CN1303429A - TNF受体超家族的成员成熟FLINT(mFLINT)多肽或OPG3的药学应用 - Google Patents

TNF受体超家族的成员成熟FLINT(mFLINT)多肽或OPG3的药学应用 Download PDF

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Abstract

成熟的FLINT蛋白(mFLINT)结合FasL和LIGHT,并防止FasL－Fas相互作用介导的编程性细胞死亡和促炎活性,可用于治疗与异常的编程性细胞死亡和炎症相关的疾病。本发明提供了FLINT和成熟FLINT的氨基酸序列和核苷酸序列。公开了表达FLINT的转基因动物的制备和鉴定。也提供了利用mFLINT治疗的治疗组合物和方法。

Description

TNF受体超家族的成员成熟FLINT(mFLINT)多肽 或OPG3的药学应用
本申请要求对下列美国申请的优先权：于1998年3月30日提交的60/079,856；于1998年3月20日提交的60/086,074；于1998年9月9日提交的60/099,643；于1998年12月18日提交的60/112,703；于1998年12月17日提交的60/112,577；于1998年12月18日提交的60/112,933；以及于1998年12月22日提交的60/113,407。
                    发明背景
FasL(也称为CD95L和APO1L)在各种细胞类型中表达并可以产生如增殖、分化、免疫调节、炎性反应、细胞毒性和编程性细胞死亡等生物学反应。有趣的是，在TNFR家族受体FAS/APO(Suda等人，1993,Cell 75:1169-78)的配体FasL中的突变与自身免疫有关(Fisher等人，1995,Cell 81:935-46)，同时已经将FasL的过量产生与药物诱导的肝炎联系起来。FasL在眼、睾丸、脑和一些肿瘤的免疫优势(immune-previliged)组织中表达。也已经在肾和肺以及激活的胸腺细胞、脾细胞和T淋巴细胞中发现了FasL。
编程性细胞死亡在发育和体内稳态中都起重要作用。在处于形态发生或突触发生过程中的发育中的胚胎内、以及在处于组织更新过程中或免疫应答末期的成年动物体内，细胞由于编程性细胞死亡而死亡。由于编程性细胞死亡的生理作用是关键的，因此该过程的偏离可能是有害的。例如，某些脑神经元的期外编程性细胞死亡是造成如Alzheimer病和Parkinson病等疾病的原因之一，而正在***的细胞在遭受了严重DNA损伤后不能起始编程性细胞死亡是造成癌症的原因之一。
来自细胞环境的生存信号以及细胞完整性的内部传感器通常阻止细胞的编程性细胞死亡机制。在细胞失去与环境的接触或遭受无法修复的伤害的情况下，该细胞起始编程性细胞死亡。同时接受促进或减弱***周期的矛盾信号的细胞也触发编程性细胞死亡。而哺乳动物已经进化出另一种机制，该机制使生物体能主动地指导各个细胞进行自我毁灭。这种“指导性”的编程性细胞死亡在免疫***中尤其重要。死亡受体，即传递由特异性“死亡配体”起始的编程性细胞死亡信号的细胞膜受体，在指导性编程性细胞死亡中起重要作用。这些受体可以在配体结合后几秒钟内激活死亡caspase，在几小时内造成细胞的编程性细胞死亡。
死亡受体属于肿瘤坏死因子(TNF)受体基因超家族，该超家族根据相似的富含半胱氨酸的胞外结构域确定。死亡受体另外包含一个名为“死亡结构域”的同源胞质序列。死亡结构域通常使死亡受体能够使用细胞的编程性细胞死亡机制，但在某些情况下，它们介导与编程性细胞死亡不同或甚至相对抗的功能。
Fas(也称为CD95或Apol)是一种已经很好地确定了特征的死亡受体。Fas和Fas配体(FasL)在编程性细胞死亡中起重要作用。FasL是同源三聚体分子。据显示有可能每个FasL三聚体结合三个Fas分子。因为死亡结构域有相互结合的倾向，所以Fas的连接导致受体死亡结构域的聚集。然后一种名为FADD(Fas结合死亡结构域；也称为Mortl)通过其本身的死亡结构域结合到聚集的受体死亡结构域。FADD还包含“死亡效应物结构域”，该结构域结合在caspase-8(也称为FLICE或MACH)的酶原形式中串联重复的类似结构域。在被FADD募集后，caspase-8的寡聚化通过自我切割促进caspase-8的激活。随后caspase-8激活下游的效应物caspase，如caspase-9，使细胞进入编程性细胞死亡。Ashkenazi A等人，“Death Receptors:Signalingand Modulation Science 281,1305-1308(1998年8月)。
虽然FasL在T淋巴细胞中触发编程性细胞死亡，但FasL也是促炎的。已经显示FasL刺激嗜中性粒细胞(也称为多形核白细胞(PMN))的激活。(Chen J．等人，Science 282:1714-17(1998))已经显示FasL-Fas结合涉及外周淋巴组织中自体反应性淋巴细胞的克隆缺失以及自体反应性淋巴细胞群体的去除，并因此促进免疫***的稳态。然而，已经发现FasL在转基因小鼠的肌管或胰岛上的表达诱导加快移植排斥的粒细胞反应(Allison J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci,94:3943-47(1997年4月)；Kang S-M等人，Nature Medicien，第3卷，No.7,738-743(1997年7月))。
至少FasL-Fas受体结合的其中一种效应是编程性细胞死亡，而编程性细胞死亡对于体内稳态是必要的。然而，有时在应激反应(stress)、疾病或创伤中扰乱了配体-受体结合的平衡。不受调节的FasL-Fas结合的其中一个负效应是失控或偏离的编程性细胞死亡。所述结合的另一个效应是FasL激活的中性粒细胞引起的对健康细胞的破坏。
例如，特定器官中失控的编程性细胞死亡的一个更不可思议的结果是急性肝衰竭。急性肝衰竭的特征在于编程性细胞死亡途径的过度激活，其中有大量的肝细胞编程性细胞死亡和出血性肝病变。影响肝的病毒感染、影响肝的细菌感染、肝炎、肝细胞损伤和/或其它肝细胞遭受大量编程性细胞死亡的病征可以导致急性肝衰竭的发生。感染导致急性肝衰竭的一个例子是细菌诱导的暴发性肝炎。
                      发明简述
本发明包括具有图1序列的分离的核酸分子、具有图3序列的分离的核酸分子、具有图1序列的分离多肽以及具有图3序列的分离多肽。本发明还包括具有转基因的转基因小鼠，其中所述转基因具有图1的序列。
根据本发明的一个方面，提供mFLINT以在治疗下列病征中使用：急性肝衰竭；肝的炎症；异常的肝细胞编程性细胞死亡；脓毒病；与炎症有关的疾病；肝炎；治疗异常的编程性细胞死亡；与局部缺血有关的损伤或疾病；与血凝性过高有关的损伤或疾病，包括使用由溶栓剂和抗凝剂中选出的组中选出的药物，如激活的蛋白C；与再灌注有关的损伤或疾病；由于异常的心肌缺血引起的心肌细胞损伤；Ⅰ型糖尿病；癌症；由化疗剂或治疗辐射引起的无辜受殃组织(innocent bystander tissue)损伤，其中所述无辜受殃组织包括骨髓、肠上皮、口腔上皮；暴露于治疗辐射或化疗中的造血祖细胞的损伤；由治疗辐射或化疗引起的细胞损伤，包括对肠上皮细胞、造血祖细胞和外周血细胞的损伤；再生障碍性贫血；脊髓发育不良综合征；以及各类血细胞减少的病征。
根据本发明的另一个方面，提供mFLINT以用于促进造血祖细胞的生长或分化以及促进CD34+细胞的生长或分化。
本发明的另一方面包括以mFLINT作为有效成分的制剂，所述制剂适用于治疗以下病征：急性肝衰竭；肝的炎症；异常的肝细胞编程性细胞死亡；脓毒病；与炎症有关的疾病；肝炎；治疗异常的编程性细胞死亡；与局部缺血有关的损伤或疾病；与血凝性过高有关的损伤或疾病，包括使用由溶栓剂和抗凝剂中选出的组中选出的药物，如激活的蛋白C；与再灌注有关的损伤或疾病；由于异常的心肌缺血引起的心肌细胞损伤；Ⅰ型糖尿病；癌症；由化疗剂或治疗辐射引起的无辜受殃组织损伤，其中所述无辜受殃组织包括骨髓、肠上皮、口腔上皮；暴露于治疗辐射或化疗中的造血祖细胞的损伤；由治疗辐射或化疗引起的细胞损伤，包括肠上皮细胞损伤、造血祖细胞损伤和外周血细胞损伤；再生障碍性贫血；脊髓发育不良综合征；以及各类血细胞减少的病征。
根据本发明的再一个方面，提供以mFLINT作为有效成分的制剂，所述制剂适用于促进造血祖细胞的生长或分化以及促进CD34+细胞的生长或分化。
本发明的其它实施方案包括使用mFLINT制备在治疗以下病征中有用的药物：急性肝衰竭；肝的炎症；异常的肝细胞编程性细胞死亡；脓毒病；与炎症有关的疾病；肝炎；治疗异常的编程性细胞死亡；与局部缺血有关的损伤或疾病；与血凝性过高有关的损伤或疾病，包括使用选自溶栓剂和抗凝剂中的药物，如激活的蛋白C；与再灌注有关的损伤或疾病；由于异常的心肌缺血引起的心肌细胞损伤；Ⅰ型糖尿病；癌症；由化疗剂或治疗辐射引起的无辜受殃组织损伤，其中所述无辜受殃组织包括骨髓、肠上皮、口腔上皮；暴露于治疗辐射或化疗中的造血祖细胞的损伤；由治疗辐射或化疗引起的细胞损伤，包括肠上皮细胞损伤、造血祖细胞损伤和外周血细胞损伤；再生障碍性贫血；脊髓发育不良综合征；以及各类血细胞减少的病征。
依照本发明的另一个方面，本发明包括在制备药物中使用mFLINT，其中所述药物可用于促进造血祖细胞的生长或分化以及促进CD34+细胞的生长或分化。
本发明包括治疗遭受异常的肝细胞编程性细胞死亡的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。本发明还包括治疗患有与炎症有关的疾病的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。此外，本发明包括治疗遭受异常的编程性细胞死亡的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。
本发明还包括使用mFLINT治疗多种肝病。在这一方面，本发明包括治疗患有急性肝衰竭的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。本发明还包括治疗患有肝的炎症的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。本发明的另一方法是为治疗患有肝炎的个体，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。
本发明还包括治疗患有脓毒病的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。
本发明还包括治疗患有与局部缺血有关的损伤或疾病的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。这样一种损伤或疾病可能与血凝性过高有关。在这一方面，本发明还包括治疗与血凝性过高有关的疾病，包括联合血栓剂或抗凝剂，给予治疗有效量的mFLINT蛋白。这样一种抗凝剂的一个例子有激活的蛋白C。
本发明还包括治疗患有与再灌注有关的损伤或疾病的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。
本发明还包括在遭受异常的心肌局部缺血的个体中预防心肌细胞损伤的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。
本发明还包括治疗患有Ⅰ型糖尿病的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。本发明包括的再一个方法是治疗患有癌症的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT蛋白。
本发明还包括在用化疗试剂或治疗辐射治疗的个体中治疗由所述试剂或辐射引起的对无辜受殃组织的损伤的方法，包括给予所述个体治疗有效量的mFLINT。这样的组织包括骨髓和肠上皮，包括口腔上皮。
本发明包括治疗已暴露于治疗辐射或化疗的造血祖细胞的方法，包括给予所述细胞mFLINT。这样一种方法促进造血祖细胞从治疗辐射或化疗的副作用中恢复。本发明包括促进造血祖细胞的生长或分化的方法，包括给予所述细胞mFLINT。本发明还包括促进CD34+细胞的生长或分化的方法，包括给予所述细胞mFLINT。
本发明还包括治疗癌症的方法，包括用mFLINT在体外治疗骨髓细胞，然后将所述细胞给予所述患者，其中在用治疗辐射或化疗治疗所述患者后进行所述给予。所述骨髓细胞可以是自体的(即来自接受治疗的患者)或是异体的(即来自并非所述患者的个体)。
本发明还包括在接受治疗辐射或化疗的患者中治疗细胞损伤的方法，包括将治疗有效量的mFLINT与所述辐射或化疗一起给予所述患者。所述细胞损伤可以是对肠上皮细胞、造血祖细胞或外周血细胞的损伤。
本发明还设想了治疗再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征或各类血细胞减少的病征的方法，包括给予遭受再生障碍性贫血的患者治疗有效量的mFLINT。
                      附图简述
图1显示了人FLINT的组合的氨基酸序列和核苷酸序列。
图2显示了人FLINT的组合的氨基酸序列和核苷酸序列。
图3显示了人mFLINT的组合的氨基酸序列和核苷酸序列。
图4显示了人mFLINT的组合的氨基酸序列和核苷酸序列。
图5比较了在给予LPS不同时间后在动物脓毒病模型中mFLINT与其它试剂的表现。
图6的左图显示了在动物脓毒病模型中比较mFLINT与抗TNF的实验。右图在同一个模型中比较了更低剂量的mFLINT与抗TNF。
图7显示了在动物脓毒病模型中比较静脉内和腹膜内传送mFLINT和抗TNF的实验。
图8显示了响应mFLINT处理的B16黑素瘤体积减少。
图9显示了辐射后mFLINT促进的骨髓祖细胞恢复。
图10显示了5-氟尿嘧啶处理后mFLINT促进的骨髓祖细胞恢复。
                     发明详述
通过使用鉴定结合Fas配体的化合物的方法，申请人已经发现人FLINT多肽能够破坏FasL-Fas受体相互作用。申请人已经发现了调节TNFR蛋白与它们各自的配体相互作用的方法，其中所述相互作用引起或加重疾病，申请人还发现了预防或治疗疾病的方法。
如上文所提到的，相当确定FasL-Fas受体结合的下游效应之一是编程性细胞死亡。在表现出该途径的异常激活的情况中，导致了失控的编程性细胞死亡，而失控的编程性细胞死亡是多种疾病病理学中的作用因素。FasL-Fas受体结合的另一个下游效应是激活中性粒细胞，其中FasL激活的中性粒细胞破坏细胞。
最近发现，FasL在腹膜渗出细胞(PEC)中诱导IL-1β的加工和释放，而IL-lβ的加工和释放引起中性粒细胞浸润。尤其是Miwa K.等人Nature Medicine,4(11):1287-1292(1998年11月)发现，在野生型小鼠中接种表达Fas配体的肿瘤细胞诱导大量的中性粒细胞浸润，而与此相反，在IL-1αβ删除的小鼠中中性粒细胞的浸润受到抑制。这表明FasL具有炎性作用。还暗示编程性细胞死亡本身在某些情况下可能诱导炎症。此外，已知某些炎性因子可以诱导Fas介导的编程性细胞死亡途径。因此，有可能FasL在施加它的病理影响时，通过两个有可能不同但相关的途径起作用。
本发明人发现，FLINT多肽以与FasL结合的亲和生如果不是比Fas受体本身结合的亲和性更大则至少相同。作为结合FasL的结果，FLINT多肽可以干扰FasL结合Fas受体并干扰下游事件。本发明人使用在下文的实施例中展示的各种体外模型和动物模型，证明了FLINT多肽预防Fas介导的有害效应的能力。根据这些数据，明显地看出FLINT可以作用于FasL活性的编程性细胞死亡方面和促炎方面两方面，这意味着它在下面讨论的几种疾病状态和损伤状态中的应用。
下面展示的数据显示mFLINT抑制FasL的编程性细胞死亡诱导活性和促炎活性两者。通过拮抗FasL,mFLINT多肽可以调节由FasL激活的中性粒细胞引起的健康细胞破坏以及FasL-Fas相互作用直接介导的编程性细胞死亡损伤引起的健康细胞破坏。因此，本发明的利用mFLINT的治疗方法可以用于治疗和预防与FasL的直接编程性细胞死亡效应有关的疾病和/或FasL的促炎效应介导的损伤，而不论这些效应是否代表不同的病理学途径。
因此，如一般所确定特征的，本发明涉及预防或治疗由“异常的编程性细胞死亡”引起或加重的病征，其中所述“异常的编程性细胞死亡”尤其指Fas配体(FasL)和Fas受体(Fas)结合(也称为FasL-Fas结合)诱导的编程性细胞死亡。本发明还涉及预防或治疗由促炎反应引起的病征，其中所述促炎反应尤其指由Fas诱导的中性粒细胞激活引起的促炎反应。
在本申请的全文中，标题仅用于方便组织的目的，而不应当被认为是限制本文所述的主题。Ⅰ．定义
下面的定义使用在本申请中。
如本申请所用，术语“FLINT”指任何全长的FLINT多肽。这样一种全长的多肽包括前导序列，即FLINT多肽的第1-29氨基酸。FLINT的例子包括图1中陈述的氨基酸序列的蛋白，即人FLINT，以及包括图2中陈述的氨基酸序列的蛋白，即人FLINT的变异体。
如本申请所用，术语“mFLINT”指成熟的FLINT，即不具有前导(也称为信号)肽的FLINT。mFLINT的例子包括具有图3陈述的氨基酸序列的蛋白，即缺少前导肽的图1的蛋白，以及具有图4陈述的氨基酸序列的蛋白，即缺少第1-29氨基酸的图2的蛋白。因此，“mFLINT基因”是编码mFLINT多肽的核酸。图3和图4中陈述的核酸是依照本发明的mFLINT基因的例子。
如本文所用，术语“不合适的”和“异常的”在指FasL或Fas表达或相互作用以及指任何引起的编程性细胞死亡时，应当被理解为包括从正常表达、相互作用或编程性细胞死亡水平的任何偏离。这样的偏离包括暂时、定量和定性的异常。FasL或Fas“表达”不仅指转录、翻译以及相关事件，还指任何导致有活性的FasL或Fas的可得性增加的过程，如转运和细胞表面可得性/可达性。
如本文所用，术语“异常的编程性细胞死亡”指过量和/或不适当的编程性细胞死亡。通常在遭受物理、化学或生物损伤的细胞和组织中观察到异常的编程性细胞死亡。这样的损伤包括但不限制于物理损伤、病毒感染、细菌感染、局部缺血、辐射、化疗等等。
术语“融合蛋白”代表在自然中未发现的杂种蛋白分子，包括翻译融合体或酶促融合体，其中两个或更多的不同蛋白或其片段在一条多肽单链中共价连接。
“宿主细胞”指适于增殖和/或表达包含在载体中的克隆基因的任何真核细胞或原核细胞，其中所述载体通过，例如，转化或转染等引入所述宿主细胞。
“分离的核酸化合物”指无论是构建或合成的在位置上与其天然位置不同的任何RNA或DNA序列。
术语“质粒”指染色体外的遗传元件。本文所公开的质粒在商业上可得到、在无限制的基础上公众可得到、或可以按照公开的方法由容易得到的质粒构建。
“引物”是用作例如核酸化合物的酶促延伸或合成延伸的起始底物的核酸片段。
术语“启动子”指的是指导例如DNA转录为RNA的核酸序列。诱导型启动子是可以由如碳源、热或金属离子等环境信号调节的启动子。组成型启动子通常在恒定的水平上操作，并且是无法调节的。
如本文所用，“重组DNA克隆载体”指任何自我复制的因子，包括但不限于质粒和噬菌体，其中包括可以或已经引入一个或多个附加DNA区段的DNA分子。
如本文所用，术语“重组DNA表达载体”或“表达载体”指任何重组DNA克隆载体，例如质粒或噬菌体，其中所述克隆载体中存在启动子和其它调节元件，因此使得***的DNA(可能编码一种多肽)能够转录。
术语“选择性结合”指FLINT多肽结合FasL而不结合TNF∝的能力。
用于指肽或蛋白的“大致纯”意味着所述肽或蛋白与其它细胞和非细胞分子(包括其它蛋白分子)分离。大致纯的制备物的纯度将至少为约85％；最好约95％。如本文所述，“大致纯”的蛋白可以通过熟练技术人员所熟知的各种技术制备，包括例如IMAC蛋白纯化方法。
如本文所用，术语“载体”指用于将外源或内源DNA引入宿主细胞的核酸化合物。载体包括可以编码一种或多种蛋白分子的核苷酸序列。通常使用的载体的例子有处于天然状态或经过重组工程化的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。
本文公开和描述的各种限制酶在商业上可以得到，并且本领域内的技术人员熟知使用所述酶的方法，包括反应条件、辅因子和其它对活性的要求。按照厂家的建议实施特定酶的反应条件。Ⅱ．FLINT结合FasL和LIGHT
FLINT是TNFR超家族的新鉴定的成员。该受体家族介导TNF配体的各种生物学效应，包括但不限制于细胞增殖、细胞分化、免疫调节、炎性反应、细胞毒性和编程性细胞死亡。
本发明的FLINT多肽是包括胞外结构域的可溶性受体。FLINT多肽不包括任何跨膜结构域，因此是可溶性的。FLINT也称为OPG3(osteoprotegrin 3)或TNFRsol。据信FLINT与TNFR 6α和TNFR 6β以及TR4密切相关，其中TNFR 6α和TNFR 6β在要求U.S.S.N.60/035,496的优先权的WO98/30694中讨论，TR4在EP 0861850A1中讨论。
下面显示的数据展示mFLINT在体外结合FasL和LIGHT。如已经提到的，FasL参与触发炎性反应和诱导编程性细胞死亡。LIGHT的生物学功能包括但不限于细胞增殖。LIGHT是由激活的T细胞产生的29kDaⅡ型跨膜TNFR超家族成员蛋白。Mauri D.M.,Immunity,8:21(1998)。至于FasL，有证据将LIGHT与中性粒细胞浸润和编程性细胞死亡联系起来。Zhai等人，J.Clin.Investig.102:1142-51,1998。因此，如下文所述，预期mFLINT介导的LIGHT活性抑制在治疗上确实可以用于mFLINT介导的FasL抑制，尤其是在免疫调节和癌症治疗中。Ⅲ．FLINT-治疗应用
本发明人已经发现，mFLINT在体外防止FasL诱导的Jurkat细胞的编程性细胞死亡。抗CD3抗体激活这些细胞，导致它们表达FasL并遭受编程性细胞死亡。mFLINT还以依赖于剂量的方式在体外有效抑制抗CD3诱导的Jurkat细胞的编程性细胞死亡。
由于mFLINT阻止FasL与Fas的相互作用，因此本发明可应用于治疗和/或预防与不合适的或异常的这种相互作用有关的疾病。例如，由于FasL和/或Fas的表达或可得性增加，可能出现这种不合适的相互作用。由于已知FasL-Fas相互作用诱导编程性细胞死亡，因此本发明的方法一般还应用于特征在于不合适的或异常的编程性细胞死亡的疾病。
在另一个实施方案中，本发明涉及预防或治疗由FasL-Fas结合引起或加重的病征，其中包括FasL介导的编程性细胞死亡和/或促炎反应，更具体地说，是由FasL诱导的中性粒细胞激活引起的促炎反应。
例如，可以使用mFLINT治疗Down氏综合征。神经元细胞的编程性细胞死亡增强可能涉及Down氏综合征。在这一方面，Seidi等人，Neuroscience Lett.260:9(1999)报道，在Down氏综合征成人患者的颞叶和小脑内，Fas蛋白的水平升高，这暗示与Fas有关的编程性细胞死亡是Down氏综合征中神经变性的重要特征。因此，预期用mFLINT治疗Down氏综合征患者可能是有效的。尤其是本发明的发明人已经显示mFLINT结合FasL、防止Fas-FasL结合并抑制编程性细胞死亡。相似地，已经将编程性细胞死亡与Alzheimer氏病和其它神经变性疾病联系起来。预期给予mFLINT将降低与Down氏综合征、Alzheimer氏病和其它神经变性疾病有关的编程性细胞死亡增强。
本发明人已经在显示出不同疾病和损伤状态的多种模型***中测试了mFLINT。一些典型的疾病包括但不限于依赖于抗体的细胞毒性、人类免疫缺陷病毒的感染、溶血性尿毒综合征、***反应和支气管肺发育不良。因此，下面部分在对应模型***的范围内讨论疾病和损伤状态。
本发明还包括产生具有FLINT转基因的转基因动物。具体地说，本发明人已经产生了产生可测量水平mFLINT的转基因小鼠。如这些的动物可用于评估mFLINT对下文详述的多种疾病的效应，其中所述疾病如内毒素引起的休克、脑缺血、心脏再灌注损伤以及由癌症治疗(如治疗辐射和化疗)引起的损伤。A．用mFLINT治疗肝损伤和炎症
已经将FasL与急性肝衰竭联系起来，其中所述肝衰竭包括但不限于在肝炎中对肝造成的损伤。在急性肝炎的小鼠模型中，给予小鼠抗FasL抗体在肝细胞中导致编程性细胞死亡诱导的肝衰竭，并且动物在数小时内死亡。Kondo等人，1997 Nature Medicine 3(4)409-413。还可见Galle等人，J.Exp.Med,1995年11月，182:1223-1230。
Tsuji等人(1998)，Infect.Immun.65:1892-1898描述了细菌诱发的暴发性肝炎的模型***。如下文所述，该***是肝和其它组织的多种疾病的预兆。在Tsuji等人的方法中，先给小鼠注射疮疱丙酸杆菌(Propionbacterium acnes)，随后给小鼠注射脂多糖(LPS)。在正常小鼠中，第一次注射导致肝中形成肉芽肿，而第二次注射诱导大量编程性细胞死亡以及随后的肝损伤。Tsuji等人使用该方法将TNFRp55与肉芽肿形成联系起来，将TNFRp55和Fas与编程性细胞死亡联系起来。
本申请人使用Tsuji等人的动物模型的改变形式，已经发现给予mFLINT显著地提高测试动物的存活率。如已经指出的，许多依照本发明可治疗和/或可预防的疾病共同具有FasL-Fas相关的病原学。因此，目标疾病通常或者涉及组织不适当地(如暂时地、定性地或定量地)表达Fas，或者涉及组织在表达Fas时不适当地与FasL接触。许多这些疾病遵循不适当地正调节Fas、随后FasL介导编程性细胞死亡的诱导的一般病理学模式。例如，炎症损伤可以诱导Fas(或FasL)的不适当表达，其中某些与炎症有关的细胞因子有可能诱导表达。
例如，已知一期单核细胞浸润导致多种细胞因子的分泌，而这可以导致不适当的Fas和/或FasL表达。例如，已知IL-1α、IL-1β和TNF-α可以诱导Fas表达。这种增强的Fas表达实际上可以使受影响的组织对带有FasL的效应细胞敏感，其中所述效应细胞如自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞。带有FasL的效应细胞与带有Fas的靶的接触诱导后者的编程性细胞死亡。换句话说，这种肝损伤模型是特征在于(a)炎症损伤和/或(b)FasL-Fas介导的编程性细胞死亡和/或坏死的某些疾病的体内替代。
与该模型一致的是移植物抗宿主疾病(GVHD)的病理学，该疾病在例如自体骨髓移植中非常普遍。破坏宿主细胞(至少部分通过FasL介导的编程性细胞死亡)的宿主反应性T细胞的存在导致GVHD。GVHD通常分为两个期，称为植入(afferent)期和排斥(efferent)期。植入期的特征在于对宿主抗原的识别和供体T细胞的增殖。在传出期内，如皮肤、肝和胃肠道等组织发炎，并且排斥期的特征在于单核细胞浸润和组织病理损伤。事实上，使用FasL缺陷型小鼠的实验显示，FasL在GVHD中肝、皮肤和淋巴器官损伤的发生中起关键作用。因此，GVHD遵循炎症损伤和Fas介导的编程性细胞死亡的变化规律(paradigm)。
桥本甲状腺炎(HT)也遵循这一规律。HT源于对甲状腺滤泡细胞的自体免疫反应。正常的甲状腺细胞产生FasL并表达痕量水平的Fas。然而，在HT中，引起的炎症导致激活的巨噬细胞分泌IL-1β，这随后诱导甲状腺细胞产生Fas。这就建立了导致编程性细胞死亡的致死FasL-Fas自分泌回路。
相似的，与动脉粥样硬化损伤有关的氧化的低密度脂蛋白(OxLDL)促进慢性炎性反应。虽然血管内皮通常表达FasL和Fas两者，但在不受到OxLDL损伤时它并不遭受编程性细胞死亡。然而，在用OxLDL处理时，FasL的表达增加并且内皮细胞遭受编程性细胞死亡。
慢性肾衰竭与IL-1α和TNF-α的分泌有关，而已经显示这二者在肾小管上皮细胞中诱导Fas表达。该疾病的特征在于通过FasL-Fas编程性细胞死亡途径减少肾小管上皮细胞。而且在急性肾衰竭的内毒素休克(脓毒病)模型中，在肾小管细胞中观察到同样的细胞因子介导的Fas表达的诱导。
在侵袭肝的病毒感染、侵袭肝的细菌感染、肝炎、肝细胞损伤和/或其它肝细胞遭受大量编程性细胞死亡的病理情况中，可以发现急性肝衰竭。例如，Galle等人(J.Exp Med.，1995年11月,182:1223-1230)发现FasL-Fas介导的细胞死亡在人类肝衰竭中起作用。Galle等人知道FasL-Fas介导的编程性细胞死亡是去除衰老肝细胞的一种机制。例如，已经在肝再生中、停止用亲脂化合物(如***)治疗后的肝衰退中以及病毒感染中发现了这一机制。通过实验，他们发现在病毒性肝炎中，激活的T细胞攻击肝细胞。Fas在肝细胞中组成型表达。这就是说，在T细胞激活时，FasL在T细胞中表达。据认为T细胞在从肝清除HBV的过程中，有可能杀死表达乙型肝炎(HBV)抗原的肝细胞。
本发明人使用改良的Tsuji模型的成功还指出mFLINT可用于治疗和预防脓毒病。脓毒病的特征在于在血液或组织中存在一种或多种致病生物或它们的毒素。此外，脓毒病的特征在于与多种宿主防御机制激活有关并介导的对感染的***性炎性反应，其中所述宿主防御机制包括细胞因子网络、淋巴细胞以及补体和凝固/纤维蛋白溶解作用***。见Mesters等人，Blood,88:881(1996)。
已知内毒素诱导组织坏死因子(TNF)，而组织坏死因子又诱导炎性反应和FasL，因此促进肝衰竭和死亡。然而，在治疗脓毒病中使用结合TNF-α的抗体的努力都已经一律失败。这可能是由于以下事实：TNF-α除了在脓毒病的病理学中的效应外，还是更完全的正常免疫功能介质。此外，如下文在实施例中所展示的，TNF抑制物在治疗损伤后脓毒病中很少有用；比较起来它们在预防上更有用。
下面实施例中显示的数据证实在动物脓毒病模型中，mFLINT比TNF抑制物在促进存活上更有效。事实上，这些数据显示，TNF抑制物仅在用于预处理方案(即在给予LPS/半乳糖胺前)中有效，但mFLINT可以用于处理后方法。这在临床上是有意义的，因为患者实际上常常在暴露于内毒素后才在外观上表现出来。换句话说，这些数据显示：与TNF抑制物形成显著对比，mFLINT可用于预防方法也可用于改善方法。这些数据最低限度指出，mFLINT可以在疾病进行中比抗TNF迟一些给予；因此预期这可以避免在临床上TNF抑制物所面临的问题。
此外，这些数据显示mFLINT在至少两个水平上具有治疗效果。已知内毒素诱导TNF，而TNF直接诱导炎性反应和FasL。上面Tsuji等人的数据指出这些代表两个不同的途径，而这两个途径都是造成肝衰竭和死亡的原因之一。尤其是，他们使用Fas缺陷型小鼠得到的数据强烈地暗示，在他们的模型中相当大量的损伤是通过不依赖于Fas而依赖于TNF的途径发生的。然而，下面展示的数据显示，依赖于Fas途径的抑制物mFLINT可以抑制所述模型中所有诱导的损伤，不管所述损伤是不是依赖于Fas的。因此，即使它们代表两个不同的途径，mFLINT也可以抑制由炎性反应和FasL诱导所介导的损伤。
此外，设想mFLINT可以与其它在治疗脓毒病中有用的药物有利地联合使用。例如，美国专利第5,009,889号展示了激活的蛋白C(aPC)在治疗狒狒脓毒病模型中有效。可以使用这样一种模型来确定合适的使用例如mFLINT和aPC的联合治疗方法。aPC可以预防与脓毒病有关的弥漫性血管内凝血和在微脉管***中的广泛血纤蛋白沉积，其中后者是脓毒病/脓毒性休克的早期表现。
因此，基于在mFLINT处理的动物中观察到的改善的存活率，本发明人设想可以用mFLINT治疗以下疾病中的一种或多种：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；甲状腺肿；肝细胞损伤(病毒性、细菌性、癌症、创伤)；单核细胞增多症；粘膜炎(mucocites)(粘膜的炎症)；胰炎；牙周病/齿龈炎；肾衰竭；satellite organ failure；***性炎性反应综合征(SIRS)；手术；血管出血(vascular bleed)；血管渗漏综合征(vascular leak sydrome)；全器官移植；多器官功能紊乱(MODS)；冠状动脉旁路移植；同种移植；移植排斥；感染(如微生物感染、肺炎、组织坏死感染、病毒感染)；类风湿性关节炎中的骨损失；桥本甲状腺炎；病毒，包括丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、Ebola(溶血热)病毒和Epstein-Barr(EBV)病毒；皮肤炎症；牛皮癣；炎性肠疾病；溃疡性结肠炎；Crohn氏病；动脉粥样硬化；晚期肾病；以及脓毒病。
更具体地说，本发明设想了治疗与炎症有关的疾病的方法。有经验的技术人员将认识到这些疾病包括但不限于GVHD、桥本甲状腺炎、ARDS、肝细胞损伤(病毒性、细菌性、癌症、创伤)；粘膜炎(粘膜的炎症)；胰炎、牙周病/齿龈炎；肾衰竭；(卫星气管衰竭(satelliteorgan failure)；***性炎性反应综合征(SIRS)；全器官移植；多器官功能紊乱(MODS)；冠状动脉旁路移植；同种移植；移植排斥；感染(如微生物感染、肺炎、组织坏死感染、病毒感染)；类风湿性关节炎；病毒感染，其中包括丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、Ebola(溶血热)病毒和Epstein-Barr(EBV)病毒；皮肤炎症；炎性肠疾病；动脉粥样硬化；以及脓毒病。B．用mFLINT治疗局部缺血和再灌注
局部缺血的特征在于到组织的血流减少，由此导致多种有毒代谢物的积累。这些代谢物是造成源于坏死和/或编程性细胞死亡的细胞死亡的原因之一。可能惊人的是，当再灌注组织时，编程性细胞死亡损伤增加。这可能是通过局部缺血诱导的代谢物与血清成分的反应产生了自由基和其它毒素。在任何情况下，研究显示编程性细胞死亡损伤至少部分源于Fas介导的途径。下面显示的实验展示了mFLINT可用于阻止局部缺血/再灌注损伤(可能是通过抑制FasL)。
下面显示的数据证实了mFLINT组合物在治疗或预防与大脑局部缺血有关的疾病(如中风和头部创伤)中的有用性。显示了使用广泛性中风的活体沙土鼠模型的模型。通过暂时阻塞颈总动脉诱导大脑缺血，然后用mFLINT或载体对照进行治疗。数据显示，用mFLINT处理的沙土鼠比用载体处理的对照组保留了显著更多的活的神经元。
这些数据与其它研究相一致，在这些研究中比较了在缺乏有功能的Fas受体的小鼠中受到大脑局部缺血损伤后梗塞脑组织的程度，发现比正常对照显著小得多的损伤。Rosenbaum等人，Annals ofNeurology,44(3),441,1998。因此，预料mFLINT将在已经遭受大脑局部缺血发作的患者体内干扰Fas受体的正常信号过程，因此保护脑组织不会变坏。
另外，在一个心肌梗死模型中，已经将Fas介导的编程性细胞死亡与局部缺血再灌注损伤联系起来。Kajstura等人，Laboratoryinvestigation 74:86-107(1996)。因此，前述的沙土鼠模型可能是广义的局部缺血再灌注损伤的前兆。为支持这一观点，本发明人使用心肌细胞进行了体外分析。具体地说，将心肌细胞在低氧条件下培养8小时，然后在正常O2下培养16小时，这模拟了在局部缺血的心组织中的低氧环境。实验结果显示，用mFLINT处理心肌细胞保护所述细胞免受低氧诱导的编程性细胞死亡。尤其是使用10μg/ml mFLINT的处理导致抑制90％的低氧诱导的编程性细胞死亡。用mFLINT处理也抑制心肌细胞的FasL诱导的编程性细胞死亡。
根据前述观察和数据，本发明人设想可以用mFLINT治疗下面的一种或多种疾病：中风；脊髓局部缺血；子痫/子痫前期；再灌注损伤；心肌梗塞，心肌梗塞的急性、亚急性和慢性后遗症以及相关的临床综合征，其中包括但不限于充血性心力衰竭。因此，FLINT可用于促进心脏抢救和预防代偿性心脏肥大。
再灌注损伤可以在许多组织中发生，源于多种损伤，其中包括肠损伤、烧伤、心脏旁路机械损伤(cardiac bypass machine injury)、肝损伤(创伤引起的)、溶血热(Ebola)、新生儿毒性(高氧含量的氧过多的恒温箱)、limb crush lung injury/ARDS、器官移植、多处创伤(multipletrauma)(如源于车祸)、血管床的保护、常常出现在脓毒病和其它疾病中的血管性器官衰竭(vascular organ failure)。这些观察还指出，mFLINT可用于预防/减弱急性心肌梗塞后心肌细胞的编程性细胞死亡，并且广泛地用于预防由于低氧对心组织和其它组织造成的损伤。
例如，在器官保存的情况下为采集作准备时，在预防上可用mFLINT预防器官一旦从供体中取出后与对所述器官造成局部缺血再灌注损伤有关的编程性细胞死亡。典型的方法涉及在采集器官前用有效量的mFLINT预处理供体。用另一种方法，可以用含有mFLINT的溶液灌注或浸洗采集的器官，或者可以将两种方法结合起来。例如，这种方法可应用于肾、心脏、肺和其它器官和组织。
在另一个实施例中，mFLINT可用于治疗与血栓形成或血凝性过高有关的局部缺血再灌注损伤。因此，可以将mFLINT与溶栓剂(如尿激酶和链激酶)和/或抗凝剂(如激活的蛋白C(aPC))一起给予。美国专利第5,350,578号描述了aPC的抗凝活性。该文公布的狒狒动物模型可用于确定所设想的联合治疗的有益给药方案。在这一方面，预期可以用添加或不添加aPC的mFLINT治疗下述疾病：子痫和子痫前期，其特征在于凝血病增加的状态；HELLP(血小板减少并发子痫前期、溶血和肝功能异常)；HITS(肝素诱导的血小板减少)；弥漫性血管内凝血(DIC)；烧伤；以及源于手术的血管栓塞并发症。
如上文所提到的，研究显示在再灌注时引起了大量编程性细胞死亡损伤。这种损伤看起来至少部分源于氧化损伤，因为抗氧化剂可以减少所述损伤。同样，已经发现抗氧化剂维生素E可以用作肉类防腐剂，可能其作用是预防导致酸败的同样类型的损伤。已经显示在屠宰前几天给予猪维生素E增加猪肉的储藏期限。因此，设想mFLINT可以相似地用于保存组织和器官。这对于增加人类消费的器官和肉类的储藏期限特别有用。C．用mFLINT治疗造血疾病
如本申请所讨论，mFLINT抑制Fas/FasL相互作用，从而预防编程性细胞死亡。如下面所讨论的，已经将Fas/FasL相互作用与血细胞形成的过程联系起来。因此，本申请设想了改善从多种治疗和疾病的血液恢复的基于mFLINT的治疗方法，其中所述治疗和疾病包括骨髓移植、化疗、放射疗法、再生障碍性贫血以及脊髓发育不良综合征、各类血细胞减少的病征。本发明还覆盖对任何需要骨髓细胞谱系的扩增的病征的基于mFLINT的治疗，其中所述治疗单独进行或与其它血液生长因子组合进行。这样的生长因子包括但不限制于***(EPO)、FLT-3配体、血小板生成素(TPO)、干细胞生长因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
自体和异体骨髓移植常常用来治疗许多肿瘤疾病。在自体骨髓移植中，从待治疗的患者体内取出骨髓细胞并在体外培养。在化疗和/或放射治疗后，将所述细胞再引入所述患者。在异体骨髓移植中，由第二个个体提供骨髓细胞。用于治疗这些疾病的化疗或放射治疗由于对骨髓腔和肠上皮造成伤害，引起显著的骨髓抑制，使患者遭受免疫抑制并对微生物的侵袭易感。已经显示用造血细胞因子处理移植的骨髓细胞，导致血液中骨髓谱系和红细胞谱系恢复的改善，虽然通常存在与使用这些细胞因子有关的毒性，并且一种细胞因子通常不能增强所有谱系的恢复。Moore,M.A.S.Blood 78:1(1991)；Metcalf,D.Science 254:529(1991)。
已经显示辐射或化疗诱导骨髓细胞和肠上皮细胞的编程性细胞死亡。已知Fas/FasL途径在易感细胞中诱导编程性细胞死亡。最近的报道描述了Fas/FasL涉及造血作用。综述可见Niho等人；CurrentOpinion in Hematology,5:163(1998)。Fas在CD34+祖细胞上表达，并且这些细胞对Fas刺激的编程性细胞死亡效应敏感。Nagafuji等人，Blood,86:883-889(1995),Sato等人，Br J Haematol,97:356(1997)。Yamane等人，Eur J Haematol,58:289(1997)。此外，已经显示用细胞因子体外扩增造血祖细胞正调节有功能的Fas的表达，并且目前认为Fas可能在造血的体内稳态中作为负调节物在体内起作用。Takenaka等人，Blood,88:2871(1996),Stahnke等人，Exp.Hematol.26:844(1998)。1．mFLINT与辐射和化疗
本发明人已经显示mFLINT改善曾经暴露于辐射中的骨髓祖细胞的恢复。具体地说，用辐射照射小鼠，然后取出骨髓细胞并用细胞因子IL-6和CSF在体外培养。在培养基中加入mFLINT显著改善骨髓祖细胞(即红细胞系细胞的祖先)、粒细胞-巨噬细胞和红细胞系单核细胞巨核细胞(erythroid monocyte megakaryocyte)的恢复。本发明人也已经显示mFLINT提高从5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的小鼠收获的骨髓细胞的存活率。抗FasL抗体也增加取自5-FU处理的小鼠的细胞的存活率。
因此，本发明包括使用mFLINT作为辐射保护剂和/或化学保护剂。mFLINT可用于在自体或异体移植之前增强骨髓祖细胞的体外扩增和成熟。在用辐射或化疗治疗患者后，也可以用mFLINT促进祖细胞的扩增和成熟。在这一方面，预期当用癌症疗法(化疗或放射治疗)治疗患者后，给予所述患者mFLINT将促进祖细胞的扩增和成熟。在用癌症疗法和骨髓抑制剂(在癌症治疗中阻止祖细胞的循环)治疗的患者中，预期mFLINT将促进祖细胞的扩增和成熟。
如上文所提到的，在接受癌症治疗的患者中，细胞因子用于在体外和体内增强红细胞系和骨髓细胞谱系的扩增。本发明的发明人已经显示mFLINT改善用细胞因子处理的细胞的扩增。因此，本发明设想与一种或多种细胞因子联合使用mFLINT，在体外和体内扩增骨髓祖细胞。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)用于改善由化疗或放射治疗所引起的骨髓抑制的恢复。因此，本发明设想使用mFLINT和GM-CSF的组合去改善从骨髓抑制的恢复。
本发明人还已经显示抗FasL抗体也改善从5-FU处理的骨髓细胞的恢复。因此，本发明设想使用抗FasL在化疗或放射治疗之后改善骨髓细胞的恢复。这样一种抗体可用于为异体或自体移植在体外扩增骨髓细胞。也可以体内给予抗FasL抗体以改善化疗、放射治疗和/或给予骨髓抑制剂引起的骨髓抑制的恢复。
当用mFLINT治疗患者时，***地给予将是合适的。如在本申请中使用，与化疗或辐射“一起”给予mFLINT包括所有以下给予mFLINT的模式：(1)用mFLINT预处理，然后进行放射治疗或化疗；(2)同时给予mFLINT和化疗或放射治疗；(3)首先化疗或放射治疗，然后给予mFLINT；(4)用mFLINT预处理，接着进行放射治疗或化疗，随后给予mFLINT。本发明包括在一种或多种前述的治疗模式中使用mFLINT。2．治疗外周血细胞减少症
本发明还设想治疗与造血疾病(如再生障碍性贫血和脊髓发育不良综合征)有关的外周血细胞减少。已经显示Fas/FasL介导的编程性细胞死亡抑制淋巴细胞生成。Yasutomo等人，J.Immunol.157:1981(1996)。已经在来自患有再生障碍性贫血的患者的祖细胞中观察到增强的Fas表达。Young,N.S.,Eur.，Hematol.60(增刊):55(1996)。在来自患有脊髓发育不良综合征的患者的祖细胞中也观察到了增强的Fas表达。
另外，Maria等人报道，Fas在早期成红血细胞中迅速地受到正调节并在整个终末成熟期间以高水平表达。Blood 93:796(1999)。Maria等人还报道，未成熟的血细胞是依赖于EPO的，并且表达有功能的Fas分子。在产生FasL的成熟成红血细胞的存在下，未成熟的细胞除非暴露于高水平的EPO中，否则遭受编程性细胞死亡。Maria等人提出Fas/FasL***与EPO一起促成红细胞生成的体内稳态。
虽然不希望受限于任何具体的理论，但造血作用的减少和因此而发生的血细胞减少可能是编程性细胞死亡的直接结果，而编程性细胞死亡可能是通过Fas和Fas配体的正调节而介导的。如在本申请中别处所述，mFLINT抑制Fas/FasL结合，抑制编程性细胞死亡，并且mFLINT还增强造血祖细胞的生长和成熟。因此，预期使用mFLINT将抑制造血疾病所引起的编程性细胞死亡，因此减轻与这些疾病有关的一种或多种症状。此外，由于未成熟的造血细胞对FasL诱导的编程性细胞死亡易感，并且个体缺乏分化的造血细胞，因此预期给予这样的个体mFLINT将通过抑制FasL诱导的未成熟造血细胞编程性细胞死亡而改善这些成熟缺陷。
可以通过直接给予受影响的个体mFLINT、或通过用mFLINT体外处理骨髓细胞，然后将其移植进患病个体，进行对所述患有造血疾病的个体的治疗。
通过给予EPO和其它促进造血祖细胞生长和/或成熟的化合物，可以增强使用mFLINT的治疗。已知细胞因子刺激造血祖细胞的生长。因此，本发明还包括在患有如血小板减少和脊髓发育不良综合征等疾病的个体中，使用mFLINT与一种或多种细胞因子的组合来促进这样的祖细胞的生长和分化。3．基因治疗
也可以将mFLINT与基因治疗联用。当要将造血祖细胞移植进个体中时，用合适的转基因转染所述造血祖细胞，并且还用mFLINT处理，可选地与一种或多种细胞因子联用。在培养所述细胞后，将它们移植进个体。这样的基因治疗可用于将所需的性质赋予所述血细胞。D．用mFLINT保护无辜受殃组织
众所周知许多损伤细胞的治疗方法，如用于治疗癌症的化疗和治疗辐射导致所谓“无辜受殃”组织的损伤和编程性细胞死亡。如本申请中所用，“无辜受殃”组织是药物治疗、放射治疗或仪器辅助治疗损伤的无病组织。这些组织包括但不限于胃上皮(包括衬于口腔、食管、胃和肠道的上皮)、肺上皮、血细胞(淋巴细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、骨髓细胞、造血祖细胞、中性粒细胞、嗜酸细胞、肥大细胞、血小板)、肾上皮和毛囊。许多这些组织的特征在于它们的组成细胞的快速生长和/或更新。
“损伤细胞的”治疗包括但不限于化疗(如顺式铂氨、阿霉素、丝裂霉素C、喜树碱和氟尿嘧啶以及其它核苷类似物)、治疗辐射、激光治疗以及给予吸入的毒素(如博来霉素)。与仪器辅助的治疗有关的物理操作，如从冠状动脉中物理去除阻塞，也可能对无辜受殃组织造成损伤。如上文所提到的，虽然这些损伤细胞的治疗由于损伤和杀死患病组织而是有用的，但它们具有不希望的损伤“无辜受殃”组织和诱导“无辜受殃”组织的编程性细胞死亡的副作用。
如本申请别处所讨论的，mFLINT阻断Fas/FasL相互作用。本文也已经展示mFLINT在体外抑制FasL诱导的编程性细胞死亡，并且mFLINT在治疗辐射和化疗后提高骨髓细胞的存活率。因此，本发明的目的之一是减轻由损伤细胞的治疗对无辜受殃组织造成的损伤。
已经显示癌症治疗如辐射和化疗在肠上皮细胞中诱导编程性细胞死亡。已知许多化疗剂通过诱导编程性细胞死亡起作用。见如Micheau等人，J.Natl.Can.Inst.89:783(1997)。这种编程性细胞死亡与辐射和化疗引起的骨髓抑制一起使得有可能发生大量的机会感染。目前还没有有效地处理与化疗和治疗辐射有关的肠功能破坏的疗法。如上文所提到的，已经显示用细胞因子的治疗改善从骨髓抑制的恢复，但细胞因子可能产生不希望的毒性。
因此，预期mFLINT将减轻辐射和/或化疗引起的对肠上皮的损伤。虽然不希望受限于任何具体的理论，但预期mFLINT将通过抑制肠上皮的编程性细胞死亡和/或肠上皮的炎症来减轻这种损伤。
已经将Fas/FasL相互作用与慢性胃炎联系起来。已经显示在来自患有慢性胃炎的个体的胃上皮细胞中，Fas和FasL的表达增加。见Rudi等人，J.Clin.Invest.102:1506(1998)。Rudi还报道螺杆菌(Helicobacter)感染的胃上皮细胞具有提高的FasL(CD95配体)和Fas(CD95受体)水平，并且用抗APO-1抗体封闭FasL减少了螺杆菌诱导的编程性细胞死亡。因此，预期mFLINT可以有效地抑制(ⅰ)由螺杆菌诱导的胃炎，以及上文所提到的(ⅱ)损伤细胞的治疗，如化疗和辐射。
此外，接受高剂量化疗(HD-CT)的患者有患严重的粘膜炎的危险，其中粘膜炎的特征在于胃上皮的编程性细胞死亡和炎症。Wymenga等人，Br.J.Cancer 76:1062(1997)研究了用HD-CT治疗的乳癌患者的口腔中的粘膜炎。在用HD-CT治疗的患者中，在口腔洗液中出现的活上皮细胞的百分率增加，暗示口腔粘膜表层的脱落。同时，在HD-CT患者的口腔粘膜中有较高百分率的未成熟细胞。
其它无辜受殃组织也可以从mFLINT治疗中受益。例如，已经将Fas/FasL诱导的编程性细胞死亡与博来霉素在肺上皮中诱导的编程性细胞死亡和纤维变性联系起来。Hagimoto等人，Am.J.Repir.Cell.Mol.Biol.16:91(1997)。该研究显示在用博来霉素处理的肺泡上皮细胞中，Fas mRNA受到正调节，并且FasL mRNA在浸润的淋巴细胞中受到正调节。因此，本发明人预期，mFLINT可以减轻由损伤细胞的治疗在肺组织(如上皮)中引起的损伤。E．用mFLINT治疗癌症
本发明的发明人已经发现，给予小鼠mFLINT减少了在给小鼠注射黑素瘤细胞时产生的肿瘤的体积。mFLINT可能是通过mFLINT/FasL结合和随后的对FasL介导的T细胞编程性细胞死亡的抑制，使T细胞介导的免疫反应有可能发生以便利对肿瘤的破坏，从而介导这种效应。在这样方面，已知FasL在黑素瘤、人结肠直肠癌、肝细胞癌、星形细胞癌和肺癌中表达。O’Connell等人，ImmunologyToday插页*，Chappell等人，Cancer Immunol.Immunother.47:65(1998)。也已经报道结肠癌细胞系表达FasL并可以在体外通过诱导FasL介导的编程性细胞死亡而杀死T细胞。O’Connell。因此，本申请中观察到的黑素瘤可能表达FasL，触发表达Fas的浸润T细胞的FasL介导的死亡。然而，其它机制也可能是在本申请中展示的肿瘤减小的原因。
基于本发明的发明人用mFLINT介导的肿瘤体积减小获得的成功，预期可以用mFLINT成功地治疗其它类型的癌症。这些癌症包括但不限于星形细胞癌、结肠癌、食管癌、肺癌、黑素癌和肝细胞癌。其它可以用mFLINT治疗的癌症包括膀胱癌和卵巢癌。F．用mFLINT治疗自身免疫病
Ⅰ型糖尿病(依赖于胰岛素)和Ⅱ型糖尿病(不依赖于胰岛素)的特征都在于高血糖。如本文所用，本领域内熟知的术语“高血糖”描述了特征在于血糖浓度高于正常人体内发现的血糖浓度的病征。正常人的禁食血糖水平低于110mg/ml。The Expert Committee on theDiagnosis and Classification of Diabetes Mellitus,Diabetes Care,21(增刊1)，S5-S19(1992)。
Ⅰ型依赖于胰岛素的糖尿病(IDDM)是涉及通过FasL-Fas途径破坏胰(产生胰岛素的)β细胞的慢性自身免疫病。可能炎症过程激活了这个破坏途径。正常β细胞不表达Fas，但在胰岛炎期间Fas在这些细胞中表达。因此与淋巴细胞有关的FasL有可能是通过FasL-Fas相互作用造成这些Fas+细胞局部破坏的原因之一。在某种程度上mFLINT可用于拮抗这个途径，它可用于预防或治疗IDDM。
多发性硬化(MS)是一种退行性炎症脱髓鞘病。在急性和慢性MS中，都已经在位于病灶边缘和临近的白色物质中的少突神经胶质细胞中发现了Fas，而正常的组织中几乎没有或没有Fas。有可能炎症过程中释放的细胞因子诱导这种Fas的异常表达。此外，已经将表达FasL的细胞与表达Fas的编程性细胞死亡的少突神经胶质细胞一起定位，暗示该途径涉及这种疾病的病理学。也可以用mFLINT治疗另一种自身免疫病狼疮。G．用mFLINT治疗骨质蔬松症
下面实施例中显示的数据表明，mFLINT可用于预防或治疗骨损失的疾病，如骨质疏松症。mFLINT也可用于抑制骨吸收。这些数据与显示最近报道在调节骨吸收中起作用的TNFR超家族天然出现的分泌成员的数据一致。Simonet等人，Cell 89:309(1997)(名为osteoprotegrin(OPG)；Tsuda等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.234:137(1997)(名为破骨细胞生成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF))，所述成员主要作为吸收骨的破骨细胞的分化的抑制物起作用。与此一致的是，研究已经将Fas与破骨细胞的编程性细胞死亡直接联系起来。Jilka等人，J.Bone & Mineral Res.13:793-802；Kawakami等人，1997,J.Bone & Mineral Res.12:1637-46。Ⅳ．mFLINT的治疗制剂
以与医疗质量管理规范(good medical practice)一致的方式配制和给予mFLINT多肽组合物，其中考虑各个患者的临床情况(特别是单独使用mFLINT多肽治疗的副作用)、mFLINT多肽组合物的传送位点、给药方法、给药计划以及其它医师知道的因素。
有效量的多肽导致在统计学上显著调节所选定的TNFR家族配体(如FasL或LIGHT)的生物活性。FasL的生物活性包括但不限于编程性细胞死亡。LIGHT的生物活性包括但不限于细胞增殖。LIGHT是由激活的T细胞产生的29kDa的Ⅱ型跨膜TNF超家族成员蛋白。Mauri d.M.,Immunity,8:21-30,1998年1月。
此外，可以根据对要治疗的疾病、损伤或紊乱的不利病征或症状的预防或减轻而确定有效剂量。因此根据这样的考虑确定本文为此目的的“治疗有效量”的mFLINT。应该注意到mFLINT是一种免疫调节物，并且对这样的物质的一般观察是钟形的剂量反应曲线。这样一种现象在本领域内是众所周知的，并且一般的临床医生因此在调节治疗有效量的mFLINT时会将这一点考虑在内。
作为一般的比例，肠胃外给予的每剂量总的治疗有效量mFLINT将处于根据患者体重的约1μg/kg/天到10mg/kg/天的范围内，尤其是2-8mg/kg，优选2-4mg/kg，更优选2.2mg/kg到3.3mg/kg，最好是2.5mg/kg。然而，如上文所指出的，这将由治疗判断决定。该剂量最好是至少0.01mg/kg天。
假如连续给予mFLINT，通常将mFLINT多肽以约0.1μg/kg/小时到约50μg/kg/小时的剂量率给予，所述给予或者通过每日注射1-4次，或者通过，例如，使用微型泵连续皮下输注。也可以使用静脉内袋装溶液(intravenous bag solution)。观察到变化所需的治疗时间长度以及治疗后发生反应所需的间隔看起来依据所需效应而不同。
可以使用多种方法给予本发明的含有mFLINT的药用组合物，其中所述方法包括但不限于口服给予、直肠给予、颅内给予、肠胃外给予、脑池内给予、***内给予、腹膜内给予、体表给予、经皮给予(如通过粉剂、软膏剂、滴剂或经皮贴剂、经颊给予或作为口腔喷雾剂或鼻喷雾剂给予。“药学上可接受的载体”是指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释剂、成胶囊材料或任何形式的配制辅助剂。如本文所用，术语“肠胃外的”是指包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下以及关节内注射和输注的给药模式。也可以使用含有mFLINT的植入物。
也可以通过持续释放***合适地给予mFLINT多肽。持续释放的组合物的合适例子包括成形制品(如膜或微胶囊)形式的半透性聚合物基质。持续释放的基质包括聚交酯(美国专利第3,773,919号、EP58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman,U.等人，Biopolymers 22:547-556(1983))、聚异丁烯酸2-羟乙酯(R.Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)，以及R.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(R.Langer等人，同前)或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放的mFLINT多肽组合物也包括脂质体包裹的mFLINT多肽。通过本身已知的方法制备含有mFLINT多肽的脂质体：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EDP143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。一般来说，所述脂质体是小的(约200-800埃)单层类型，其中脂质含量是大于约30％(摩尔)的胆固醇，根据最适的TNFR多肽疗法调节选定的比例。
在一个实施方案中，为肠胃外给予，通常将mFLINT多肽以所需要的纯度并以可注射单位剂型(溶液、悬浮液或乳浊液)与药学上可接受的载体混合，其中所述药学上可接受的载体是在所使用的剂量和浓度下对受体无毒并且与制剂中的其它成分相容的载体。例如，所述制剂最好不包括氧化剂以及其它已知对多肽有害的化合物。
通常通过使mFLINT多肽与液体载体或细碎的固体载体或者这二者均匀并且密切地接触，制备所述制剂。然后，如果需要，将所述产品定型成所需的制剂。所述载体最好是肠胃外载体，更优选是与受体的血液等渗的溶液。这样的载体的例子包括水、盐水、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。本文中也可以使用非水性的载体，如固定油和油酸乙酯以及脂质体。
所述载体可以包含少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这样的材料在所使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲液(如磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、乙酸缓冲液以及其它有机酸或它们的盐的缓冲液)；抗氧化剂(如抗坏血酸)；低分子量(少于约10个残基)多肽(如多聚精氨酸或三肽)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸)；单糖、二糖以及其它糖(包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(如EDTA)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；平衡离子(如钠离子)；和/或非离子表面活性剂(如聚山梨酯、聚羟亚烃(poloxamers)或PEG)。
通常在这样的载体中，以约3到8的pH，在约0.1mg/ml到100mg/ml、最好是1-10mg/ml的浓度下配制mFLINT多肽。可以理解使用某些前述的赋形剂、载体或稳定剂将导致mFLINT多肽盐的形成。
用于治疗用给予的FLINT多肽必须是无菌的。通过用除菌滤膜(如0.2微米的膜)过滤，可以容易地达到无菌。通常将治疗用mFLINT多肽组合物置于带有无菌进入口的容器中，所述容器如静脉溶液袋(intravenous solution bag)或具有可被皮下注射针头穿透的塞子的管形瓶。
通常将FLINT多肽作为水溶液或需要复原的冻干制剂储存在单位或多剂量容器，如密封的安瓿或管形瓶。作为冻干制剂的一个例子，在10ml管形瓶内注入5ml无菌过滤的1％(w/v)mFLINT多肽水溶液，并将得到的混合物冻干。使用抑菌的注射用水复原冻干的mFLINT多肽，制备输注用溶液。
本发明还提供了包括一个或多个容器的药包或药盒，其中所述容器盛有本发明的药用组合物的一种或多种成分。与这样的容器在一起的是采用由管制药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定形式的注意事项，该注意事项反映了该机构同意为给予人体的生产、使用或销售。此外，可以与其它治疗化合物一起使用本发明的多肽。Ⅴ．多肽生产方法
本发明的一个实施方案涉及基本纯化的由mFLINT基因编码的蛋白或基本纯化mFLINT基因。
熟练的技术人员将认识到本发明的多肽可以用多种不同的方法合成，如本领域内众所周知的化学方法，其中包括固相肽合成或重组方法。美国专利4,617,149描述了这两种方法。
固相化学合成多肽的原理是本领域内众所周知的，可以在本领域内的一般教科书中找到。例如，见H.Dugas和C.Penney,BIOORGANIC CHEMISTRY(1981)Springer-Verlag,New York,54-92。例如，可以利用由Applied Biosystem提供的Applied Biosystems430A肽合成仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)和合成循环，通过固相方法合成多肽。
也可以用克隆的FLINT基因通过重组DNA方法产生本发明的多肽。如果需要高产量，那么优选重组方法。可以在多种本领域内技术人员熟知的合适宿主细胞中进行克隆基因的表达。为此目的，可以通过本领域内技术人员熟知的任何合适方法将FLINT基因引入宿主细胞。虽然本发明的范围包括克隆基因的染色体整合，但优选将所述基因克隆进合适的染色体外保持的表达载体，以便所述FLINT基因的编码区操作性地连接组成型启动子或诱导型启动子。
重组产生FLINT多肽的基本步骤是：
a)构建天然、合成或半合成的编码FLINT多肽的DNA；
b)以适于表达所述FLINT多肽的方法，将所述DNA或者单独、或者作为融合多肽整合进表达载体；
c)将所述载体通过转化或其它方法引入合适的真核或原核宿主细胞，形成重组宿主细胞；
d)以表达所述FLINT多肽的方式培养所述重组宿主细胞；然后
e)通过本领域内技术人员熟知的任何合适方法回收和基本纯化所述FLINT多肽。1．在原核和真核宿主细胞中表达重组FLINT多肽
在重组FLINT多肽的生产中可以使用原核细胞。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株294(ATCC第31446号)对于外源多肽的原核表达特别有用。在克隆和表达本发明的重组多肽中也可以用作宿主细胞的有：大肠杆菌的其它菌株、杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、肠杆菌科如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tryphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、各种假单胞菌属(Pseudomonas)的物种以及其它细菌，如链霉菌属(Streptomyces)。
适于在原核细胞中驱动基因表达的启动子序列包括β-内酰胺酶[如载体pGX2907,ATCC 39344，包含一个复制子和β-内酰胺酶基因]、乳糖***[Chang等人，Nature_(London),275:615(1978)；Goeddel等人，Nature(London),281:544(1979)]、碱性磷酸酶以及色氨酸(trp)启动子***[载体pATHl(ATCC 37695)]，其中所述色氨酸启动子***设计用于促进在trp启动子控制下表达作为trpE融合多肽的可读框。杂种启动子如tac启动子(可由质粒pDR540,ATCC-37282分离)也是合适的。可以将核苷酸序列已经众所周知的其它细菌启动子连接到编码本发明的多肽的DNA，其中使用接头或连接物以提供任何所需要的限制位点。在细菌***中使用的启动子也将包含操作性地连接编码所需多肽的DNA的Shine-Dalgarno序列。这些例子是说明性的，而不是限制性的。
可以通过直接表达或作为融合多肽合成本发明的多肽，其中所述融合多肽包含与另一个可以通过酶促切割或化学切割除去的多肽或肽翻译性融合体的目的多肽。在重组***中生产某些多肽常常观察到融合多肽的表达使所需肽的寿命延长、产量增加或是提供了纯化所述多肽的方便方法。当在原核宿主中表达哺乳动物多肽时，这一点特别相关。已知多种在特定位点切割多肽(如肠激酶和凝血酶)或从肽链的氨基末端或羧基末端消化所述多肽(如二氨肽酶)的肽酶。此外，特定的化学药品(如溴化氰)将在特定位点切割多肽链。熟练的技术人员将知道引入位点特异性内部切割位点所需的对氨基酸序列(如果使用重组方法，则是合成或半合成的编码序列)的修饰。例如，见P.Carter，“融合多肽的位点特异性蛋白水解”，第13章，PROTEINPURFICATION:FROM MOLECULAR MECHANISMS TO LARGESCALE PROCESSES,American Chemical Society,Washington,D.C.(1990)。
除原核细胞外，可以使用多种两栖动物表达***(如蛙***)和哺乳动物细胞***。具体宿主细胞的选择在某种程度上取决于所使用的具体表达载体。适于在本发明中使用的哺乳动物宿主细胞的例子包括，例如，HepG-2(ATCC HB 8065)、CV-1(ATCC CCL 70)、LC-MK2(ATCC CCL 7.1)、3T3(ATCC CCL 92)、CHO-K1(ATCC CCL61)、HeLa(ATCC CCL 2)、RPMl8226(ATCC CCL 155)、H4IIEC3(ATCC CCL 1600)、C127I(ATCC CCL 1616)、HS-Sultan(ATCC CCL1484)、以及BHK-21(ATCC CCL 10)。
广泛多种载体适于转化哺乳动物宿主细胞。例如，pSV2型载体包含猴病毒40(SV40)基因组中转录和聚腺苷酸化所需的区段。已经构建了许多SV40启动子驱动***基因转录的pSV2型载体，如pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、pSV2-hyg和pSV2-β-球蛋白。这些载体可以从广泛的来源得到，如美国典型培养物保藏中心(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852或国立农业应用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research),1815North University Street,Peoria,Illinois 61604-39999。
适于在哺乳动物细胞中表达的启动子包括SV40晚期启动子、来自真核基因的启动子、胸苷激酶基因启动子以及主要早期和晚期腺病毒基因的启动子，其中所述真核基因如***诱导的鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、糖皮质激素诱导的酪氨酸氨基转移酶基因。
质粒pRSVcat(ATCC 37152)包含已知感染鸡细胞和其它宿主细胞的劳斯肉瘤病毒的长末端重复部分。该长末端重复包含适于在本发明的载体中使用的启动子。H.Gorman等人，Proc Nat.Acad.Sci.(USA),79,6777(1982)。质粒pMSVi(NRRL B-15929)包含已知感染小鼠细胞和其它宿主细胞的鼠类肉瘤病毒的长末端重复部分。已经很好地确定小鼠金属硫蛋白的启动子可用于真核宿主细胞中并且适于在本发明中使用。该启动子存在于质粒pdBPV-MMTneo(ATCC 37224)中，该质粒可以用作构建本发明的其它质粒的起始材料。
可以通过许多众所周知的方法用载体转染哺乳动物细胞，所述方法包括但不限于原生质体融合、磷酸钙共沉淀、电穿孔等等。见，如Maniatis等人，同上。
一些病毒也构成合适的载体。例子包括腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、杆状病毒和劳斯肉瘤病毒，如美国专利4,775,624中所述，特此通过引用结合到本文中。例如，杆状病毒pFastBac-1(GIBCO/BRL)可用于感染合适的宿主细胞(如SF9)以产生重组蛋白。
诸如酵母和其它真菌的真核微生物也是合适的宿主细胞。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)是优选的真核微生物。其它酵母，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)也是合适的。为在酵母属中表达，可以使用例如质粒YRp7(ATCC-40053)。见，如L.Stinchcomb等人，Nature,282,39(1979)；J.Kingsman等人，Gene,7,141(1979)；S.Tschemper等人，Gene,10,157(1980)。质粒YRp7包含TRP1基因，该基因为在trp1营养缺陷型突变体中使用提供了选择标记。
纯化重组产生的FLINT多肽
使用标准方法将带有克隆的FLINT基因的表达载体转化或转染进合适的宿主细胞。在适于表达所述重组FLINT多肽的条件下繁殖包含所述载体的细胞。例如，假如将所述重组基因置于诱导型启动子的控制之下，则合适的生长条件将包括合适的诱导物。通过任何合适的方法，可以由转化细胞的细胞提取物纯化重组产生的多肽。
在多肽纯化的优选方法中，在5′端修饰FLINT基因以在FLINT多肽的氨基末端引入几个组氨酸残基。该“组氨酸标志”使得能够基本按照美国专利4,569,794所述的方法，进行称为“固定化金属离子亲和层析”(IMAC)的单步多肽纯化方法，该专利特此通过引用结合到本文中。IMAC方法使得能够从如上所述表达修饰的重组多肽的细胞的粗提取物开始，快速分离大致纯的重组FLINT多肽。
本发明的其它实施方案包括分离编码图1、2、3、4的核酸。可以通过化学合成方法产生这些核酸中的任何一种。核酸的合成是本领域内众所周知的。见，如，E.L.Brown,R.Belagaje,M.J.Ryan和H.G.Khorana,Methods in Enzymology,68:109-151(1979)。可以使用常规DNA合成仪器，如Applied Biosystems Inc.(850 Lincoln CenterDrive,Foster City,CA 94404)的380A型或380B型DNA合成仪，用亚磷酰胺化学产生对应于FLINT基因或mFLINT基因的DNA序列的片段，随后连接所述片段以重新构建完整的基因。可替代地，可以使用磷酯三酯化学合成本发明中使用的核酸。见，如，Gait,M.J.编辑，OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS,A PRACTICALAPPROACH(1984)。
在一个可替代的方法，即PCR中，可以从许多起始材料产生包含例如图1的本文所公开和描述的DNA序列。例如，从表达FLINT基因的组织得到的cDNA制备物(如cDNA文库)开始，如美国专利第4,889,818所述制备与图1或其中任何亚区互补的合适的寡核苷酸引物。PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHOD ANDAPPLICATIONS,Michael A Innis等人编辑，Academic Press,Inc(1990)中公开了PCR的其它合适方法。
可以通过上面讨论的多核苷酸合成方法制备本发明的核糖核酸，或者可以通过例如使用RNA聚合酶转录FLINT DNA模板而酶促制备本发明的核糖核酸。制备本发明的核糖核酸的最优选***使用来自噬菌体T7或噬菌体SP6的RNA聚合酶。这些RNA聚合酶具有高度特异性，要求在要转录的模板的5′端***噬菌体特异性序列。见Maniatis等人，同上。本发明还提供与图1-4互补的核酸，即RNA或DNA。2．载体
本发明的另一方面涉及包含本发明的核酸的重组DNA克隆载体和表达载体。
熟练的技术人员知道最合适的克隆载体或表达载体的选择取决于多种因素，其中包括限制酶切位点的可得性、载体要转染或转化的宿主细胞类型、转染或转化的目的(如作为染色体外元件稳定转化，或整合进载体染色体中)、是否存在容易分析或选择的标记(如抗生素抗性以及一种类型和其它类型的代谢标记)以及在宿主细胞中所需要的基因拷贝数。
适于携带本发明核酸的载体包括RNA病毒、DNA病毒、烈性噬菌体、溶原性噬菌体、稳定噬菌体、质粒、类病毒等等。最优选的载体是质粒。
在制备表达载体时，熟练的技术人员知道需要考虑许多变量，如使用组成型还是诱导型的启动子。专业人员也知道要产生的核酸或多肽的量部分决定了表达***的选择。关于启动子序列，诱导型启动子是优选的，因为它们能够产生与其操作性地连接的基因的高水平的可调节表达。熟练的技术人员会知道响应多种诱导物(如碳源、金属离子和热)的多种合适的启动子。其它关于表达载体的相关考虑包括是否包括指导重组多肽定位的序列。例如，编码位于基因编码区之前的信号肽的序列可用于指导所得到的多肽的胞外输出。
本发明还提供了构建能够表达包含图1-4的多肽的重组宿主细胞的方法。该方法包括将重组DNA载体通过转化或其它方法引入宿主细胞中，其中所述重组DNA载体包含图1到4中任何一幅所描述的分离DNA序列。
优选的宿主细胞是能容纳外源引入的基因或多肽的高水平表达、并将所述多肽掺入其膜结构中的任何真核细胞。用于表达的载体是那些包含图1到4的序列中任一序列的载体。在熟练技术人员所熟悉的条件下培养转化细胞以表达FLINT或mFLINT，由此在所述重组宿主细胞中产生重组FLINT或mFLINT多肽。
下面的实施例将更全面地描述本发明。本领域内的技术人员会知道所述的具体试剂、设备和方法仅仅是说明性的而不是为了以任何方式限制本发明。
           实施例1
从mRNA RT-PCR扩增FLINT基因
使用常规方法通过逆转录酶PCR(RT-PCR)分离FLINT基因。使用标准方法由表达所述FLINT基因的组织(如肺)制备总RNA。使用商业上可得到的试剂盒(SuperScriptTM***；Life Technologies)通过PCR与导向图1-4的任何合适区的特异性引物完成第一链FLINTcDNA的合成。
在第一链cDNA(在真空下干燥)中加入以下试剂，进行扩增：8μl的10X合成缓冲液(200mM Tris-HCl,pH8.4；500mM KCl,25mMMgCl2,1ug/ul BSA)；68μl蒸馏水；每种引物10uM的溶液各1μl；以及1μl Taq DNA聚合酶(2到5U/μl)。反应物在94℃加热5分钟以使RNA/cDNA杂交物变性。然后使用任何合适的热循环仪进行15到30个循环的PCR扩增。可以通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的样品以检查合适大小的片段。
              实施例2
产生在宿主细胞中表达FLINT的载体
容易制得在多种原核宿主细胞，如大肠杆菌中适于表达FLINT或其片段的表达载体。所述载体包含复制原点(Ori)、氨苄青霉素抗性基因(Amp)以及操作性地连接FLINT编码区的T7启动子和T7终止子序列，其中所述氨苄青霉素抗性基因用于在转化程序后选择已经引入所述载体的细胞。质粒pETllA(得自Novogen,Madison WI)是合适的亲代质粒。通过用内切核酸酶NdeⅠ和BamHⅠ限制性消化而线性化pET11A。将线性化的pET11A连接至带有NdeⅠ和BamHⅠ粘端并且包含如图1-4所公开的FLINT基因的编码区的DNA片段。
可以在5′端(所编码多肽的氨基末端)略微修饰在所述构建中使用的FLINT基因以简化所编码的多肽产物的纯化。为此目的，在ATG起始密码子之后***编码8个组氨酸残基的寡核苷酸。在所编码多肽的氨基末端放置组氨酸残基用于使得能够进行IMAC单步多肽纯化方法。
         实施例3
FLINT多肽的重组表达和纯化
用标准方法将表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)(hsdS galλcIts857 indlSam7nin5lacUV5-T7基因)，其中所述载体带有编码FLINT或其片段的可读框(ORF)并且所述可读框操作性地连接表达启动子。使用快速质粒制备，通过琼脂糖凝胶电泳随机选择根据对氨苄青霉素的抗性选出的转化子和测试所述载体的存在。将带有所述载体的菌落在L肉汤中培养，并基本如美国专利4,569,794所述，通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化载体所带的ORF编码的多肽产物。
简要地说，如下制备IMAC柱。在蒸馏水中洗涤无金属螯合树脂(如Sepharose 6B IDA,Pharmacia)以去除防腐物质，然后加入50mM金属氯化物或金属硫酸盐水溶液，输注合适的金属离子[如Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)或Cu(Ⅱ)]直到约75％的树脂孔隙空间被有色的金属离子饱和。然后所述柱子就可以装载包含重组多肽产物的细胞粗提物。
在用任何合适的缓冲液在pH7.5洗涤柱子去除未结合的多肽和其它物质后，用任何合适的缓冲液在pH4.3，或最好用含有咪唑的缓冲液在pH7.5洗脱结合的多肽。
         实施例4
FLINT mRNA的组织分布
通过RNA印迹分析多种人类组织中FLINT mRNA的存在。通过标准的盐酸胍(guanidine chloride)/酚提取方法分离来自不同组织或培养细胞的总RNA，并使用7型寡聚(dT)-纤维素(Pharmacia)分离poly-A+RNA。在甲醛中进行RNA样品的电泳，然后用毛细管将RNA转移到Zeta-ProbeTM尼龙膜(Bio-Rad,Hercules,Calif)。图1是使用MultiPrimeTM随机引发试剂盒(Amersham,Arlington Heights,Ⅲ.)产生探针的模板。标记反应的效率约为每μg模板引入4×1010cpm。杂交缓冲液含有0.5M磷酸钠、7％SDS(重量/体积)、1％BSA(重量/体积)和1mM EDTA。65℃下在杂交缓冲液中预杂交2小时，加入32P标记的探针，然后温育过夜。将滤膜在缓冲液A(40mM磷酸钠pH7.2,5％SDS[重量/体积]，0.5％BSA[重量/体积]和1mM EDTA)中于65℃下洗涤1小时，然后在缓冲液B(40mM磷酸钠pH7.2,1％SDS[重量/体积]和1mM EDTA)中于65℃下洗涤20分钟。将滤膜风干并使用增感屏在-80℃对Kodak X-OMAT AR底片曝光。
结果显示FLINT mRNA存在于多种组织中，包括胃、脊髓、***、气管、脾、结肠和肺。
       实施例5
针对多肽的抗体的产生
使用本领域内任何众所周知的方法，或通过本文具体公开的方法，从转染或转化的细胞分离大致纯的多肽或其片段。通过，如，Amicon过滤装置过滤，调整最终制备物中的多肽浓度以便所述水平为约1到5ug/ml。可以如下制备单克隆抗体或多克隆抗体。
可以根据Kohler和Milstein(Nature,256,495,1975)的方法或根据其修改的方法，由鼠杂交瘤制备单克隆抗体。简要地说，在几周时间内，用几微克所述多肽或其片段或其融合肽反复接种小鼠。然后处死小鼠并分离脾中产生所述抗体的细胞。将所述脾细胞通过聚乙二醇与小鼠骨髓瘤细胞融合。用任何合适的免疫分析鉴定产生抗体的融合细胞，其中所述免疫分析的例子有，例如，ELISA，如E.Engvall,Meth.Enzymol,70,419,1980中所述。
可以用涉及用本文公开的多肽、其片段或其融合多肽免疫合适动物的众所周知的方法制备多克隆抗血清，其中所述方法如，例如，J.Vaitukaitis等人，Clin.Endocirnol.Metab.33,988(1971)所述。在多个皮内位点给予小剂量(如纳克量)抗原看起来是最可靠的方法。
            实施例6
构建哺乳动物FLINT-Flag表达载体
为便于FLINT表达的确认(不使用抗体)，将“内部核糖体进入位点”/增强的绿荧光多肽(IRES/eGFP)PCR片段***哺乳动物表达载体pGTD(Gerlitz,B.等人，1993,Biochemical Journal 295:131)，构建双顺反子表达载体(pIG1-FLINTF)。这个名为pIGl的新载体包含下列序列标记：Ela反应性GBMT启动子(D.T.Berg等人，1993BioTechniques 14:972；D.T.Berg等人，1992 Nucleic Acids Research 205485)；唯一的BclⅠ cDNA克隆位点；来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列；eGFP(Clontech)编码序列(Cormack等人，1996 Gene 173:33)；SV40小“t”抗原剪接位点/聚腺苷酸化序列；SV40早期启动子和复制原点；鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)编码序列；以及pBR322氨苄青霉素抗性标记/复制原点。所得到的蛋白在C末端连接Flag序列，产生[FLINT]-DYKDDDDK。
根据人FLINT序列，合成下面的引物：5’-TAGGGCTGATCAAGGATGGGCTTCTGGACTTGGGCGGCCCCTCCGCAGGCGGACCGGGG-3’；和5’-AGGGGGGCGGCCGCTGATCATCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGTGCACAGGGAGGAAGCGC-3’。后者(反向引物)包含Flag表位序列(第24-47位，双下划线)(Micele,R.M.等人，1994 J.Immunol.Methods 167:279)。然后将这些引物用于PCR扩增FLINT cDNA。得到的1.3Kb PCR产物随后用BclⅠ(限制位点已引入引物，上面的下划线部分)消化并连接进pIG1的唯一的BclⅠ位点以产生质粒pIG1-FLINTF。通过限制性消化并对***物进行双链测序，确认人FLINT cDNA的取向和核苷酸序列。
             实施例7
构建哺乳动物FLINT-无Flag表达载体
为产生无Flag的表达载体(pIG1-FLINT)，使用Quick Change诱变试剂盒(Stratagene)从pIG1-FLINTF构成物缺失编码八个氨基酸的FLAG表位的24个碱基DNA序列。合成35个碱基的引物以及其与FLAG的侧翼19碱基序列相同的互补部分，用于使用pIG1-FLINTF质粒作为模板的PCR扩增。用DpnⅠ限制性内切核酸酶消化PCR反应混合物以去除亲代DNA，并将PCR产物转化进Epicurean XLI-blue大肠杆菌细胞。挑出十六个氨苄青霉素抗性转化子并通过限制消化分析质粒DNA。16个中有10个给出与缺失24个碱基的序列相一致的结果。通过对pIG1-FLINT的DNA测序确认24个碱基的序列的精确缺失。该质粒中的FLINT核苷酸序列显示于图1。
                  实施例8
从AV12 RGT18转染子分离大量产生FLINT的克隆
带有FLINT基因的重组质粒(pIG1-FLINT)编码对氨甲蝶呤的抗性。此外，该构成物包含与FLINT基因在同一个转录物上并紧接着FLINT基因3’端的编码荧光多肽GFP的基因。由于GFP的高水平表达需要FLINT-GFP mRNA的高水平表达，因此具有高度荧光的克隆将更有可能产生高水平的FLINT。用pIG1-FLINT和pIG1-FLINTF转染AV12 RGT18细胞。选择抗250mM氨甲蝶呤的细胞并合并这样的细胞。对抗性细胞的合并物进行荧光辅助细胞分类(FACS)，并将荧光值在群体的最高5％以内的细胞作为单独的细胞分入一个库中。对高荧光的库进行三个连续的分类循环。通过SDS-PAGE分析得自第二和第三个循环的库和各个克隆的FLINT产生。根据考马斯染色判断在最高水平表达FLINT的库或克隆用于放大生产和纯化FLINT。图3显示了用该质粒产生的成熟FLINT蛋白(即mFLINT)的氨基酸序列。
       实施例9
mFLINT多肽的大规模纯化
进行mFLINT的大规模生产：首先在几个10升旋转器中培养稳定的克隆，即稳定的包含pIG1-FLINT的AV12 RGT 18细胞。在达到汇合后，继续培养细胞2-3天以使最大量的FLINT分泌进培养基。将含有mFLINT的培养基调整到0.1％CHAPS并在Amicon ProFluxM12切向过滤***中浓缩到350ml。浓缩的培养基在19,000rpm(43,000xg)离心15分钟，然后以8ml/分钟的流速通过SP-5PW TSK-GEL柱(21.5mm×15cm；TosoHass)。用缓冲液A(20mM MOPS,0.1％CHAPS,pH6.5)洗涤柱子直到吸光度(280nm)回到基线，然后用0.1M-0.3M NaCl(在缓冲液A中)的线性梯度洗涤超过85分钟，洗脱结合的多肽。合并含有mFLINT的流分并通过在缓冲液B(50mM Tris,0.1％CHAPS,0.3M NaCl,pH7.0)中平衡的(7.5mm×7.5cm)Heparin-5PW TSK-GEL柱。用0.1M-0.3M NaCl(在缓冲液B中)的线性梯度洗超过60分钟，洗脱结合的多肽。合并含有mFLINT的流分并通过用0.1％TFA/H2O平衡的1cm×15cm Vydac C4柱。用0-100％CH3CN/0.1％TFA的线性梯度洗脱结合的多肽。通过SDS-PAGE分析含有mFLINT的流分，发现纯度超过95％，然后将含有mFLINT的流分对8mM NaPO4,0.5M NaCl,10％甘油，pH7.4透析。用纯化的多肽确认mFLINT的N末端序列。质谱分析和糖苷内切酶F消化显示mFLINT是糖基化的。
                   实施例10
A．构建FLINT-Flag和FLINT表达载体为获得足够的重组蛋白以供研究，在杆状病毒感染的细胞中表达Flag标记的以及天然形式的人FLINT。为进行表达，如下工程化人FLINT cDNA。用XbaⅠ切割pIG3(pIG1的衍生物；Gerlitz,B和Grinnell,B.W.未发表的数据)并补平以产生平端，其中所述pIG3含有编码FLAG标记形式FLINT的cDNA。然后用SalⅠ切割载体。凝胶纯化得到的包含所述编码区的918个碱基对的片段，将其连接进用BamHⅠ消化的杆状病毒载体pFastBac-1(GIBCO/BRL)，使末端平端化，随后用SalⅠ消化，产生质粒pBacOPG3Flag。该构成物设计用于表达全长的分子(包括构成信号肽的29个NH2端氨基酸)并在蛋白的COOH端表达FLAG标记。所述表达处于杆状病毒多角体蛋白启动子的控制之下。
为构建表达天然形式所述蛋白的载体，用XbaⅠ和HindⅢ切割事先已经亚克隆进pCDNA3.1(+/-)[购自Invitrogen]的编码全长蛋白的920个碱基对的XbaⅠ/HindⅢ cDNA片段。凝胶纯化所述片段并连接进已经用XbaⅠ和HindⅢ消化的杆状病毒载体pFastBac-1(GIBCO/BRL)，产生质粒pBacOPG3。
B．杆状病毒的产生和蛋白产生如经销商(GIBCO/BRL)所述，将两种载体pBacOPG3Flag和pBacOPG3分别用于产生两种重组杆状病毒(vBacOPG3Flag和vBacOPG3)。为产生蛋白，分别用每种病毒感染SF-9细胞。通过蛋白质印迹分析和考马斯染色分析测定从被感染的SF-9细胞收集的上清液中的重组蛋白。
    实施例11
FAS配体结合实验检测mFLINT与FasL的相互作用
进行斑点印迹实验以检测已知的TNF配体(即商业上可得到的TRAIL和FasL)与mFLINT的相互作用。
将TRAIL(RnD***)和FasL(Kamiya Biomedical Company)点样在硝酸纤维素纸上并与纯化的mFLINT-Flag一起温育。洗去mFLINT并用抗Flag抗体检测与mFLINT的结合。按照上述的实施例过量表达并纯化OPG2Fc和mFLINT-Flag。然后用PBS中的5％脱脂乳在室温下封闭滤膜30分钟。随后将硝酸纤维素纸与含有FasL-Myc的细胞裂解物混合，室温下在旋转器上继续温育1小时。用抗myc抗体进行第二次温育1小时，用抗小鼠IgG-HRP进行第三次温育30分钟。通过在显示mFLINT特异性结合FasL的X胶片上检测化学发光，检测包含myc表位的多肽。没有检测到可检测的与TNFα、TNFβ、TRAIL、CD40L或TRANCE的结合。
首先进行体外Fas-Fas配体相互作用的基线实验。除非特别指出，否则所有的洗涤步骤都使用TBST(含Tween20的Tris缓冲盐溶液，得自SIGMA)进行3-6次。
将mrecFas(100ng)吸附至ELISA板。然后用加了0.1％明胶的TBST封闭板。此后，加入在包含0.1％含1微克/ml M2 Abs (通过Kodak的Scientific Imaging System部门购买的抗flag抗体)溶液的TBST中从最高浓度300ng直到1ng的不同浓度的hFas配体(Flag标记)。洗板6次后，在孔中加入抗小鼠-Abs-HRP(3000倍稀释，Bio-Rad)。洗3次后，用ABTS作为底物进行显色酶促反应。除非特别指出，否则使用由Molecular Devices Corp.(Menlo Park,California)商业化的ELISA读板仪。
收集到下面的数据：
    FasL,ng     OD,405nM
    1     .1
    5     .2
    10     .3
    50     .7
    100     1.2
    500     1.6
使用实时生物分子相互作用分析，确认FLINT-FasL结合并确定结合的特性(如动力学、特异性、亲和性、协同性、类似结合模式、浓度)。该技术赋予实时研究生物分子的相互作用而不必标记任何相互作用物的能力。具体地说，该技术利用光学现象表面等离子体共振(optical phenomenon surface plasmon resonance)，并根据生物特异性界面处的大分子的质量浓度的变化进行检测。实时跟踪相互作用，以便可以容易地得到动力学信息。在许多情况下，可以不首先纯化成分而进行研究。
使用BiaCore 2000仪器完成测量。从Biacore AB,Rapsgatan 7,S-754 50 Uppsala，瑞典获得所述仪器、所附的芯片、固定化和保养的试剂盒及缓冲液。从Kamiya Biomedical Company,910 Industry Drive,Seattle,WA 98188获得FasL，从GibcoBRL获得异硫氰酸胍溶液，如实施例8和实施例9中所述制备mFLINT。
实验采用固定化的FasL，装载含有mFLINT的溶液。在本实验中，FasL-FLINT相互作用的KD是1.13×10-7，低于FasL结合Fas的KD1.62×10-7。这可以解释为FasL是三体，而本文中结合的是FasL单体。进一步的实验利用在溶液中与FasL结合的FLINT，这使得三体能够形成。在这些实验中得到的FLINT-FasL的KD要好两个数量级(即KD降低了两个数量级)。该观察指出FLINT应该有效地与Fas竞争结合FasL，这有可能解释在下文详述的实验中观察的治疗好处。FLINT阻止Fas-Fas配体相互作用
如上所述，将mrecFas(100ng)吸附到ELISA板上。然后用TBST和0.1％明胶封闭板。此后，在每孔中加入在包含含1微克/ml M2 Abs的0.1％溶液、在不同mFLINT浓度(从最高浓度300ng降至1ng)存在下的TBST上的hFas配体(Flag标记，每个点30ng)。如前所述，洗板后，在孔中加入抗小鼠-Abs-HRP(3000倍稀释，Bio-Rad)。洗涤后，用ABTS作为底物进行显色酶促反应。数据显示于下表中：
    FLINT,ng     OD,405nM
    1     0.36
    5     0.36
    10     0.36
    50     0.28
    100     0.18
    500     0.06
Fas配体以不同亲和性结合Fas和mFLINT
将FLINT和Fas(各100ng)吸附至ELISA板上。加入在包含含1微克/ml M2 Abs的0.1％溶液的TBST上从最高浓度300ng降至0.1ng的不同浓度的hFas配体(FIag标记)。洗板后，在孔中加入抗小鼠-Abs-HRP(1∶3000倍稀释，Bio-Rad)。洗涤后，用ABTS作为底物进行显色酶促反应。下表显示了数据。
    FasL,ng     FLINT OD   Fas OD,405nM
    0.1      O      0
    0.5      0      0
    1.0     .02      0
    5.0     .04     .01
    10     .12     .03
    50     .28     .045
    100     .78     .18
                   实施例12
测量mFLINT对于抗CD3诱导的Jurkat编程性细胞死亡的效应
用0.5ml PBS中的1μg/ml抗CD3(Farmingen)在37℃包被无组织处理的24孔板(Decton Dickinson,Mansfield,MA)90分钟。用PBS洗板一次。在每孔中加入1ml 1×106细胞/ml，进行或不进行以下处理：10μM DEVD-cmk,1μg OPG2-Fc,1或2μg mFLINT和1μg抗FasLAb。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。
在37℃恒温箱中培养细胞过夜，然后通过Annexin V和PI染色法染色细胞。通过流式细胞仪(FACS)分析编程性细胞死亡。用AnnexinV的阳性染色指示细胞的编程性细胞死亡。
    Jurkat对照     6.97
    Jurkat+抗Fas     59.28
    Jurkat+抗CD3     46.32
    Jurkat+抗CD3+DEVDcmk     30.80
    Jurkat+抗CD3+mFLINT(1ug)     27.77
    Jurkat+抗CD3+OPG2-Fc(1ug)     45.78
    Jurkat+抗CD3+mFLINT(2ug)     18.67
    Jurkat+抗CD3+抗FasL Ab     24.05
                      实施例13测量mFLINT对重组FasL诱导的Jurkat细胞的编程性细胞死亡的效应
在24孔组织培养板的每个孔中加入1微升1×106细胞/ml并用下面的试剂处理：可溶性FasL(200ng)、FasL加1μg mFLINT、FasL加1μg OPG2-Fc、Trail(200ng)、Trail加1μg mFLINT。细胞在37℃培养过夜，然后用Annexin V和PI染色细胞。通过流式细胞仪(FACS)分析编程性细胞死亡。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。
    对照Jurkat     3.23
    Jurkat+FasL(200ng/ml)     67.39
    Jurkat+FasL(200ng/ml)+抗FasL Ab(1ug)     3.3
    Jurkat+FasL(200ng/ml)+mFLINT(1ug)     3.32
    Jurkat+FasL(200ng/ml)+mFLINT(1ug)     4.6
    Jurkat+FasL(200ng/ml)+OPG2(1ug)     70.58
    Jurkat+FasL(200ng/ml)+OPG2(1ug)     69.58
    Jurkat+TRAIL(200ng/ml)     17.47
    Jurkat+TRAIL(200ng/ml)     17.43
                    实施例14测量mFLINT以依赖于剂量的方式对于抗CD3诱导的Jurkat编程性细胞死亡的效应
进行实施例13中陈述的同样板包被和细胞处理步骤，但在每孔中加入不同量的mFLINT。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。下表显示了所加的量：
Jurkat细胞(对照)     5.33
Jurkat细胞+抗CD3     27.49
Jurkat细胞+抗CD3+抗FasL中和Ab     12.74
Jurkat细胞+抗CD3+OPG-Fc4μg     26.24
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT/PG3 3000ng     14.68
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 2000ng     17.02
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 1000ng     24.29
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 500ng     27.48
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 250ng     28.93
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 125ng     29.4
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 62.5ng     28.99
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 31.25ng     28.21
 Jurkat细胞+抗CD3+mFLINT 15.625ng     28.80
                       实施例15使用小鼠T细胞杂交瘤细胞(LTT细胞)测量人mFLINT对鼠FasL介导的编程性细胞死亡的效应(Annexin V分析)
按照实施例8和实施例9制造FLINT。在这个Annexin V分析中使用LTT,2,14,11细胞(LTT细胞)，见Glasebrook,Eur.J.Immunol.17:1561-65(1987)。在第一天，用抗CD3(2C11)以连续稀释度包被96孔板。在第二天，每孔中加入在50μl培养基中的100,000 LTT细胞，并在对照孔中加入50μl培养基，在其它孔中加入含以下的50μl培养基：
组1．可溶性Fas(sFasFc)(FasFc，小鼠)，终浓度为1μg/ml
组2．mFLINT(人)，终浓度为1ug/ml
组3．抗FasL(小鼠)，终浓度为1ug/ml然后将它们在37℃下5％CO2中培养过夜。
在下一天(第3天)，从每个孔收获细胞，洗涤并用Annexin V和PI标记，然后进行流式细胞术分析。
  抗CD3   对照％Annexin V阳性     sFas％Annexin V阳性   FLINT％Annexin V阳性   抗FasL％Annexin V阳性
    1     96.42     56.66     34.41     53.46
    0.33     94.48     47.28     35.89     39.21
    0.11     91.27     41.08     33.24     32.54
    0     19.74     23.14     26.47     17.54
                       实施例16使用小鼠T细胞杂交瘤细胞(LTT细胞)测量人mFLINT对鼠FasL介导的编程性细胞死亡的效应(细胞毒性分析)
在第1天和第2天进行与实施例16中同样的步骤。第3天在细胞中加入20μl MTS溶液(Promega)，然后在37℃培养2小时。使用读板仪收集490nm波长处的吸光度。
抗CD3浓度(μg/ml) s-Fas(1μg/ml) FLINT(1μg/ml)  抗FasL 对照
    0   1.774   1.691   2.01   1.534
    0.0014   1.968   1.923   2.134   1.614
    0.004   1.929   1.982   2.147   1.653
    0.012   1.779   2.006   2.108   1.284
    0.037   1.777   2.006   1.988   0.834
    0.11   1.638   1.874   1.956   0.733
    0.33   1.624   1.671   1.978   0.648
    1   1.459   1.581   1.887   0.664
实施例17
LIGHT结合实验
为确认LIGHT和mFLINT间的斑点印迹结合，用LIGHT表达构成物瞬时转染293细胞过夜。第二天，使细胞脱落并与mFLINT-Flag在冰上培育。随后用缀合了荧光染料的抗Flag检测Flag表位，并用流式细胞仪检测显示与mFLINT特异性结合的细胞群体。我们使用载体转染的细胞作为对照。为确认结合是特异性的，用10倍过量的未标记mFLINT进行竞争分析。
更具体地说，如上转染6孔板的细胞。提供既表达载体也表达m-LIGHT的细胞。用P100滴管猛烈吸放，使细胞与板分离。然后在PBS/BSA 0.1％中，将细胞暴露于如a-d所陈述的下列溶液中的一种。
a．20nM GST/flag,mFLINT/flag，或HVEM；
b．20nM FLINT/flag+200nM GST/flag或mFLINT或HVEM；
c．20nM FLINT/flag+HVEM+200nM抗人FAS配体；
d．1μg/ml抗人FAS配体-生物素
在冰上培育细胞30分钟并用PBS/BSA,0.1％洗涤。然后将细胞或者暴露于1μg/ml抗人IgG生物素(为检测HVEM)，或者暴露于2μg/ml M2-生物素(为检测flag缀合物)。在冰上培育细胞30分钟并用PBS/BSA,0.1％洗涤。此后，将细胞暴露于以1∶1000稀释的链霉抗生物素Alexa 488(SIGMA)。再次在冰上培育细胞30分钟并用PBS/BSA.0.1％洗涤。用FACSORT流式细胞仪(Decton Dickinson)分析细胞以检测结合。
使用流式细胞仪的细胞表面结合分析确认：仅当用mFLINT-Flag染色表达LIGHT的细胞时，才发生峰偏移(数据未显示)。当用mFLINT-Flag染色时，对照细胞中没有偏移。当用10倍过量的未标记mFLINT与细胞预培育而因此预先占据所有的mFLINT-Flag的结合位点时，偏移峰完全与基线峰相反。
           实施例18
在治疗肝损伤方面体内测试mFLINT
用小鼠做实验，使用在Tsuji H.等人，1995,Infection and Immunity,65(5):1892-1898中陈述的方法的修改形式，诱导肝损伤模型。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。
明确地说，使用下面的程序测定本发明的多肽对抗急性炎症和编程性细胞死亡的活性。简要地说，给每个实验组的BALB/c小鼠(Harlan)给予皮下注射(尾侧静脉)100μl PBS(GIBCO/BRL)中的6mgD(+)-半乳糖胺(Sigma,39F-0539)以及100μl PBS中的3μg脂多糖B大肠杆菌026:B6(LPS)(Difco,3920-25-2)。在静脉给予半乳糖胺5分钟后，通过静脉注射给予LPS。LPS攻击后，在0、2、4、6小时的时间点分别腹膜内给动物注射mFLINT(200μg)、仓鼠IgG(500μg,Cappel,30926)、抗鼠TNF mAb、TN3-19.12(500μg,Sheehan K.C.F.等人，J.Immunol.1989.142:3884)以及抗小鼠Fas配体(500μg,PharMingen,MO24301)。LPS注射24和48小时后测定小鼠的存活率。
在小鼠中，腹膜内注射200μg mFLINT多肽(FLINT)后用3μg LPS攻击对动物的存活率有正效应。当在攻击后2小时给予mFLINT时，100％的动物存活；在攻击后4小时给予mFLINT时，73％的动物存活；在攻击后6小时给予mFLINT时，60％的动物存活。与此相比，在攻击后4小时给予抗TNF∝，仅保护10％的动物。
图5比较了在用LPS/GalN攻击之前和之后静脉给予200μgmFLINT和其它分子的效应。当在LPS/GalN攻击之前2小时给予时，抗TNF和mFLINT处理都导致100％的小鼠存活。80％用抗FasL处理的小鼠存活，而约30％用IgG处理的小鼠存活。
与此相比，当在LPS/GalN攻击之后4小时给予抗TNF，在48小时少于10％的动物存活。惊人的是，当在LPS/GalN处理后4小时用mFLINT处理时，80％的动物存活。在LPS/GalN处理后4小时给予抗FasL也导致80％的存活率。IgG对存活率基本没有影响，只有约2％的动物存活。因此，mFLINT对治疗晚期疾病有效。
图6显示，当在LPS和GalN攻击前2小时腹膜内给予小鼠400μgmFLINT时，100％的动物在给予LPS/GalN 48小时后存活。假如在LPS/GalN攻击前2小时腹膜内给予400μg抗TNF时，约95％的动物在48小时时存活。与此相比，未用mFLINT处理的动物仅20％在48小时时存活。在LPS/GalN之前2小时给予IgG仅增加存活率到30％。
图6显示了降低mFLINT的剂量到50μg仍然有保护效果。给予LPS/GalN 48小时后，约70％的动物存活到48小时，而未处理的动物有0％存活。
图7显示，不管在给予LPS/GalN前12小时或2小时、腹膜内给予或是静脉内给予，100μg mFLINT对存活率的效应是一样的。当在给予LPS/GalN后4小时给予mFLINT时，静脉内给予导致100％的存活率，而腹膜内给予导致80％的存活率。该图还显示了给予LPS/GalN后4小时静脉内给予的剂量/反应关系：50ug得到80％的存活率，10ug得到40％的存活率，5ug得到20％的存活率，而1ug仅得到约2％的存活率。
                    实施例19
本实施例证明了mFLINT在治疗与中风、头部创伤以及其它相似疾病在临床上相关的大脑局部缺血方面的有效性。
腹膜内注射40mg/kg戊巴比妥钠(Nembutal)麻醉成年雄性沙土鼠(体重70到80g,Charles River Laboratories,Wilmington,MA)，当需要维持麻醉的手术水准(surgical plane)时另外再腹膜内注射10mg/kg。将动物置于恒温控制的加热毯上以维持体温在37℃。暴露颈的前侧表面，剃毛，并用2％碘溶液清洁皮肤。
进行术前准备后，中线切开，并打开皮肤。分开胸骨舌骨肌，暴露并分离颈总动脉(CCA)以将其夹住。使用无菌clip applier，将无菌的动脉瘤夹(夹口0.15mm，闭合力约10gm)固定在左颈总动脉和右颈总动脉上5分钟。然后去除所述夹具，目视检查所述动脉的开放。用手术用缝线缝合颈上的伤口。
紧接在大脑局部缺血程序之后并且在沙土鼠仍未苏醒时，剃去头部背面的毛，用2％碘溶液清洁皮肤。在外科麻醉的情况下，通过
利用定向仪(stereotaxic apparatus)(SA)将沙土鼠的头固定在稳定的位置，中线切开以暴露颅骨。根据SA的游尺所指出的前卤外侧1mm和后面1mm的位置，用装有直径0.5mm的钻头的牙钻修磨颅骨使其变薄。用配备27号钝头针的微量注射器穿刺变薄的区域，***3mm深，一次性注射(bolus injection)5μl(0.63mg/ml)磷酸缓冲盐水(PBS)中的mFLINT。根据实施例8和实施例9制造mFLINT。
在所述注射后，将注射器针头更换为连接到Alzet渗透泵(AlzaCorp.,Palo Alto,CA)的脑输注组合件(brain infusion assembly)上的输注插管(长3mm)，其中所述脑输注组合件的贮液器置于沙土鼠肩部皮肤之下。用牙科粘固粉将输注插管固定在颅骨的表面上。用手术用缝线缝合伤口。所述Alzet渗透泵装有mFLINT溶液(0.63mg/ml)或PBS，以1μl/小时的流速连续输送3天。使沙土鼠存活5天(手术当天定为第0天)。
在存活到第五天时，在CO2室中处死沙土鼠。进行胸廓切开术，以心内(transcardiac)灌注盐水3分钟，甲醛2分钟。取出脑部，进行按照本领域内通常适用的标准方法进行组织处理。在前卤后部约1.7mm获得冠状切片。用甲酚紫染色后，在显微镜下用40x的放大倍数观察冠状切片以进行细胞计数，定量沿着两个大脑半球的背面CAl区(长0.5 mm)的完整海马神经元。用Student t检测和Wilcoxon秩评定检测分析数据。
结果显示：mFLINT与载体相比对神经元的存活率有显著效应(在t检测中p=0.0039；在Wilcoxon秩和检验中p=0.0037)，而与正常对照没有差异。
       实施例20处理组                    动物数对照                         10静脉给予FLINT(50μg/注射)    10第4-13天静脉给予OPG2(50μg/注射)     10第4-13天
                         总数：30只小鼠
为进行实验，从a brie of供体肿瘤制备B16黑素瘤的单细胞悬浮液。在第0天将肿瘤细胞(2×106)皮下植入来自Taconic Farms的雄性C5781小鼠的后腿。在第4天开始处理。从第4天到第13天，每天一次通过静脉注射入尾静脉而给予mFLINT或OPG2，共注射10次。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。上文显示了本方法的概述。
通过测量肿瘤体积监测肿瘤反应，其中在第4、8、11、17、21、25、30和34天用测径器测量肿瘤的两维，确定肿瘤体积。将肿瘤体积作为半椭圆计算。按照与上述相同的计划称量动物重量。
对照肿瘤在第17.4±0.3天达到500mm3的体积，在第21.1±0.3天达到1000mm3的体积。用mFLINT处理的动物肿瘤在第19.3±0.3天达到500mm3的体积，在第23.0±0.4天达到1000mm3的体积。用OPG2处理的动物肿瘤在185.±0.4天达到500mm3的体积，在第22.2±0.4天达到1000mm3的体积。因此，由mFLINT产生的肿瘤生长延迟是1.8天，而用OPG2产生的肿瘤生长延迟是1.1天。这些数据在图8中作图显示。如图8所示，在mFLINT处理的小鼠中，20天后的肿瘤体积约为730mm3，但对照小鼠的肿瘤体积约为1000mm3。根据动物的体重损失，没有来自给予mFLINT或OPG2的毒性的迹象。
                  实施例21
30只六周龄NOD小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Marine)。在每个笼子中放养三只小鼠，使其自由取食(Purina 5001)和饮水。适应一周后，通过剪尾以从小鼠取血，并测量血糖和血浆胰岛素。不麻醉而剪尾，使用Precision G血糖分析仪(Medisense Inc.,Bedford,MA)测量血糖。使用RIA试剂盒(Linco Inc.,St.Louis.MO.)测量血浆胰岛素。然后将小鼠任意分成三组：对照、注射mFLINT和注射OPG2。在分配小鼠到各组后，每周一次测量体重和血糖。从明显的糖尿病(血糖＞200mg％；约14周龄)发病时开始，每天一次给小鼠腹膜内注射稀释于PBS中的mFLINT(50μg/天)或是OPG2(50μg/天)。对照小鼠注射等体积的PBS。注射两周后，通过吸入麻醉(二氧化碳)来麻醉小鼠，通过心脏穿刺取血以测量葡萄糖和胰岛素。此外，通过Animal Studies Support Team收获胰腺并在锌-***中固定24小时，以进行随后的β细胞完整性的组织化学分析(苏木精和曙红)以及胰岛素的免疫组织化学染色(George Sanduskys laboratory)。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。
                    实施例22
本实施例证明了mFLINT在一个模拟局部缺血再灌注损伤的体外模型中抑制编程性细胞死亡。这些数据指出mFLINT可用于预防和治疗这样的损伤。
通过胰蛋白酶消化，从1-3日龄新生大鼠的心脏中分离心室的心肌细胞，并通过预贴壁(pre-plating)除去非肌细胞。将原代培养物接种到在无血清培养基中特殊包被(special coated)的96孔板。
将培养物在无葡萄糖和无氧(5％CO2和95％N2)条件下培养8小时，诱导低氧血。在正常氧条件的含有葡萄糖的培养基中培养16小时，模拟再灌注。在培养结束时，用胞质核小体相关DNA ELISA方法测定心肌细胞的编程性细胞死亡。用mFLINT(2μg/ml或5μg/ml)培育测试样品，用商业化的caspase抑制物Z-YVAD-fmk(50μM)培育对照样品。复份实验显示了基本完全的对低氧/再灌注诱导的编程性细胞死亡的抑制。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。
为确定这些数据并查询所观察到的结果是否是Fas介导的，通过与可溶性FasL培育诱导心肌细胞的编程性细胞死亡，并如上所述测量编程性细胞死亡。在这些实验中，抗Fas中和抗体(1μg/ml)或mFLINT(10μg/ml)抑制编程性细胞死亡。这些实验证实mFLINT抑制编程性细胞死亡，并指出mFLINT至少部分通过抑制FasL-Fas编程性细胞死亡途径而做到这一点。
                     实施例23
                  鼠破骨细胞分化分析
如Galvin等人(Endocrinology 137:1254 1996)所述修改Takahashi等人(Endocrinology 123:2600,1988)的共培养方法，并用所述方法研究各种试剂对破骨细胞分化的效应。按照实施例8和实施例9制造mFLINT。
用CO2无痛致死雄性Balb/C小鼠(4-8周龄)，取出股骨，用生长培养基将骨髓洗涤出股骨。在500xg离心6分钟，沉淀骨髓细胞并重悬浮于生长培养基中(RPMI 1640加5％热变性的胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂溶液)。将骨髓群体(5×104细胞/cm2)接种进在加入骨髓前两小时已经加入了BALC细胞(由新生小鼠颅盖得到的稳定细胞系，1.5×104细胞/cm2)的组织培养皿。所述细胞在潮湿的培养箱中37℃下5％CO2培养7天，其中在第3天和第5天更换培养基。在第0天、第3天和第5天用或不用10-8M 1,25-(OH)2D3处理培养物。此外，用或不用由mFLINT基因转染的细胞的条件培养基中纯化的分泌mFLINT蛋白(图1)处理所述细胞。培养7天后，用***(3.7％10分钟)固定24孔细胞群集板(cluster dish)中的细胞，然后用Graves,L和Jilka RL,J Cell Physiology 145:102 1990所述方法的修改形式，用酒石酸抗性的酸性磷酸酶(TRAP)染色细胞。定量破骨细胞(含有3个或更多核的TRAP阳性细胞)的数量。结果在下表中报告。
            表
FLINT(ng/ml)    破骨细胞/孔a
0.00            145.50±7.33
0.01            40.50±2.39*
0.10            65.50±3.33*
1.00            97.50±3.10*
10.00           170.17±8.26
100.00          335.00±8.90*a-每个值代表6个孔的平均值和标准误。*与对照组相比，p＜0.05
                              实施例24
                        猪破骨细胞分化分析
用CO2无痛处死新生猪(1到5日龄)，用70％乙醇冲洗附器，去除软组织，切下肱骨、桡骨、尺骨、股骨、胫骨和腓骨。将长骨置于冰冷的无钙及无镁Hank氏平衡盐溶液(CMF-HBSS,Gibco BRL)中并清除所有的软组织。纵向切开这些骨，敲开骨内的表面以取出骨髓和小梁骨。猛烈振荡，搅拌脊柱骨颗粒和骨髓细胞的悬浮液，并依次序通过200mm和100mm的筛。4℃下在500xg离心细胞10分钟，将沉淀重悬浮于CMF-HBSS中，然后在Ficoll-Paque梯度(Pharmacia,Piscataway,NJ)上分离。用CMF-HBSS洗涤得自所述梯度的单核细胞组份两次，然后通过35mm的筛。所述细胞悬浮于含a-MEM(pH7.2，调整到含8.3mM NaHCO3(Gibco BRL,Grand Island,NY))、10％热变性的胎牛血清(FBS,Hyclone,Logan,UT)以及2％抗生素/抗真菌剂溶液(Gibco BRL,Grand Island,NY)的生长培养基中，并以1×106细胞/cm2的密度接种到组织培养皿。一般的骨髓细胞产量在1-2×109细胞/动物之间，根据动物的大小而有所不同。细胞在潮湿的培养箱中37℃下5％CO2培养。24-48小时后，取出未贴壁的细胞并以7.5×105细胞/cm2的密度接种在24孔细胞群集培养皿的培养基中，其中所述培养基含有或不含有10-8M 1,25-(OH)2D3(Biomol,Plymouth Meeting,PA)和mFLINT蛋白(如实施例8和实施例9获得)。细胞培养至多10天，并且每48-72小时用含或不含1,25-(OH)2D3和mFLINT的生长培养基更换培养基。培养5天后，如实施例6中所述，用***(3.7％10分钟)固定细胞，然后用酒石酸抗性的酸性磷酸酶(TRAP)染色细胞。定量破骨细胞(含有3个或更多核的TRAP阳性细胞)的数量。结果在下表中报告。
             表
FLINT(ng/ml)   破骨细胞/孔a
0.00           214.83±14.22
0.01           68.83±6.28*
0.10           176.17±23.01
1.00           228.50±17.26
10.00          228.50±29.29
100.00         382.33±26.59*a-每个值代表6个孔的平均值和标准误。*与对照组相比，p＜0.05
                  实施例25
              用mFLINT的体外治疗
按照实施例8和实施例9制造FLINT并使用于下面的实验。
A-来自照射过的小鼠的骨髓细胞-本实验设计用于通过用造血细胞因子强迫体外扩增，确定mFLINT是否可以改善鼠造血祖细胞从照射恢复。给小鼠腹膜内注射3mg 5-氟尿嘧啶，四天后，取出股骨并洗涤以分离骨髓(BM)细胞。一式三份，接种1×106BM细胞到24孔板的每个孔中的Iscoves改良dulbeccos培养基(IMDM)+10％FBS中，并用细胞因子干细胞生长因子(SCF)和IL-6在mFLINT(1μg/ml)存在或不存在时刺激细胞3天。3天的体外扩增期后，一式三份地从板中取出(plated out)5×103细胞以进行CFU分析。
与未用mFLINT处理的细胞相比，用mFLINT培育的骨髓细胞显著增加了CFU的数量。图9显示CFU集落/3×106刺激过的BM细胞。这些结果暗示，mFLINT保护祖细胞免受编程性细胞死亡，并增加能够形成集落的有活力细胞的数量。该图显示了对下列集落形成单位的结果-红细胞系细胞(CFU-E)(对照-15,000集落；mFLINT处理-33,000集落)(p＜0.003)-粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)(对照-8,000集落；mFLINT处理-15,000集落)(p＜0.039)；以及更原始的粒细胞红细胞系单核细胞巨核细胞(CFU-GEMM)(对照-750集落；mFLINT处理-3,000集落)(p＜0.007)。按照Student’s T检验计算的p值显示了显著性差异。
B-来自用化疗试剂处理的小鼠的骨髓细胞-本实验设计用于证明mFLINT或抗FasL抗体可以在鼠造血祖细胞已经暴露于化疗剂并用造血细胞因子体外扩增后，改善所述细胞的恢复。将来自5-FU处理的小鼠的2×106骨髓细胞一式三份接种到24孔板的每个孔中的IMDM培养基+10％FBS中，并用SCF和IL-6以及下列化合物中的一种刺激3天：
1)mFLINT(1ug/ml)
2)抗FasL(1ug/ml)
3)FasL(0.15ug/ml)
4)对照-无添加
在用细胞因子体外扩增3天后，计数有活力的细胞并用于建立CFU分析。如果mFLINT或抗FasL抗体保护祖细胞免受编程性细胞死亡，则预期这些组在CFU分析中将有更大量的克隆。图10显示了结果，该图显示了骨髓细胞计数(x1000)。得到的值是：对照细胞：3,300；FasL处理细胞：3,000；抗FasL处理细胞：4,200；mFLINT处理细胞：4,900。
C-CD34+细胞-本实验设计用于确定mFLINT或抗FasL抗体是否可以改善来自纯化的人CD34+祖细胞的祖细胞的恢复。在存在或不存在mFLINT或抗FasL抗体的情况下，用100U/ml人IL-6和100ng/ml人SCF体外刺激纯化的人CD34+细胞(1×106/ml)3天以扩增祖细胞。在该扩增和处理之后，计数细胞并进行CFU分析。
                      实施例26
                   转基因FLINT小鼠A-转基因小鼠的准备
本实施例展示了表达FLINT的转基因小鼠的构建。这些动物表达显著水平的FLINT，但未显示负效应，这指出FLINT具有有利的毒性分布型。这些动物也可用于进一步描述针对上文所述病症的有用治疗方法。
构建转基因。如上所述，合成聚合酶链反应(PCR)引物并用于从质粒pIG1-FLINTF扩增融合的FLINT-FLAG DNA序列。5’引物5’-GAAGATCTTCTTTGATCAAGGATGGGCTTCTGGACTT-3’包含一个BglⅡ限制位点，而3’引物5’-GGACTAGTCCTGATCATCACTTGTCGTCGTCGTCCTT-3’包含一个SpeⅠ限制酶位点。这些引物用于扩增完整的FLINT和FLAG编码区。将扩增的1.1kb片段连接进质粒pMTmcs2的多克隆位点，产生质粒pMTmcs2-FLINT(6.7kb)。见Fox等人，Eur.J.Pharmacol.308:195(1996)。
通过BglⅡ和SpeⅠ消化，从pMTmcs2-FLINT上切下FLINT基因片段并进行凝胶纯化。然后将该片段用克列诺酶平端化并连接进质粒pLIV.7的克列诺片段平端化MluⅠ位点，其中所述质粒pLIV.7由J.David Gladstone Institutes的John Taylor提供。见Fan等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.91:8724(1994)。得到的质粒pLIV7-FLINT也含有apoE基因启动子/5’侧翼区以及名为“肝控制区”(HCR)的肝增强子序列。为微注射进胚，用SalⅠ和SpeⅠ消化，从质粒pLIV7-FLINT上切下包含Apo E基因启动子-FLINT/FLAG-HCR融合基因的7.0kb DNA片段，然后通过凝胶电泳和玻璃珠提取纯化。
转基因动物发育，使用已经建立的技术产生转基因小鼠，其中所述技术由例如Hogan,B.等人(1986)MANIPULATING THE MOUSEEMBRYO:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory(Cold Spring Harbor,NY)所述并如Fox和Solter,Molec.Cell.Biol.8:5470(1988)所修改。简要地说，将包含Apo E基因启动子-FLINT-HCR融合基因的7.0kb DNA片段微注射进FVB/N株的新受精的单细胞期胚(受精卵)的雄性原核中。在体外培养所述胚过夜以使其发育到二细胞期。随后将二细胞期胚移植进假孕的CD-1株小鼠的输卵管中，使其发育到足月。为测试新生小鼠中转基因的存在，从每只动物切下一小片脚趾，用蛋白酶K消化以释放核酸。随后使用人FLINT特异性引物，对脚趾提取物的样品进行PCR分析以鉴定含有转基因的小鼠。经鉴定，五只建立者转基因小鼠包含一个FLINT转基因，并将它们命名为6494、7262、7353、7653和7659。繁殖每一个建立者以产生稳定的转基因系。
已经广泛鉴定了6494系的转基因表达和病理学。通过RNA印迹分析、RT-PCR(TaqMan)、蛋白质印迹分析和免疫组织化学分析，在6494系子代中检测到广泛组织的表达，并且在肝和肾中的表达最高。在6494系小鼠循环中经ELISA分析检测到高水平的FLINT蛋白；建立者水平=490ng/ml；子代水平从285ng/ml到1360ng/ml(n=6)。通过这些分析没有检测到内源FLINT。在5周龄或8周龄6494子代中没有检测到显著的组织病理学发现。初步血化学分析暗示6494小鼠中的甘油三酯水平可能提高。这些动物没有可观察到的异常现象。
B-保护小鼠免受辐射的伤害-本实验设计用于评价是否转基因FLINT小鼠受到保护免受辐射的负效应影响。用850 cGy致死照射18只转基因小鼠和18只非转基因小鼠。每组的18只小鼠中，有8只没有给予骨髓移植物。在这8只小鼠中，用5只作为辐射诱导死亡的对照，3只用于辐射后3天肠粘膜和骨髓腔的组织学分析。
将来自正常非转基因供体的3×104骨髓细胞移植进每组余下的10只小鼠。由于肝未被辐射损伤，因此FLINT转基因小鼠应该还能够***地产生FLINT蛋白。在已经如本文所述照射的野生型动物中，该骨髓细胞的给予通常在30天时导致约50％的存活率。在移植后第7、15、21和30天通过尾部取血获得50-100μl的血并进行血液学分析以监测外周血的恢复(n=每组10只小鼠；总共20只小鼠)。所述血液分析将包括白血球计数(WBC)、红血球计数(RBC)、血细胞比容以及血液涂片镜检观察，以确定血液中淋巴细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞、血小板、肥大细胞和单核细胞的数量。测量小鼠的存活率和外周血细胞的恢复。
预期由于FLINT防止扩增中的祖细胞的编程性细胞死亡和/或增强肠上皮从辐射诱导的损伤中恢复，因此两组间在存活率、肠上皮和骨髓的组织学以及外周血细胞的恢复上会有差异。
C-保护小鼠免受化疗伤害-本实验设计用于确定FLINT和GM-CSF的组合的给予对于祖细胞从亚致死照射和化疗诱导的骨髓抑制中恢复的效应。具体地说，本实验检查转基因FLINT小鼠中白血球从化疗和亚致死照射中的恢复是否改善。这样一种化疗方法的一个例子是用卡铂处理。
在15只转基因小鼠和15只对照小鼠中一次腹膜内注射卡铂(1.2mg/小鼠)4小时后，给予500 cGY辐射。该方法诱导伴随延长的血小板减少和严重贫血的严重骨髓抑制。Leonard等人，Blood,83:1499(1994)。从照射后24小时开始，每天腹膜内注射10μg/kg体重的重组鼠rmGM-CSF共12天，以促进WBC计数的恢复。Mayer等人，J.Inf.Diseases 163:584(1991),Gamba-Vitalo等人，1991,Blood Cells 17:193(1991)。每7天通过尾部取血收集血液，直到第30天，然后进行完全的血液分析。所述血液分析将包括白血球计数(WBC)、红血球计数(RBC)、血细胞比容以及血液涂片镜检观察以确定血液中淋巴细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞、血小板、肥大细胞和单核细胞的数量。在第12天和第30天，在每组处死3只小鼠。由这些小鼠分析脾细胞构成和骨髓细胞构成。同时，汇集骨髓细胞并用于建立CFU分析以检测祖细胞的含量。
D-FLINT对祖细胞的外周活动的效应- 本实验设计用于测试祖细胞的外周迁移。为测试祖细胞的外周迁移，腹膜内注射3mg 5-FU，处理FLINT转基因小鼠和对照小鼠，4天后，或者从分离的骨髓细胞建立CFU分析，或者连续3天每天腹膜内给予100ng GM-CSF，然后通过CFU分析确定骨髓的细胞构成以及祖细胞含量。移植方法在上文的实施例B中描述。如上所述，用逆转录病毒转导应用基因疗法将改善祖细胞在用细胞因子在体内或体外刺激后的恢复。

Claims (86)

1．用于治疗急性肝衰竭的mFLINT。
2．用于治疗肝脏炎症的mFLINT。
3．用于治疗异常的肝细胞编程性细胞死亡的mFLINT。
4．用于治疗脓毒病的mFLINT。
5．用于治疗与炎症有关的疾病的mFLINT。
6．用于治疗肝炎的mFLINT。
7．用于治疗异常编程性细胞死亡的mFLINT。
8．用于治疗与局部缺血有关的损伤或疾病的mFLINT。
9．依照权利要求8的mFLINT，其中所述损伤或疾病与血凝性过高有关。
10．依照权利要求8的mFLINT，还包含选自溶栓剂和抗凝剂的药物。
11．依照权利要求10的mFLINT，其中所述抗凝剂是激活的蛋白C。
12．用于治疗与再灌注有关的损伤或疾病的mFLINT。
13．用于预防由于异常的心肌缺血对心肌细胞损伤的mFLINT。
14．用于治疗Ⅰ型糖尿病的mFLINT。
15．用于治疗癌症的mFLINT。
16．用于治疗由化疗剂或治疗辐射引起的对无辜受殃组织损伤的mFLINT。
17．依照权利要求16的mFLINT，其中所述组织是骨髓。
18．依照权利要求16的mFLINT，其中所述组织是肠上皮。
19．依照权利要求18的mFLINT，其中所述上皮位于口腔内。
20．用于治疗造血祖细胞的mFLINT，其中所述造血祖细胞已经暴露于治疗辐射或化疗。
21．用于促进造血祖细胞的生长或分化的mFLINT。
22．用于促进CD34+细胞的生长或分化的mFLINT。
23．用于治疗源于治疗辐射或化疗的细胞损伤的mFLINT。
24．依照权利要求23的mFLINT，其中所述细胞是肠上皮细胞、造血祖细胞或外周血细胞。
25．用于治疗再生障碍性贫血的mFLINT。
26．用于治疗脊髓发育不良综合征的mFLINT。
27．用于治疗各类血细胞减少的病症的mFLINT。
28．具有图1的序列的分离核酸分子。
29．具有图3的序列的分离核酸分子。
30．具有图1的序列的分离多肽。
31．具有图3的序列的分离多肽。
32．包含转基因的小鼠，其中所述转基因具有图1的序列。
33．适于治疗急性肝衰竭的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
34．适于治疗肝脏炎症的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
35．适于治疗异常的肝细胞编程性细胞死亡的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
36．适于治疗脓毒病的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
37．适于治疗与炎症有关的疾病的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
38．适于治疗肝炎的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
39．适于治疗异常的编程性细胞死亡的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
40．适于治疗与局部缺血有关的损伤或疾病的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
41．依照权利要求40的制剂，其中所述损伤或疾病与血凝性过高有关。
42．依照权利要求40的制剂，所述制剂还包含选自溶栓剂和抗凝剂的药物。
43．依照权利要求42的制剂，其中所述抗凝剂是激活的蛋白C。
44．适于治疗与再灌注有关的损伤或疾病的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
45．适于在患有异常心肌缺血的患者中预防对心肌细胞的损伤的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
46．适于治疗Ⅰ型糖尿病的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
47．适于治疗癌症的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
48．适于治疗对无辜受殃组织的损伤的制剂，其中所述损伤由化疗剂或治疗辐射引起，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
49．依照权利要求48的制剂，其中所述组织是骨髓。
50．依照权利要求48的制剂，其中所述肠上皮。
51．依照权利要求50的制剂，其中所述上皮位于口腔内。
52．适于治疗造血祖细胞的制剂，其中所述造血祖细胞已经暴露于治疗辐射或化疗，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
53．适于促进造血祖细胞的生长或分化的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
54．适于促进CD34+细胞的生长或分化的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
55．适于治疗源于治疗辐射或化疗的细胞损伤的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
56．依照权利要求55的制剂，其中所述细胞是肠上皮细胞、造血祖细胞或外周血细胞。
57．适于治疗再生障碍性贫血的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
58．适于治疗脊髓发育不良综合征的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
59．适于治疗各类血细胞减少的病症的制剂，所述制剂包含mFLINT作为活性成分。
60．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗急性肝衰竭。
61．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗肝脏炎症。
62．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗异常的肝细胞编程性细胞死亡。
63．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗脓毒病。
64．在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗与炎症有关的疾病。
65．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗肝炎。
66．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗异常的编程性细胞死亡。
67．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗与局部缺血有关的损伤或疾病。
68．依照权利要求67的用途，其中所述损伤或疾病与血凝性过高有关。
69．依照权利要求67的用途，其中所述制备还包括选自溶栓剂和抗凝剂的药物。
70．依照权利要求69的用途，其中所述抗凝剂是激活的蛋白C。
71．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗与再灌注有关的损伤或疾病。
72．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于预防由异常的心肌缺血引起的对心肌细胞的损伤。
73．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗Ⅰ型糖尿病。
74．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗癌症。
75．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗由化疗剂或治疗辐射引起的对无辜受殃组织的损伤。
76．依照权利要求75的mFLINT，其中所述组织是骨髓。
77．依照权利要求75的mFLINT，其中所述组织是肠上皮。
78．依照权利要求77的mFLINT，其中所述上皮位于口腔内。
79．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗已经暴露于治疗辐射或化疗的造血祖细胞。
80．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于促进造血祖细胞的生长或分化。
81．mFLINT制备药物中的用途，其中所述药物可用于促进CD34+细胞的生长或分化。
82．mFLINT制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗源于治疗辐射或化疗的细胞损伤。
83．依照权利要求82的用途，其中所述细胞是肠上皮细胞、造血祖细胞或外周血细胞。
84．mFLINT制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗再生障碍性贫血。
85．mFLINT制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗脊髓发育不良综合征。
86．mFLINT在制备药物中的用途，其中所述药物可用于治疗各类血细胞减少的病症。
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