增来分离编码Src或编码Yes的核苷酸序列。另外，用基于此处所述核酸序列的杂交探针通过常规核酸杂交方法也可以从cDNA或基因组文库中鉴定并分离需要的cDNA克隆。其它分离和克隆适用的编码Src或Yes的核酸的方法对于本领域的技术人员显而易见。

2.基因转移和/表达载体

本发明涉及一种重组DNA分子(rDNA)，其中包含如此处所述的编码Src或Yes蛋白或同时编码这两种蛋白的DNA片段。通过将本发明编码Src或Yes的DNA片段可操作地(框内，可表达)连接到载体上可以得到可表达rDNA。因此，重组DNA分子是杂交DNA分子，其中含有至少两个正常情况下自然界未发现在一起的核苷酸序列的核酸。

选择本发明DNA片段可操作性连接的载体直接根据本领域公知需要的功能特性，例如，蛋白表达和待转化的宿主细胞。本领域中构建重组DNA分子方面的典型考虑。本发明考虑的载体至少能指导包括于载体DNA片段中结构基因的复制，并优选也指导其表达，该片段可操作性连接于载体上。

表达载体同时包含可表达src和yes核酸序列时，两个基因可同时由第一个基因上游的同一个调节元件来调节，或者由不同的调节元件单独调节。

载体构建领域一般的技术人员都熟悉原核和真核表达载体，并且它们由Ausebel，et al.描述于 Current Protocols in Molecular Biology，Wiley and Sons，New York(1993)和由Sambrook et al.描述于 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，(1989)。这些参考文献也描述了许多此处参考的常规重组DNA方法。

在一个实施方案中，本发明考虑的载体包括一个原核复制子，即具有指导自主复制并在用其转化的原核宿主细胞，如细菌宿主细胞中，染色体外维持重组DNA分子能力的DNA序列。这种复制子本领域公知。另外，那些包括原核复制子的实施方案也包括其表达提供转化宿主药物抗性的基因。典型的细菌药物抗性基因是那些提供氨苄青霉素或四环素抗性的基因。

包括原核复制子的载体也可包括能在由其转化的细菌宿主细胞，如大肠杆菌中指导结构基因表达(转录和翻译)的原核启动子，启动子是一种由DNA序列形成的表达调控元件，该序列允许RNA聚合酶结合并起始转录。与宿主细菌相容的启动子序列典型由质粒载体提供，其中含有常见限制性位点以***本发明的DNA片段。典型的这种载体质粒是由Biorad Laboratories(Richmond，CA)提供的pUC8，pUC9，pBR322和pBR329，由Invitrogen(San Diego，CA)提供的pRSET和由Pharmacia，Piscataway，N.J.提供的pPL和pKK223。

与真核细胞相容，优选与脊椎动物细胞相容的表达载体，也可用来构建本发明的重组DNA分子。真核细胞表达载体本领域公知且可从几个商业来源获取。典型地，这种载体包含方便的限制性切点以***需要的DNA片段。典型的这种载体是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)，pTDT1(ATCC，#31255)，pRc/CMV(Invitrogen，Inc.)，描述于实施例中的优选载体，及类似的真核表达载体。

本发明特别优选的基因表达***包括基因递送组分，也即，递送基因进入相关组织的能力。适用的载体是“感染性”载体如重组DNA病毒、腺病毒或逆转录病毒载体，它们经工程化以表达需要的蛋白并具有允许感染预选靶组织的特性。特别优选的是此处描述的具有复制能力的禽肉瘤病毒(RCAS)。

用重组病毒或病毒元件来指导表达的哺乳动物细胞表达***可以被工程化。例如，当用腺病毒表达载体时，可将多肽编码序列连接到腺病毒转录/翻译调控复合体，例如晚期启动子和三联前导序列中。然后用体外或体内重组将该嵌合基因***腺病毒基因组。***病毒基因组非必需区(例如E1或E3区)将产生可存活的病毒并能在感染宿主中表达该多肽(例如，见Logan et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.， USA，81：3655-3659(1984))。另外，也可使用痘苗病毒7.5K启动子。(例如见Mackett et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79：7415-7419(1982)；Mackett et al.， J.Virol.，49：857-864(1984)；Panicali et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79：4927-4931(1982))。特别感兴趣的是基于牛***瘤病毒的载体，它具有作为染色体外元件复制的能力(Sarver et al.， Mol.Cell. Biol.，1：486(1981))。该DNA进入靶细胞后不久，质粒复制到每细胞约100到200拷贝。***cDNA的转录不要求质粒整合入宿主染色体，因此产生高水平表达。通过在质粒上包括一个可筛选标记，如neo基因，这些载体可用于稳定表达。另外，可修饰逆转录病毒基因组用作引入和指导编码多肽的核苷酸序列在宿主细胞中表达的载体(Coneet al.， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：6349-6353(1984))。高水平表达也可用诱导型启动子获得，包括但不限于金属硫蛋白IIA启动子和热休克启动子。

最近，有人研究了巨细胞病毒(CMV)启动子与劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子驱动的胸苷激酶(TK)基因疗法对携带人卵巢癌的裸鼠的长期存活性的影响。发现腺病毒介导的CMV启动子驱动的单纯疱疹病毒TK基因疗法的细胞杀伤效果比RSV驱动的疗法高2到10倍。(Tong et al.，1999， Hybridoma 18(1)：93-97)。已经描述了设计基因疗法使用的嵌合启动子，它需要低水平表达，然后是诱导型高水平表达。(Suzukiet al.，1996， Human Gene Therapy 7：1883-1893)。

对于长期高产率生产重组蛋白，优选稳定表达。宿主细胞可用适当表达调控元件(例如，启动子和增强子序列，转录终止子多腺苷酸化位点等)和可选择标记控制的cDNA转化，而不是用包含病毒复制起始的表达载体。如上所述，重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合入其染色体中并生长形成转化灶，由此可将其克隆并扩增成细胞系。

例如，引入外源DNA后，可将工程化细胞在富集培养基上生长1至2天，然后换成选择培养基。可使用多种选择***，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.， Cell，11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska et al.， Proc.Natl. Acad.Sci.，USA，48：2026(1962))，和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.， Cell，22：817(1980))基因，它们可分别用于tk^-，hgprt^-或aprt^-细胞。也可使用抗代谢物抗性赋予基因作为选择基础；例如dhfr基因，它赋予氨甲喋呤抗性(Wigler et al.， Proc.Natl. Acad.Sci.，USA，77：3567(1980)；O’Hare et al.， Proc.Natl. Acad.Sci.，USA，78：1527(1981))；gpt，它赋予霉酚酸抗性(Mulligan et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，78：2072，(1981))；neo，它赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin etal.， J.Mol.Biol.，150：1(1981))；和hygro，它赋予潮霉素抗性(Santerre et al.， Gene，30：147(1984))。最近，有其它选择性基因已被描述，即trpB，它允许细胞使用吲哚代替色氨酸；hisD，它允许细胞使用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman et al.， Proc. Natl.Acad.Sci.，USA，85：804(1988))；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，它赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO抗性(McConlogue L.，In：Current Communications in MolecularBiology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.，(1987))。

人基因疗法考虑的主要载体起源自逆转录病毒。(Wilson，1997，Clin.Exp.Immunol.107(Sup.1)：31-32；Bank et al.，1996，Bioassays 18(12)：999-1007；Robbins et al.，1998， Pharmacol. Ther.80(1)：35-47)。基因转移和反义疗法的治疗前景刺激了许多治疗各种组织的载体***的开发。(脉管***，Stephan et al.，1997，Fundam.Clin.Pharmacol.11(2)：97-110；Feldman et al.，1997，Cardiovasc.Res.35(3)：391-404；Vassalli et al.，1997，Cardiovasc.Res.35(3)：459-69；Baek et al.，1998， Circ.Res.82(3)：295-305；肾，Lien et al.，1997， Kidney Int.Suppl.61：S85-8；肝，Ferrv et al.，1998， Hum Gene Ther.9(14)：1975-81；肌肉，Marshall et al.，1998， Curr.Opn.Genet.Dev.8(3)：360-5)。除了这些组织外，人基因疗法的关键靶位是癌，或者肿瘤自身，或者相关组织。(Runnebaum，1997， Anticancer Res.17(4B)：2887-90；Spear et al.，1998， J.Neurovirol.4(2)：133-47)。

下面简述容易适用于本发明方法的病毒基因疗法载体***的具体实例。最近Federspiel和Hughes综述了逆转录病毒基因递送(1998，Methods in Cell Biol.52：179-214)，其中特别提到禽白血病病毒(ALV)逆转录病毒家族(Federspiel et al.， Proc.Natl.Acad. Sci.，USA，93：4931(1996)；Federspiel et al.， Proc.Natl.Acad. Sci.，USA，91：11241(1994))。Svoboda进一步描述了逆转录病毒载体，包括ALV和鼠白血病病毒(MLV)(1998， Gene 206：153-163)。

改进的逆转录病毒/腺病毒表达***很容易适用于本发明方法的实施。例如，鼠白血病病毒(MLV)***由Karavanas等综述于1998，Crit.Rev.in Oncology/Hematology 28：7-30。腺病毒表达***由Von Seggern和Nemerow综述于 Gene Expression Systems(ed.Fernandez & Hoeffler，Academic Press，San Diego，CA，1999，chapter 5，pages 112-157)。

已经证明蛋白表达***在体内和体外都有有效用途。例如，已有描述用I型单纯疱疹病毒(HSv)扩增子载体将基因有效转移入人鳞状细胞癌。(Carew et al.，1998， Am.J.Surg.176：404-408)。单纯疱疹病毒已用于神经***基因转移。(Goins et al.，1997，J.Neurovirol.3(Sup.1)：S80-8)。用HSV-TK导向的***载体已在实体瘤上用于测定。(Smiley et al.，1997， Hum.Gene Ther.8(8)：965-77)。I型单纯疱疹病毒载体已用于结肠癌细胞的癌症基因疗法。(Yoon et al.，1998， Ann.Surg.228(3)：366-74)。已开发杂交载体以延长转染时间，包括用于治疗肝细胞的HSV/AAV(腺伴随病毒)杂交体。(Fraefel et al.，1997， Mol.Med.3(12)：813-825)。

因为其基因组很大，痘苗病毒已被用来开发人基因疗法。(Peplinski et al.，1998， Surg.Oncol.Clin.N.Am.7(3)：575-88)。表达嘌呤核苷焦磷酸化酶的胸苷激酶缺失的痘苗病毒已经被描述用于肿瘤定向的基因治疗载体。(Puhlman et al.，1999，Human Gene Therapy 10：649-657)。

腺伴随病毒2(AAV)已经描述用于人基因治疗，然而AAV需要辅助病毒(如腺病毒或疱疹病毒)以在哺乳动物细胞中最优化复制和包装。(Snoeck et al.，1997， Exp.Nephrol.5(6)：514-20；Rabinowitzet al.，1998， Curr.Opn.Biotechnol.9(5)：470-5)。然而已经描述了感染性重组AAV的体外包装，使该***前景更好。(Ding et al.，1997， Gene Therapy 4：1167-1172)。已经表明AAV介导的亲嗜性逆转录病毒受体cDNA转移允许亲嗜性逆转录病毒转导传代和原代人细胞。(Qing et al.，1997， J.Virology 71(7)：5663-5667)。用表达人野生型p53的AAV载体进行癌症基因治疗已有人描述。(Qazilbash et al.，1997， Gene Therapy 4：675-682)。用AAV载体将基因转移入血管细胞也已经出现。(Maeda et al.，1997，Cardiovascular Res.35：514-521)。已经证明AAV是肝定向基因治疗的适用载体。(Xiao et al.，1998， J.Virol.72(12)：10222-6)。已经出现将AAV载体用于脑组织和中枢神经***的基因治疗。(Chamberlin et al.，1998， Brain Res.793(1-2)：169-75；Duringet al.，1998， Gene Therapy 5(6)：820-7)。也比较了AAV载体和腺病毒载体(AdV)用于肺基因治疗和转移入人囊性纤维化上皮细胞。(Teramoto et al.，1998， J.Virol.72(11)：8904-12)。

嵌合AdV/逆转录病毒基因治疗载体***结合每种病毒的有用方面创建了一种非整合性AdV，通过逆转录病毒产生细胞的中间代提供其功能整合性。(Feng et al.，1997， Nat.Biotechnology15(9)：866-70；Bilbao et al.，1997， FASEB J 11(8)：624-34)。这种强大的新一代基因治疗载体已经在靶向性癌症基因治疗中采用。(Bilbao et al.，1998， Adv.Exp.Med.Biol.451：365-74)。单次注射表达p53的AdV抑制人***癌细胞皮下肿瘤结节的生长。(Asgari et al.，1997， Int.J.Cancer 71(3)：377-82)。已有描述对晚期非小细胞肺癌患者使用AdV介导的野生型p53基因转移。(Schuler et al.，1998， Human Gene Therapy 9：2075-2082)。同样的这种癌症也是Adv载体介导的p53基因替代疗法的对象。(Rothet al.，1998， Semin.Oncol.25(3 Suppl 8)：33-7)。Adv介导的p53基因转移抑制体内内皮细胞分化和血管发生。(Riccioni et al.，1998， Gene Ther.5(6)：747-54)。腺病毒介导的黑色素瘤抗原gp75表达作为转移性黑色素瘤的免疫疗法也已有描述。(Hirschowitz etal.，1998， Gene Therapy 5：975-983)。AdV协助亲嗜性逆转录病毒感染人细胞并增加逆转录病毒的感染效率。(Scott-Taylor，et al.，1998， Gene Ther.5(5)：621-9)。AdV载体已用于将基因转移入血管平滑肌细胞(Li et al.，1997， Chin.Med.J.(Eng1)110(12)：950-4)，鳞状细胞癌细胞(Goebel et al.，1998， Otolarynol Head Neck Surg 119(4)：331-6)，食管癌细胞(Senmaru et al.，1998，Int.J.Cancer 78(3)：366-71)，系膜细胞(Nahman et al.，1998，J.Invsetig.Med.46(5)：204-9)，胶质细胞(Chen et al.，1998，Cancer Res.58(16)：3504-7)，以及动物关节(Ikeda et al.，1998，J.Rheumatol.25(9)：1666-73)。更近时期，已经描述了AcV载体介导的基于导管的心包基因转移。(March et al.，1999， Clin. Cardiol.22(1 Suppl 1)：I23-9)。具有合适的调控遗传元件的AdV***的操作允许AdV介导的可调节靶基因的体内表达。(Burcin et al.，1999， PNAS(USA)96(2)：35 5-60)。

已经开发出用于人类基因治疗的甲病毒载体，它具有适于用适用于辛德毕斯病毒和塞姆利基森林病毒衍生载体的表达盒用转化的包装细胞系。(Polo et al.，1999， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，96：4598-4603)。以非细胞病变的黄病毒复制子RNA为基础的***也已被开发。(Varnavski et al.，1999， Virology 255(2)：366-75)。含***HSV-TK基因的辛德毕斯病毒载体已被用于细胞特异性导向肿瘤细胞。(Iijima et al.，1998， Int.J.Cancer 80(1)：110-8)。

基于人泡沫病毒(HFV)的逆转录病毒载体也显示出作为基因治疗载体的希望。(Trobridge et al.，1998， Human Gene Therapy9：2517-2525)。泡沫病毒已被用于设计***性基因疗法。(Nestleret al.，1997， Gene Ther.4(11)：1270-7)。重组鼠巨细胞病毒及其启动子***也已被用作高水平表达载体。(Manning et al.，1998， J. Virol.Meth.73(1)：31-9；Tong et al.，1998， Hybridoma18(1)：93-7)。

已经可以通过产生基于仙台病毒的载体将基因递送入非***细胞。(Nakanishi et al.，1998， J.Controlled Release54(1)：61-8)。

在其它转化非***体细胞的努力中，已经对慢病毒载体进行了研究。用复制缺陷的基于人免疫缺陷病毒的载体进行囊性纤维化的基因治疗已有描述。(Goldman et al.，1997， Human Gene Therapy8：2261-2268)。用慢病毒载体递送入肝和肌肉基因的持续性表达也已有发表。(Kafri et al.，1997， Nat.Genet.17(3)：314-7)。然而，最主要的是安全问题，同时开发更好的载体正迅速进行。(Kim etal.，1998， J.Virol.72(2)：994-1004)。研究HIV LTR和Tat获得关于基因组结构以开发载体的重要信息。(Sadaie et al.，1998，J.Med.Virol.54(2)：118-28)。因而现在对基于HIV的有效载体的遗传学要求有更多了解。(Gasmi et al.，1999， J.Virol.73(3)：1828-34)。自失活载体、或条件包装细胞系已有描述。(例如Zuffery et al.，1998， J.Virol.72(12)：9873-80；Miyoshi et al.，1998， J.Virol.72(10)：8150-7；Dull et al.，1998， J.Virol.72(11)：8463-71；和Kaul et al.，1998， Virology 249(1)：167-74)。用HIV载体有效转导人淋巴细胞和CD34+细胞已有描述。(Douglas et al.，1999， Hum.Gene Ther.10(6)：935-45；Miyoshiet al.，1999， Science 283(5402)：682-6)。用猫免疫缺陷病毒(FIU)慢病毒载体有效转导非***人细胞已有描述，这可以最小化使用基于HIV的载体时的安全问题。(Poeschla et al.，1998， Nature Medicine4(3)：354-357)。用FIV载体生产性感染人血单核细胞已有发表。(Johnston et al.，1999， J.Virol.73(3)：2491-8)。

许多病毒载体难以操作，并且***的DNA片段有限，这些限制和缺点已引起注意。例如，除了简化的病毒包装细胞系，源自人疱疹病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV-1)和E-B病毒(EBV)的小型病毒载体也已开发，以简化遗传材料的操作及病毒载体的产生。(Wang et al.，1996， J.Virology 70(12)：8422-8430)。已证明接合质粒可以简化外源DNA***不需辅助病毒的逆转录病毒载体。(1987， J.Virology61(10)：3004-3012)。

病毒载体不是实现基因治疗的唯一方式，因为几种非病毒载体也已经描述。基于使用表皮生长因子/DNA多复合体(EGF/DNA)的导向性非病毒基因递送载体已有描述，可实现有效且特异性的基因递送。(Cristiano，1998， Anticancer Res.18：3241-3246)。已有用阳离子脂质体基因治疗脉管***和CNS的实例。(Yang et al.，1997，J.Neurotrauma 14(5)：281-97)。用阳离子脂质体进行胰腺炎的瞬时基因治疗也已成功。(Denham et al.，1998， Ann.Surg.227(6)：812-20)。脱乙酰壳聚糖基的载体/DNA复合体也已证明可有效用于基因治疗。(Erbacher et al.，1998， Pharm.Res.15(9)：1332-9)。基于三元复合体***的非病毒DNA递送载体已有描述。(Kim et al.，1998，53(1-3)：175-82)。包被病毒粒的脂质体复合体也已被用于实现基因转移。(Hirai et al.，1997， Biochem. Biophys.Res.Commun.241(1)：112-8)。

直接向肿瘤注射编码胸苷激酶基因的非病毒T7载体的基因疗法已有先例。(Chen et al.，1998， Human Gene Therapy 9：729-736)。制备质粒DNA对直接注射基因转移很重要。(Horn et al.，1995， Hum. Gene Ther.6(5)：656-73)。改良的质粒载体已专门被直接注射采用。(Hartikka et al.， Hum.Gene Ther.7(10)：1205-17)。

因而，本领域已知宽范围的基因转移/基因治疗载体和构建体。这些载体容易被本发明的方法采用。用重组DNA/分子生物学技术通过适当的操作将操作性连接的Src或Yes***，或二者同时***(活性或无活性)所选的表达/递送载体，可得到适用于本发明的许多等价载体。

E.调节血管通透性(VP)的方法

本发明提供调节与疾病过程或状况相关的组织中血管通透性的方法，并由此影响组织中依赖于VP的事件。一般来说，该方法包括向与疾病过程或状况相关的组织给予一种组合物，根据本发明的方法，其中含有VP调节量的Src或Yes蛋白、或它们的混合物、或表达活性或无活性Src或yes或同时表达二者的核酸载体、或Src家族酪氨酸激酶抑制剂如化学Src抑制剂、蛋白Src抑制剂、或核酸Src抑制剂。

如此处所述，多种组织或由器官化组织组成的器官中的任一种，可以是疾病状况下VP的位置，包括脑、皮肤、肌肉、肠道、***、关节、骨等其中存在血管的组织。

在本发明的许多实施方案中，接受治疗的患者希望是人类患者，尽管可以明白本发明的原理表明，本发明对于所有哺乳动物都有效，它们都被包括在名词“患者”之内。本文中，应理解哺乳动物包括任何需要对涉及血管发生的疾病组织进行治疗的哺乳动物物种，特别是农业和家养哺乳动物物种。

因此，本方法包括给予患者治疗上有效量的生理可耐受的组合物，其中包含Src或Yes蛋白、或其混合物、或表达Src或Yes蛋白或同时表达二者的DNA载体、或Src家族酪氨酸激酶抑制剂如化学Src抑制剂、蛋白Src抑制剂、或核酸Src抑制剂。

Src或Yes蛋白给药的剂量范围依赖于蛋白形式及其效力，正如此处进一步所述，并且其量大到足够产生期望的效应，其中VP及VP介导的疾病症状得到改善。剂量不应大到引起有害的副作用，如高粘度综合征、肺水肿、充血性心衰等。一般地，剂量随患者年龄、状况、性别和疾病程度变化，这可以由本领域技术人员确定。如果有任何并发症，剂量也可由个别医生调节。

治疗上有效的VP调节量是Src或Yes蛋白或其混合物、或编码Src或Yes蛋白的核酸的量，它足以在受治组织中产生可测量的VP调节，也即VP调节量。VP调节可由此处所述的方法测定，或用本领域技术人员已知的其它方法。VP调节可用此处所述的Miller试验来测量，或用本领域技术人员已知的其它方法。

Src或Yes蛋白、或表达Src或Yes蛋白或同时表达二者的核酸载体，可以经胃肠外注射或长时间缓慢输注给药。尽管待治疗组织典型地可通过全身给药进入体内，并因此大多数经常通过静脉给予治疗性组合物来治疗，但在被定向组织有可能含有靶分子的地方，其它组织和递送方法也可以考虑。因而，本发明的组合物可以经以下方式给药：静脉内，腹膜内，肌内，皮下，腔内，经皮，且可以蠕动方式递送。

包含Src或Yes蛋白或表达Src或Yes蛋白的核酸载体的治疗组合物常规可以静脉给药，例如以注射单位剂量方式。当用作本发明治疗组合物参考时，名词“单位剂量”指适用作单元剂量的物理离散的单位，每个单位包含预定量的活性物质，经计算在要求稀释剂，即载体或赋形剂条件下产生期望的治疗效果。

在一个优选实施方案中，试剂经单剂量静脉给药。局部给药可通过直接注射或利用解剖学分离的区隔、分离靶器官***的微循环、再灌注入循环***，或基于导管的临时性闭塞疾病组织相关靶区域的脉管***。

组合物以与剂量配方相容的方式以及治疗上有效的量给药。给药量和给药时间依赖于治疗对象，受试者利用活性成分的能力，和希望的疗效程度。所需活性成分的精确量基于实施者的判断，且每个个体需个别对待。然而，全身应用的合适剂量范围在此处公开并且依赖于给药途径。适用的给药方案也是可变的，但初次给药随后间隔一或多个小时重复剂量的注射或其它方式给药为典型。另外足以维持血液浓度在体内治疗规定范围内的连续静脉输注也可考虑。

有多种疾病其中抑制血管发生被认为很重要，称为血管发生性疾病，包括但不限于炎症性疾病如免疫和非免疫炎症、慢性风湿性关节炎和银屑病，不适当或不适宜的血管侵入相关的疾病如糖尿病视网膜病、新生血管性青光眼、再狭窄、动脉粥样硬化斑和骨质疏松中的毛细血管增生，以及癌症相关的疾病如实体瘤、实体瘤转移、血管纤维瘤、晶状体后纤维增生症、血管瘤、卡波西肉瘤和其它要求新生血管形成以支持肿瘤生长的癌症。

相似地，血管通透性是血管发生的重要成分，且其自身也与有害的病理状况相关。例如，中风诱发的血管通透性导致的损伤可引起炎症相关的损伤。

因此，抑制疾病状况相关组织中血管通透性的方法改善疾病症状，而且取决于疾病，可以有助于治愈疾病。在一个实施方案中，本发明本质上涉及抑制疾病状况相关组织中的血管通透性。组织中血管通透性程度及因此由本方法得到的抑制程度可以由多种方法评价。

因此，在一个相关实施方案中，待治疗组织是发炎组织且待抑制血管通透性是由于VEGF介导的刺激。在这类中本方法涉及关节炎组织中VP抑制，如慢性风湿关节炎患者，免疫或非免疫性发炎组织，牛皮癣组织等。

在另一个相关实施方案中，待治疗组织是视网膜病，如糖尿病视网膜病，黄斑变性或新生血管性青光眼患者的视网膜组织，待抑制VP是视网膜组织VP且其中有新生血管生成。

本方法对于转移灶形成也特别有效，因为(1)其形成要求原发肿瘤的血管生成，这样转移癌细胞才能离开原发肿瘤，和(2)其在其它位点的建立要求新生血管生成以支持转移灶的生长。

在相关实施方案中，本发明考虑与其他治疗法一起使用本方法，如直接针对实体瘤和控制转移的常规化疗。典型在化疗中或化疗后进行给予VP抑制剂，优选在化疗后抑制VP，因为在这时肿瘤组织将通过诱导VP对毒素攻击作出应答，以通过血液供应及营养物进入肿瘤组织而恢复。另外，也可以在手术后使用血管通透性抑制方法，在此实体瘤已被切除以预防转移。

在本发明方法应用于抑制转移相关的血管通透性范围内，本发明也可用于抑制转移形成，以及使已形成的肿瘤消退。

再狭窄是平滑肌细胞(SMC)迁移和增殖入经皮腔内冠状动脉成形术位点的组织，它阻碍成功实施血管形成术。再狭窄中SMC的迁移和增殖可认为一个VP过程，这用本方法可抑制。因此，根据用于血管成形术后患者的本发明方法，本发明也考虑通过抑制血管通透性来抑制再狭窄。为抑制再狭窄，典型地在血管成形术后给予无活性酪氨酸激酶，因为典型地从约2到约28天，更典型为术后约前14天，冠状血管壁有再狭窄的风险。

本方法用于抑制疾病相关组织中血管通透性，因此本方法也用于治疗血管通透性相关的疾病，本方法包括将含治疗上有效量的无活性Src和/或Yes蛋白或表达该蛋白的载体的组合物与正发生血管透性增加或有此风险的组织相接触。

在需要促进或加强VP的情况下，向组织给予活性Src和/或Yes蛋白将有用，给药途径和时间方案可与上述抑制方法类似。

例如，考虑了操作血脑屏障通透性以调节药物进入脑组织。血脑屏障血管通透性增加将允许药物进入脑组织，而它们在正常情况下不能穿过脑组织。

可能会需要与VP相关联的血管发生的精细调节，在此可以给予活性和无活性形式的Src蛋白、Yes蛋白、或编码Src或Yes蛋白的表达性核酸的混合物。

在与实施例中的治疗组合物接触5到7天后，血管发生抑制或加强作用会清楚出现。相似地，在大致时间范围内VP调节可以发生。在给予治疗组合物短时间内作用就会出现。限时因子包括组织吸收速率，细胞吸收速率，蛋白转位或核酸转位(依赖于治疗剂)和蛋白靶向的速率。因此，VP调节作用可在短至给药后一小时的时间内出现。用适当的条件，也可以对无活性Src和/或Yes蛋白附加或延长暴露。因而，通过调节这些参数可以设计多种期望的治疗时间范围。

本发明方法也包括向疾病过程或血管损伤或创伤状况相关的组织施用一种组合物，其中含有一种Src家族酪氨酸激酶抑制剂。Src家族酪氨酸激酶抑制剂可以是化学Src抑制剂，蛋白Src抑制剂，或核酸Src抑制剂。

适用的化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于PP1，PP2，PD173955，AGL1872，PD162531，根赤壳素R2146，格尔德霉素等。

PP1(来自Biomol，由Pfizer许可)是用于这些研究的合成Src抑制剂。PP1属于吡唑并嘧啶家族的Src抑制剂。其它合成Src抑制剂包括PP2(来自Calbiochem，由Pfizer辉瑞许可)，它在结构上与PP1相关，且也已表明可阻断Src家族激酶活性。(Hanke et al.，1996， J.Biol.Chem.271(2)：695-701)。其它特异性Src激酶抑制剂包括PD173955(Moasser et al.，1999， Cancer Res.59：6145-6152；Parke Davis)，其结构已发表。PD162531(Owens etal.，2000， Mol.Bio.Cell 11：51-64)也是一种特异性Src激酶抑制剂，它来自Parke Davis但结构不能从文献中获得。格尔德霉素也是一种Src激酶抑制剂，从Life Technologies获得，不同的公司都有商业供应(例如Calbiochem，RBI，Sigma)，它是一种抗真菌的大环内酯类抗生素，也用作非特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂并表现出抑制Src激酶活性。优选的化学抑制剂是PP1和PP2等，最优选的化学抑制剂是PPl。

其它适用的Src家族酪氨酸激酶抑制剂可用本领域已知的标准测定方法鉴定和定性。例如已有筛选具有有效和选择性抑制Src或其它酪氨酸激酶的化合物的工作，并且已导致用作Src家族酪氨酸激酶有效抑制剂的化学成分的鉴定。

例如，儿茶酚已被鉴定为起源自天然产物的多种酪氨酸激酶抑制剂的重要结合元件，且已通过组合靶定向筛选化合物中发现c-Src的选择性抑制剂。(Maly D.J.，et al.，2000，“CombinatorialTarget-guided ligand assembly：Identification of potentsubtype-selective c-Src inhibitors” PNAS(USA)97(6)：2419-2424)。基于组合化学的候选抑制化合物筛选采用对Src抑制重要的已知结构作为起点，是一种分离和鉴定Src家族酪氨酸激酶的其它化学抑制剂的有力和有效的方法。

然而，基于模仿多肽和核酸上存在的多种功能的潜力，更仔细筛选潜在的结合元件可用于组合筛选的活性抑制剂。例如，O-甲基肟库特别适于此项任务，只要该库容易通过O-甲基羟胺与大量商品化醛类缩聚制备。O-烷基肟形成与宽范围功能基相容，它们在生理pH下稳定。Malay et al.，同前。

如上所述，根据本发明的方法，适用的Src家族激酶抑制剂也包括VP抑制量的无活性或活性Src或Yes蛋白，或其混合物，或表达无活性Src或Yes或同时表达二者的核酸载体。

根据本发明的方法，其它适用的Src家族激酶抑制剂包括CSK，或表达灭活量CSK的核酸载体。

如此处所述，多种组织或由器官化组织组成的器官中的任一种，可以是疾病状况下VP的位置，包括脑、皮肤、肌肉、消化道、***、关节、骨等存在血管的组织。

能用体现本发明的方法治疗的患者希望是人类患者，尽管可以明白，本发明的原理表明本发明对于所有哺乳动物都有效，因此它们被包括在此处的名词“患者”之内。本文中，应理解哺乳动物包括任何哺乳动物物种，其中需要进行血管渗漏或水肿的组织损伤的治疗，特别是农业和家养哺乳动物物种。

在实施本发明的方法时，体现本发明的方法包括给予哺乳动物患者治疗有效量的生理上可耐受的组合物，其中包含化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂、无活性Src或Yes蛋白、活性CSK蛋白、编码这类蛋白的核酸、或其混合物。

化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂的给药剂量范围，如PP1可以在约0.1mg/kg体重到约10mg/kg体重的范围内，或者在药用载体中活性成分的溶解度限内。优选的典型剂量可以从约1mg/kg体重到约9mg/kg体重。较低剂量，如从约0.1mg/kg体重到约1mg/kg体重可以优化以多次给药治疗慢性疾病。对于不太严重、容易达到、且给药途径更直接的急性疾病，典型治疗剂量可以从约1mg/kg体重到约3mg/kg体重。根据损伤的严重程度、位置或给药途径，当遇到较严重损伤、难以到达的位置或只能通过间接的全身途径给药时，可以使用从约3mg/kg体重到约10mg/kg体重的较高剂量。

在急性损伤或创伤的情况下，最好尽可能快地在事故发生后立即给予治疗。然而，在急性事故中，Src家族酪氨酸激酶抑制剂的有效给药时间可以在损伤或创伤发生的约48小时内。优选在发病约24小时内给药，12小时内更好，最优选在发病约6小时内给药。初始损伤48小时后给药可以适当改善由于进一步血管渗漏或水肿导致的其它组织损伤，但对初始组织损伤的作用则大大降低。

预防性给药用于防止外科手术过程中的血管渗漏或水肿，或者根据诱发性诊断标准来实施，这种给药可以在任何急性VP增加之前，或者在这种VP增加引起的事件期间给药。为治疗导致VP增加及相关的血管渗漏或水肿的慢性疾病，可以用连续给药方案给予活性Src家族酪氨酸激酶抑制剂。

如下进一步所述，无活性Src或Yes蛋白、或活性CSK蛋白的给药剂量范围依赖于蛋白形式及其效力，且其量大到足已产生期望的作用，其中VP及VP介导的疾病症状得以改善。剂量不应大到引起有害的副作用，如高粘度综合征、肺水肿、充血性心衰等。

治疗上有效的VP调节量是足以在受治疗组织中产生可测量的VP调节的活性CSK或无活性Src或Yes蛋白或其混合物、或编码这类蛋白的核酸的量，也即VP调节量。VP调节可由此处所述的方法测定，或用本领域技术人员已知的其它方法。VP调节可用此处所述的Miller试验来测量，或用本领域技术人员已知的其它方法。

一般地，剂量随年龄、状况、性别和患者疾病程度变化，这可以由本领域技术人员确定。如果有任何并发症，剂量也可由个别医生调节。

本发明的药物组合物可以胃肠外注射或长时间缓慢输注给药。尽管待治疗组织典型地可通过全身给药进入体内，并因此大多数经常通过静脉给予治疗性复合物来治疗，但在靶向组织有可能含有靶分子的情况下，其它组织和递送方法也可以考虑。因而，本发明的组合物可以经以下方式给药：静脉内，腹膜内，肌内，皮下，腔内，经皮，且可以蠕动方式递送。

例如，静脉内给药通过注射单位剂量方式起作用。当用作本发明治疗组合物参考时，名词“单位剂量”指适用作单元剂量的物理离散的单位，每个单位包含预定量的活性物质，在要求稀释剂，即载体或赋形剂条件下经计算产生期望的治疗效果。

在一个优选实施方案中，活性成分经单剂量静脉给药。局部给药可通过直接注射或利用解剖学分离的区隔、分离靶器官***的微循环、再灌注入循环***，或基于导管的临时性闭塞疾病组织相关靶区域的脉管***。

组合物以与剂量配方兼容的方式以及治疗上有效的量来给药。给药量和给药时间依赖于治疗对象，受试者利用活性成分的能力，和希望的疗效程度。所需活性成分的精确给药量基于实施者的判断，且每个个体需个别对待。然而，全身应用的合适的剂量范围在此处公开并且依赖于给药途径。适用的给药方案也是可变的，但初次给药随后间隔一或多个小时重复剂量的注射或其它方式给药为典型。另外足以维持血液浓度在体内治疗规定范围内的连续静脉输注也可考虑。

本发明的方法改善由于与疾病状况、损伤或创伤相关的血管渗漏或水肿导致的组织损伤，改善疾病症状，并根据疾病类型可以有助于治愈疾病。组织中血管通透性程度及因此由本方法得到的抑制程度，可以由多种方法评价。特别地，本方法适于改善中风或其它心血管意外相关的对CNS的损伤，其发生是由于VP增加诱发的损伤，以及随后的血管渗漏和/或水肿对相关组织的破坏。

在一个相关实施方案中，待治疗组织是发炎组织且待抑制血管通透性是由于VEGF介导的刺激。在这类中本方法涉及关节炎组织中VP抑制，如慢性风湿关节炎患者，免疫或非免疫性发炎组织，牛皮癣组织等。

在另一个相关实施方案中，待治疗组织是视网膜病，如糖尿病视网膜病，黄斑变性或新生血管性青光眼患者的视网膜组织，待抑制VP是视网膜组织VP，且其中有新生血管化。

本方法用于抑制损伤或疾病组织中血管通透性，且因此本方法也用于治疗血管通透性相关的疾病，包括将含治疗有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂的组合物，与正发生血管透性增加或有此风险的组织相接触。

VP调节，以及血管渗漏和水肿所导致组织损伤的改善可以在给予治疗组合物的短时间内发生。在急性损伤或创伤的情况下，大多数疗效可以在给药3天内看到。典型地，缓慢给药的作用将不是如此容易看出来。

时间限制因子包括组织吸收速率，细胞摄取速率，蛋白转位或核酸转位(依赖于治疗剂)和蛋白定向的速率。因此，组织损伤调节作用可在短至给予抑制剂后一小时的时间内出现。用适当的条件，也可以对Src家族酪氨酸激酶抑制剂附加或延长暴露。因而，通过调节这些参数可以设计多种期望的治疗时间范围。

F.治疗组合物(一般考虑)

本发明涉及实施此处描述治疗方法的治疗组合物，本发明的治疗组合物包含生理可耐受的载体，以及此处所述的Src和/或Yes蛋白或可表达Src和/或Yes蛋白的载体，或此处所述的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，如化学性Src抑制剂、蛋白Src抑制剂或核酸Src抑制剂，它们溶解或分散于载体中作为活性成分。在优选实施方案中，当为治疗目的给予哺乳动物或人类患者时，治疗组合物没有免疫原性。

根据期望调节，Src或Yes蛋白可以是活性、无活性、或其混合物。Src或Yes的优选形式描述于上。CSK蛋白含有活性形式。

如此处所用，当名词“可药用”、“生理可耐受”及其语法变体用于组合物、载体、稀释剂和试剂时可以互换，且代表该材料可以给予哺乳动物，但不产生不希望的生理作用如恶心、眩晕、反胃等。

本领域熟知包含溶解或分散于其中的活性成分的药理组合物的制备，不必基于配方的限制。典型地这些组合物制成可注射的溶液或悬浮液，然而也可以制成适于使用前溶于或混悬于液体中的固体形式。也可以将制剂乳化或以脂质体组合物提供。

活性成分可与赋形剂混合，这些赋形剂是可药用的且可以以适用于本治疗方法的量与活性成分相容。适用的赋形剂是，例如，水，盐水，右旋糖，甘油，乙醇等及其组合。另外，如果需要，组合物可以包含少量辅助物质如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂等增强活性成分效果的物质。

本发明的治疗组合物可包含可药用的盐成分。可药用的盐包括加酸盐(与多肽的游离氨基一起形成)，它们与无机酸如盐酸或磷酸、或有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等一起形成。与游离羧基一起形成的盐也可衍生自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱如异丙基胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等。

生理耐受的载体本领域公知。例证性液体载体是无菌水溶液，其中除活性成分和水外不含其它物质，或含缓冲剂如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者都含，如磷酸缓冲液。更进一步地，水性载体可含一种以上缓冲盐，如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇及其它溶质。

除水以外，液体组合物也可含其它液体相。例证性的这种其它液体相是甘油，植物油如棉籽油及水油乳液。

F(i).本发明的调节VP的治疗组合物

在本发明的一个实施方案中，治疗组合物包含血管通透性调节量的Src和/或Yes蛋白，或足以表达有效量Src和/或Yes蛋白的重组DNA表达载体，典型配方包含占总治疗组合物重量至少0.1重量％的Src或Yes蛋白。重量百分比是Src或Yes蛋白重量对总组合物重量的百分比。因此，例如，0.1重量％是每100克总组合物中含0.1克Src或Yes蛋白。对于DNA表达载体，给药量依据表达载体的特性、待治疗组织及其它条件。

F(ii). 本发明的Src家族酪氨酸激酶抑制剂治疗组合物

本发明的化学性治疗组合物包含生理可耐受的载体及溶解或分散于其中的Src家族酪氨酸激酶抑制剂活性成分。

本发明的蛋白治疗组合物包含生理可耐受的载体和无活性Src、无活性Yes、或活性CSK蛋白，它们作为Src家族酪氨酸激酶抑制剂溶解或分散于介质中。

本发明的核酸治疗组合物包含生理可耐受的载体和编码无活性Src、无活性Yes或活性CSK蛋白的核酸，它们作为Src家族酪氨酸激酶抑制剂溶解或分散于介质中。

适用的Src家族酪氨酸激酶抑制剂将特异性抑制Src家族酪氨酸激酶的酪氨酸激酶生物活性。最适的Src家族酪氨酸激酶将具有抑制^pp60Src蛋白活性的主要特异性，及次要地抑制最相关的Src家族酪氨酸激酶如Yes。特别适用的Src家族酪氨酸激酶抑制剂的例子包括PP1、PP2、PD173955、AGL1872、PD162531、根赤壳素R2146和格尔德霉素等。其它适用的化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂可用本领域已知的标准测定方法鉴定及定性。

表现为抑制而非刺激VP的Src突变体称为无活性Src突变体。赋予这种抑制活性的突变蛋白也称为显性失活Src蛋白，因为它们抑制VP，包括源自Src的内源性活性及源自生长因子刺激的增强Src活性的VP。因而本发明野生型c-Src的某些突变体也可起显性失活的功能，它们能阻断血管生长和VP，及相应地下调体内VP。因此，其它适用的Src家族酪氨酸激酶抑制剂可包括无活性形式的Src和Yes蛋白，它们可以拮抗Src或Yes活性，导致抑制或下调靶组织中血管通透性。优选的无活性Src蛋白是Src 251。另一种优选的无活性Src蛋白是Src K295M。与野生型蛋白相比，优选的无活性Yes蛋白具有更低的激酶活性。

其它Src家族酪氨酸激酶抑制剂可以是反义核酸、核酸类似物、或在靶细胞中抑制Src或Yes基因表达的蛋白核酸。当可与编码Src或Yes蛋白的mRNA杂交的所述反义核酸以合适的药物介质转染进靶细胞时，当它能杂交这种mRNA并导致抑制细胞表达酪氨酸激酶蛋白Src或Yes时，反义分子可以是治疗上有效的VP调节量。

如述，优选的抑制性c-Src蛋白包括仅表达Src前251个氨基酸的Src 251。这种构建体缺乏整个激酶区并因此被称为“激酶死亡的”Src蛋白。另一种构建体是Src(K295M)突变，其中赖氨酸残基295突变成甲硫氨酸。激酶区的这种点突变阻止ATP结合并也阻断了激酶依赖的Src功能，这与血管细胞和肿瘤细胞信号传递和增殖相关。

对于点突变，导致期望的抑制活性的任何突变都可考虑用于本发明。只要Src蛋白期望的调节作用完整保留，融合蛋白构建体也可被考虑，它们将期望的Src蛋白(突变或其片段)与被表达氨基酸标签、抗原表位、荧光蛋白或其它这类蛋白或肽结合。

与之相似，加入Src蛋白活性的外源抑制剂或刺激这种抑制剂在靶组织中表达，如CSK(C-端Src激酶)，也是一种抑制Src活性的方法。酪氨酸灭活Src的磷酸化，是通过称为CSK的C-端Src激酶。的一种负调控方式。(Nada et al.，1991， Nature 351：69-72；Okadaet al.，1991， J.Biol.Chem.266(36)：24249-24252)。当CSK磷酸化野生型Src的527位氨基酸时，Src蛋白被灭活。450个氨基酸的人CSK蛋白序列由访问号P41240识别并可在瑞士蛋白质数据库中找到。人CSK编码mRNA核酸序列由GenBank数据库访问号NM 004383识别。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含血管通透性调节量的Src、Yes和/或CSK蛋白，或足以表达有效量无活性Src、Yes或活性CSK蛋白的表达载体，典型配方包含占总药物组合物重量至少0.1重量％的蛋白。因此，例如，0.1重量％是每100克总组合物中含0.1克蛋白。对于表达载体，给药量依据表达载体的特性、待治疗组织及其它条件。因而，药物组合物中Src家族酪氨酸激酶抑制剂的有效量是，可以产生对Src调节的血管通透性进行治疗上有效的调节所需的量。任一种药物组合物的治疗量是，就其自身，导致血管渗漏或水肿相关组织损伤改善所需的量。

G(i) 一般考虑；制造物

此处所用的名词包装材料指玻璃、塑料、纸、金属箔等能用固定方式保持药剂的材料。因此，例如，包装材料可以是塑料或玻璃小瓶；层压封套等用于盛装包括药剂的药物组合物的容器。

在优选实施方案中，包装材料包括标签，清楚表明制造物含量及所含药剂的用途。

G(ii) VP调节的治疗组合物；制造物

本发明涉及一种制造物，其中含有带标签容器以提供治疗有效量的Src蛋白和Yes蛋白的混合物。制造物含有包装材料及盛于包装材料内的药剂。

制造物内的药剂是本发明的任一种组合物，它适于提供Src和Yes蛋白，根据公开适应症按此处所述制成可药用的形式。因此，该组合物可含有Src和Yes蛋白，或可表达Src蛋白的DNA分子，可表达Yes蛋白的DNA，或可同时表达二者的DNA。制造物包含一定量的药剂，以单位或多剂量方式，它足以用来治疗此处指明的疾病状况。

根据需要的调节水平，Src或Yes蛋白可以是活性或无活性或其混合物。活性和无活性Src和Yes蛋白的优选形式如上所述。

包装材料含有标签，它表明其中药剂的用途，例如，用于治疗由抑制或加强血管通透性辅助的状况，及此处公开的类似状况。标签可进一步包括使用说明和营销需要的相关信息。包装材料可包括储存药剂的容器。

G(iii). Src家族酪氨酸激酶抑制剂组合物；制造物

本发明也涉及一种制造物，它是一种带标签容器，提供治疗有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂。该抑制剂可以是被包装的化学性、蛋白或核酸Src家族酪氨酸激酶抑制剂，一种以上的组合，或其混合物。制造物含有包装材料及包装材料中包含的药剂。该制造物也可包含两个或更多亚治疗有效量的药物组合物，它们一起协同作用导致血管渗漏或水肿引起的组织损伤得以改善。

制造物中的药剂是本发明的任一种组合物，它适于提供Src家族酪氨酸激酶抑制剂，根据公开适应征按此处所述制成可药用的形式。因此，该组合物可含有化学抑制剂如PP1、PP2、PD173955、AGL1872、PD162531、根赤壳素R2146和格尔德霉素，蛋白抑制剂如无活性Src、无活性Yes及活性CSK蛋白，或可表达这类蛋白或其组合的核酸分子。制造物包含一定量的药剂，以单位或多剂量方式，它足以用来治疗此处指明的疾病状况。

包装材料含有标签，它表明其中药物成分的用途，例如，用于治疗由抑制血管通透性增加辅助的状况，及此处公开的类似状况。标签可进一步包括使用说明和营销需要的相关信息。包装材料可包括储存药剂的容器。

实施例

以下关于本发明的实施例是例证性的，当然不应被认为是对本发明的具体限制。进一步，现在已知或随后开发的本发明的变化形式，在本领域技术人员眼界范围内，应认为是在本发明所附的权利要求的范围内。

1.制备c-src或c-yes表达构建体

为制备根据本发明方法用于调节VP和血管发生的表达构建体，操作c-src cDNA并***表达构建体/载体中。

编码野生型(即内源性)鸡c-src的cDNA序列见图1(SEQ IDNO：2)，其编码的氨基酸残基序列见图2(SEQ ID NO：3)。被编码蛋白序列由cDNA 112到1713位置的核苷酸翻译而成。对应人c-src cDNA(SEQ ID NO：4)核酸序列的核酸序列及其编码的氨基酸残基(SEQ IDNO：5)序列分别见图3和4。对于人蛋白序列，编码序列从其cDNA的134位核苷酸开始到1486位止。

制备许多野生型和突变c-src cDNA。突变c-Src构建体由定位诱变制备，这描述于Kaplan et al.，EMBO J.13：4745-4756(1994)。用于本发明方法的编码突变S rc蛋白的突变c-Src构建体描述于Kaplan et al.， id.同上。Kaplan et al.描述了多种突变c-src构建体及其编码的用于本发明实施的蛋白。例如，Kaplan et al.描述了图1中鸡c-src等位基因的几种产物，包括Src A和Src251。

本发明描述两类调节VP的c-Src功能。如前讨论，一类包含增加VP并因而被认为是活性蛋白的Src分子。野生型和多种突变Src在本发明中表现为诱导VP。本文中功能为诱导血管生长和VP的野生型c-src的一种突变是Src A突变体，在527位氨基酸残基(aa)处具有由酪氨酸527改变成苯丙氨酸的点突变。该位点正常情况下由称为激酶CSK的c-Src激酶进行负调节。当CSK磷酸化野生型Src的aa527时，蛋白被灭活。然而，在突变的Src A中aa527的调节性酪氨酸转变成苯丙氨酸，因而赋予蛋白组成型(即永久性)的活性蛋白，而不受磷酸化灭活影响。

Src上其它突变此处表明对VP具有相反的调节作用，由刺激变成抑制VP。这类突变称为无活性Src突变。具有此抑制活性的突变蛋白也称为显性失活的Src蛋白，因为它们抑制VP，包括源自内源性Src活性以及由生长因子刺激导致的增强Src活性。因而本发明野生型c-Src的某些突变体也可起显性失活的功能，它们能阻断血管生长和VP，及相应地下调体内VP。

这种优选的抑制性c-Src蛋白包括仅表达Src前251个氨基酸的Src 251。这种构建体缺乏整个激酶区并因此被称为“激酶死亡的”Src蛋白。另一种构建体是Src(K295M)突变，其中赖氨酸残基295突变成甲硫氨酸。激酶区的这种点突变阻止ATP结合并也阻断了激酶依赖的Src功能，这与血管细胞和肿瘤细胞信号传递和增殖相关。

对于点突变，导致期望的抑制或刺激活性的任何突变都可考虑用于本发明。只要Src蛋白期望的调节作用完整保留，融合蛋白构建体也可被考虑，它们将期望的Src蛋白(突变或其片段)与被表达氨基酸标签、抗原表位、荧光蛋白或其它这类蛋白或肽结合。

例如，对于Src第527位残基的活化性突变，只要得到的突变氨基酸残基不是酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸，本发明预期在期望位置存在替代性氨基酸将导致Src蛋白具有期望活性的VP促进调节活性。

Src家族激酶Yes已在前述，但对于其细胞内功能还知之不多。(Burck et al.，1988， The Oncogenes，Springer-Verlag，New York，pp.133-155；Marth et al.，1985， Cell，43：393；Semba et al.，1986， PNAS(USA)83：5459；Shibuya et al.，1982， J.Virol.42：143；Yoshida et al.，1985， Jpn.J.Cancer Res.76：559)。优选的活性  Yes蛋白由Sukegawa等.描述的核酸编码(1987， Mol. Cell Biol.7：41-47)。对人Yes蛋白及编码Yes核酸的失活修饰可以按对Src描述的进行修饰。

                               表I

Src/突变        Src功能           对VP及血管发生的作用

c-Src             +      活性                刺激

SrcA(T527F)       +      活性                刺激

Src527(点)        +      活性                刺激

Src251            -      无活性              抑制

Src(截短型)       -      无活性              抑制

Src(K295M)        -      无活性              抑制

Src295(点)        -      无活性              抑制

用于本发明的一种优选表达构建体是RCASBP(A)构建体(SEQ IDNO：1)。该表达载体基于一系列具复制能力的禽肉瘤病毒，带有增强的布里安聚合酶(BP)以提高滴度，并且对正常禽细胞上表达的A型包膜糖蛋白有特异性(综述于Methods in Cell Biology，52：179-214(1997)；也见，Hughes et al.，1987， J.Virol.61：3004-3012；Fekete & Cepko，1993， Mol.Cellular Biol.13(4)：2604-2613；Itoh et al.，1996， Development 122：291-300；及Stott et al.，1998， Biotechniques 24：660-666)。RCASBP(A)(SEQ ID NO：1)的完整序列在序列表中给出，其构建体的限制性图谱描述于图10，此处称为RCAS。

原始Src 251构建体由Pam Schwartzberg博士在NIH的HaroldVarmus博士的实验室亚克隆。简单地说，克隆src cDNA序列以对其表达是通过在Src 251的5’端的单一Not I位点***含Not I-BstB1-Not I限制性位点的连接子。Src在其3’端有单一Cla I切点。用Bst B1和Cla I消化Src产生一个BstB1-Cla I片段，然后将其连接到RCASBP(A)的Cla I位点。BstB1粘端允许与Cla I粘端连接，其连接产物不能用Cla I重切。

通过用Not I和Cla I先消化含Src 251的RCAS载体(在DAM+本底下)以允许***相似消化的Src cDNA，很容易从上述载体中获得适于实施本发明的Src构建体。因此这个含Src 251的初始RCASBP(A)构建体进一步用于亚克隆如上述及Kaplan et al.(1994， The EMBO J.13(20)：4745-4756)所述的所有其它Src构建体，通过Src 251构建体产生的Not I-Cla I片段将其***RCASBP(A)。为在cDNA中产生所需的c-src突变，使用本领域一般技术人员熟悉的标准定位诱变程序。设计掺入所需突变的PCR引物也设计有限制酶切位点以辅助随后的克隆步骤。通过基于鸡、人等的Src同源物的已知cDNA序列的PCR扩增技术及随后形成新构建体，编码Src的核酸序列的整个片段从核酸构建体上被删除。

在本发明的一个实施方案中，用于扩增src核酸的3’PCR引物也编码框内序列。用该引物在随后Src构建体的羧基端添加一个9E10-myc表位标签。下面的氨基酸加到Src第251位氨基酸之后，以产生含9E10-myc表位标签的载体构建体：VDMEQKLIAEEDLN(SEQ IDNO：6)。每个构建体各进行两次独立的PCR，得到相似的结果。由PCR构建的所有突变构建体也通过PCR测序以确认预测的克隆DNA序列。用于本发明的该表达***的野生型和突变Src cDNA也可从UpstateBiotech Laboratories，Lake Placid，NY获得，它销售人及禽src，及其几种激酶死亡和活化突变形式。

用于表达本发明Src或Yes蛋白的替代性表达载体也包括腺病毒载体，描述于美国专利4,797,368,5,173,414,5,436,146,5,589,377和5,670,488。递送Src或Yes调节蛋白的替代性方法包括用非病毒载体***递送Src或Yes cDNA，这描述于美国专利5,675,954，和以裸DNA方式递送cDNA自身，这描述于美国专利5,589,466。递送本发明的构建体也不限于下面CAM测定中描述的局部施用病毒载体。例如，病毒载体制剂也可经静脉注射***递送入血管床。例如通过局部注射肿瘤，这些载体也可定向于新血管生成增加的位点。

表达和纯化选定的Src蛋白后，通过用于蛋白或多肽递送的方法，体外表达的蛋白也被考虑用于递送。一种该方法包括脂质体递送***，如描述于美国专利号4,356,167，5,580,575，5,542,935和5,643,599中的方法。其它载体和蛋白递送***用于表达和/或递送本发明的Src或Yes蛋白，对于本领域一般技术人员熟知。

2.来处理鸡绒毛***(CAM)的鉴定

A.CAM制备

在正常胚胎血管发生导致成熟血管形成后，可在鸡绒毛***(CAM)上诱导血管发生。已经表明作为对特异性细胞因子或肿瘤片段的应答，可以诱导血管发生。这由下文描述Leibovich et al.， Nature，329：630(1987)和Ausprunk et al.， Am.J.Pathol.，79：597(1975)。从鸡胚制备CAM以供随后诱导和抑制血管发生。十日龄鸡胚由McIntyre Poultry(Lakeside，CA)获得，并在37℃、60％湿度条件下孵育。在气囊端卵壳上用小工具钻(Dremel，Division of EmersonElectric Co.Racine WI)钻一小洞。在缺乏胚胎血管区域的卵宽侧再钻一小洞，之前先通过对光透视卵检查确定。在第一个洞上加负压，导致CAM(绒毛***)从壳膜中脱出并在CAM上产生一个假气囊。用小模型砂轮(Dremel)通过壳在脱出的CAM上切出一个1.0厘米(cm)×1.0cm见方的窗口。这个小窗口允许直接达到下面的CAM。

得到的CAM制备物然后用于胚胎发生6天(此阶段标志是活跃的新血管生成)，对CAM没有另外处理反映了用于评价对胚胎新血管生成作用的模型，或用胚胎发生10天，其时血管发生已经消退。因此后者制备物用于本发明，诱导再次血管发生以对细胞因子处理或如下所述与肿瘤接触作出应答。

3.CAM血管发生测定

A.生长因子诱导的血管发生

已经表明可用细胞因子或生长因子诱导血管发生。血管发生的诱导方法如下：5毫米(mm)×5mm Whatman圆滤纸片(Whatman滤纸1号)先用Hanks平衡盐溶液(HBSS，GIBCO，Grand Island，NY)或含2微克/毫升(μg/ml)重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)(Genzyme，Cambridge，MA)的HBSS饱和，然后放置于9或10日龄鸡胚CAM中的缺乏血管的区域，并随后用胶带密封窗口。其它浓度的生长因子也可有效诱导血管生长。血管发生抑制用静脉内注射拮抗剂来评价，对于这种测定，首先用1-2μg/ml bFGF或VEGF在成纤维细胞生长培养基上诱导血管发生。72小时后用显微照相监测血管发生。

B.胚胎血管发生

用于评价血管发生抑制剂对胚胎新脉管***自然形成作用的CAM制备物是前述的6日龄鸡胚。在此发育阶段，血管正在从头生长，因此提供一个评价本发明Src蛋白对血管发生调节作用的有用***。CAM***按前述制备，但测定在胚胎第6天而不是9或10天。

4. 在CAM测定中测量血管发生调节

为评价Src蛋白对血管发生的作用，以下测定在10日龄鸡CAM制备物上进行。5μg按实施例1制备的RCAS构建体转染进永生化鸡成纤维细胞系DF-1(Doug Foster惠赠，明尼苏达大学)。与原代鸡胚成纤维细胞一样，该细胞系可以产生病毒，然而DF-1细胞系产生更高滴度。病毒上清液收集自无血清CLM培养基(配方：F-10培养基基质，添加DMSO，叶酸，谷氨酸和MEM维生素溶液)中的亚融合的DF-1生产细胞系。35ml病毒上清液用超离心在4℃、22,000rpm浓缩2小时。这些浓缩的病毒沉淀重悬于1/100原始体积的无血清CLM培养基中，等分分装并存于-80℃。通过系列稀释具有编码绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸序列的对照病毒载体，称为RCAS-GFP，感染培养48-72小时的原代鸡胚成纤维细胞，来评价其滴度。经常规浓缩获得的。病毒原液滴度超过10⁸I.U./ml。为用病毒原液进行CAM测定，浸透醋酸可的松的6mm直径的Whatman滤纸片由浸入含3mg/ml可的松的95％乙醇中30分钟来制备。在层流罩中干燥纸片，然后每片在20μl病毒原液中浸泡10分钟。这些纸片贴到9或10日龄鸡胚的CAM上并用玻璃纸带密封，在37℃孵育18-24小时。然后空对照PBS或5μg/ml浓度的生长因子在20μl体积适当的病毒原液中加到CAM上，这些病毒作为对CAM组织的再次增强。72小时后收获CAM，并用双盲法计算纸片下CAM中的分支点数目以检查血管发生指数的变化。对激酶测定，纸片下组织收获于RIPA中，用电动研磨器匀浆，从等价量总蛋白免疫沉淀Src并用FAK-GST融合蛋白作底物进行体外激酶测定。对于免疫荧光研究，纸片下CAM组织于一种低温保存剂OCT中冷冻，切成4μm片，丙酮固定1分钟，3％正常山羊血清中孵育1小时，然后如前述在兔抗磷酸化ERK一抗中孵育(Eliceiri et al.，J.Cell Biol.，140：1255-1263(1998))，PBS中洗涤，再用荧光二抗检测。

A.bFGF或VEGF对内源性Src的活化

为评价生长因子对Src调节血管发生的活性，进行以下测定。已暴露于bFGF或VEGF(2μg/ml)2小时的10日龄鸡CAM的组织提取物被裂解。从等价量总蛋白中免疫沉淀内源性Src并用FAK-GST融合蛋白作底物进行体外免疫复合物激酶测定，电泳并转移到硝酸纤维素膜上。

测定结果示于图5，其中与指示CAM测定中基线Src活性的未处理(空对照)样品比较，随bFGF或VEGF处理，Src活性的增加显示于凝胶中密度增加。BFGF和VEGF都导致CAM中内源性Src活性大约增加2倍。以上激酶测定印迹也用抗Src抗体探针检测作为等价Src和IgG含量的加样对照。

B.逆转录病毒介导的Src A基因表达对鸡CAM血管发生的作用

以下测定用于评估突变Src蛋白对CAM制备物血管发生的影响。测定按前述的操作进行，9日龄鸡CAM暴露于表达RCAS-Src A或RCAS-GFP的逆转录病毒或缓冲液中72小时。

该测定结果示于图6A，其中血管发生按上述定量。用立体显微镜拍摄的代表性光学显微照片(4X)示于图6B。基线内源性Src活性的血管发生指数大约为50。相比较，逆转录病毒载体表达的RCAS-Src A(其中527位氨基酸从酪氨酸点突变为苯丙氨酸)处理的CAM导致血管发生增强(诱导)，其血管发生指数约为90。Src A介导的血管发生增强在图6B的照片中也显而易见。

C.逆转录病毒表达Src A激活血管MAP激酶磷酸化

与生长因子VEGF和PMA相比，Src A对血管MAP激酶磷酸化的影响也用上面及此处描述的测定程序来评估。10日龄鸡CAM的组织提取物暴露于VEGF或PMA(在相当浓度下的另一种促***原)30分钟，与那些用表达Src A的逆转录病毒感染48小时组织作比较。然后从等价量总蛋白提取物中免疫沉淀Src，并用FAK-GST融合蛋白作底物进行体外免疫复合物激酶测定，电泳并转移到硝酸纤维素膜上。

该测定结果示于图7A，其中未处理CAM(NT)表现基线内源性Src介导的血管MAP激酶磷酸化。与基线相比VEGF和PMA都导致约2倍增加。与之相比，Src A增强其活性约5到10倍于未处理样品的程度。

等分的上述全组织裂解物也用于测量内源性ERK磷酸化，这通过用抗磷酸化ERK抗体作免疫印迹进行，结果示于图7B。在此评估中，用空对照RCAS或表达SRC A的RCAS感染10日龄CAM。两天后，解剖CAM，冻存于OCT中并切成4μm片。切片用抗磷酸化ERK抗体(NewEngland Biolabs)免疫染色，洗涤，用羊抗兔FITC偶联的二抗检测。用冷却CCD相机(Princeton Inst.)获取荧光图像。显微照片表明与空对照相比Src A处理的制备物免疫荧光增强。

D.在VEGF、而非bFGF诱导的血管发生期间对Src活性的选择性要求

为评估Src调节活性对生长因子诱导的血管发生的影响，进行以下测定。9日龄鸡CAM暴露于表达显性失活Src突变的逆转录病毒载体制备物，该突变指前述的Src 251或Src K295M。用RCAS-Src 251或对照RCAS-GFP逆转录病毒或缓冲液处理CAM 20小时，然后在存在或缺乏bFGF或VEGF条件下继续孵育72小时。

按前述定量的血管发生水平示于图8A。用立体显微镜拍摄的代表性显微照片(6X)示于图8B。图8C表示用抗Src抗体检测的印迹，以确认与空对照相比Src 251在转染细胞中表达。

上述测定结果表明，与空对照或未处理CAM制备物中Src介导的基线血管发生相比，存在RCAS-GFP对照时bFGF和VEGF处理的CAM都诱导血管发生。表达的显性失活突变Src 251可有效抑制VEGF诱导的血管发生，使之回到基线水平，同时不能有效抑制bFGF介导的血管发生。图8B中的显微照片用图示确认了图8A中的数据。因此，当用VEGF诱导血管发生时，逆转录病毒表达的Src 251是一种有效的血管发生抑制剂。

将本发明的Src蛋白应用于以下实施例描述的其它血管发生模型中包括于本发明中。

5. 根据体内兔眼模型测定的测量，Src调节剂使肿瘤组织生长消 退

Src调节剂对生长因子诱导的血管发生的影响可以在天然透明结构中观察到，例如眼角膜。具有丰富血液供应的新血管从角膜边缘生长到角膜中心，此处正常情况下没有血液供应。当将血管发生刺激剂如bFGF用到角膜上时，诱导新血管从角膜边缘生长。而将血管发生拮抗用到角膜上时，抑制新血管从角膜边缘生长。这样，角膜经历血管发生，内皮细胞从角膜边缘侵入容易看到的坚韧胶原覆盖的角膜组织。因此兔眼模型测定提供一种体内模型，当直接向眼角膜植入化合物后，可以直接观察血管发生刺激和抑制。

体内兔眼模型测定证明生长因子诱导血管发生

在体内兔眼模型测定中用生长因子bFGF或VEGF诱导血管发生，并描述于下面。

含生长因子的Hydron聚合物小片按下述方法制备，D’Amato etal.， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：4082-4085(1994)。每个小片含650ng结合到硫酸铝(Carafet，Marion Merrell DowCorporation)上的生长因子并确保其缓慢释放入周围组织中，此处硫酸铝用于稳定生长因子。另外按上述方法制备含所需的表达Src逆转录病毒的hydron小片。用专门制备的表面钻有2.5mm芯孔的Teflon栓浇注小片。每栓放入约12μl浇注材料，在无菌通风柜中聚合过夜，然后用紫外照射灭菌。按前述方法评估Src蛋白的作用。

6. 根据嵌合鼠：人测定测量，Src调节剂在体内使肿瘤生长倒退

通过用人新生儿***取代SCID小鼠部分皮肤建立体内嵌合体鼠：人模型。体内嵌合鼠：人模型基本按以下文献制备，Yan et al.， J.Clin. Invest.，91：986-996(1993)。简单地说，从SCID小鼠(6-8周龄)手术去除2cm²面积的皮肤，并用人***代替。将小鼠麻醉，腹部区两侧各剃除5cm²面积的毛。除去全部厚度皮肤直到筋膜，得到两个2cm²圆形移植床。来自人新生儿***的同样大小的全厚度人皮肤移植物放到创口床上并缝合。移植物用缝合到皮肤上的Band-Aid覆盖，也可用微孔布带覆盖伤口。

M21-L人黑色素瘤细胞系或MDA 23.1乳腺癌细胞系(ATCC HTB 26；用单抗LM609对组织切片进行免疫反应显示α_vβ₃阴性)用于在SCID小鼠的人皮肤移植物上形成人实体瘤。5×10⁶M21-L或MDA 23.1细胞的单次细胞悬液皮内注射到人皮肤移植物内。然后观察小鼠2到4周以允许可测量的人肿瘤生长。

7. 根据CAM测定的测量，Src调节剂在体外使人肿瘤组织生长消 退

肿瘤生长依赖血管发生(Folkman，1992， J.Biol.Chem.267：10931-10934；Weidner et al.，1991， N.E.J.Med.324：1-8；Brooks et al.，1994， Cell 79：1157-1164)。事实上，最近的报道提示，肿瘤生长对VEGF受体拮抗剂的抗血管发生作用敏感(Kim etal.，1993，Nature，362：8451-844)。因此，我们检测由递送激酶缺失的Src 251是否对血管发生的抑制将影响人骨髓母细胞瘤(DAOY)的生长，这是一种高度血管发生性的肿瘤，已知其产生VEGF及非常少的bFGF。

3和6天DAOY骨髓母细胞瘤肿瘤生长测定基本按前述方法在鸡CAM上进行(Brooks et al.，1994，同上)。洗涤培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640中的5×10⁶DAOY细胞，然后种植于10日龄胚胎的CAM上以产生DAOY肿瘤片段。7天后解剖出50mg肿瘤片段，并重新种植于另一10日龄胚胎，再局部施用(25μl)对照RCAS-GFP逆转录病毒、RCAS-Src 251、或空载体对照处理并孵育3或6天。对感染肿瘤用全组织共聚焦成像作指导，能确定在此局部方法的肿瘤片段内及周围RCAS构建体有显著表达。用双盲方式仅切除容易定义的实体瘤块，进行肿瘤切割及称重(Brooks et al.，1994，同上)。3或6天后肿瘤湿重与起始重量比较并确定每组肿瘤重量变化的百分比。

这些肿瘤容易在CAM上生长，并产生活性血管发生(图9)，允许我们用禽特异性RCAS逆转录病毒选择性定向禽起源的肿瘤血管***。

图9的结果表明向生长在鸡CAM上的人肿瘤递送逆转录病毒RCAS-Src 251可以使肿瘤生长逆转。图9A表示上述的生长于鸡胚胎CAM上的人骨髓母细胞瘤。含RCAS-GFP或RCAS-Src 251的逆转录病毒局部施用于大于50mg的预建立肿瘤。用表达GFP的RCAS-GFP感染的骨髓母细胞瘤肿瘤片段的代表性显微照片显示，在用BioRad激光共聚焦扫描显微镜(横条＝500μm)形成的光学切片检测时，在肿瘤血管(箭头)中有专一性表达。图9B表示如上处理的肿瘤的结果，使之生长3或6天，随后切除并称其湿重。数据表示为肿瘤重量的平均变化(从50mg起始重量)+/-两次重复的SEM。3天(*，P＜0.002)和6天(**，P＜0.05)后RCAS-Src 251对肿瘤生长有显著影响。图9C示出用奥林巴斯立体显微镜拍摄的从胚胎上手术切除的骨髓母细胞瘤的代表性显微照片(横条＝350μm)。(下排)每个肿瘤高度放大的显微照片详细示出每个肿瘤的血管***(横条＝350μm)。箭头指出RCAS-Src 251处理肿瘤中的血管破坏。

结果表明，递送含Src 251的RCAS到预建立的骨髓母细胞瘤导致在肿瘤相关的血管中选择性病毒表达(图9A)，且这最终导致在6天观察期内肿瘤的消退(图9B)。重要的是，含Src 251的病毒处理的动物中肿瘤相关的血管严重破坏，且与对照动物中肿瘤血管数相比更少(图9C)。RCAS-GFP感染的肿瘤表明GFP仅定位于肿瘤血管***，这暗示观察到的逆转录病毒递送的Src 251的抗肿瘤作用是由于其抗血管发生特性。

8. 在VEGF、而非bFGF介导的血管发生中内皮细胞存活需要Src

最近的证据暗示，生长因子受体(Choi and Ballermann，1995，J.Biol.Chem.270：21144-21150；Satake et al.，1998， Biochem. Biophys.Res.Comm.244：642-646)和整合素(Meredith et al.，1993， Mol.Biol.Cell 4：953-961；Brooks et al.，1994a， Science264：569-571)促进血管发生性内皮细胞的存活。生长因子和粘附受体也都调节Src活性，这促进研究血管发生中Src在内皮细胞存活中的角色。用bFGF或VEGF刺激的CAM用含Src 251的逆转录病毒感染，并对组织冷冻切片以检查凋亡细胞的存在。

简单地说，用bFGF或VEGF处理RCAS-GFP或RCAS-Src 251处理的CAM冷冻切片，用Apoptag试剂盒分析其冷冻切片中的凋亡细胞(Oncor，Gaithersburg，MD)。切片也用兔抗vWF多克隆抗体(biogenix，San Ramon，CA)免疫染色并用1μg/ml DAPI负染。用冷却CCD相机(Roper，Trenton，NJ)获取荧光图像，处理荧光图像并按前述在实验处理间进行曝光匹配(Ellcelri et al.，1998，同上)。

为测量逆转录病毒感染的CAM组织的凋亡指数，用偶联FITC的膜联蛋白V(Clontech，Palo Alto，CA)染细胞悬液，并用流式细胞仪分析洗涤后的细胞。按前述方法(Brooks，et al.，1994b)将空载体或病毒感染的CAM用0.1％(w/v)四型胶原酶(WorthingtonBiochemicals，Lakewood，NJ)消化，将切碎的CAM组织在RPMI1640中37℃摇床1小时，然后用100μM尼龙筛(Becton Dickinson，Fountain Lakes，NJ)过滤，即得到CAM细胞悬液。用FACscan流式细胞仪(Becton Dickinson)测量荧光计数到10,000个细胞。

用平行的胶原酶消化的CAM组织细胞制备物经FACs测量vWF染色。细胞用1.8％多聚甲醛固定，经70％乙醇渗透，用抗vWF抗体孵育，再用偶联FITC的二抗检测。

在VEGF、而非bFGF刺激的CAM中的VIII因子相关抗原(vonWillebrand factor冯·维尔布兰德因子[vWF])阳性的血管中，Src251的递送促进广泛的TUNEL染色。事实上，在这些CAM上的其它类型细胞中观察到的凋亡最少，这暗示在VEGF活化的血管中的细胞存活，内皮细胞特异性要求Src激酶活性。在另一组实验中，用VEGF或bFGF刺激的感染逆转录病毒的CAM进行有限的胶原酶消化以制备单一细胞悬液。这些CAM来源的细胞显示含20％-50％内皮细胞(vWF阳性)，用流式细胞检测膜联蛋白V阳性的细胞分析其凋亡，这是一种早期凋亡标志。相对于假RCAS-GFP感染的VEGF处理的CAM，起源自Src 251感染的VEGF刺激的CAM的细胞，具有显著增加的膜联蛋白V染色。与之相比，起源自空载体感染的CAM或用RCAS-Src 251感染并用bFGF刺激的CAM的细胞，其膜联蛋白V染色很少或没有。另外，在起源自非刺激或bFGF刺激的CAM的细胞中，检测不到膜联蛋白V染色。这些数据证明，在VEGF、而非bFGF介导的CAM血管发生期间，内皮细胞存活特异性要求Src激酶活性。

9. 在血管发生的皮下鼠模型中选择性要求Src激酶活性

为进一步分析Src在血管发生中的作用，使用了一种小鼠模型。在此例中，添加bFGF(100ng/ml)或VEGF(400ng/ml)的Matrigel可缓释生长因子，将其皮下注射到无胸腺wehl(nu/nu)成年小鼠从而诱导血管发生，并在5天后分析(Passaniti et al.，1992)。切除组织并将其匀浆，分离蛋白，然后用对内皮细胞特异的VEGF受体的抗体(flk-1)免疫印迹(图13A)，从而定量血管发生。正如鸡中观察到的，在此小鼠模型中激酶缺失的Src 251 cDNA表达阻断了VEGF诱导的血管发生，而对bFGF诱导的血管发生没有影响(图13B)。为确证内源性Src在此模型中的作用，用表达Cak的逆转录病毒感染组织，通过磷酸化其C端调节位点，Cak可抑制抑制内源性Src活性(Nadaet al.，1991， Nature 361：68-82)。Cak表达阻断VEGF、而非bFGF诱导的血管发生(图13)，这确证了内源性Src活性在VEGF介导的血管发生中的作用。这些感染病毒的VEGF刺激的组织的新血管生成通过用偶联FITC的抗CD34抗体或抗flk-1抗体直接免疫荧光证实(图13)，并通过计算每个冷冻切片上正染的CD34血管的数目来定量(图13C)。

简单地说，将含盐水或VEGF(400ng/ml)的去除生长因子的Matrigel与2×10⁶表达GFP逆转录病毒的外翻包装细胞经皮下注射到无胸腺wehl(nu/nu)成年小鼠的肋腹部，从而诱导血管发生，并经5天孵育后分析(Passaniti et al.，1992)。用VEGF受体的抗体(flk-1)免疫印迹，它对内皮细胞特异，从而定量新血管生成。图15A给出免疫印迹的结果。激酶缺失的Src 251、Csk或GFP逆转录病毒对VEGF(400ng/ml)或bFGF(400ng/ml)诱导的血管发生的作用，可用抗flk-1抗体免疫印迹组织裂解物来分析。该结果的一个实例见图15B。通过间接免疫荧光计算在三个随机20X视野中组织横截面中CD34阳性的血管数目，可对表达Src 251和Csk的逆转录病毒对VEGF诱导的新血管生成的作用定量。也可对塞子的冰冻切片用抗CD34抗体或抗flk抗体进行免疫荧光染色，拍照，并按前述CAM血管发生测定的方法定量。

用激光共聚焦显微镜解剖肿瘤片段并直接将未固定组织成像在虚拟玻片上，从而可以实现RCAS-GFP感染肿瘤片段的整体直接荧光(MRC1024：Bio-Rad，Hercules，CA)。

10. src ^-/- 或src ^+/- 小鼠耳中皮内表达VEGF的影响

继续由鸡和小鼠血管发生模型获得的结果，利用直接遗传学方法检查src^-/-小鼠中皮内VEGF诱导的血管发生，同时也检查对血管通透性的影响，因为已知VEGF抑制新血管生长并能促进血管通透性(Senger et al.，1983， Science 218：983-985；Ferrera andDavis-Smyth，1997， Endocr.Rev.16：4-25)。

在src^-/-或src^+/-小鼠耳皮内注射表达人VEGF cDNA的腺病毒，同时将表达对照β-半乳糖苷酶的腺病毒注射入每只小鼠的对侧耳。在src^+/-小鼠耳中VEGF依赖的新血管生长在48小时内首先检测到，5天后分析新血管生成。

简单地说，pp60^c-src、pp60^c-yes、pp60^c-fyn缺陷鼠(129/8v/Ev xC57B16/J)按前述生产(Soriano et al.，1991， Cell 64：693-702)。另外的原种由Jackson实验室获得。鼠耳皮内注射(Eriksson et al.，1980， Microvasc.Res.19：374-378)5μl表达VEGF或β-半乳糖苷酶的腺病毒，5天后用立体显微镜对鼠耳拍照。

已经发现用X-gal染色注射β-半乳糖苷酶-腺病毒的鼠耳，在src^+/-和src^-/-中病毒表达水平相同。在注射VEGF的src^-/-鼠耳中，用计算分支点测量的血管发生水平没有显著降低(P＜0.05)。然而令人惊奇的是，与注射VEGF的src^+/-鼠耳相比，这些动物中最明显的表型是完全阻断了血管渗漏。检查注射VEGF的鼠耳确证了src^+/-鼠中的血管渗漏，而在src^-/-鼠中基本不存在。这些动物中的血管渗漏暗示，与体内血管发生相关的VP活性(Dvorak et al.，1995， Am.J. Pathol.148：1029-1039)在pp60^c-src缺陷鼠中可被选择性破坏。

11. pp60 ^c-src 缺陷鼠中VEGF不能穿过血脑屏障

脑血管***的特征是高度限制性的血脑屏障，它禁止小分子从外面进入周围脑组织。脑内肿瘤生长可越过这个屏障，部分是因为产生血管生长因子如VEGF。因此，我们检查了src^-/-或src^+/-小鼠血脑屏障的性质。在此例中，VEGF或盐水立体定位地分别注射入脑右或左半球，所有小鼠接受***性注射Evan’s蓝染料以检测VP活性。

简单地说，盐水或VEGF(2μl中200ng)立体定位地注射入左或右额叶，分别在中线左或右侧92mm，前囟点向嘴侧0.5mm，硬脑膜下3mm。如上述，注射30分钟后动物经静脉内接受Evan’s蓝染料。再30分钟后，灌注小鼠并切除其脑。对新鲜未固定的脑冷冻切片用激光共聚焦显微镜观察其Evan’s蓝荧光。

血管渗漏定位于src^+/-鼠的注射VEGF半球，但src^-/-鼠完全没有血管渗漏。通过这些脑冷冻切片的外荧光分析检测来测量Evan’s蓝染料积累，以检查其VP时，也发现这种现象。因此，VEGF以一种依赖于活性pp60^c-src的方式越过血脑屏障。

12. VEGF介导的VP、而不是炎症相关的VP，依赖于pp60 ^c-src

为进一步分析和定量VEGF作为VP因子对src^-/-或src^+/-小鼠的影响，用Miles测定(Miles & Miles，1952)定量测量这些动物皮肤的血管通透性。VEGF皮内注射入src^-/-或src^+/-小鼠，它们已接受静脉内注射Evan’s蓝染料。在注射VEGF后15分钟内，src^+/-小鼠的VP增加3倍，然而src^-/-小鼠中没有观察到可检测的VP活性。定量注射皮肤斑块的染料洗脱液，并与对照盐水和bFGF比较。bFGF或盐水对照注射与VEGF接近，这表明VP没有显著增加。

简单地说，Miles测定(Miles et al.，1962)适用于小鼠，通过将10μl VEGF(400ng/ml)、烯丙基异硫氰酸酯(芥子油，20％w/v溶于矿物油中)、或盐水皮内注射入小鼠，之前已预先静脉注射100μl 0.5％Evan’s蓝染料。15分钟后解剖皮肤斑块，照相，并在58℃用***洗脱并用光度计定量。

已知在炎症中也会发生血管渗漏/通透性，这允许组织中积累血清相关的粘附蛋白和炎症细胞。事实上，炎症介质自身直接促进血管渗漏。因此，一种这种炎症介质烯丙基异硫氰酸酯，也称芥子油(Inoueet al.，1997，supra同上)，在src^-/-或src^+/-小鼠中测定其产生VP的能力。与VEGF刺激的src^-/-动物中观察到的不同，注射炎症介质烯丙基异硫氰酸酯没有检测到VP降低产生。因此可得出结论，Src对VEGF诱导的VP活性起选择性作用，且不影响炎症过程相关的VP。

13. VEGF介导的VP活性依赖于Src和Yes、而不是Fyn

通过检查VEGF诱导的、与Fyn或Yes等类似于Src的SFK相关的VP活性来研究VP要求的Src特异性，已知它们在内皮细胞中表达(Bullet al.，1994， FEBS Letters，361：41-44；Kiefer et al.，1994，Curr.Biol.4：100-109)。已经确证这三种SFK等价表达于野生型小鼠的主动脉。像src^-/-小鼠，Yes缺陷的动物也缺乏VEGF诱导的VP。然而，令人惊奇的是，缺乏Fyn的小鼠对VEGF保持高VP应答，这与对照动物没有显著区别。src^-/-或yes^-/-小鼠中VEGF诱导VP的破坏证明，对于导致VP活性而无血管发生的VEGF介导的信号传递事件，特异性SFK的激酶活性是必需的。

通过将盐水或VEGF(400ng)皮内注射入已静注Evan’s蓝染料的小鼠，确定VEGF对src^+/-(图1 4A左排)或src^-/-(图14A右排)小鼠皮肤中的血管通透特性。15分钟后，照相皮肤斑块(比例横条，1mm)。星号指示注射位点。切除VEGF、bFGF或盐水注射位点周围的区域，并通过用甲醛在58℃洗脱Evan’s蓝染料24小时，测量500nm处光吸收，从而定量VP(图14B左图)。炎症介质(烯丙基异硫氰酸酯)已知可诱导炎症相关的VP，其能力在src^-/-或src^+/-小鼠中测定(图14B右)。

用Miles测定比较src^-/-、fyn^-/-或yes^-/-小鼠中VEGF诱导VP的能力。每个Miles测定的数据表示为平均值±三个动物的SD。与对照动物比较，src^-/-和yes^-/-的VP缺陷具有统计学显著性(*p＜0.05，成对t实验)，而VEGF处理的fyn^-/-小鼠和烯丙基异硫氰酸酯处理的src^+/-小鼠其VP缺陷都没有统计学显著性(**p＜0.05)。

14. 与未处理野生型小鼠相比，Src家族酪氨酸激酶抑制剂处理的 小鼠和src ^-/- 小鼠表现与创伤相关的组织破坏减小或血管损伤减小

在血管损伤或疾病如中风期间，特异性给予Src家族激酶的抑制剂起病理性血管渗漏和通透性的抑制剂作用。血管内皮是一种动态细胞类型，对许多线索作应答，以调节肿瘤血管发生期间新血管的出芽等过程，中风诱导的水肿和组织破坏期间血管壁通透性的调节。

用药物抑制Src途径，降低两种鼠中风模型中的血管通透性，通过降低局部缺血诱导的血管渗漏，这足以抑制脑破坏。进一步，在遗传缺陷Src的小鼠中，其血管渗漏/通透性已降低，梗死体积也减少。结合合成Src抑制剂的数据和中风及其它相关模型中血管渗漏降低的支持性遗传学证据，证明在降低中风后脑破坏中该方法的生理相关性。用该信号传递级联中广泛的可用Src家族激酶抑制剂抑制这些途径，对减轻血管通透性相关组织破坏中的脑破坏具有治疗益处。

使用两种不同的方法诱导局部脑缺血。两种局部脑缺血的动物模型都已建立并广泛用于中风研究。除了用于测定新型抗中风药物，两种模型之前都曾用于研究脑缺血的病理生理学。

a)用三溴乙醇麻醉小鼠并将动物置于热垫上以维持体温。在右耳和右眼间作一切口。收缩颞肌暴露出颅骨，并在大脑中动脉(MCA)上区域钻出一小孔。除去脑膜并用热丝凝固以封闭右侧MCA。使动物苏醒并放回笼内。24小时后，灌注脑，取出并切成1mm截面。切片浸于2％氯化2，3，5-三苯四唑(TTC)，梗死脑区鉴定为未染色(白)组织，由活(红)组织围绕。梗死体积定义为切片上未染色总面积乘以其厚度。

Src缺陷小鼠(Src-/-)用于研究Src在脑缺血中的作用，Src+/-小鼠作为对照。我们发现损伤24小时后Src-/-小鼠梗死体积从26±10mm³减小到对照的16±4mm³。当血管堵塞30分钟后往C57B16野生型小鼠腹腔内(i.p.)注射1.5mg/kg PP1，这种作用甚至更显著。梗死体积从未处理组的31±12mm³减小到PP1处理组的8±2mm³。

b)在另一个局灶性脑缺血模型中，在MCA起始处放置一个栓子以堵塞MCA。用改良PE-50导管将单个完整的富含纤维蛋白的24小时的血凝块放置于MCA起始处。证实通过相对于对侧半球降低同侧半球脑血流，可以诱导脑缺血。24小时后切除脑，制备系列切片并用苏木精-伊红(HE)染色。通过加总系列HE切片上梗死面积乘以每个切片间距离得到梗死体积。

根据经验选择用于此研究的PP1剂量(1.5mg/kg i.p.)。已知VEGF在脑缺血约3小时后首先表达，最大在12到24小时后。本研究中在梗死出现30分钟后给予PP1以完全阻断VEGF诱导的血管通透性增加。根据典型VEGF表达的时间曲线，给予Src抑制剂的潜在治疗窗将上至中风后12小时。在血管通透性持续性增加相关的疾病中，缓慢给予Src抑制性药物是适当的。

图15描述损伤后小鼠脑中平均梗死体积的比较性结果，其中小鼠是杂合Src(Src+/-)、显性失活Src突变体(Src-/-)、野生型小鼠(WT)或用1.5mg/kg PP1处理的野生型小鼠(PP1)。

图16表示诱导CNS损伤处理后，分离的灌注鼠脑的样本序贯MRI扫描图，其中与对照未处理动物的扫描图排列(左)相比，PP1处理动物的扫描图排列(右)清楚表明其梗死更少。

本发明的方法特别适用于特异性干涉VP诱导的组织损伤，因为定向抑制Src家族酪氨酸激酶作用主要抑制VP而对其它VEGF诱导的应答没有长期影响，这些应答有益于从损伤恢复。与中和VEGF蛋白比较，抑制Src不影响VEGF的累积性血管发生作用，而这在疾病晚期可能有益。

相对于使用大蛋白，使用合成小分子抑制剂一般更安全且更易实行。使用重组蛋白，如VEGF受体-鼠免疫球蛋白融合蛋白潜在有害，且不允许重复给药，以避免用于人时引起***反应(即人抗鼠抗体；HAMA)。

最后，VEGF不是下游Src的唯一活化剂，参与脑缺血病理生理的其它细胞因子可影响血管通透性，如IL-6和TNF-α。因此，已知VEGF可能不能抑制所有随后的损伤相关的Src活化。事实上，PP1对梗死体积的减小比VEGF拮抗更明显，这表明其它途径可以活化Src激酶而促进通透性增加。

前述的书面说明书被认为足以使本领域技术人员实施本发明。本发明不限于任何给出的细胞系的范围内，因为任何给定的实施方案都意图作为本发明一个方面的单个举例说明，且任何功能等价的细胞系都在本发明范围内。给出的材料并不说明此处所含的书面描述不足以实施本发明的任何方面，包括最佳方式，它也不应解释为将权利要求限制在它代表的特定说明的范围。事实上，除了此处示出和描述的以外，根据前面的描述，本发明的多种变化形式对本领域技术人员显而易见，并在所附权利要求的范围内。

Claims (115)

1.一种药物组合物，其中含有酪氨酸激酶蛋白Src和Yes，同时含可药用载体。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src-A。

3.权利要求1的药物组合物，其中所述Src蛋白在527位氨基酸残基处可以是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基。

4.权利要求1的药物组合物，其中所述Src蛋白是无活性的。

5.权利要求4的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src K295M。

6.权利要求4的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src 251。

7.权利要求1的药物组合物，其中所述Yes蛋白是一种无活性Yes蛋白。

8.一种药物组合物，其中含有核酸，其核苷酸序列可以表达酪氨酸激酶蛋白Src和Yes，同时含可药用载体。

9.权利要求8的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src-A。

10.权利要求8的药物组合物，其中所述Src蛋白在527位氨基酸残基处可以是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基。

11.权利要求8的药物组合物，其中所述Src蛋白是无活性Src。

12.权利要求11的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src K295M。

13.权利要求11的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src 251。

14.权利要求8的药物组合物，其中所述Yes蛋白是一种无活性Yes蛋白。

15.权利要求8的药物组合物，其中含有病毒性基因转移载体。

16.权利要求8的药物组合物，其中含有非病毒性基因转移载体。

17.一种药物组合物，其中含有其核苷酸序列可以表达酪氨酸激酶蛋白Src的核酸，以及其核苷酸序列可以表达酪氨酸激酶蛋白Yes的核酸，同时含可药用载体。

18.权利要求17的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src-A。

19.权利要求17的药物组合物，其中所述Src蛋白在527位氨基酸残基处可以是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基。

20.权利要求17的药物组合物，其中所述Src蛋白是无活性Src。

21.权利要求20的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src K295M。

22.权利要求20的药物组合物，其中所述Src蛋白是Src 251。

23.权利要求17的药物组合物，其中所述Yes蛋白是一种无活性Yes蛋白。

24.权利要求17的药物组合物，其中含有病毒性基因转移载体。

25.权利要求17的药物组合物，其中含有非病毒性基因转移载体。

26.一种调节受疾病状况损害的组织中血管通透性的方法，包括使治疗上有效的VP调节量的药物组合物与所述组织接触，该药物组合物中含有选自Src、Yes或其混合物的酪氨酸激酶蛋白。

27.权利要求26的方法，其中所述酪氨酸激酶蛋白是活性Src，且所述调节加强血管通透性。

28.权利要求27的方法，其中所述活性Src蛋白是Src A。

29.权利要求27的方法，其中所述Src蛋白在527位氨基酸残基处可以是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基。

30.权利要求26的方法，其中所述酪氨酸激酶蛋白是活性Yes蛋白，且所述调节加强血管通透性。

31.权利要求26的方法，其中所述酪氨酸激酶蛋白是活性Src蛋白和Yes蛋白的混合物，且所述调节加强血管通透性。

32.权利要求26的方法，其中所述酪氨酸激酶蛋白是无活性Src蛋白，且所述调节抑制血管通透性。

33.权利要求32的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src K295M。

34.权利要求32的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src 251。

35.权利要求26的方法，其中所述酪氨酸激酶蛋白是无活性Yes蛋白，且所述调节抑制血管通透性。

36.权利要求26的方法，其中所述酪氨酸激酶蛋白是包括无活性Src蛋白在内的混合物，且所述调节抑制血管通透性。

37.权利要求36的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src K295M。

38.权利要求36的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src 251。

39.权利要求26的方法，其中所述酪氨酸激酶蛋白是包括无活性Yes蛋白在内的混合物，且所述调节抑制血管通透性。

40.一种调节受疾病状况损害的组织中血管通透性的方法，包括将治疗上有效的VP调节量的药物组合物与所述组织接触，该药物组合物中含有可表达选自Src蛋白、Yes蛋白或其混合物的酪氨酸激酶蛋白的核酸。

41.权利要求40的方法，其中所述药物组合物中包括一种逆转录病毒表达载体。

42.权利要求40的方法，其中所述药物组合物中包括一种非病毒性表达载体。

43.权利要求40的方法，其中所述核酸可表达活性Src蛋白，且所述调节是加强血管通透性。

44.权利要求43的方法，其中所述Src蛋白是Src-A。

45.权利要求43的方法，其中所述Src蛋白在527位氨基酸残基处可以是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基。

46.权利要求40的方法，其中所述核酸可表达无活性Src蛋白，且所述调节是抑制血管通透性。

47.权利要求46的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src K295M。

48.权利要求46的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src 251。

49.权利要求40的方法，其中所述核酸可表达无活性Yes蛋白，且所述调节抑制血管通透性。

50.权利要求40的方法，其中所述核酸可表达活性Yes蛋白，且所述调节加强血管通透性。

51.权利要求40的方法，其中所述核酸可表达无活性Src蛋白和无活性Yes蛋白，且所述调节抑制血管通透性。

52.权利要求40的方法，其中所述核酸是一种混合物，其中包括可表达无活性Yes蛋白的核酸。

53.权利要求40的方法，其中所述核酸是一种混合物，其中包括可表达无活性Src蛋白的核酸。

54.权利要求53的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src K295M。

55.权利要求53的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src 251。

56.权利要求53的方法，其中所述无活性Src酪氨酸激酶蛋白是无活性Src 251和Src K295M蛋白的混合物。

57.权利要求40的方法，其中所述核酸可表达活性Src蛋白和活性Yes蛋白。

58.权利要求40的方法，其中所述核酸是一种混合物，其中包括可表达活性Yes蛋白的核酸。

59.权利要求40的方法，其中所述核酸是一种混合物，其中包括可表达活性Src蛋白的核酸。

60.一种制造物，其中含有包装材料和包含于所述包装材料内的一种药物组合物，其中所述药物组合物可调节受疾病状况损害组织的血管通透性，其中所述包装材料包含一个标签，上面标明所述药物组合物通过调节血管通透性可用于治疗疾病状况，且其中所述药物组合物含有一种酪氨酸激酶Src蛋白和Yes蛋白，位于可药用载体中。

61.权利要求60的制造物，其中所述Src蛋白是活性Src。

62.权利要求61的制造物，其中所述活性Src蛋白是Src-A。

63.权利要求61的制造物，其中所述Src蛋白在527位氨基酸残基处可以是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基。

64.权利要求60的制造物，其中所述Src蛋白是无活性的。

65.权利要求64的制造物，其中所述Src蛋白是Src K295M。

66.权利要求64的制造物，其中所述Src蛋白是Src 251。

67.权利要求60的制造物，其中所述Yes蛋白是有活性的。

68.权利要求60的制造物，其中所述Yes蛋白是无活性的。

69.一种制造物，其中含有包装材料和包含于所述包装材料内的一种药物组合物，其中所述药物组合物可调节受疾病状况损害组织的血管通透性，其中所述包装材料包含一个标签，上面标明所述药物组合物通过调节血管通透性可用于治疗疾病状况，且其中所述药物组合物含有可表达一种酪氨酸激酶Src蛋白和Yes蛋白的核酸，位于可药用载体中。

70.权利要求69的制造物，其中所述Src蛋白是活性Src。

71.权利要求70的制造物，其中所述活性Src蛋白是Src-A。

72.权利要求70的制造物，其中所述Src蛋白在527位氨基酸残基处可以是除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸残基。

73.权利要求69的制造物，其中所述Src蛋白是无活性的。

74.权利要求73的制造物，其中所述Src蛋白是Src K295M。

75.权利要求73的制造物，其中所述Src蛋白是Src 251。

76.权利要求69的制造物，其中所述Yes蛋白是有活性的。

77.权利要求69的制造物，其中所述Yes蛋白是无活性的。

78.权利要求69的制造物，其中所述Src和Yes蛋白由可表达Src蛋白、和可表达Yes蛋白的核酸的混合物编码，位于可药用载体中。

79.一种制造物，其中含有包装材料和包含于所述包装材料内的一种药物组合物，其中所述药物组合物可调节受疾病状况损害组织的血管通透性，其中所述包装材料包含一个标签，上面标明所述药物组合物通过调节血管通透性可用于治疗疾病状况，且其中所述药物组合物含有可表达一种酪氨酸激酶Yes蛋白的核酸，位于可药用载体中。

80.权利要求79的制造物，其中所述Yes蛋白是有活性的。

81.权利要求79的制造物，其中所述Yes蛋白是无活性的。

82.一种制造物，其中含有包装材料和包含于所述包装材料内的一种药物组合物，其中所述药物组合物可调节受疾病状况损害组织的血管通透性，其中所述包装材料包含一个标签，上面标明所述药物组合物通过调节血管通透性可用于治疗疾病状况，且其中所述药物组合物含有一种酪氨酸激酶Yes蛋白，位于可药用载体中。

83.权利要求82的制造物，其中所述Yes蛋白是有活性的。

84.权利要求82的制造物，其中所述Yes蛋白是无活性的。

85.一种改善与血管渗漏或水肿相关的组织破坏的方法，包括将血管通透性调节量的药物组合物与所述组织接触，该组合物中含有一种Src家族酪氨酸激酶抑制剂。

86.权利要求85的方法，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是一种化学抑制剂。

87.权利要求86的方法，其中所述化学抑制剂选自PP1、PP2、PD173955、AGL1872、PD162531、根赤壳素R2146和格尔德霉素。

88.权利要求87的方法，其中所述抑制剂是PP1。

89.权利要求85的方法，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是一种无活性Src蛋白。

90.权利要求89的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src K295M。

91.权利要求89的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src 251。

92.权利要求85的方法，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是一种无活性Yes蛋白。

93.权利要求85的方法，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是活性C端Src激酶(CSK)蛋白。

94.权利要求85的方法，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是一种编码Src家族酪氨酸激酶抑制剂蛋白的核酸。

95.权利要求94的方法，其中所述药物组合物包括一种逆转录病毒表达载体。

96.权利要求94的方法，其中所述药物组合物包括一种非病毒性表达载体。

97.权利要求94的方法，其中所述抑制剂蛋白选自无活性Src蛋白、无活性Yes蛋白、活性C端Src激酶(CSK)、及其混合物。

98.权利要求97的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src K295M。

99.权利要求97的方法，其中所述无活性Src蛋白是Src 251。

100.权利要求85的方法，其中所述抑制剂是一种Src酪氨酸激酶抑制剂。

101.一种制造物，其中含有包装材料和包含于所述包装材料内的一种药物组合物，其中所述药物组合物可调节受疾病状况损害组织的血管通透性增加，其中所述包装材料含有一个标签，上面标明所述药物组合物可用于治疗血管渗漏或水肿相关的疾病状况，且其中所述药物组合物含有一种Src家族酪氨酸激酶抑制剂及其可药用载体。

102.权利要求101的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是一种化学抑制剂。

103.权利要求102的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂选自PP1、PP2、PD173955、AGL1872、PD162531、根赤壳素R2146和格尔德霉素。

104.权利要求102的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是PP1。

105.权利要求102的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是一种无活性Src蛋白。

106.权利要求105的制造物，其中所述无活性Src蛋白是SrcK295M。

107.权利要求105的制造物，其中所述无活性Src蛋白是Src251。

108.权利要求101的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是无活性Yes蛋白。

109.权利要求101的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是活性C端Src激酶(CSK)蛋白。

110.一种制造物，其中含有包装材料和包含于所述包装材料内的一种药物组合物，其中所述药物组合物可调节受疾病状况损害组织的血管通透性，其中所述包装材料含有一个标签，上面标明所述药物组合物可用于治疗血管渗漏或水肿相关的疾病状况，且其中所述药物组合物含有编码一种Src家族酪氨酸激酶抑制剂的核酸，位于可药用载体中。

111.权利要求110的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是无活性Src蛋白。

112.权利要求111的制造物，其中所述无活性Src蛋白是SrcK295M。

113.权利要求111的制造物，其中所述无活性Src蛋白是Src251。

114.权利要求110的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是无活性Yes蛋白。

115.权利要求110的制造物，其中所述Src家族酪氨酸激酶抑制剂是活性C端Src激酶(CSK)蛋白。

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