CN106075388B - 用于输送一氧化氮的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于输送一氧化氮的组合物和方法。H‑NOX蛋白被突变为显示出改善的或优化的血液气体NO输送的动力学和热力学性质。工程H‑NOX蛋白包含突变，所述突变相对于相应的野生型H‑NOX结构域，赋予改变的NO或O2配体结合，并作为生理相容的哺乳动物血液NO气体载体起作用。本发明也提供药物组合物、试剂盒和方法，其使用野生型或突变H‑NOX蛋白治疗输送NO对其有益的任何病症。

Description

用于输送一氧化氮的组合物和方法
本申请是分案申请，原申请的申请日为2007年5月21日、中国申请号为200780027797.2、国际申请号为PCT/US2007/012133、发明名称为“用于输送一氧化氮的组合物和方法”。
相关申请的交叉引用
本申请要求由Michael A.Marletta、Stephen P.L.Cary、Elizabeth M.Boon和Jonathan A.Winger于2006年5月22日提交的、标题为“Engineering H-NOX Proteins forTherapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery(用于治疗性一氧化氮和氧输送的工程H-NOX蛋白)”(UC案号为B06-084)的美国临时申请系列号60/921,505的权益。该美国临时申请于2007年5月1日从2006年5月22日提交的美国实用申请系列号11/440,588转变为临时申请，其公开内容通过引用各自以其全部并入本文。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本工作由编号为DE-AC03-76SF的基金支持。美国政府对授予本申请的任何专利可能拥有权利。
技术领域
本申请涉及H-NOX蛋白和应用它们输送一氧化氮(NO)的方法。H-NOX蛋白提供了一个新的治疗工具，用于将NO输送到人，并且，用于兽医的目的，将NO输送到动物。
发明背景
NO在体内许多重要的过程的控制中充当化学信使，所述重要过程包括血管舒张、神经传递、炎症、血小板凝集、以及胃肠和血管平滑肌紧张的调节。由于Lauder Brunton和William Murrell在1867年发现了***(GTN)能够治疗心脏病病症如心绞痛，有机硝酸盐已经被广泛地用于治疗急性血管收缩病例。在最近几十年内，血管舒张的机理已经被阐明。NO，其在内皮细胞中合成，扩散到平滑肌细胞并且激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)以产生环GMP，并且因此诱导血管舒张。然后，有机硝酸盐作用的临床机理被认为是需要它们生物转化 为NO并且随后激活sGC。然而，由于被称为耐受的现象，有机硝酸盐在24-48小时后在患者中失效。因而，对于慢性高血压病例的治疗，化合物如β-阻断剂和ACE抑制剂被使用，虽然它们也具有局限性和副作用。因此，硝基血管扩张剂(nitrovasodilator)在治疗急性情况中最有用，在所述急性情况中需要迅速的血管舒张以减轻症状如心绞痛和心肌梗塞。有机硝酸盐的延长给药导致降低的效力，并且脉管***变得不反应；这种耐受阻止它们在慢性和急性病例中的进一步应用。因而，对于急性治疗，采用非连续的硝基血管扩张剂应用，具有有限的效果。对于慢性血管收缩病例，其它的治疗途径被使用，典型地使用有机硝酸盐和NO不依赖的血压药剂的混合用药法，成败参半。
关于耐受机理的两个主要竞争性理论平行进行，以探求导致NO释放的硝酸盐的生物转化的机理。因为NO被认为是有机硝酸盐的血管扩张效应的介质，所以从有机硝酸盐释放NO的机理可能受到抑制，导致耐受。但是有机硝酸盐如何在组织中进行新陈代谢地释放NO尚未被理解。而且，基于机理的耐受理论是有问题的，因为耐受也降低了内源性NO和外源性NO气体在介导血管舒张中的效力。因此，有机硝酸盐的生物转化机理显得不同于耐受的原因。竞争性理论在于对于来自有机硝酸盐的NO的反应在靶组织中受到抑制，可能是因为NO的产生和该反应的副产品最终抑制了对NO的反应，或因为NO通路的急性激活具有使其对于进一步的刺激脱敏的反馈机制。此理论被称为终末器官耐受(end-organ tolerance)。最近，统一的理论被提出，其包括有机硝酸盐生物转化的方面以及终末器官对于NO的脱敏。实质上，有机硝酸盐的生物转化表现为导致组织中较高水平的过氧化物(O2 -)。过氧化物以扩散速度与NO反应，产生过硝酸盐(OONO)。该反应主要俘获并破坏基础NO，阻止其活化sGC。降低的NO水平导致血管收缩，并且OONO-是损伤组织的强有力的氧化剂。用有机硝酸盐如GTN的延长治疗可能导致患者高血压和组织损伤，而这可以用共同施用抗氧化剂如抗坏血酸盐来缓和。因此，用于将NO输送到器官和组织以减轻血管收缩的改善的治疗剂是主要的治疗目标。
已经对应用基于血红蛋白的载体输送NO进行了一些研究。然而，由于在O2的存在下它们与NO的反应性——其导致基于血红蛋白的载体的失活，因此基于血红蛋白的载体受到限制。NO直接与结合到血红蛋白的O2反应，以形成高铁血红蛋白和硝酸盐。血红素铁和NO被结合的氧原子氧化，并且该反应发生地非常迅速，以致没有观测到NO置换O2(参见，如美国专利第6,455,676号)。
由于NO被持续产生和消耗，在体内存在NO的自然周转。当无细胞的血红蛋白被施用时，NO产生和消耗之间的平衡被与无细胞的血红蛋白的反应所改变。NO和结合到血红蛋白的O2之间的氧化反应是不可逆的，这导致了NO、O2和血红蛋白的破坏。NO结合到没有O2结合的血红蛋白在生理时标上实际上是不可逆的，因为亚硝酰基血红蛋白的解离的半衰期(half-life)是5-6小时，因而 有效地使作为无细胞的NO载体的血红蛋白失活。一旦NO分子与血红蛋白反应，其被从信号分子库中除去，因而引起某些不利情形。例如，NO结合到血红蛋白(有或没有结合的O2)可以防止血管舒张并潜在地导致高血压，其有时在施用某些细胞外血红蛋白溶液之后被观测到。
还需要NO以介导某些炎症反应。例如，由内皮产生的NO抑制血小板凝集。因此，在NO被无细胞的血红蛋白(具有或没有O2结合)结合时，血小板凝集可能增加。在血小板凝集时，它们释放有效的血管收缩化合物如血栓烷A2和5-羟色胺。这些化合物可以与由血红蛋白的清除引起的降低的NO水平协同起作用，以产生显著的血管收缩。除了抑制血小板凝集，NO还抑制中性粒细胞附着到细胞壁，其反过来能够导致细胞壁损坏。内皮细胞壁损坏在用某些血红蛋白溶液输注时被观察到。由于从血浆中除去无细胞的血红蛋白的血红蛋白受体的存在，基于血红蛋白的NO载体也被来自血浆的无细胞的血红蛋白的快速清除所阻碍。无细胞的血红蛋白还可以引起肾毒性，可能是由于肾小球中NO的耗尽，引起缢痕(或缩窄)和随后的机能障碍。
由于目前的硝基血管扩张剂治疗的局限性，对于输送NO的另外的或可选的治疗仍然具有重大的意义和需要。特别是，需要产生较小耐受的NO载体。此外，在O2存在下具有低的NO钝化速率的NO载体是期望的，如具有低NO反应性和/或对O2的低亲和力的NO载体。具有适合用于特定的临床或工业应用的NO解离常数或NO解离速率的NO载体也是需要的。
发明简述
本发明部分地基于这样令人惊奇的发现——野生型和突变H-NOX蛋白具有比血红蛋白低的多的NO反应性，并且因此是令人满意的NO载体。如果需要，突变可以被引入到H-NOX蛋白中，以改变它们的NO和O2配体的结合，以进一步使优化作为NO载体的H-NOX蛋白的应用。在一些实施方式中，作为NO载体的H-NOX蛋白的应用比目前的血管扩张剂——如有机硝酸盐——的应用，产生更小的耐受。
在一方面，本发明以突变H-NOX蛋白为特征。因此，在一些实施方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其包括至少一个突变，与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变NO解离常数或NO反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常数的2个数量级之内，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白NO反应性低至少100倍，如比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，如在37℃大约1×10-4s-1至大约0.012s-1或大约1×10-4s-1至大约1×10-3s-1。在一些实施方式中，突 变H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，如在37℃至少大约10μM或至少大约50μM。
在一些实施方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其包括至少一个突变，与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对NO的koff、k1或k2或改变O2解离常数。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且突变H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约0.012s-1之间或大约1×10-4s-1至大约1×10-3s-1之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约10μM，如至少大约50μM。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍，如比血红蛋白的NO反应性低至少100倍或比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。
在一些实施方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其选自腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌N-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、L2 F9W-F142Y、脱硫脱硫弧菌(D.desulfuricans)H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌(D.desulfuricans)H-NOX Y139L、β1(1-385)、β1(1-385)I145Y、β1(1-385)I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194)L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217)I142Y、肉毒梭菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭菌(C.botulinum)H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX(1-183)、以及秀丽隐杆线虫(C.elegans)H-NOX GCY-35(1-252)。在一些实施方式中，β1或β2蛋白源自褐鼠(R.norvegicus)或智人(H.sapiens)β1或β2蛋白。
在一些实施方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其选自腾冲嗜热厌氧菌H-NOXI5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOXW9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺军团菌(L.pneumophilia)2 F9W-F142Y、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、β1(1-385)I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194)L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217)I142Y、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、以及秀丽隐杆线虫H-NOX GCY-35(1-252)。在一些实施方式中，β1或β2蛋白源自褐鼠(R.norvegicus)或智人(H.sapiens)β1或β2蛋白。
在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常数的O.1至10倍之间，如在血红蛋白的NO解离常数的0.5至2倍之间。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在智人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，如在智人血红蛋白α的NO解离常数0.1至10倍之间或在0.5至2倍之间的NO解离常数。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍，如比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1000倍。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下，如在20℃为大约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1以下。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，如37℃为至少大约10μM或至少大约50μM。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如在20℃，为大约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如在20℃，为大约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，并且 H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如在20℃，为600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。
在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，与从其衍生的H-NOX蛋白相比，H-NOX蛋白包含一个或多个突变(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个突变)。在不同的实施方式中，与从其衍生的H-NOX蛋白相比，H-NOX蛋白包含少于20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个不在远侧袋中的突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个突变，其中对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的酪氨酸140(Tyr140)或嗜肺军团菌2的苯丙氨酸142(Phe142)的残基被任何其它氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少两个突变，其中至少一个突变是相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的酪氨酸140(Tyr140)或嗜肺军团菌2的苯丙氨酸142(Phe142)的残基被任何其它的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的Y140F突变或Y140L突变或嗜肺军团菌2的F142Y突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，与相应的野生型蛋白质相比，H-NOX蛋白中的至少一个C末端氨基酸(如至少大约50个连续的C-末端氨基酸或在大约25至大约200个连续的C-末端氨基酸之间)被除去。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是包含H-NOX蛋白——如褐鼠或智人β1或β2蛋白——的前194、217或385个氨基酸的缺失。
在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白来源于哺乳动物蛋白(如，人蛋白如β1)。在分离的H-NOX蛋白的各种实施方式中，H-NOX蛋白来源于细菌蛋白(如，腾冲嗜热厌氧菌蛋白)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白共价结合到另一分子或部分，如聚乙二醇。血红素可以结合或可以不结合到H-NOX蛋白。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，NO被结合到H-NOX蛋白。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白质如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。
在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY40L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺军团菌2 H-NOX F142Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是野生型嗜肺军团菌2 H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGCβ1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型脱硫脱硫弧菌β1 H-NOX、野生型脱硫脱硫弧菌CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35 H-NOX、野生型点形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄杆菌(C. crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGCβ1 H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1 H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1 H-NOXI145Y、褐鼠sGCβ1 H-NOX C78S、或褐鼠sGCβ1 H-NOX C78E。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、或智人β1H-NOX(1-385)I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1 I140Y、或智人β1 I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2 H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2 H-NOX、智人β1 H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGCβ1 H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1 H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1 H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1 H-NOXI145Y、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型脱硫脱硫弧菌β1 H-NOX、野生型脱硫脱硫弧菌CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35 H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任何一种，所述下列H-NOX蛋白以它们的基因名称列出，之后是它们的种缩写和Genebank标识符(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日；或2007年5月22日起可获得的下列蛋白序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi：46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-betal_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2，gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352，gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi：71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2-Hs_899477或GYCα-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared byanimal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMGGenomics 4：5-13)。在这些名称中使用的种缩写包括：Ana-鱼腥藻 某种(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细菌某种(Magnetococcus sp.)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻(Nostocpunctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任何一种，所述下列H-NOX蛋白以它们的生物体名称和Pfam数据库登录号(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；或2007年5月21日起可获得的下列蛋白序列)列出：线虫种(Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、红鳍东方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人(Homo sapiens)GCYB2_HUMAN、智人(Homo sapiens)GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、红猩猩(Pongopygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macacamulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Mus musculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Musmusculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q80WX8_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q920Q1_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q54A43_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WY0_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q80WY4_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q8CH85_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q80WY5_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)GCYB1_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q8CH90_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q91XJ7_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q80WX9_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)GCYB2_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)GCYA2_RAT、狗(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾(Manduca sexta)O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂(Apis mellifera)Q5FAN0_APIME、蜜蜂(Apismellifera)Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopgeles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiaestr)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)GCYH_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)GCY8E_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)GCYDA_DROME、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)GCYDB_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q296C7_DROPS、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q296C8_DROPS、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻某种(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1 Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一种嗜冷细菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6cQ3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagusdegradans Q21E20_SACD2、 Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustumS14 Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q7MJS8_VIBVY、发光菌某种(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H168 Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMFQ3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌(Clostridium beijerincki)NCIMB 8052Q2WVN0_CLOBE。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX蛋白的Tyr135、Ser137、和Arg139。
在一方面，本发明以编码本文描述的突变H-NOX蛋白的任何一个或多个的重组核酸为特征。在具体的实施方式中，所述核酸包括在图2-4D或8A-8DD中示出的核酸的任一个的片段或完整核酸序列。在一些实施方式中，所述核酸编码包括H-NOX结构域和另一蛋白质如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部的融合蛋白。在一些实施方式中，所述核酸包括来自H-NOX核酸的至少大约下列任何个数的连续核苷酸：50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多个，并且与其来源的H-NOX核酸相比，包含一个或多个突变(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个突变)。在各种实施方式中，与其来源的H-NOX核酸相比，突变H-NOX核酸包含少于大约下列任一个数的突变：20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个。本发明也以编码突变H-NOX蛋白的任一核酸的简并变体为特征。
仍在另一方面，本发明提供载体，其包括本文描述的突变H-NOX核酸的任一个或多个。在另一方面，本发明以包括本文描述的突变H-NOX核酸的任一个或多个的细胞为特征。在一方面，本发明以包括本文描述的任何载体的细胞为特征。
在一方面，本发明以产生H-NOX蛋白的方法为特征。该方法包括在适合产生突变H-NOX蛋白的条件下培养细胞，所述细胞具有编码本文描述的突变H-NOX蛋白的任一种或多种的核酸。在一些实施方式中，本发明进一步包括纯化突变H-NOX蛋白的步骤。
在一方面，本发明的特征在于包括一种或多种H-NOX蛋白——如本文描述的野生型或突变H-NOX蛋白的任一种——的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物包括药学上可接受量的本文描述的H-NOX蛋白和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃为大约1x10-4s-1至大约10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。
在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在智人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，如在智人血红蛋白α的NO解离常数的0.1至10倍之间或在0.5至2倍之间的NO解离常数。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性被智人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍，如比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1,000倍。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白质。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白是如本文所述的突变蛋白。在药物组合物的各种实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个突变，所述突变与相应的野生型蛋白相比，改变了NO解离常数、对NO的koff、对NO的k1、对NO的k2、O2解离常数、NO稳定性、NO反应性、血红素的自氧化速率、或前述的两种或多种的任何组合。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜嗜热杆菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺军团菌2 H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌1 H-NOX、野生型嗜肺军团菌2 H-NOX、嗜肺军团菌2 F9W-F142Y、野生型脱硫脱硫弧菌H-NOX、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I140Y、智人β1I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1 H-NOX C78S、 智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1 H-NOX H105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOXC78E、肉毒梭状芽胞杆菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭状芽胞杆菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum)H-NOX、丙酮丁醇梭杆菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭杆菌H-NOX(1-183)、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、秀丽隐杆线虫H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蝇(D.melangaster)β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA、野生型黑腹果蝇CG14886、野生型黑腹果蝇CG4154、野生型点形念珠藻(N.punctiforrme)H-NOX、野生型新月柄杆菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黄牛(B.Taurus)H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉(O.latipes)H-NOX、野生型O.curivatus H-NOX、野生型红鳍东方鲀(F.rubripes)H-NOX、野生型冈比亚按蚊H-NOX、野生型烟草天蛾(M.sexta)H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫gcy-31、秀丽隐杆线虫gcy-32、野生型秀丽隐杆线虫gcy-33、野生型秀丽隐杆线虫gcy-34、野生型秀丽隐杆线虫gcy-35、野生型秀丽隐杆线虫gcy-36、野生型秀丽隐杆线虫gcy-37；野生型霍乱弧菌(V.cholera)H-NOX、野生型费氏弧菌(V.fischerii)H-NOX、和野生型点形念珠藻H-NOX。在药物组合物的具体实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺军团菌1 H-NOX、野生型嗜肺军团菌2 H-NOX、以及嗜肺军团菌2 H-NOX F142Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种脂质体或纳米粒子，所述脂质体或纳米粒子包括或包封所述H-NOX蛋白。
在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY40L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺军团菌2 H-NOX F142Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是野生型嗜肺军团菌2 H-NOX、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35 H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭杆菌H-NOX。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。在药物组合物的一些实施方式中， 所述H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、或智人β1 H-NOX(1-385)I145Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1 I140Y、或智人β1I145Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY140F、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2 H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2 H-NOX、智人β1 H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOXH105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭杆菌H-NOX。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一种，所述下列H-NOX蛋白以它们的基因名称列出，随后是它们的种名缩写和Genbank标识符(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日或2007年5月22日起可获得的下列蛋白质序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi：46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2、gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352、gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi：71985505)、GCY1β3_Hs_20535603、GCY1β2-Hs_899477、或GYCα-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared by animal solubleguanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMG Genomics 4：5-13)。在这些名称中使用的种缩写包括Ana-鱼腥藻某种(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细菌某种(Magnetococcussp)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibriocholerae)； Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homosapiens)。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一种，所述下列H-NOX蛋白被以它们的生物体名称和Pfam数据库登录号(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；2007年5月21；或2007年5月22日起可获得的下列蛋白序列)列出：线虫种Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryziascurvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodonnigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、红鳍东方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homosapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、红猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pantroglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Musmusculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、蜜蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚊Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopgelesgambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)Q7KQ93_ANOGA、 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻某种(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌(HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5 Q2DG60_ACICY、浑球红假单胞菌(Rhodobactersphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1 Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophilasubsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwelliapsychrerythraea(一种嗜冷细菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradansQ21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibriosp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光菌某种(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种(Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp)RED65 Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrixorenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilusmetalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在药物组合物的一些实施方 式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Ser137和Arg139。
除非另外明确指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型和突变H-NOX蛋白可以被用于本文描述的药物组合物的任何一种。H-NOX蛋白可以具有或不具有血红素和/或结合的NO并且可以共价结合或可以不共价结合到另一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白质——如白蛋白(例如，人血清白蛋白)——的部分或全部。
在一方面，本发明提供使用H-NOX蛋白将NO输送到个体(例如，哺乳动物，如灵长类(例如，人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科动物或猫科动物)的方法。在一些实施方式中，所述个体遭受心血管病症、高血压、由高血压加剧的病症、血管收缩性病症、中风、或功能性NO缺乏或处于心血管病症、高血压、由高血压加剧的病症、血管收缩性病症、中风、或功能性NO缺乏的风险。在具体的实施方式中，由高血压加剧的病症是心力衰竭、肾功能衰竭或中风。
因此，在一些实施方式中，本发明提供向个体(如，人)输送NO的方法，该方法通过用足以将有效量的NO输送到所述个体的量对需要其的个体施用H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃为大约1×10-4s-1至大约10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。
在所述方法的一些实施方式中，在H-NOX蛋白施用到所述个体之前，NO结合到H-NOX蛋白。在所述方法的一些实施方式中，在将H-NOX蛋白施用到所述个体之前，NO不结合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白将NO从个体中一个位置输送到个体中另一位置。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白被经口施用、直肠施用、或被施用到个体的血液中。在所述方法的具体的实施方式中，所述H-NOX蛋白被施用到个体的血液中。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白被施用到个体至少两次。
在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白的NO解离常数在智人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，如NO解离常数在智人血红蛋白α的NO解离常数的0.1至10倍之间或在0.5至2倍之间。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍，如比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1,000倍。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白是如本文所述的突变蛋白。在所述方法的各种实施方式中，H-NOX 蛋白具有至少一个突变，与相应的野生型蛋白相比，所述突变改变了NO解离常数、对NO的koff、对NO的k1、对NO的k2、O2解离常数、NO稳定性、NO反应性、血红素的自氧化速率、或前述的两种或多种的任何组合。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、嗜肺军团菌2F9W-F142Y、野生型脱硫脱硫弧菌H-NOX、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1H-NOX、智人β1I140Y、智人β1I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1H-NOXH105G、智人β1H-NOX H105F、智人β1H-NOX C78S、智人β1H-NOX C78E、野生型褐鼠β1H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1H-NOXH105G、褐鼠β1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX C78S、褐鼠sGCβ1H-NOX C78E、肉毒梭状芽胞杆菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭状芽胞杆菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum)H-NOX、丙酮丁醇梭杆菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭杆菌H-NOX(1-183)、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、秀丽隐杆线虫H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蝇(D.melangaster)β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA、野生型黑腹果蝇CG14886、野生型黑腹果蝇CG4154、野生型点形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄杆菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黄牛(B.Taurus)H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉(O.latipes)H-NOX、野生型弓背青鳉H-NOX、野生型红鳍东方鲀(F.rubripes)H-NOX、野生型冈比亚按蚊H-NOX、野生型烟草天蛾(M.sexta)H-NOX；野生型秀丽隐杆线虫gcy-31、秀丽隐杆线虫gcy-32、 野生型秀丽隐杆线虫gcy-33、野生型秀丽隐杆线虫gcy-34、野生型秀丽隐杆线虫gcy-35、野生型秀丽隐杆线虫gcy-36、野生型秀丽隐杆线虫gcy-37；野生型霍乱弧菌(V.cholera)H-NOX、野生型费氏弧菌H-NOX、和野生型点形念珠藻H-NOX。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺军团菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、以及嗜肺军团菌2H-NOXF142Y。在所述方法的一些实施方式中，一种或多种脂质体或纳米粒子包括或包封所述H-NOX蛋白。
在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺军团菌2H-NOX F142Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是野生型嗜肺军团菌2H-NOX、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PAH-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭杆菌H-NOX。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX C78S、或褐鼠sGCβ1H-NOX C78E。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、或智人β1H-NOX(1-385)I145Y。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1I140Y、或智人β1I145Y。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、智人B1I145Y、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭杆菌H-NOX。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一种，所述下列H-NOX蛋白 以它们的基因名称列出，随后是它们的种名缩写和Genbank标识符(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日或2007年5月22日起可获得的下列蛋白质序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi：46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2、gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352、gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi：71985505)、GCY1β3_Hs_20535603、GCY1β2-Hs_899477、或GYCα-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared byanimal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMGGenomics 4：5-13)。在这些名称中使用的种缩写包括：Ana-鱼腥藻某种(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细菌某种(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻(Nostocpunctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一种，所述下列H-NOX蛋白被以它们的生物体名称和Pfam数据库登录号(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；2007年5月21；或2007年5月22日起可获得的下列蛋白序列)列出：线虫种Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryziascurvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodonnigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、红鳍东 方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homosapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、红猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pantroglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Musmusculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、蜜蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚁Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5 Q2DG60_ACICY、浑球红假单胞菌(Rhodobactersphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibactersp TM1040Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1 Q3XT27_9PROT、嗜肺军 团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophilasubsppneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwelliapsychrerythraea(一种嗜冷细菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradansQ21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibriosp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光菌某种(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种(Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp)RED65 Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrixorenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilusmetalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Ser137和Arg139。
除非另外明确指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型和突变的H-NOX蛋白以及所有药物组合物可以被用于本文描述的输送NO的任何方法。H-NOX蛋白可以具有或可以不具有血红素和/或结合的NO并且可以共价结合或可以不共价结合到另外一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白质——如白蛋白(例如，人血清白蛋白)——的部分或全部。
在一方面，本发明以包括一种或多种H-NOX蛋白的试剂盒为特征。在一些实施方式中，本发明提供试剂盒，该试剂盒包括H-NOX蛋白和使用该试剂盒将NO输送到个体的说明。在一些实施方式中，H-NOX蛋白对NO的koff、k1或k2在37℃为大约1×10-4s-1至大约10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。除非另外明确指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型 和突变H-NOX蛋白以及所有药物组合物可以被用于本文描述的任何试剂盒。H-NOX蛋白可以具有或不具有血红素和/或结合的NO并且可以共价结合或可以不共价结合到另外一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白质——如白蛋白(例如，人血清白蛋白)——的部分或全部。
在一方面，本发明的特征在于用作药剂的H-NOX蛋白(如本文描述的野生型或突变蛋白的任一种)。在一些实施方式中，本发明以H-NOX蛋白为特征，所述H-NOX蛋白用于将NO输送到个体的方法。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被用于治疗输送NO对其有益的任何病症，如心血管病症、高血压、由高血压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩性病症、中风或功能性NO缺乏。
在一些实施方式中，本发明以H-NOX蛋白(如本文描述的野生型或突变蛋白的任一种)在药物——如用于向个体输送NO的药物——制备中的应用为特征。在一些实施方式中，本发明以H-NOX蛋白在向个体输送NO中的应用为特征。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被用于治疗输送NO对其有益的任何病症，如心血管病症、高血压、由高血压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩病症、中风或功能性NO缺乏。
附图简述
图1A是NO-结合的和O2-结合的H-NOX蛋白的远侧袋残基的三维结构图(在血红素之上)。NO-结合的和O2-结合的H-NOX蛋白的血红素配位残基也被示出(在血红素之下)。图1A基于由Pellicena，P.等人(2004年8月31日).“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad SciUSA 101(35)：12854-12859报道的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构。
图1B是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构的立体侧视图，图解说明了H-NOX结构域的结构特征。蛋白折叠以带状图(ribbon diagram)表示。血红素、双氧配体以及近端组氨酸以球棒模型显示。根据图5B中示出的命名法，α-螺旋被标记为A-G。β-折叠被标记1-4。图1B来自Pellicena，P.等人(2004年8月31日)，“Crystal Structure of An Oxygen-BindingHeme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)：12854-12859。
图1C-1H是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构图，其举例说明了示范性的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的远侧袋残基。在图1C-1H中描述的下列残基是构成H-NOX远侧袋的主要残基：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、和Leu144，其被包含在螺旋A、D、E和G中。应用PYMOL(DeLano Scientific，LLP)制作图1C-1H。
图2是下列H-NOX蛋白的序列对比，所述H-NOX蛋白结合或被预测结合O2和NO：多数(Majority)(SEQ ID NO：1)；Ce.gcy-31(SEQ ID NO：2)；Ce.gcy-33(SEQ ID NO：3)；Ce.gcy-35(SEQ ID NO：4)；Dm.CG14885HNOX(SEQ ID NO：5)；Dm.CG4154HNOX(SEQ ID NO：6)；Ms.Beta3HNOX(SEQ ID NO：7)；Tt HNOX(SEQ ID NO：8)；以及Ca HNOX(SEQ ID NO：9)。这些H-NOX蛋白被预测结合O2以及NO，因为它们在相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Y140的位置具有酪氨酸。在图2中使用的氨基酸编编号是从H-NOX结构域或全长蛋白质中的第一个氨基酸起始，作为第1个残基。采用程序MegAlign中的默认参数进行对比。图2中使用的缩写在下文参考图4A-4D进行描述。
图3A-3D是下列H-NOX蛋白的序列对比，所述H-NOX蛋白结合或被预测结合NO而不是O2：多数(Majority)(SEQ ID NO：10)；Dm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：11)；sGCβ1蛋白(SEQ IDNO：12)；hs.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：13)；hs.β2蛋白(SEQ ID NO：14)；Ms.sGCβ1蛋白(SEQ IDNO：15)；Mm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：16)；Np.β1HD-样(SEQ ID NO：17)；Tr.sGCβ1蛋白(SEQIDNO：18)；冈比亚按蚊(Anopheles_gambiae)|XP_310919(SEQ ID NO：19)；蜜蜂(Apis_mellifera)|NP_001011632(SEQ ID NO：20)；Bt.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：21)；莱茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO：22)；弓背青鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO：23)；青鳉(Oryzias_latipes)|BAA76691(SEQ ID NO：24)；紫球海胆(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID NO：25)；以及Sus scro fa beta1|NP_001018042+(SEQ ID NO：26)。采用程序MegAlign中的默认参数进行对比。图3A-3D中使用的缩写在下文参考图4进行描述。
图4A-4D是来自图2和图3A-3D的H-NOX蛋白的序列对比：多数(Majority)(SEQ IDNO：27)；Dm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：11)；sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：12)；hs.sGCβ1蛋白(SEQ IDNO：13)；hs.β2蛋白(SEQ ID NO：14)；Mm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：16)；Np.β1HD-样(SEQ IDNO：17)；Tr.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：18)；莱茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO：22)；弓背青鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO：23)；紫球海胆(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID NO：25)；野猪(Sus scrofa)β1|NP_001018042(SEQ ID NO：26)；gcy-31a(SEQ ID NO：2)；gcy-33(SEQ ID NO：3)；Ca.HNOX(SEQID NO：9)；T.β1HD-样(SEQ ID NO：8)，Ms.sGcβ3蛋白(SEQ ID NO：7)；CG14885(SEQ ID NO：5)；和Dm.sGC短变体(SEQ ID NO：6)。采用程序MegAlign中的默认参数产生该对比。对于图2-4D，“Dm.sGCβ1蛋白”表示黑腹果蝇β1H-NOX，“sGCβ1蛋白”表示褐鼠β1H-NOX；“hs.sGCβ1蛋白”表示智人β1H-NOX；“hs.β2蛋白”表示智人β2H-NOX；“Mm.sGCβ1蛋白”表示小鼠β1H-NOX；“Np.β1HD-样”表示点形念珠藻H-NOX；“Tr.sGCβ1蛋白”表示红鳍东方鲀(Takifugurubripes)β1H-NOX；“Anopheles_gambiae|XP_310919”表示冈比亚 按蚊β1H-NOX；“Apis_mellifera|NP_001011632”表示蜜蜂β1H-NOX；“Bt.sGCβ1蛋白”表示牛β1H-NOX；“Chlamydomonas_reinhardtii|AAR02”表示莱茵衣藻β1H-NOX；“Oryzias_curvinotus|BAC98396表示弓背青鳉β1H-NOX；“Oryzias_latipes|BAA76691”表示青鳉β1H-NOX；“Strongylocentrotus_purpuratus|X”表示紫球海胆β1H-NOX；“Sus scrofaβ1|NP_001018042+”表示野猪β1H-NOX；“gcy-31a”表示秀丽隐杆线虫Gcy-31a H-NOX；“gcy-33”表示秀丽隐杆线虫Gcy-33H-NOX，“gcy-35”表示秀丽隐杆线虫Gcy-35H-NOX；“Ca.HNOX”表示丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutiylicum)H-NOX；“T.β1HD-样”表示腾冲嗜热厌氧菌H-NOX；“Ms.sGcβ3蛋白”表示烟草天蛾β3H-NOX；“CG14885”表示黑腹果蝇CG14885H-NOX；“Dm.sGC短变体”表示黑腹果蝇Gcy-88-E-S H-NOX，而“Dm.CG4154HNOX”表示黑腹果蝇CG4154H-NOX。
图5A是H-NOX家族的成员的序列对比。序列编号是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的编号。不变残基用“V”表示，非常高度保守的残基以“s”表示。腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Y140以“H.”表示。在其它的H-NOX蛋白中可以稳定FeII-O2复合物的推测的远侧袋酪氨酸残基是：对于秀丽隐杆线虫GCY-35是位置70；在黑腹果蝇CG14885-PA中是位置140；秀丽隐杆线虫GCY-35的位置138；丙酮丁醇梭杆菌的位置140；根据腾冲嗜热厌氧菌进行编号。登录号为：智人β1[gi：2746083](SEQ ID NO：28)、褐鼠β1[gi：27127318](SEQ ID NO：29)、黑腹果蝇β1[gi：861203](SEQ ID NO：30)、黑腹果蝇CG14885-PA[gi：23171476](SEQ ID NO：31)、秀丽隐杆线虫GCY-35[gi：52782806](SEQ ID NO：32)、点形念珠藻[gi：23129606](SEQ ID NO：33)、新月柄杆菌[gi：16127222](SEQ ID NO：34)、沙雷氏菌[gi：24373702](SEQ ID NO：35)、嗜肺军团菌(ORF 2)[CUCGC_272624](SEQ ID NO：36)、丙酮丁醇梭杆菌[gi：15896488](SEQID NO：37)、以及腾冲嗜热厌氧菌[gi：20807169](SEQ ID NO：38)。采用程序MegAlign、Lasergene、DNA Star(见万维网“dnastar.com/products/megalign.php”)，生成对比。Clustal-W默认参数被采用。
图5B是示例性H-NOX结构域的序列对比。该对比顶部的二级结构注解和编号对应于来自腾冲嗜热厌氧菌的H-NOX结构域。α-螺旋以螺旋表示，而β-折叠以箭头表示。远侧袋由α-螺旋αA、αD、αE以及αG限定。Pubmed/NCBI登录号如下：Ther_tengcongensis gi20807169.(SEQ ID NO：39)、Clos_acetobutylicum gi 15896488.(SEQ ID NO：40)、Clos_tetani GI：75543266(SEQ ID NO：41)、Desu_desulfuricans gi 23475919.(SEQ ID NO：42)、Vibr_vulnificus gi 27361734.(SEQ ID NO：43)、Caul_crescentus gi 16127222.(SEQ ID NO：44)、Micr_degradans gi 23027521.(SEQ ID NO：45)、Vibr_cholerae gi15601476.(SEQ ID NO：46)、Shew_oneidensis gi 24373702.(SEQ ID NO：47)、Rat_betal_sGC gi 27127318.(SEQ ID NO：48)、Rat_beta2_sGC gi 21956635.(SEQ ID NO：49)、Nost_punctiforme gi 23129606.(SEQ ID NO：50)以及Nost_sp.gi 17229770.(SEQ ID NO：51)。共有序列被显示在图5B(SEQ ID NO：52)的底部。采用程序MULTALIN(Corpet，F.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-10890)生成对比，并且采用程序ESPRIPT(Gouet，P.et al.(1999)Bioinformatics 15：305-308.)制作图5B。
图6A和6B是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的血红素环境的三维结构图。图6A和6B来自Pellicena，P等人2004年8月31日)，“Crystal Structure of An Oxygen-BindingHeme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.AcadSci USA 101(35)：12854-12859。
图7A-7F是对于Tt H-NOX(图7A)、Tt Y140L(图7B)、Tt W9F-Y140L(图7C)、TtF78Y-Y140L(图7D)、L2H-NOX和L2F142Y(图7E)以及β1(1-385)和β1(1-385)I145Y(图7F)，在暴露于空气(FeII-O2复合物；每个图的底部图线)之前和之后，在厌氧还原作用(FeII未连接复合物；每个图的顶部图线)后H-NOX蛋白的UV-可见光光谱图。除了L2F142Y和β1(1-385)I145Y的FeII和FeII-O2复合物之外，在还原并且暴露于空气之后的野生型L2H-NOX和β1-(1-385)H-NOX的光谱分别在图7E和7F中的中间图线中被示出，表明这些蛋白质在加入远侧袋酪氨酸之前不结合O2。书写在每一组曲线的左上角的两个或三个数字代表图中的图线峰的波长。所述数字以其中相应的图线在图中垂直出现的顺序进行垂直书写。例如，在图7A中的430nm的值表示该图中顶部图线的波长的峰(其代表FeII未连接的复合物)，而图7A中416nm的值表示该图中底部图线的波长的峰(其代表FeII-O2复合物)。在空气的存在下，波长的偏位表示该蛋白质结合O2.。在空气存在下，500和600nm之间的双峰的形成也可表示O2结合。图7A-7F来自Boon,E.M等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in SolubleGuanylate Cyclase,”Nature Chem.Biol.1:53-59。
图8A-8DD包括编码H-NOX蛋白的示例性核酸的多核苷酸序列及相应的H-NOX蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NOS:53-162)。
发明详述
本发明部分地基于令人惊讶的发现——H-NOX蛋白具有比血红蛋白低得多的NO反应性。由于在O2存在下NO使H-NOX蛋白失活的可能性较低，这种固有的低NO反应性(和高NO稳定性)使野生型和突变H-NOX蛋白成为期望的NO载体。重要的是，在一些H-NOX蛋白中的远侧袋酪氨酸的存在(Pellicena,P.等人，(August 31,2004)，“Crystal Structure of AnOxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases,”ProcNatl.Acad Sci USA101(35):12854-12859)提示了不期望的高NO反应性，表明用作NO载体不可取。例如，通过类推，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)血红蛋白——其具有结构类似的远侧袋酪氨酸——与NO极其迅速地反应，且被分枝杆菌 (Mycobacterium)用于有效地清除和避免由受到感染的宿主产生的防御性NO(Ouellet,H.等人(2002年4月30日)，“Truncated Hemoglobin HbN Protects Mycobacterium Bovis From NitricOxide,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A99(9):5902-5907)。然而，我们惊讶地发现H-NOX蛋白实际上具有比血红蛋白低得多的NO反应性，这使它们用作NO载体成为可能。
此外，发现可以通过改变H-NOX蛋白对于NO或O2的亲和性以使结合到H-NOX蛋白的NO的量最大并且减少被NO与结合到H-NOX蛋白的O2的反应所氧化的H-NOX蛋白的量，来提高H-NOX蛋白作为NO载体的有效性。特别是，H-NOX蛋白对于NO或O2的亲和性以及H-NOX蛋白区分NO和O2配体的能力可以通过引入一个或多个氨基酸突变而改变，使得H-NOX蛋白适合以期望的亲和性结合NO或O2。例如，通过H-NOX蛋白结合NO或O2的解离常数或解离速率可以通过引入单个氨基酸突变而改变。另外的突变可以被引入，以进一步改变对NO和/或O2的亲和性。H-NOX蛋白家族因此可以***作，以显示改善或最佳的NO输送的动力学和热力学特性。例如，突变H-NOX蛋白被制备，其具有改变的NO结合的解离常数和/或解离速率，其提高了H-NOX蛋白对于多种临床和工业应用的有效性。在一些实施方式中，具有低O2亲和力的H-NOX蛋白(如在37℃至少大约1μM的O2解离常数)被用于使结合H-NOX蛋白的O2的量减到最少，因而促进NO与H-NOX蛋白的结合，并且减少由于NO与结合到H-NOX蛋白的血红素的O2反应而被氧化的H-NOX蛋白的量。H-NOX蛋白的氧化的这种减少导致可以被受治疗个体的器官、组织、以及细胞利用的NO和O2的破坏较少。调节H-NOX蛋白结合并输送NO的能力是解决和克服当前血管扩张剂的主要缺点的治疗途径。因此，本发明提供用于NO输送的蛋白质、组合物、试剂盒以及方法。
使用用于NO输送的H-NOX蛋白有许多优点。有机硝酸盐对于由于耐受引起的有限时长是有效的。因为H-NOX蛋白直接将NO输送到个体而不要求硝酸盐到NO的生物转化，H-NOX蛋白作为NO载体的效应不被这种生物转化途径的抑制所限制。血红蛋白基的NO载体的主要局限性是它们对于O2的高亲和力以及它们被NO钝化的倾向。如上面提到的，即使低水平的NO被血红蛋白基的载体破坏，可以对脉管***和器官的紧张性静止状态(tonicresting state)具有严重的影响并且导致高血压和胃肠的不良应激。在被用作氧载体时，分子内和分子间交联已经被用于使血红蛋白基运载工具的毒性降到最低(“BloodSubstitutes，”R.Winslow ed.Academic Press，2006)。虽然这些修饰克服了与血红蛋白外渗有关的一些严重毒性问题，但仍保持高NO反应性。相反地，H-NOX蛋白具有比血红蛋白低得多的NO反应性。由于较少的NO与结合到H-NOX蛋白的O2反应，这种较低的反应性导致NO、O2以及H-NOX蛋白的破坏较少。选择具有期望的NO解离常数和解离速率的H-NOX蛋白的能力也可以通过防止太多的NO释放(引起低血 压)使副作用降到最低，并且防止NO在不期望的部位(如，没有血管收缩的部位)被释放。工程改造H-NOX蛋白以在最小的NO反应性下结合并输送NO，提供了一种新的血液气体NO载体，其中所述H-NOX蛋白输送NO而不被NO钝化。这些H-NOX蛋白、组合物、试剂盒以及方法在本文被进一步描述。
对于NO的输送，工程H-NOX蛋白代表了重要的替代选择，其克服了长期存在的当前硝基血管扩张剂耐受问题。H-NOX蛋白作为NO输送媒介的应用提供了治疗慢性高血压加重的疾病的新的治疗途径。
H-NOX蛋白
H-NOX蛋白家族综述
除非另外指出，任何野生型或突变H-NOX蛋白可以在如本文所述的组合物、试剂盒以及方法中被使用。如本文所用的，“H-NOX蛋白”是指具有H-NOX结构域(称为血红素-一氧化氮以及氧(Heme-Nitric oxide and OXygen)结合结构域)的蛋白质。H-NOX蛋白可以包含或不包含一个或多个除了H-NOX结构域之外的其它结构域。H-NOX蛋白是高度保守的、充分表征的血红素蛋白家族的成员(Iyer，L.M等人(2003年2月3日)，“Ancient ConservedDomains Shared by Animal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial SignalingProteins，”BMC Genomics4(1)：5；Karow，D.S等人(2004年8月10日)，“SpectroscopicCharacterization of the Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains FromVibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)：10203-10211；Boon，E.M等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in SolubleGuanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.等人(2005年10月)，“LigandDiscrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of HemeSensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.等人(2005)，“LigandSpecificity of H-NOX Domains：From sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)：892-902)。H-NOX蛋白也被称为Pfam 07700蛋白或HNOB蛋白(Pfam-蛋白质结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型(Hidden Markov Models)的数据库，Copyright(C)1996-2006The Pfam Consortium；GNU LGPL Free Software Foundation，Inc.，59Temple Place-Suite 330，Boston，MA 02111-1307，USA)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有，或被预测具有包括六个α-螺旋、随后是两个β折叠、接着是一个α-螺旋、之后是两个β折叠的二级结构。H-NOX蛋白可以是能够结合血红素的脱辅基蛋白质或具有结合的血红素的全蛋白质。H-NOX蛋白能够共价地或非共价地结合血红素基团。一些H-NOX蛋白结合NO但不结合O2，而另外的H-NOX蛋白结合NO和O2。来自已经被分离的兼性好氧菌的H-NOX结构域结合NO但不结合O2。来自专性好氧原核生物、秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇的H-NOX蛋白结合NO和O2。哺乳动物具有两种H-NOX蛋白：β1和β2。小鼠、大鼠、母牛以及人H-NOX序列的对比显示这些物种共有99％的同一性。在一些实施方式中， H-NOX蛋白的H-NOX结构域或整个H-NOX蛋白与天然存在的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白或天然存在的sGC蛋白(如，天然存在的sGCβ1蛋白)的相应区域具有至少大约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％的同一性之一。如本文进一步讨论的，与相应的天然存在的H-NOX蛋白相比，H-NOX蛋白可以任选地包含一个或多个突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白包括除了H-NOX结构域之外的一个或多个结构域。在具体的实施方式中，H-NOX蛋白包括来自另一个蛋白质的一个或多个结构域或整个序列。例如，H-NOX蛋白可以是融合蛋白，该融合蛋白包括H-NOX结构域和另一蛋白质如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。在一些实施方式中，只有H-NOX结构域存在。
来自腾冲嗜热厌氧菌的原核O2-结合H-NOX的晶体结构(Nioche，P.等人(2004年11月26日)，“Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From Clostridium Botulinum，”Science 306(5701)：1550-1553；Pellicena，P.等人(2004年8月31日).“CrystalStructure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble GuanylateCyclases，”Proc Natl.AcadSci USA 101(35)：12854-12859)表明，酪氨酸侧链羟基形成与FeII-O2部分的关键H键。这种远侧袋氢键合网络——其主要涉及Y140—-使FeII-O2复合物稳定(图6B)。该酪氨酸不存在于排斥O2并只结合NO的H-NOX蛋白中。例如，这种氢键合网络被预测在来自sGC和好氧原核生物的H-NOX蛋白中不存在，表明这在由这些血红素蛋白显示出的针对O2的显著配体选择性中是关键的分子因素。图7A-7G清楚地表明，在结合NO而不结合O2的野生型H-NOX蛋白的远侧袋中添加酪氨酸可以使突变H-NOX蛋白能够结合O2。因而，在H-NOX血红素折叠的远侧血红素袋中的酪氨酸发挥开关一样的作用，以开启或关闭O2结合。
如在图6A和6B中所示的，卟啉的结构被高度扭曲。如在图6A中图示的，保守的Y-S-R基序使氢键合与血红素基的丙酸侧链相互作用。图6B，保守的H102是血红素的近侧配体(图6B)。
如本文所用的，“蛋白质”包括无论分离自天然来源、由重组技术产生的、或化学合成的蛋白质和蛋白质片段。蛋白质可以具有一种或多种修饰，如翻译后修饰(如，糖基化，等)或任何其它修饰(如，PEG化，等)。蛋白质可以包含一个或多个非天然存在的氨基酸(例如，如具有侧链修饰的氨基酸)。在不同的实施方式中，H-NOX蛋白具有至少大约50、100、150、181、200、250、300、350、400、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白可以包括大约50至大约600个氨基酸，如大约100至大约500个氨基酸、大约150至大约400个氨基酸、大约150至大约300个氨基酸、或大约175至大约200个氨基酸。
H-NOX蛋白的来源
来自任何属或种的H-NOX蛋白可以被用在本文描述的组合物、试剂盒和方法中。在不同的实施方式中，H-NOX蛋白为来自哺乳动物(如灵长类(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科或猫科)、昆虫、酵母、或细菌的蛋白质，或来源于这类蛋白质。示例性的哺乳动物H-NOX蛋白包括野生型人和大鼠可溶性鸟苷酸环化酶(如β1亚基)。H-NOX蛋白的例子包括野生型哺乳动物H-NOX蛋白，所述野生型哺乳动物如智人、小鼠、家犬、牛和褐鼠；以及野生型非哺乳动物的脊椎动物H-NOX蛋白，所述野生型非哺乳动物的脊椎动物如爪蟾、弓背青鳉、O.curivatus和红鳍东方鲀。非哺乳动物野生型NO-结合H-NOX蛋白的例子包括黑腹果蝇、冈比亚按蚊以及烟草天蛾的野生型H-NOX蛋白；非哺乳动物野生型O2结合H-NOX蛋白的例子包括下列动物的野生型H-NOX蛋白：秀丽隐杆线虫gcy-31、gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36和gcy-37；黑腹果蝇CG14885、CG14886和CG4154；以及烟草天蛾β-3；原核野生型H-NOX蛋白的例子包括腾冲嗜热厌氧菌、霍乱弧菌、费氏弧菌、点形念珠藻、脱硫脱硫弧菌、嗜肺军团菌1、嗜肺军团菌2、和丙酮丁醇梭菌的野生型H-NOX蛋白。
示例性H-NOX蛋白的NCBI登录号包括下列：智人(Homo sapiens)β1[gi：2746083]、褐鼠(Rattus norvegicus)β1[gi：27127318]、黑腹果蝇(Drosophila melangaster)β1[gi：861203]、黑腹果蝇(Drosophila melangaster)CG14885-PA[gi：23171476]、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)GCY-35[gi：52782806]、点形念珠藻(Nostoc punctiforme)[gi：23129606]、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)[gi：16127222]、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis[gi：24373702]、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)(ORF 2)[CUCGC_272624]、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)[gi：15896488]以及腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)[gi：20807169]。
示例性H-NOX蛋白还包括下列H-NOX蛋白，其按照它们的基因名、接着是它们的种的缩写和Genbank标识符加以列出(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；或2007年5月21日起可获得的下列蛋白序列，其各自以其全部通过引用由此被并入)：Npun5905_Npu_23129606，alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476，CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi：46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169，Ddes2822_Dde_23475919，CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455，GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpu1_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2、gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352、gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi：71985505)、 GCY1a3_Hs_20535603、GCY1a2-Hs_899477、或GYCa-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared byanimal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMGGenomics 4：5-13)。在这些名称中使用的种的缩写包括：Ana-鱼腥藻(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细菌某种(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻(Nostocpunctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。
其它示范性的H-NOX蛋白包括下列H-NOX蛋白，其按照它们的生物体名称和Pfam数据库登录号(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；或2007年5月21日起可获得的下列蛋白序列，其各自以它们的全部通过引用被并入)列出：线虫种Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryziascurvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryziaslatipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、红鳍东方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、红猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Musmusculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Mus musculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、 褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bostsurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、蜜蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚊Anopheles gambiae str)PESTQ7Q9W6_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻某种(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌(Flavobacteriabacterium)BBFL 7Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Aciaiphiliumcryptum)JF-5 Q2DG60_ACICY、浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsppneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一种嗜冷细菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibrio sp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、 创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光菌(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensisQ2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp)RED65 Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052Q2WVN0_CLOBE。应用如本文所述的Pfam数据库，基于属于H-NOX蛋白家族的这些蛋白质的标识，预测这些序列编码H-NOX蛋白。
可以应用标准方法确定另外的H-NOX蛋白和核酸，其可适合用于本文描述的药物组合物和方法。例如，基于它们与已知H-NOX蛋白和核酸的一级和/或预测的蛋白质二级结构的相似性，标准序列对比和/或结构预测程序可以被用于鉴定另外的H-NOX蛋白和核酸。例如，Pfam数据库采用所定义的对比算法和隐蔽马尔科夫模型(如Pfam 21.0)来将蛋白质分类成家族，如H-NOX家族(Pfam-蛋白结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型的数据库，Copyright(C)1996-2006The Pfam Consortium；GNU LGPL Free Software Foundation，Inc.，59Temple Place-Suite330，Boston，MA 02111-1307，USA)。标准数据库如swissprot-trembl数据库(万维网“expasy.org”，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Protgroup CMU-1rue Michel Servet CH-1211Geneva4，Switzerland)也可以被用于鉴定H-NOX蛋白家族的成员。采用标准结构预测程序如PredictProtein(630West，168Street，BB217，New York，N.Y 10032，USA)的默认设置，H-NOX蛋白的二级和/或三级结构可以被预测。可选地，采用标准方法，H-NOX蛋白的真实二级和/或三级结构可以被确定。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白在相应位置上具有与腾冲嗜热厌氧菌H-NOX中的下列远侧袋残基的任何一个相同的氨基酸：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、Leu144或前述的两个或多个的任何组合。在一些实施方式中，基于它们的氨基酸序列的序列对比，H-NOX蛋白在对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115或Arg135的位置分别具有脯氨酸或精氨酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有对应于褐鼠β1H-NOX的His105的组氨酸。在一些实施方式中，H-NOX具有或被预测具有包括6个α螺旋、之后为2个β折叠、接着为1个α螺旋、之后为2个β折叠的二级结构。H-NOX蛋白的这种二级结构已经被报道。
如果需要，采用标准方法，新鉴定的H-NOX蛋白可以被测试，以确定其是否结合血红素。可以通过应用标准方法——如本文描述那些方法——确定H-NOX蛋白是否结合NO，来测试H-NOX蛋白作为NO载体起作用的能力。 如果需要，本文描述的一个或多个突变可以被引入到H-NOX蛋白中，以使其作为NO载体的特征得到优化。例如，一个或多个突变可以被引入，以改变其NO解离常数、对NO的koff、对NO的k1、对NO的k2、O2解离常数、NO稳定性、NO反应性、血红素自氧化速率、和前述的两个或多个的任何组合。标准技术如本文描述的那些可以被用于测量这些参数。
如本文所讨论的，突变H-NOX蛋白(如下面讨论的I类和II类突变)可以从这些或其它天然野生型来源序列(如，在图2-4D或8A-8DD列出的序列或本文所述的任何其它序列)通过诱变进行衍生。如本文所用的，“从......衍生(或衍生自)”涉及一个或多个突变被引入到其中的蛋白质的来源。例如，“衍生自哺乳动物蛋白”的蛋白质是指将一个或多个突变引入野生型(即，天然存在的序列)哺乳动物蛋白序列产生的目标蛋白质。
突变H-NOX蛋白
如本文进一步讨论的，H-NOX蛋白可以包括一个或多个突变，如与相应野生型蛋白的那些相比，改变NO解离常数、对NO的koff、O2解离常数、对O2的koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性、或前述两个或多个的任何组合的突变。由于本文提供的教导，使用本文所述且普通技术人员已知的技术，可通过随机诱变，接着经验筛选需要的或期望的解离常数、解离速率、NO反应性、稳定性、生理相容性或前述两种或多种的任何组合，来产生工程H-NOX蛋白组。可选地，诱变可以选择性地靶向特定区域或残基，例如H-NOX蛋白的实验确定或预测的三维结构中明显的远侧袋残基(本文图1A，并参见，例如，Boon，E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”NatureChemical Biology 1∶53-59，其通过引用由此并入其全部内容，特别是涉及野生型和突变H-NOX蛋白的序列)或从序列对比中鉴定的进化上保守的残基(本文图2-4D，并且参见例如，Boon E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble GuanylateCyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59，其通过引用由此并入其全部内容，特别是涉及野生型和突变H-NOX蛋白的序列)。
如本文所使用，“突变蛋白”意指与天然发生的蛋白质相比，具有一个或多个突变的蛋白质。在一种实施方式中，突变蛋白具有与所有天然发生的蛋白质的序列不同的序列。在各种实施方式中，突变蛋白的氨基酸序列与天然发生的蛋白的相应区域的序列具有至少约下列任一的同一性：10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％。在一些实施方式中，突变蛋白是含有来自全长蛋白的至少约下列任何个数的连续氨基酸的蛋白片段：25、50、75、100、150、200、300或400个。例如，可以使用带有其中指定的默认参数的序列分析软件(例如Genetics Computer Group的序列分析软件包(Sequence AnalysisSoftware Package)，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710University Avenue，Madison，WI 53705)测量序列同一性。该软件程序通过对各种氨基酸置换、删除和其它修饰赋予同源性程度来匹配相似序列。
如本文所使用，“突变”意指在天然发生的参考核酸或氨基酸序列中的改变。示例性的核酸突变包括***、删除、移码突变、沉默突变、无义突变或错义突变。在一些实施方式中，核酸突变不是沉默突变。示例性的蛋白突变包括一个或多个氨基酸的***(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的***)、一个或多个氨基酸的删除(如N-末端、C-末端和/或内部残基的删除，例如至少约下列任何个数的氨基酸的删除：5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或更多个，或者大约下列任何个数的氨基酸的删除：5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或400个)、一个或多个氨基酸的置换(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的置换)、或前述两种或多种的组合。H-NOX蛋白的示例性功能截短包括β1序列的残基1-385。在一些实施方式中，与天然发生的蛋白质相比，突变蛋白具有至少一个氨基酸改变。在一些实施方式中，突变核酸序列编码与天然发生的蛋白质相比具有至少一个氨基酸改变的蛋白质。在一些实施方式中，核酸不是天然发生的核酸的简并版本，所述天然发生的核酸编码与天然发生的蛋白质具有相同的氨基酸序列的蛋白质。在提到特定氨基酸突变中使用的命名法首先确定野生型氨基酸，接着是残基编号，而最后是取代氨基酸。例如，Y140L表示在残基编号140上的酪氨酸被亮氨酸置换。
“进化上保守的突变”是一种蛋白质中的氨基酸被同一蛋白质家族中另一种蛋白质相应位置上的氨基酸置换。示例性的进化上保守的突变(也表示为I类突变)列于表1A。在表1A中，突变根据人β1H-NOX的序列进行编号/注释，但对有所有H-NOX序列都是类似的。因此，任何其它H-NOX蛋白中的对应位置可以被突变为指出的残基。例如，人β1H-NOX的Phe4可以被突变为酪氨酸，由于其它H-NOX蛋白在该位置具有酪氨酸。对应的苯丙氨酸残基可以被突变为其它任何H-NOX蛋白中的酪氨酸。在具体实施方式中，一个或多个突变被限定为进化上保守的残基。在一些实施方式中，一个或多个突变可包括至少一个进化上保守的突变和至少一个非进化上保守的突变。如果希望，鉴于本文提供的教导，这些突变H-NOX蛋白经受对NO/O2解离常数、NO反应性、稳定性和生理相容性的经验筛选。
表1A.示例性的靶向进化上保守的残基的I类H-NOX突变
Figure BSA0000131545090000341
在一些实施方式中，所述突变为远侧袋突变，例如α-螺旋A、D、E 或G中残基的突变(Pellicena，P.etal.(2004年8月31日).“Crystal Structure ofAn Oxygen-Binding HemeDomain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)：12854-12859)。示例性的远侧袋突变(也表示为II类突变)列于表1B。在表1B中，突变根据人β1H-NOX的序列进行编号/注释，但对于所有H-NOX序列都是类似的。因为若干取代在每个所描述的残基处提供了可行的突变，在每个指出位置的残基可以被改变为任何其它天然或非天然存在的氨基酸(表示为“X”)。这类突变可以产生具有各种期望亲和力、稳定性和反应性特征的H-NOX蛋白。
表1B.示例性的靶向远侧袋残疾的II类H-NOX突变
V8X M73X I145X
L9X F77X I149X
F70X C78X
在具体实施方式中，所述突变为血红素远侧袋突变。如本文所述，在H-NOX家族的NO-结合成员中阻止O2结合的关键分子决定因素是血红素的远侧袋中氢键供体的缺乏。因此，在一些实施方式中，所述突变改变H-NOX结构域和远侧袋内配体之间的氢键结合。在一些实施方式中，所述突变破坏远侧袋的氢键供体和/或赋予相对于对应的野生型H-NOX结构域降低的O2配体结合。示例性的远侧袋残基包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140和Leu144以及任何其它H-NOX蛋白中对应的残基。
不在远侧袋中的残基也可影响血红素基团的三维结构；该结构再影响O2和NO与血红素基团中铁的结合。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白在远侧袋之外具有一个或多个突变。可以被突变但不在远侧袋中的残基的实例包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115和Arg135。在一些实施方式中，所述突变在近侧袋(proximal pocket)中，所述近侧袋包括His105，其作为连接到血红素铁的残基。
在一些实施方式中，当存在两个或多个突变时，至少一个突变在远侧袋之中，并且至少一个突变在远侧袋之外(例如，在近侧袋中的突变)。在一些实施方式中，所有的突变都在远侧袋中。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与由自然界中生物体产生的蛋白质的序列不相同。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与在2006年5月21日或2006年5月22日于任何数据库中发现的序列(例如预测为或已知为H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与在2007年5月21日或2007年5月22日于任何数据库中发现的序列(例如预测为或已知为H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序 列)不相同。
为了降低从人以外来源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突变为人H-NOX中的对应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四级结构表面上的一个或多个氨基酸可以被突变为人H-NOX蛋白中的相应氨基酸。在一些变异中，一个或多个表面氨基酸的突变可与两个或多个远侧袋残基的突变、远侧袋外的一个或多个残基的突变(如，近侧袋中的突变)或前述两种或多种的组合进行组合。
示例性的突变显示于表2。此外，表2中所列残基的任何一个可以被突变为任何其它氨基酸。本发明也涉及本文所述突变的任何组合，例如双突变、三突变或更高的多突变。例如，本文所述突变的任何一种的组合可以在同一H-NOX蛋白中进行。注意，在其它哺乳动物或非哺乳动物H-NOX蛋白的等价位置上的突变也被本发明包括。如果希望，除表2中提到的残基以外的残基也可以被突变。示例性的突变H-NOX蛋白包含一个或多个突变，其相对于对应的野生型H-NOX结构域赋予改变的NO或O2配体-结合，并可作为生理相容的哺乳动物NO血液气体载体起作用。
在表2和所有随后的表格中，突变的残基编号表示在被描述的特定H-NOX蛋白的序列中的位置。例如，腾冲嗜热厌氧菌I5A指的是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX第五个位置上的异亮氨酸被丙氨酸置换。相同的异亮氨酸到丙氨酸的突变可以在任何其它H-NOX蛋白的相应残基中进行(该残基可以是或可以不是其它H-NOX蛋白序列中的第五个残基)。由于哺乳动物β1 H-NOX结构域的氨基酸序列最多有两个氨基酸不同，所以，当被引入野生型大鼠β1 H-NOX蛋白时产生期望突变H-NOX蛋白的突变也被预期，在被引入来自其它哺乳动物如人的野生型β1H-NOX蛋白中时产生期望的突变H-NOX蛋白。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个突变，其中对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115、Arg135或Tyr140，β1(1-385)的I145，或嗜肺军团菌2的Phe142的残基被任何其它氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少两个突变，其中至少一个突变是对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115、Arg135或Tyr140，β1(1-385)的I145，或嗜肺军团菌2的Phe142的残基被任何其它氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的I5A突变、I5L突变、W9F突变、Y140F突变、Y140L突变、Y140H突变、W9F Y140H双突变、或F78Y Y140F双突变，或β1的I145Y突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的W9Y突变、W9H突变、W9N突变、N74H突变、N74E突变、N74A突变、P115A突变、R135Q突变、I5L P115A双突变、N74AY140H双突变或W9F N74A双突变。在一些实施方式中，与相应的野生型蛋白(如褐鼠或智人β1)相比，H-NOX蛋白中的至少一个C-末端氨基酸(如至少大约50个连续的C- 末端氨基酸或在大约25至大约200个之间的连续C-末端氨基酸)已被除去。
表2.来自腾冲嗜热厌氧菌(Tt)、嗜肺军团菌(Lp)、脱硫脱硫弧菌(Dd)、霍乱弧菌(Vc)、点形念珠藻(Np)、肉毒梭菌(Cb)、丙酮丁醇梭杆菌(Ca)、大鼠、人、秀丽隐杆线虫(Ce)的示例性H-NOX突变
Figure BSA0000131545090000371
Figure BSA0000131545090000381
H-NOX蛋白的修饰
野生型或突变H-NOX蛋白的任何一种都可以使用标准方法进行修饰和/或配制，以增强治疗或工业应用。例如并且尤其是应用到异源工程H-NOX蛋白时，本领域内已知各种方法用于将这样的试剂与免疫监视隔离，包括交联、聚乙二醇化、糖修饰等(例如，Rohlfs，R.J.et al.(1998年5月15日)“Arterial Blood Pressure Responses to Cell-FreeHemoglobin Solutions And The Reaction With Nitric Oxide，”J.Biol.Chem.273(20)：12128-12134；Migita，R.et al.(1997年6月).“Blood Volume And Cardiac Index inRats After Exchange Transfusion With Hemoglobin-Based Oxygen Carriers，”J.Appl.Physiol.82(6)：1995-2002；Vandegriff，K.D.et al.(2004年8月15日)“Kineticsof NO and O2Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated HumanHaemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)：183-189，它们各自通过引用由此并入其全部内容，尤其是关于蛋白质的修饰)，以及普通技术人员已知的其它技术。将H-NOX蛋白与诸如人血清白蛋白的人蛋白融合可以提高血清半衰期、粘度和胶体渗透压(colloidal oncoticpressure)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白在其合成过程之中或之后被修饰，以降低其免疫原性和/或提高其血浆保留时间。H-NOX蛋白也可以被包封(例如在脂质体或纳米颗粒中包封)。
野生型或突变H-NOX蛋白的特征
如本文所述，已经制备了大量不同的提供NO解离常数范围、O2解离常数范围、NOkoff范围、O2koff范围、NO反应性范围和稳定性范围的H-NOX突变蛋白。在一些实施方式中，与目前使用的输送NO的化合物——如任何生物转化为NO的有机硝酸盐——相比，H-NOX蛋白具有类似的或改善的NO解离常数、O2解离常数、NO koff、O2koff、NO反应性、自氧化速率、血浆保留时间、或前述的两者或多种的任何组合。
如上面所讨论的，固有的低NO反应性(和高的NO稳定性)使野生型和突变H-NOX蛋白成为期望的NO载体，因为在O2存在下由NO钝化H-NOX蛋白的可能性较低。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有低的O2亲和力(如在37℃至少大约1μM的O2解离常数)或没有可检测到的O2亲和力。由于很少的——如果有的话——O2结合到H-NOX蛋白，结合到H-NOX蛋白的血红素的O2的NO氧化为最少。因而最少的NO、O2和H-NOX蛋白被这种NO氧化所钝化。因 此，更多的NO可以被输送到个体中期望的位点，而较少的能够被个体中组织利用的O2被破坏。
如本文所使用，“血红蛋白”表示来自被良好表征的血红蛋白家族的蛋白或其突变体，它们是红细胞中含铁的O2输送金属蛋白。纯化的、无基质人血红蛋白具有约200-500nM的对O2动力学KD。该值是亚基依赖性的。
“6-配位FeII-NO复合物”表示6-配位铁-亚硝酰基，其在大约416-422nm处产生紫外-可见索雷(UV-Vis Soret)峰，如，例如由Boon，E.M.等人(2006年8月)，“Nitric OxideBinding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclaseβ1 H0NOXDomain，”J.Biol.Chem.281(31)：21892-21902所描述的，其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于含有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白样品的百分数和含有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白样品的百分数的确定。
“5-配位FeII-NO复合物”表示5-配位铁-亚硝酰基，其在大约397-400nm处产生紫外-可见索雷峰，如，例如由Boon，E.M.等人(2006)，“Nitric Oxide Binding toProkaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclaseβ1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)：21892-21902所描述的，其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于含有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白样品的百分数和含有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白样品的百分数的确定。
如本文使用的，“koff”表示解离速率，如从蛋白质中释放NO或O2的速率。较低数值的低koff表示较慢的解离速率。对于具有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白，如Boon，E.M.等人(August 2006)，“Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the SolubeGuanylate Cyclaseβ1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)：21892-21902和Boon，E.M等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59所述的计算对NO的koff，其各自通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff的计算。对于具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白，对NO的koff由对NO的k1和对NO的k2来描述，如由Winger，J.A.等人(January 2007)“Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-NitricOxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)：897-907所描述的，其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是H-NOX蛋白的NOkoff、NO k1和NO k2的计算。对于包含5-配位FeII-NO复合物和6-配位FeII-NO复合物的混合物的H-NOX蛋白，对NO的koff由对NO的k1和对NO的k2来描述，如由Winger，J.A等人(January 2007)，“Dissociation of NitricOxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-Nitric Oxide/Oxygen BindingDomain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)：897-907所描述的，其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1和NO k2的计算。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃为大约1x 10-4s-1至大约10s-1之间，如在37℃在大约1x 10-4s-1至大约0.012s-1 之间，在大约1x 10-4s-1至大约0.007s-1，大约0.005s-1至大约0.011s-1，或大约1x10-4s-1至大约1x 10-3s-1。在不同的实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff在37℃为大约1至大约1,000s-1，如在37℃大约1至大约50s-1，大约50至大约100s-1，大约100至大约250s-1，大约250至大约500s-1，大约500至大约750s-1，或大约750至大约1,000s-1。
“kon”表示结合速率，如NO或O2结合到蛋白质的速率。较低数值的低kon表示较慢的结合速率。在不同的实施方式中，H-NOX蛋白的对O2的kon在20℃为大约0.14至大约60μM-1s-1，如大约6至大约60μM-1s-1，大约6至大约12μM-1s-1，大约15至大约60μM-1s-1，大约5至大约18μM-s-1，大约6至大约15μM-1s-1。
“解离常数”表示“动力学解离常数”或“计算的解离常数”。“动力学解离常数”或“KD”表示动力学解离速率(off-rate)(koff)与动力学结合速率(on-rate)(kon)的比率，如采用标准方法(如，标准光谱法、停流法、或闪光光解法)——包括技术人员已知的和/或本文描述的方法——被测定为绝对值的KD值。“计算的解离常数”或“计算的KD”指基于测量的koff的动力学解离常数的近似值。对于计算的对NO的KD，H-NOX蛋白的对NO的kon的值被假定为710μM-1s-1，其是报道的β1(1-385)的kon，该kon在4℃被测量并且在37℃没有显著增加(Zhao，等人(1999)，“A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble GuanylateCyclase，”PNAS.96：14753-14758，其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于H-NOX蛋白质的NO kon的计算)。对于计算的对O2的KD，kon的值通过如本文所述的动力学KD和koff之间的相关性得到。
在不同的实施方式中，H-NOX蛋白结合NO的动力学或计算的KD在相同的条件下(如在20℃)在血红蛋白的大约0.01至大约100倍之内，如在相同的条件下(如在20℃)，在血红蛋白的大约0.1至大约10倍之间或在大约0.5至大约2倍之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在37℃在大约0.1至大约20pM之间，如在37℃，为大约0.5至大约15，大约0.5至大约12，大约0.7至大约4，或大约0.7至大约3。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在37℃为至少大约0.1pM，如在37℃为至少大约0.5、1、3、5、10、12、50、100、400、500、1000、2000、3000或4000pM的任一个。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在37℃为5000pM以下，如在37℃为大约4000pM、3000pM、2000pM、1000pM、500pM、400pM、100pM、50pM、12pM、10pM、5pM、3pM或1pM的任一个以下。
在不同的实施方式中，H-NOX蛋白结合O2的动力学或计算的KD在相同的条件下(如在20℃)在血红蛋白的大约0.01至大约100倍之内，如在相同的条件下(如在20℃)，在血红蛋白的大约0.1至大约10倍之间或在大约0.5至大约2倍之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，如在37℃为至少大约5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、 70μM、80μM、90μM、或100μM的任一个。在一些实施方式中，在37℃没有可检测到的与O2的结合，如采用如本文所述的紫外-可见光谱法，没有可检测到的O2结合(如，在O2存在下，在～418nm没有可观察到的峰，例如，当如在O2不存在的情况下所观察到的Soret峰保持在～431nm时或当由于蛋白质氧化Soret峰移动到～410nm时)。
如本文使用的，“NO亲和性”是定性的术语，其指NO结合到蛋白质的强度(如结合到血红素基或结合到氧，所述氧结合到与蛋白质结合的血红素基上)。这种亲和性受对NO的koff和kon两者的影响。数值较小的NO KD值意味着较高的亲和性。“氧亲和性”是定性术语，其指氧结合到蛋白质的血红素部分的强度。这种亲和性受对氧的koff和kon两者的影响。数值较小的氧KD值意味着较高的亲和性。
如本文所用的，“NO稳定性”指在氧存在下蛋白质对NO氧化的稳定性或抵抗力。例如，蛋白质在氧存在下结合到NO时不被氧化的能力可表示该蛋白质的NO稳定性。在一些实施方式中，在20℃温育大约1、2、4、6、8、10、15或20小时的任一段时间之后，大约50、40、30、10或5％的任一个以下的H-NOX蛋白被氧化。
如本文所使用，“NO反应性”指的是在2μM蛋白质的浓度下，在氧存在的情况下，在血红素结合蛋白的血红素中的铁被NO氧化的速率。单位为s-1的较低数值的NO反应性表示较低的NO反应性。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1，例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃在约0.1到约600s-1之间，例如，在20℃在约0.5到约400s-1、约0.5到约100s-1、约0.5到约50s-1、约0.5到约10s-1、约1到约5s-1或约0.5到约2.1s-1之间。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的反应性在相同条件下，如在20℃，比血红蛋白的反应性至少低约10、100、1,000或10,000倍。
如本文所使用，“自氧化速率”指的是在血红素结合蛋白的血红素中铁被自氧化的速率。单位为s-1的较低数值的自氧化速率表示较低的自氧化速率。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1.0h-1，例如在37℃小于约下列值的任何一个：0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、0.3h-1、0.2h-1、0.1h-1或0.05h-1。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃，在约0.006到约5.0h-1之间，例如在37℃，约0.006到约1.0h-1、约0.006到约0.9h-1或约0.06到约0.5h-1。
在多种实施方式中，突变H-NOX蛋白具有(a)在血红蛋白的2个数量级之内的NO或O2解离常数、结合速率(对NO或O2的kon)或解离速率(对O2或NO的koff)，(b)分别具有比sGCβ1弱(例如，至少弱约10倍、100倍或1000 倍)的NO亲和力，(c)比血红蛋白低至少1000倍的与结合O2的NO反应性，(d)比血红蛋白高至少2、10、100或1000倍的体内血浆保留时间，或(e)前述两种或多种的任何组合。
示例性的适当NO载体提供了在血红蛋白的两个数量级之内的解离常数，即在约0.01到100倍之间，例如在血红蛋白的解离常数的约0.1到10倍之间，或约0.5到2倍之间。各种已建立的技术可被用于量化解离常数，例如本文所述的技术(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”NatureChem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月).“Ligand Discrimination inSoluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.et al.(2005).“Ligand Specificity ofH-NOX Domains：From sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)：892-902)，Vandegriff，K.D.et al.(August 15，2004)“Kinetics of NO and O2Binding to aMaleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)：183-189，它们的每个都在此被完整引入作为参考，尤其是涉及解离常数的测量)，以及普通技术人员已知的那些技术。示例性的NO载体为带有结合O2的H-NOX蛋白提供了低的或最小的NO反应性，例如比血红蛋白低的NO反应性。在一些实施方式中，NO反应性比血红蛋白的NO反应性低得多，例如低至少约10、100、1,000或10,000倍。多种已建立的技术可被用于量化NO反应性(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity inSoluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Familyof Heme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.et al.(2005).“Ligand Specificity of H-NOX Domains：From sGC to Bacterial NOSensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)：892-902)，Vandegriff，K.D.et al.(2004年8月15日)“Kinetics of NO and O2Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-ConjugatedHuman Haemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)：183-189，它们的每个都在此被完整引入作为参考，尤其是涉及NO反应性的测量)，以及普通技术人员已知的那些技术。因为野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX具有这样的低NO反应性，所以其它野生型H-NOX蛋白和突变H-NOX蛋白可具有相似的低NO反应性。例如，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H具有与野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX相似的NO反应性。
用于NO输送的示范性突变体具有比sGCβ1弱的的NO亲和性，优选地弱至少10倍、100倍、或1000倍。对于治疗性NO输送(如，在心脏病发作、心脏直视手术或中风期间/之后)，一系列具有不同亲和性的工程H-NOX蛋白在特定的疾病状况下被经验测试功效，在一些实施方式中NO亲和性的范围为0.1至1000nM。
此外，适当的NO载体提供了高的或最大的稳定性，特别是体内稳定性。多种稳定性量度可以被使用，例如氧化稳定性(如，对自氧化或NO氧化 的稳定性)、温度稳定性和体内稳定性。多种已建立的技术可被用于量化稳定性，例如本文所述的技术(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月).“Ligand Discriminationin Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.et al.(2005).“Ligand Specificity ofH-NOX Domains：From sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)：892-902)，以及普通技术人员已知的那些技术。对于血浆、血液或组织中的体内稳定性，示例性的稳定性量度包括保留时间、清除速率和半衰期。来自嗜热生物体的H-NOX蛋白被预期在高温下稳定。在多种实施方式中，血浆保留时间比血红蛋白的血浆保留时间高至少约2、10、100或1000倍(例如，Bobofchak，K.M.et al.(2003年8月).“A Recombinant PolymericHemoglobin With Conformational，Functional，And Physiological characteristicsof an in vivo O2transporter，”Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.285(2)：H549-H561)。普通技术人员将认识到，血红蛋白基载体受到来自血浆的无细胞血红蛋白的快速清除的限制，该快速清除的原因在于存在将无细胞血红蛋白从血浆中除去的血红蛋白受体。由于血浆中没有H-NOX蛋白的受体，野生型和突变H-NOX蛋白被预期具有比血红蛋白更长的保留时间。如果希望，血浆保留时间可以通过聚乙二醇化或交联H-NOX蛋白，或使用标准方法(如本文所述的那些和普通技术人员已知的那些)将H-NOX蛋白与另一蛋白融合而提高。
在不同的实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常数的2个数量级之内，而H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃在大约1x 10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μm。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃为大约1x 10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μm。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃为大约1x 10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如，在20℃为大约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，而H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如，在20℃为600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃为大约1x 10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，并且H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为约700s-1以下(如，在20℃为约 600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1和4厘泊(centipoise(cP))之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的胶体渗透压在20和50mm Hg之间。
表3列出了野生型和突变H-NOX蛋白的示例性大小、氧亲和性、自氧化稳定性、NO反应速率以及修饰。在表3中，载体大小是指修饰的(如PEG化的)或未修饰的H-NOX蛋白的分子量。
表3：H-NOX蛋白的示例性实施方式
Figure BSA0000131545090000441
在表4-14中报道了具体突变体的示例性数据。在表4-14中，β1和β2指来自大鼠H-NOX蛋白的蛋白质。由于哺乳动物β1H-NOX结构域的氨基酸序列至多两个氨基酸不同，所以对于其它哺乳动物H-NOX蛋白，如人β1中的相应突变，相似的结果被预期。
表4表明，NO结合的解离常数可以通过使H-NOX蛋白中的一个或多个残基突变而显著地改变。另外，变构调节剂显著地影响sGC的NO解离常数和解离速率的能力支持了这样的突变能力，所述突变改变sGC或其它H-NOX蛋白的结构以改变NO的解离常数和解离速率。如果需要，通过结合表4中列出的任何突变或通过将一个或多个另外的突变引入到H-NOX蛋白中，NO结合的解离常数可以被进一步改变，如本文所述。
表4.NO结合到H-NOX和其它血红素蛋白的KD值
Figure BSA0000131545090000442
Figure BSA0000131545090000451
表5表明，通过突变H-NOX蛋白中的一个或多个残基，NO结合的解离速率(koff)可以被显著地突变。这些示例性突变H-NOX蛋白的koff在37℃在0.00013到0.011s-1的范围内。对于表5，应用如在每一引用的文献中指明的化学阱，得到血红素蛋白的NO解离速率。为了比较，采用NO电极对来自有机硝酸盐和NONOate的NO解离速率进行了测量并且使用氧基血红素阱进行确认。必要时，利用大约每10℃速率加倍这一事实将数值调节到37℃。如果需要，通过将表5中列出的单或双突变的任何组合或通过将一个或多个另外的突变引入到H-NOX蛋白中，NO结合的koff可以被进一步改变，如本文所述。
表5.血红素蛋白和硝基血管扩张剂在37℃下的NO解离速率的比较。
Figure BSA0000131545090000452
Figure BSA0000131545090000461
如表6中所示，将一个或多个突变引入到野生型H-NOX蛋白中使自氧化速率和O2解离速率发生改变。如果需要，通过将表6中列出的单或双突变的任何组合或通过将一个或多个另外的突变引入到H-NOX蛋白中，自氧化速率或O2解离速率可以被进一步改变，如本文所述。
表6.野生型和II类突变H-NOX蛋白对自氧化的稳定性、O2结合特性(如O2解离的速率)以及远侧袋H-键合残基被列出。
Figure BSA0000131545090000462
Figure BSA0000131545090000471
表7说明了通过引入一个或多个突变，H-NOX蛋白的O2结合速率(kon)、O2解离速率(koff)、O2解离常数(KD)以及自氧化速率(kox)的改变。在一些实施方式中，表7中列出的单或双突变的任一个与另一个突变(如表7中的另一个突变或本文所述的任何其它突变)结合，以进一步改变O2结合速率(kon)、O2解离速率(koff)、O2解离常数、自氧化速率或前述两个或多个的组合。
表7.组氨酰基连接的FeII血红素蛋白的O2结合动力学常数
Figure BSA0000131545090000472
Figure BSA0000131545090000481
表8说明，H-NOX蛋白中的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧化速率、NO反应性以及FeII-O2复合物的稳定性可以通过引入一个或多个突变被改变。在一些实施方式中，表8中列出的任一单突变或双突变与另一个突变(如表8中的另一个突变或本文所述的任何其它突变)结合，以进一步改变H-NOX蛋白中的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧化速率、NO反应性或FeII-O2复合物的稳定性。如技术人员将会理解的，一个或多个额外的突变的引入，如本文描述的 那些突变，可以被用于进一步改变这些数值。
表8.H-NOX蛋白中的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧化速率、NO反应性和FeII-O2复合物的稳定性。
Figure BSA0000131545090000491
表9表明通过使H-NOX蛋白中的一个或多个残基发生突变，O2结合的解离常数可以被显著改变。这些示例性的H-NOX蛋白的动力学KD值在20℃在21.20nM至1000000.00nM的范围内。如果需要，通过将表9中列出的任一单或双突变组合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，O2结合的解离常数可以被进一步改变，如本文所述。
表9.根据O2结合的解离常数的数值排列的野生型和突变的H-NOX蛋白以及参照蛋白。
Figure BSA0000131545090000492
Figure BSA0000131545090000501
表10表明，通过使H-NOX蛋白中的一个或多个残基发生突变，O2结合的解离速率可以被显著改变。这些示例性的H-NOX蛋白的解离速率在20℃在0.21s-1到23.4s-1的范围内。如果需要，通过将表10中列出的任一单或双突变结合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，O2结合的解离速率以被进一步改变，如本文所述。
表10.根据O2结合的解离速率的数值排列的野生型和突变的H-NOX蛋白以及参照蛋白。
Figure BSA0000131545090000502
Figure BSA0000131545090000511
表11表明，通过使H-NOX蛋白中的一个或多个残基发生突变，O2结合的结合速率可以被显著改变。这些示例性的H-NOX蛋白的结合速率在20℃在60μM-1s-1至0.14μM-1s-1的范围内。如果需要，通过将表11中列出的任一单或双突变结合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，O2结合的结合速率可以被进一步改变，如本文所述。
表11.根据O2结合的结合速率的数值排列的野生型和突变的H-NOX蛋白以及参照蛋白。
Figure BSA0000131545090000512
Figure BSA0000131545090000521
表12说明示了例性H-NOX突变对NO和O2结合的影响。表12中列出的Fe-未连接形式的每一个数字是用于单峰(其被列在β列和α列之间)。当NO或O2结合时，该单峰分成两个峰，β和α(其被分别列于β列和α列下方)。如果需要，通过将表12中列出的任一单或双突变结合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，NO或O2结合可以被进一步改变，如本文所述。
表12：一些组氨酰基-连接的FeII血红素蛋白复合物的紫外-可见光峰的位置a。
Figure BSA0000131545090000522
Figure BSA0000131545090000531
表13包含一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO和Fe(II)-O2复合物的UV-可见光峰的位置。当血红蛋白或H-NOX蛋白厌氧时，其在～431nm处具有一个Soret(索雷)峰，并且其处于未连接态。如果H-NOX蛋白未结合O2，那么当O2被加入时，该Soret峰不改变。如果H-NOX蛋白结合NO并且形成6-配位的铁-亚硝酰基复合物，那么当NO被加入时，其Soret峰将移动到420nm和424nm之间。如果H-NOX蛋白结合NO并且形成5-配位的铁-亚硝酰基复合物，那么其Soret峰将移动到～399nm。如果H-NOX蛋白没有结合O2，那么当O2被加入时，Soret峰将不会发生变化。如果H-NOX蛋白结合O2，那么当O2被加入时，其Soret峰将移动414nm和418nm之间，这与发生在血红蛋白中的移动相同，表示O2结合到血红素。氧化的H-NOX(Fe(III))的Soret峰可能与储存或使用之后的H-NOX蛋白的状态有关。如果需要，通过将表13中列出的任一单或双突变结合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，NO或O2结合可以被进一步改变，如本文所述。
表13.一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO以及Fe(II)-O2复合物的紫外-可见峰光的位置。
Figure BSA0000131545090000532
Figure BSA0000131545090000541
a“N.A.”表示由于在较长的波长处的低信号，不可指定的α和β谱带。
复合物 蛋白质 Soret β α
Fe(II)-NO Tt wt 420 550 578
Tt W9Y 420 552 576
Tt N74A 421 572
Tt N74H 424 562
Tt N74A-Y140H 421 549 576
Tt W9H 420 548 575
Tt N74E 422 544 571
Tt W9N 421 541 576
Tt wt His<sub>6</sub> 420 547 576
复合物 蛋白质 Soret β α
Fe(II)-O<sub>2</sub> Tt wt 416 556 591
Tt W9Y 416 555 590
Tt N74A 418 553 589
Tt N74H 418 553 589
Tt N74A-Y140H 414 555 584
Tt W9H 418 556 589
Tt N74E 417 555 587
Tt W9N 416 588 553
Tt wt His<sub>6</sub> 416 556 591
表14包含示例性腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白的自氧化速率。如果需要，通过组合表14中列出的任何突变或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，自氧化速率可以被进一步改变，如本文所述。2nm和3nm的值在表14中是指UV-可见光Soret峰在观察的时间段内偏移2到3nm；这样极小的改变可能是由于自氧化。
表14.腾冲嗜热厌氧菌(Tt)H-NOX蛋白的自氧化速率
蛋白质 自氧化速率(25℃，hr<sup>-1</sup>)<sup>a</sup>
Tt wt 稳定
Tt W9Y 稳定
Tt N74A 稳定
Tt N74H 在4℃稳定，在RT非常慢(2nm)
Tt W9H 稳定
Tt N74E 在4℃非常慢(2nm)，在RT缓慢
Tt W9N 在4℃稳定，在RT非常慢(3nm)
Tt wt His<sub>6</sub> 稳定
Tt I75F-His6 稳定
Tt L144F-His6 稳定
a“稳定”表示在至少24小时之后血红素没有发生氧化。
“RT”表示室温
H-NOX核酸
本发明也以编码本文所述的任何突变H-NOX蛋白的核酸为特征。如本文所使用，“核酸”指的是单链或双链形式的两个或多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且除非另有限制，包含天然发生核苷酸的类似物，其以与天然发生的核苷酸相似的方式与核酸杂交。在一些实施方式中，所述核酸为重组核酸。“重组核酸”表示一种目标核酸，其不含一个或多个在所述目标核酸从中衍生的生物体的天然发生的基因组中位于所述目标核酸侧翼的核酸(如基因)。在一些实施方式中，H-NOX核酸被可操作地连接到另一核酸，所述另一核酸编码另一蛋白的全部或部分，以便该重组核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包括H-NOX蛋白(如，具有或不具有来自H-NOX蛋白另一结构域的H-NOX结构域)，以及诸如人血清白蛋白的另一蛋白的全部或部分。该术语因此包括，例如被参入载体、参入自主复制质粒或病毒、或参入原核生物或真核生物基因组DNA的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子(如，cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA片段)存在的重组DNA。
本发明也以含有一个或多个编码本文所述的任何突变H-NOX蛋白的核酸的载体为特征。如本文所使用，“载体”表示能够输送，并任选地在宿主细胞中表达一个或多个目标核酸的构建体(construct)。载体的实例包括，但不限于，质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、黏粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，载体包含在表达调控序列调控下的核酸。“表达调控序列”表示指导目标核酸转录的核酸序列。表达调控序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或者增强子。该表达控制序列被可操作地连接到待转录的核酸片段。
在具体实施方式中，所述核酸包括图2-4D或8A-8DD中所示的任何 核酸的片段或完整核酸序列。在一些实施方式中，所述核酸包括至少约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多个连续的来自H-NOX核酸的核苷酸，并且与其所衍生的H-NOX核酸相比包含一个或多个突变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变)。在多种实施方式中，与其从中衍生的H-NOX核酸相比，突变H-NOX核酸包含少于约任何20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变。本发明也以编码突变H-NOX蛋白的任何核酸的简并变体(degenerate variant)为特征。
本发明也包括含有至少一种编码本文所述突变H-NOX蛋白的核酸的细胞或细胞群。示例性的细胞包括昆虫、植物、酵母、细菌和哺乳动物细胞。这些细胞可用于使用标准方法——如本文所述的那些方法——生产突变H-NOX蛋白。
H-NOX蛋白的制剂
本文所述的任何野生型或突变H-NOX蛋白可被用于药物组合物或非药物组合物的配制。如下文进一步讨论，这些制剂在多种治疗应用和工业应用中有用。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白(例如本文所述的任何H-NOX野生型或突变蛋白)和药学上可接受的载体。在多种实施方式中，H-NOX蛋白是分离的或纯化的蛋白质。“药学上可接受的载体”是表示任何这样的物质——当与活性成分结合时，基于普通技术人员的知识，其允许所述成分保持生物活性并且不引起不可接受的免疫反应(如严重的过敏或过敏性休克)。实例包括，但不限于，任何标准药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、和各种类型的润湿剂。用于气雾剂或肠胃外给药的示例性的稀释剂是磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含这类载体的组合物通过已知的传统方法(参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，The Science andPractice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000，它们在此被完整引入作为参考，尤其是涉及制剂的部分)进行配制。
尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体可被用于本发明的药物组合物，载体的类型将根据给药方式而改变。组合物可以被配制，用于任何合适方式的给药，包括，例如静脉内、动脉内、囊内(intravesicular)、吸入、腹膜内、肺内、肌肉内、皮下、气管内、经粘膜、眼内、鞘内或经皮给药。对于肠胃外给药，例如皮下注射，载体可包括，例如水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于经口给药，可利用上述载体的任何一种，或者固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖或碳酸镁。生物可降解微球(例如，聚乳酸、聚甘醇酸(polylactate polyglycolate))也可被用作载体。
在一些实施方式中，所述药物组合物或非药物组合物包括缓冲液(如中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水等)、糖(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精等)、抗氧化剂、螯合剂(如EDTA、谷胱甘肽等)、防腐剂、用于结合和/或运输氧的另一种化合物、非活性成分(如稳定剂、填料等)或前述两种或多种的组合。在一些实施方式中，所述组合物被配制为冻干物。H-NOX蛋白也可能使用公知的技术包封入脂质体或纳米颗粒中。可以被用于H-NOX蛋白的其它示例性制剂由例如美国专利号6,974,795和6,432,918进行了描述，其在此被完整引入作为参考，尤其是关于蛋白质制剂的部分。
本文所述的组合物可作为持续释放制剂(例如，诸如胶囊或海绵的制剂，其在给药后产生缓慢释放的化合物)的一部分进行给药。这样的制剂通常可使用公知的技术加以制备，并通过例如经口、直肠、皮下植入进行给药，或通过在期望的目标部位植入进行给药。持续释放制剂可含有分散于载体基质中和/或包含于被速率控制膜包围的储库(reservoir)中的H-NOX蛋白。这类制剂中使用的载体是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。在一些实施方式中，所述制剂提供了相对恒定水平的H-NOX蛋白释放。包含在持续释放制剂中的H-NOX蛋白的量取决于植入部位、释放速率和期望持续时间、以及待治疗或预防的病症的本质。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的野生型或突变H-NOX蛋白。术语“有效量”意思是本文所述一种或多种蛋白的这样的量——基于执业专门医师的知识，与其功效和毒性的参数结合，其在给定的治疗形式中应该有效。如本领域所知，有效量可以是一个或多个剂量。如临床中所理解，与另一种药物、化合物或药物组合物一起，药物组合物的有效剂量可能达到或可能不会达到。因此，有效量可以在给予一种或多种治疗试剂的背景下加以考虑，并且如果与一种或多种其它试剂结合，期望或有益的结果可以或已经达到，则单一药剂可以被认为以有效量给药。
血红蛋白作为血液替代物的示例性剂量为每千克患者体重约10mg到约5克或更高的胞外血红蛋白。H-NOX蛋白的相似剂量可被用于NO的输送。因此，在一些实施方式中，给予人的有效量的H-NOX蛋白在数克到超过约350克之间。H-NOX蛋白的其它示例性剂量包括在适当的输注速率——例如约0.5ml/min(参见，例如Winslow，R.Chapter 12In Blood Substitutes)下大约4.4、5、10或13G/DL(其中G/DL是H-NOX蛋白溶液在输注进入循环***之前的浓度)的任何一个。在一些实施方式中，10毫克以下剂量的H-NOX蛋白被用于临时性血管舒张。可以理解，每种剂型的各个剂量中包含的活性成分的单位含量本身不需要构成有效量，因为必要的有效量可通过多次给药的组合效果达到。包含在药物组合物中H-NOX蛋白量的选择取决于使用的剂型、治疗的病症、以及根据本领域普通技术人员确定的要达到的具体目的。
示例性的组合物包括遗传工程改造的重组H-NOX蛋白，其可被分离或纯化，所述重组H-NOX蛋白质包含一个或多个突变，所述突变相对于对应野生型H-NOX蛋白整体上赋予改变的NO或O2配体结合，并作为生理上相容的哺乳动物血液气体NO载体起作用。例如，本文所述的突变H-NOX蛋白。
本发明也提供NO载体，其包含一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白或主要由其组成。适合用于配制蛋白质(如被输送到血液或胃肠***的蛋白质)的缓冲液和其它成分在本领域内是已知的。
为了减轻或防止被给予药物组合物的人类对象的免疫反应，人H-NOX蛋白(野生型人蛋白质或一个或多个突变已经被引入其中的人蛋白质)或其它非抗原性H-NOX蛋白(如，哺乳动物H-NOX蛋白)可以被使用。为了降低或消除从人以外来源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突变为人H-NOX中的对应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四级结构表面上的一个或多个氨基酸可以被突变为人H-NOX蛋白中的相应氨基酸。
H-NOX蛋白的治疗应用
本文描述的任何野生型或突变H-NOX蛋白(如分离的或纯化的H-NOX蛋白)或药物组合物可以在治疗应用中使用。对于所治疗的具体适应征，基于期望的NO解离常数、O2解离常数、NO koff、O2koff、NO反应性、NO稳定性、自氧化速率、血浆停留时间、半衰期或前述两种或多种的任何组合，可以选择具体的H-NOX蛋白，用于这类应用。H-NOX蛋白可以被用于治疗任何输送NO对其有益的病症。典型的靶指征包括功能性NO缺乏的疾病，如其中需要血管扩张剂或NO载体的病症，包括由慢性高血压加剧的病症，如心力衰竭、肾功能衰竭和中风。在不同的实施方式中，治疗的病症是心血管病症(如，心肌梗塞或心脏手术)、高血压、血管收缩性病症(如，中风)、***功能障碍、便秘、或肠梗阻。对于便秘或肠梗阻的治疗，H-NOX蛋白可以被用于输送NO，以治疗***控制缺陷，因而使平滑肌松弛。例如，当在消化***中起作用的H-NOX蛋白通过消化***时，所述H-NOX蛋白可以使回肠的平滑肌松弛。所述方法和组合物可应用于急性的情况(向组织或特定部位快速提供NO，如急性心肌梗塞或中风)和慢性的情况(如，慢性高血压或从心肌梗塞或中风的急性后恢复(post-acute recovery fromcardiac infarction or stroke))。
在多种实施方式中，本发明以向个体(例如，哺乳动物，如灵长类(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科或猫科)输送NO的方法为特征，该方法通过给予需要它的个体足以向该个体输送NO的量的野生型或突变H-NOX蛋白进行。在一些实施方式中，本发明提供了携带或向诸如哺乳动物的个体输送血液气体的方法，其包括向该个体(如，哺乳动物)的血液输送一种或多种H-NOX组合物的步骤。用于向血液、消化***或组织(如，哺乳动物血液或 组织)输送蛋白质的方法在本领域内是已知的。在多种实施方式中，所述H-NOX蛋白是能够结合血红素的脱辅基蛋白或是具有血红素结合的全蛋白质。在向个体施用H-NOX蛋白之前，H-NOX蛋白可具有或可不具有结合的血红素。在一些实施方式中，NO在其被输送到个体之前结合到H-NOX蛋白。在其它实施方式中，在给予所述个体所述蛋白之前，NO未被结合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白将NO从该个体中的一个位置运输到该个体中的另一个位置。例如，在具体的实施方式中，H-NOX蛋白结合血流中的NO并且只在NO浓度非常低的地方(如血管收缩部位)释放NO。该NO的靶向输送可以比传统血管扩张剂产生更小的副作用，所述传统血管扩张剂独立于局部NO浓度而释放NO并且因此全身性起作用，具有副作用如头痛和周围刺痛。
本发明的方法可以被用于治疗任何个体。对于本文的应用，除非另外清楚指出，如本文所使用，“个体”意思是哺乳动物，包括但不限于，灵长类(如，人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科和猫科。因此，本发明可用于人类药物和兽医环境，包括在农业牲畜和家养宠物中的用途。所述个体可已经被诊断患有、被怀疑患有或处于发展某种指征的风险，例如心血管疾病(例如，心肌梗塞或心脏手术)、高血压、由高血压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩性病症(如中风)、功能性NO缺乏、***功能障碍、便秘、或肠梗阻。该个体可以是遗传上易于发展这类病症或以其它方式易于发展这类病症。
如本文所用的，“需要它的(in need thereof)”包括患有病症或疾病(如，心血管病症如心肌梗塞或心脏手术，高血压，由高血压加剧的病症如心力衰竭、肾功能衰竭或中风，血管收缩性病症如中风，功能性NO缺乏，***功能障碍，便秘或肠梗阻)或处于所述病症或疾病的风险中的个体。如本文所使用的，“处于风险中”的个体是处于发展病症如心血管病症(如，心肌梗塞或心脏手术)、高血压、由高血压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩性病症(如中风)、功能性NO缺乏、***功能障碍、便秘、或肠梗阻的风险中的个体。“处于风险中”的个体可以具有或可以不具有可检测的疾病或病症，并且在本文描述的治疗方法之前可以显示出或不显示出可检测的疾病。“处于风险中”表示个体具有一个或多个所谓的风险因素，其是与疾病和病症的发展相关的可测量的参数并且在本领域内是已知的。具有一种或多种这些风险因素的个体比没有这些风险因素(一种或多种)的个体具有更高的可能性发展所述疾病或病症。这些风险因素包括但不限于，年龄、性别、种族、饮食、以前的疾病史、前兆疾病的存在、基因(即，遗传的)考虑因素以及环境暴露。
这些方法可以被用于治疗或延迟NO输送对其有益的任何病症。“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”表示用于获得有益或期望结果——包括临床结果——的方法。出于本发明的目的，有益或期望的结果包括，但不限于与病症 (如，但不限于，心血管病症如心肌梗塞或心脏手术，高血压，由高血压加剧的病症如心力衰竭、肾功能衰竭或中风，血管收缩性病症如中风，功能性NO缺乏，***功能障碍，便秘或肠梗阻)相关的症状的缓解、与病症相关的症状程度的减弱、或与病症相关的症状恶化的预防。在一些实施方式中，比起与当前可用的疗法相关的副作用，使用一种或多种本文公开的蛋白质进行的治疗未伴随有副作用或伴随有更少的副作用。
如本文所使用，“延迟”疾病或病症的发展表示延迟、阻碍、减缓、阻止、稳定和/或推迟诸如如心血管病症(如心肌梗塞或心脏手术)、高血压、由高血压加剧的病症(如心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩病症(如中风)、功能性NO缺乏、***功能障碍、便秘或肠梗阻的疾病或病症的发展。延迟可以具有各种时间长度，取决于所述疾病的历史和/或正治疗的个体。如本领域普通技术人员所知，实际上，足够或明显的延迟可以包括预防，因为个体不发展所述疾病或病症。例如，当与不使用所述方法比较时，所述方法可降低在给定时帧中疾病发展的概率和/或减轻所述疾病在给定时帧中的程度。在一些实施方式中，这样的比较基于使用统计上显著个数的对象进行的临床研究。疾病发展可以是使用标准临床技术可检测的。发展也可指初始不可检测的疾病的发展，并包括发生、复发和发病。
在一些直接输送带有结合NO的H-NOX蛋白到身体中特定部位(如组织或器官)的实施方式中，对NO koff比KD值重要，因为NO已经结合到所述蛋白质(使得kon较不重要)并且NO需要在身体中特定部位处或附近处被释放(以受koff影响的速率释放)。在急性病症治疗的一些实施方式中，H-NOX蛋白具有相对高的对NO的koff、k1或k2(如至少大约0.05s-1、0.1s-1或1.0s-1的任一个)，以便血管舒张迅速发生。在一些全身给药的实施方式中，H-NOX蛋白具有相对低的对NO的koff、k1或k2(如至少大约0.05s-1、0.01s-1或0.001s-1的任一个)，以使NO直到H-NOX蛋白到达低NO浓度的部位(如血管收缩的部位)才被释放。
H-NOX蛋白也可以被用于成像(imaging)。具体而言，光成像(例如，光学相干断层扫描(optical coherence tomography)；参见，例如Villard，J.W.(2002)“Use of a BloodSubstitute to Determine Instantaneous Murine Right Ventricular Thickeningwith Optical Coherence Tomography，”Circulation 105：1843-1849，其在此被完整引入作为参考，尤其是关于光学相干断层扫描)被红细胞变模糊。用H-NOX溶液灌注允许循环***和血管壁的图像更清晰，因为H-NOX蛋白比红细胞小的多。
本发明的H-NOX蛋白和药物组合物可以通过任何常规手段给予个体，例如通过经口、局部、眼内、鞘内、肺内、气管内或气溶胶给药；通过经皮或粘膜吸收；或通过注射(如，皮下、静脉内、动脉内、囊泡内或肌内注射)。H-NOX蛋白也可以被包含在大体积肠胃外溶液中，用于施用到血液。在示例性的实施方 式中，H-NOX蛋白被施用至个体的血液(例如，施用至血管，如静脉、动脉或毛细血管)。
在一些实施方式中，所述组合物的持续连续释放制剂被使用。H-NOX蛋白的给药可以进行例如数秒到数小时的时间期间，这取决于给药目的。对于急性病症，示例性的给药时程是尽可能迅速。其它示例性的时程包括大约10、20、30、40、60、90或120分钟的任何一个。示例性输注速率为从约30mL/小时到约13,260mL/小时，例如约100mL/小时到约3,000mL/小时。H-NOX蛋白的示例性总剂量为约900mg/kg，在20分钟内以13,260mL/小时加以施用。对于猪，H-NOX蛋白的示例性总剂量约为18.9克。
示例性的给药频率包括，但不限于，每周至少1、2、3、4、5、6或7次(即每天一次)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白每天至少给药2、3、4或6次。H-NOX蛋白可以在例如数天或数周的时间段内给药。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被给药更长的时间段，例如数月或数年。基于给药医师的判断，所述组合物的给药频率可以在疗程内加以调整。
如上文所述，H-NOX蛋白剂量的选择取决于使用的剂型、给药的频率和次数、治疗的病症和根据本领域普通技术人员确定的所要达到的具体目的。在一些实施方式中，给予人的H-NOX蛋白的有效量在数克到超过约350克之间。
在一些实施方式中，两种或多种不同的H-NOX蛋白被同时、顺序或共同给药。在一些实施方式中，用于O2输送的另一种化合物或疗法与一种或多种H-NOX蛋白的给药同时、顺序、或共同给予。
H-NOX蛋白的工业应用
本文所述的H-NOX蛋白和组合物也可以被用于多种体外或工业应用(参见，例如美国专利号6,455,676，其在此被完整引入作为参考，特别是关于体外或工业应用)。对于特定的应用，基于期望的NO解离常数、O2解离常数、NO koff、O2koff、NO反应性、NO稳定性、自氧化速率、半衰期或前述两种或多种的任何组合，可以选择特定的H-NOX蛋白用于这类应用。在工业应用的多种实施方式中，H-NOX蛋白是能够结合血红素的脱辅基蛋白或带有血红素结合的全蛋白质。
H-NOX蛋白可以被用于将NO加入到需要NO的溶液中。在使用需要厌氧发酵的生物反应器的实施方式中，H-NOX蛋白被用于输送NO到细胞。例如，向线粒体的NO输送可限制氧化磷酸化并且增强通过乳酸盐通路的代谢。丙酮丁醇梭杆菌中的H-NOX蛋白——其作为生物燃料发生器(biofuel generator)在厌氧发酵的条件下进行培养——可以天然地发挥此功能。而且，H-NOX蛋白可以被用于从需要除去NO的溶液中除去NO。例如，H-NOX蛋白可以被用于吸收或除去生物反应器中的NO，在所述生物反应器中NO是细胞增殖和/或线粒体功能的抑制剂。除去NO可以改善线粒体功能、限制凋亡、增加每细胞的生产率、或 前述的两种或多种的任何组合。
含有H-NOX蛋白的试剂盒
也提供了包含本文所述任何H-NOX蛋白及适当包装的制品和试剂盒。在一些实施方式中，本发明包括试剂盒，其具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文所述的它们的制剂)和(ii)使用该试剂盒向个体输送NO的说明。在多种实施方式中，本发明以试剂盒为特征，所述试剂盒具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文所述的它们的制剂)和(ii)将该试剂盒用于本文所述的任何工业应用(如，将NO加入到溶液或从溶液除去NO)的说明。
用于本文所述组合物的适当包装在本领域内是已知的，并且包括，例如，小瓶(如，密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、软包装(如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。这些制品可进一步被灭菌和/或密封。也提供了包含本文所述组合物的单位剂型。这些单位剂型能够以单或多单位剂量被储存在适当的包装中，并也可被进一步灭菌和密封。本发明的试剂盒中提供的说明通常是在标签或包装内页(例如，该试剂盒中包含的纸张)上的书面说明，但是机器可读的说明书(例如，磁盘或光盘上携带的说明书)也是可接受的。涉及H-NOX蛋白应用的说明通常包括关于目的治疗或工业应用的剂量、给药方案和给药途径。试剂盒可进一步包括选择适于治疗的个体的描述。
容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，含有足够剂量本文所公开的H-NOX蛋白的试剂盒也可被提供，以向个体提供延长时间段的有效治疗，例如，约下列值的任何一个：一周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。试剂盒也可包括多单位剂量的H-NOX蛋白和使用说明，并以足以用于药房——例如医院药房和配药药房(compounding pharmacies)——存储和使用的量进行包装。在一些实施方式，试剂盒包括干燥(例如，冻干)组合物，其能够被重构、重悬浮或再水化，通常形成稳定的H-NOX蛋白水混悬液。
H-NOX蛋白的示例性生产方法
本发明也提供了产生本文所述任何突变H-NOX蛋白的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在适合突变H-NOX蛋白产生的条件下培养具有编码突变H-NOX蛋白的核酸的细胞。在多种实施方式中，突变H-NOX也被纯化(例如，从细胞或培养基中纯化H-NOX蛋白)。
如上文所述，数个野生型H-NOX蛋白和核酸的序列是已知的并且可以被用于产生本发明所述的突变H-NOX蛋白和核酸。用于重组H-NOX蛋白的突变、表达和纯化的技术由例如Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in SolubleGuanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59和Karow，D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-LikeHeme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)：10203-10211中描述，其在此被完整引入作为参考，特别是关于重组H-NOX蛋白的突变、表达和纯化。这些技术或其它标准技术可以被用于产生任何突变H-NOX蛋白。
具体而言，本文所述的突变H-NOX蛋白可以通过本领域已知的多种方法产生。突变可以通过氨基酸的化学修饰发生在氨基酸水平，或通过编码给定氨基酸的核苷酸序列的改变发生在密码子水平。在蛋白质的任何给定位置处的氨基酸取代可以通过改变编码该氨基酸的密码子而实现。这可以通过定点诱变，使用下列进行，例如：(i)Amersham技术(Amersham mutagenesis kit，Amersham，Inc.，Cleveland，Ohio)，其基于Taylor，J.W.etal.(1985年12月20日)“The Use of Phosphorothioate-Modified DNA in RestrictionEnzyme Reactions to Prepare Nicked DNA，”Nucleic Acids Res.13(24)：8749-8764；Taylor，J.W.et al.(1985年12月20日)“The Rapid Generation of Oligonucleotide-Directed Mutations at High Frequency Using Phosphorothioate-Modified DNA，”Nucleic Acids Res.13(24)：8765-8785；Nakamaye，K.L.et al.(1986年12月22日)“Inhibition of Restriction Endonuclease Nci I Cleavage by PhosphorothioateGroups and its Application to Oligonucleotide-Directed Mutagenesis，”Nucleic Acids Res.14(24)：9679-9698；和Dente et al.(1985).在DNA Cloning，Glover，Ed.，IRLPress，pages 791-802中的方法；(ii)Promega试剂盒(Promega Inc.，Madison，Wis.)；或(iii)Biorad试剂盒(Biorad Inc.，Richmond，Calif.)，其基于Kunkel，T.A.(1985年1月)“Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(2)：488-492；Kunkel，T.A.(1987).“Rapid And EfficientSite-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection，”Methods Enzymol.154：367-382；Kunkel，美国专利4,873,192，它们的每一个都在此被引入作为参考，特别是关于蛋白质诱变。诱变也可以通过其它商业可得的或非商业手段进行，例如使用带有突变核苷酸的定点诱变的那些手段。
定点诱变也可以使用基于PCR的诱变进行，例如在Zhengbin et al.(1992).PCRMethods and Applications，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中205-207页；Jones，D.H.et al.(1990年2月).“A Rapid Method For Site-SpecificMutagenesis And Directional Subcloning by Using the Polymerase Chain Reactionto Generate Recombinant Circles，”Biotechniques 8(2)：178-183；Jones，D.H.et al.(1991年1月).“A Rapid Method For Recombination And Site-Specific Mutagenesisby Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase Chain Reaction，”Biotechniques10(1)：62-66中描述的那些，它们中的每一个都在此被引入作为参考，特别是关于蛋白质诱变。定点诱变也可以使用盒式诱变，利用本领域 普通技术人员已知的技术进行。
突变H-NOX核酸可以使用标准技术被参入载体，例如表达载体。例如，限制性酶可以被用于切割突变H-NOX核酸和载体。接着，被切割的突变H-NOX核酸和被切割的载体的匹配末端可以被连接。产生的载体可以使用标准技术(例如，电穿孔)被***细胞(例如，昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或细菌细胞)，用于编码的H-NOX蛋白的表达。
具体而言，异源蛋白质已经被表达在许多生物表达***中，例如昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞和细菌细胞。因此，合适的生物蛋白表达***可以被用于产生大量重组H-NOX蛋白。在一些实施方式中，所述H-NOX蛋白(如，突变或野生型H-NOX蛋白)是分离的蛋白质。如本文所使用，“分离的蛋白质”表示从一种或多种组分分离的蛋白，所述蛋白质与所述组分天然相关，所述组分包括，例如核酸、脂质和其它蛋白质。分离的蛋白质也不存在于蛋白质文库中，例如具有2、5、10、20、50或更多种不同蛋白质的文库。分离的蛋白质也可以通过，例如编码该蛋白质的核酸的表达或通过该蛋白质的化学合成而获得。
如果希望，H-NOX蛋白可以使用标准技术进行纯化。如本文所使用，“纯化的蛋白质”表示，已经从在产生蛋白质时存在的一种或多种组分中分离的蛋白质(例如，突变或野生型H-NOX蛋白)。在一些实施方式中，所述蛋白质至少不含按重量计约60％的当产生所述蛋白质时存在的其它组分。在多种实施方式中，所述蛋白质按重量计至少约75％、90％或99％纯。纯化的蛋白质可以通过，例如从天然来源、重组表达***或化学合成的反应混合物进行纯化(如，提取)而获得。示例性的纯化方法包括免疫沉淀、柱层析例如免疫亲和层析、磁珠免疫亲和纯化、和使用板结合抗体淘选、以及普通技术人员已知的其它技术。纯度可以通过任何适当的方法进行测定，例如，通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。在一些实施方式中，纯化的蛋白质被掺入本发明所述的药物组合物或被用于本发明所述的方法。本发明所述的药物组合物可具有添加剂、载体或除纯化的蛋白质以外的其它组分。
实施例
实施例——其旨在纯粹是本发明的示例并因此不应该被认为以任何方式限制本发明——还描述并详述了上面讨论的本发明的方面和实施方式。这些实施例并不旨在表示以下实验是所进行的全部的或唯一的实验。除非另外说明，温度以摄氏度表示并且压力等于或接近大气压。
实施例1：野生型和突变H-NOX蛋白的产生
使用标准方法产生、表达和纯化野生型和突变H-NOX蛋白，基本上如Boon，E.M.etal.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59和Karow，D.S.et al.(August 10，2004)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like HemeDomains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)：10203-10211中所描述，它们在此都被完整引入作为参考，特别是关于重组H-NOX蛋白的诱变、表达和纯化。使用来自Strategene(La Jolla，CA)的
Figure BSA0000131545090000651
方案进行诱变。蛋白质在细胞培养中的表达及后续的蛋白质纯化根据Karow，D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of The SolubleGuanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae AndThermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)：10203-10211所述进行。
实施例2：突变H-NOX蛋白的表征
计算的对NO的KD：koff与kon的比率
为了确定计算的对NO的KD，H-NOX蛋白的对NO的kon的值被假定为710μM-1s-1，并且NO的解离速率(具有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的koff或具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的k1或k2)如下所述进行测定。
koff、k1和k2(NO解离速率)
具有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的koff值
对于具有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白，NO的koff被计算出，如由Boon，E.M.等人(August 2006)，“Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the SolubeGuanylate Cyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)：21892-21902和Boon，E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59所描述的，其各自以其全部内容通过引用并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff的计算。简而言之，稀释在无氧的50mM三乙醇胺、50mM NaCl、pH7.5的缓冲液中的H-NOX蛋白的FeII-NO复合物(5μM血红素，终浓度)与饱和一氧化碳和相同缓冲液(无氧的)中的30mM(终浓度)连二亚硫酸盐阱(trap)(Na2S2O4)迅速混合(Kharitonov，V.G.等人(1997)，Biochemistry 36：6814-6818和Moore，E.G.等人(1976)，J.Biol.Chem.251：2788-2794，其各自全部内容通过引用并入，尤其是关于NO解离速率的计算)。以前已经确定，CO结合在这些实验中并非速率限制性的(Kharitonov，V.G等人(1997)Biochemistry 36：6814-6818)；这在没有CO下仅应用30mM Na2S2O4作为阱的实验中得到证实。采用具有100微升到1毫升大小和1厘米径长的石英小池(quartz cuvette)(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)，通过在Cary 3E分光光度计上定时地扫描而获得数据，所述分光光度计装备有被设定到不同温度(0-70℃)的Neslab RTE-100恒温浴。当FeII-CO复合物形成时，在423nm处监测来自血红素的NO的解离。通过从每一后续扫描减去第一次扫描来计算差示光谱(difference spectra)。通过423nm处的吸光度相对于时间的增加确定NO解离速率并且采用 Kaleidagraph 3.X(Synergy Software，Reading，PA)将其以具有f(x)＝Ax(1-e-kx)型的单指数进行拟合。具体而言，血红素-CO浓度的单指数增加(由于来自NO阱的CO结合)可以由方程1描述：
Figure BSA0000131545090000661
其中，ΔAt是在时间t下信号幅度的变化；ΔAT是信号幅度的总变化，并且k1是观测反应速率常数。每一次实验最少进行六次，并且对获得的速率取平均。所测量的解离速率独立于CO和连二亚硫酸盐浓度(3、30和300mM连二亚硫酸盐被检测)。
具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的k1和k2值
对于具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白，对NO的koff通过对NO的k1和对NO的k2进行描述，如由Winger，J.A.等人(January 2007)，“Dissociation of Nitric Oxide fromSoluble Guanylate Cyclase and Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding DomainConstructs”J.Biol.Chem.282(2)：897-907所描述的，其由此通过引用以其全部并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1以及NO k2的计算。简而言之，采用以前描述的CO/连二亚硫酸盐捕集法(Cary，S.P.L.等人(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：13064-13069和Kharitonov，V.G.等人(1997)，Biochemistry 36：6814-6818，其各自由此通过引用以其全部内容并入，尤其是关于NO解离速率的计算)，在37℃和10℃测量NO与具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的血红素的解离。如下制备捕集液：使用无氧室(Coy LaboratoryProducts)，在特氟隆-密封的反应小瓶(Teflon-sealed Reacti-Vial)(Pierce)中制备连二亚硫酸钠(Na2S2O4)在50mM HEPES，pH 7.4，50mM NaCl中的溶液。从无氧室移出该溶液并通过使气体通过溶液起泡10分钟用CO饱和该溶液。通过与过量DEA/NO(在10mM NaOH中)在25℃下在50mM HEPES，pH 7.4，50mM NaCl中温育10分钟，形成H-NOX蛋白-NO复合物。通过追踪Soret最大值从431至399nm的偏移，确认向亚硝酰基类的全部转化。H-NOX蛋白被放置在隔膜密封的无氧小池(具有100微升到1毫升的大小和1厘米径长的石英小池)中，并且使用清除氧的气体组(oxygen-scavenged gas train)进行脱氧。正好在脱氧之前加入小量的DEA/NO(～3当量)，以维持亚硝酰基类(任何残留物随后被捕集溶液中大量过量的Na2S2O4破坏)。无氧小池的顶部空间用CO替换，并且所述小池和捕集溶液在测定温度下平衡1分钟。通过用Hamilton气密式注射器将CO/连二亚硫酸盐溶液加入到无氧小池中并混合，起始反应。反应混合物中的Na2S2O4的终浓度为30mM。最终的蛋白质浓度：对于β1(1-194)、β1(1-385)和β2(1-217)为1.9至2.5μM，而对于sGC为0.88至2.5μM。在捕集液加入之后10秒钟，开始数据收集。应用装备有Neslab RTE-100温度控制器的Cary 3E分光光度计(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)，通过电子吸收光谱监测反应。在909纳米/分钟下，以1.5nm的数据点间隔，在380-450nm的范围内收集数据。每18秒钟记录光谱，进行5分钟；每分钟记录，进行10分钟；以及之后每2分钟记录，共记录3小时或直到反应完成。从每一光谱中减去缓冲液基线，并且通过标准化至410纳米处的等吸光点，校正光谱的基线漂移。通过从所有后续光谱中减去时间0时的光谱，获得差示光谱。从差示光谱中提取出在423纳米处(ΔA423；β1(1-194))和β1(1-385))或424纳米处(ΔA424；sGC和β2(1-217))的吸光度的变化值并且将其相对于时间作图，以获得每一实验的解离时程。重复两次或三次获得解离时程，并且每一实验在几天内重复2-5次。一般地，由于获得大量的纯化sGC相对困难，全长sGC的ΔA424值——其与实验蛋白质浓度成比例——比血红素结构域构建物的ΔA424值小。
采用Kaleidagraph 3.X(Synergy Software Reading，PA)，进行曲线拟合、数据分析以及图形产生。来自每一解离实验的数据被拟合到如下面方程2示出的双指数中，以获得观测速率常数。具体而言，方程2描述了血红素-CO浓度的双指数增加(由于来自NO阱的CO结合)：
Figure BSA0000131545090000671
其中，ΔAt是在时间t时信号幅度的变化；ΔA1和ΔA2是每一指数过程对于信号幅度总变化的贡献，并且k1和k2是每一过程的观测反应速率常数。
观测到的数据与其中解离发生于两种5-配位血红素-NO复合物的初始平衡混合物的模型一致，如方案1中显示。因此，k1对应于NO从血红素-NO5C构象的解离，而k2代表观测的反应速率，对应于kO-kC，其受到较慢的从血红素-NO NO* 5C到血红素-NO5C的转化的限制。
Figure BSA0000131545090000672
方案1
具有5-配位和6-配位FeII-NO复合物混合物的H-NOX蛋白的k1和k2值
对于包含5-配位和6-配位FeII-NO复合物的混合物的H-NOX蛋白，对NO的koff由对NO的k1和对NO的k2来描述。如同上述对于具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白一样，测量对NO的k1和k2，如由Winger，J.A.等人(January 2007)，“Dissociation of Nitric Oxidefrom Soluble Guanylate Cyclase and Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding DomainConstructs”J.Biol.Chem.282(2)：897-907所描述的，其由此通过引用以其全部并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1以及NO k2的计算。
NO的计算的KD
对于NO的计算的KD，H-NOX蛋白的对NO的kon值被假定为710μM-1s-1，其是报道的β1(1-385)的kon——其在4℃下测量并且在37℃下没有显著增加(Zhao等人(1999)，“AMolecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase，”PNAS.96：14753-14758，其尤其通过引用以其全部并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO kon计算)。因此，通过计算koff、k1或k2(如上述进行测量)与kon(被假定为710μM-1s-1)之比来确定NO的计算的KD。
O2的动力学KD：koff与kon之比
测定野生型和突变H-NOX蛋白的动力学KD值，基本上如Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”NatureChemical Biology 1：53-59所述进行，其在此被完整引入作为参考，特别是涉及O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、自氧化速率和NO解离速率。
kon(O2结合速率)
使用闪光光解法在20℃下测量O2对血红素的结合。由于非常快的成对重组动力学(geminate recombination kinetics)，不可能闪蒸出(flash off)FeII-O2复合体；因此，FeII-CO复合体用560nm的激光(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)进行闪光光解，产生5-配位的FeII中间体，在不同波长下追踪分子O2与该FeII中间体的结合。通过用10mM连二亚硫酸盐进行厌氧还原，接着在PD-10柱(Millipore，Inc.，Billerica，MA)上进行脱盐而制备蛋白质样品。该样品随后在受控气氛的石英小池(quartz cuvette)中在50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中被稀释到20μM的血红素，石英小池的尺寸为100μL到1mL并且径长为1cm。CO气体在该小池的顶部空间流动10分钟，以形成FeII-CO复合物，该复合物的形成通过UV-可见光谱(Soret最大值为423nm)加以确认。该样品随后被用于测量闪光光解后但仍在1大气压的CO气体下的CO-再结合动力学，或在闪光光解之前，它被打开并在空气中搅拌30分钟，充分对缓冲液充氧，以观察O2-再结合事件。在多个波长对时间下，观察O2与血红素的结合。这些迹线使用Igor Pro软件(Wavemetrics，Inc.，Oswego，OR；最新2005版)以单指数拟合。该速率独立于观测波长，但依赖于O2浓度。UV-可见光光谱自始至终被使用，以确认所有的复合物和中间体(Cary 3K，Varian，Inc.Palo Alto，CA)。瞬时吸收数据使用Dmochowski，I.J.et al.(2000年8月31日)“Enantiomeric Discrimination of Ru-Substrates byCytochrome P450cam，”JInorg Biochem.81(3)：221-228所述的仪器进行采集，其在此被完整引入作为参考，特别是关于仪器操作。该仪器具有20ns的反应时间，并且数据以200兆样每秒(megasample s-1)的速率被数字化。
koff(O2解离速率)
为了测量koff，蛋白质(5μM血红素)的FeII-O2复合物，在无氧的50mM TEA、50mMNaCl、pH 7.5的缓冲液中稀释，与等体积含有各种浓度连二亚硫酸盐和/或饱和CO气体的相同缓冲液(无氧)迅速混合。在装备有设置为20℃的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECHScientific SF-61停流分光光度计(TGK Scientific LTD.，Bradford On Avon，UnitedKingdom)上获取数据。O2从血红素的解离被监控为在437nm——FeII-FeII-O2差示光谱中的最大值——或425nm——FeII-FeII-CO差示光谱中的最大值——处吸光度的增加。最终的迹线使用软件拟合成单指数，该软件是所述仪器的一部分。每个实验进行最少6次，并且对得到的速率进行平均。测量的解离速率独立于连二亚硫酸盐浓度(测试了100、50、25、10、5和2.5mM连二亚硫酸盐)且独立于作为被还原物质的阱(trap)的饱和CO，两者都在10mM连二亚硫酸盐存在和不存在的情况下。
O2的动力学KD
通过使用上述koff与kon的测量结果计算koff与kon的比率，确定O2的动力学KD。
计算的KD
为测量计算的KD，对如上所述获得的koff值和动力学KD值进行绘图。koff与动力学KD之间的线性关系通过方程(y＝mx+b)加以定义。然后，koff值沿图线***，以使用Excel：MAC2004(Microsoft，Redmond，WA)得到计算的KD。在没有测量的kon的情况下，该插值提供了使koff与KD相关的方法。
自氧化速率
为测量自氧化速率，蛋白质样品被无氧还原，随后在有氧的50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中被稀释到5μM血红素。然后，这些样品在装备有设置到37℃的NeslabRTE-100恒温浴的Cary 3E分光光度计中温育，并定期扫描(Cary 3E，Varian，Inc.，PaloAlto，CA)。通过在对时间绘制的并使用Excel：MAC 2004(Microsoft，Redmond，WA)以单指数拟合的FeIII-FeII差示光谱中的最大值与最小值之间的差确定自氧化速率。
与NO反应的速率
使用在缓冲液A中以2μM浓度制备的纯化蛋白(Tt WT HNOX、Tt Y140H HNOX和智人血红蛋白(Hs Hb))和在缓冲液A中以200μM制备的NO测量NO反应性(缓冲液A：50mM Hepes，pH 7.5、50mM NaCl)。在装备有设置为20℃的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECHScientific SF-61停流分光光度计(TGK Scientific LTD.，Bradford On Avon，英国)上获取数据。所述蛋白质与NO以1∶1的比例迅速混合，混合时间0.00125秒。使用软件将最大变化的波长拟合成单指数，该软件是光度计的一部分，主要测量NO氧化的限速步骤。该反应的终产物对于H-NOX蛋白是三价铁-NO，而对于Hs Hb为三价铁-水合物。
p50测量
如果希望，突变或野生型H-NOX蛋白的p50值可以如Guarnone，R.et al.(1995年9月/10月).“Performance Characteristics of Hemox-Analyzer For Assessment of TheHemoglobin Dissociation Curve，”Haematologica 80(5)：426-430所述加以测量，其在此被完整引入作为参考，特别是关于p50值的测量。使用血氧分析仪(HemOx-Analyzer)测定p50值。测量室起始于0％氧并缓慢上升，递增至100％氧。该室中的氧探针测量氧饱和百分比。第二探针(UV-可见光)测量两个吸收波长，调谐至血红素蛋白(如，诸如与血红素复合的H-NOX的蛋白质)的UV-可见光光谱的α和β峰。这些吸收峰随着血红素蛋白结合氧而线性升高。然后，绘制从未结合至100％结合的百分数变化对氧百分数值的图，以产生曲线。p50是该曲线上的点，在该点50％血红素蛋白结合氧。
具体而言，血氧-分析仪(Hemox-Analyzer)(TCS Scientific Corporation，NewHope，PA)通过将50μL血液或血红素蛋白暴露于提高的氧气分压并用氮气使其去氧，来确定氧血红素蛋白(oxyhemoprotein)解离曲线(oxyhemoprotein dissociation curve，ODC)。Clark氧电极检测氧张力的变化，该变化被记录在x-y坐标记录仪的x轴上。所产生的氧血红素蛋白分数的增长通过双波长分光光度法在560nm和576nm同时监测，并显示在y轴上。从前中静脉(antemedial vein)取血样，用肝素抗凝，并在湿冰上保持在4℃，直到测定。50μL全血在5μL的Hemox溶液中稀释，该溶液是制造商提供的缓冲液，其保持溶液的pH值在7.4±0.01。该样品-缓冲液被吸入作为血氧-分析仪的一部分的小池，并且混合物的温度被平衡并带到37℃；该样品随后用空气充氧到100％。调整pO2值之后，该样品用氮气去氧；在去氧的过程中，曲线被记录在图纸上。p50值使用作为血氧-分析仪一部分的软件在x轴上外推为这样的点，在该点上O2饱和度为50％。完成记录所需的时间约为30分钟。
任何H-NOX蛋白的p50值可以与血红蛋白的p50值比较，作为H-NOX蛋白相比于血红蛋白对O2的相对亲和性的指示。表13列出了先前报告的血红蛋白的p50值。
表13.血红蛋白突变体及其报告的氧亲和性
Figure BSA0000131545090000711
粘度测量
如果希望，H-NOX溶液的粘度可以使用带有的CPE-40圆锥轴(cone spindle)的锥板式流变计(型号DV-III，Brookfield；Middleboro，MA)以200/s的剪切速率进行测量。在血液稀释氧输送实验中给予的粘度在1到4厘泊(cP)之间的溶液被报告为安全(Winslow，R.M.et al.(2004年10月).“Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin inExtreme Hemodilution in the Rat，”J Appl Physiol.97(4)：1527-1534，美国专利号6,974,795和6,432,918，它们中的每一个都在此被完整引入作为参考，特别是关于粘度测量)。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1和4cP之间。
胶体渗透压测量
如果希望，胶体渗透压可以使用胶体渗透压计(型号4420，Wescor；Logan，UT)，根据制造商的说明进行测量。测量胶体渗透压的示例性方法在Vandegriff，K.D.et al.(1997年11月).“Colloid Osmotic Properties of Modifed Hemoglobins：Chemically Cross-Linked Versus Polyethylene Glycol Surface-Conjugated，”Biophys.Chem.69(1)：23-30，万维网地址为“anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php”；美国专利号6,974,795和6,432,918中进行描述，它们中的每个都在此被完整引入作为参考，特别是关于测量胶体渗透压。在血液稀释氧输送实验中给予的、胶体渗透压在20到50mmHg之间的溶液被报告为安全(Winslow，R.M.et al.(2004年10月).“Comparison of PEG-Modified Albumin AndHemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat，”J.Appl.Physiol. 97(4)：1527-1534)。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的胶体渗透压在20和50mm Hg之间。
实施例3：用于NO载体H-NOX突变体的心脏病模型
两个动物模型可以被用于比较作为NO载体的H-NOX蛋白和标准硝酸盐疗法的功效。为了在慢性心血管疾病的大鼠模型中比较H-NOX蛋白的效应与用二硝酸异山梨醇(ISDN)进行的真实NO输送，可以使用雄性Wistar大鼠对已经建立的方案(Shimamura，S.等人(2006)，J Vet Med Sci Vol.68(3)：213-7，其由此通过引用以其全部并入，尤其是关于心血管疾病的模型)进行改进。为了模拟心血管肥大，通过腹侧腹部剖腹手术和在***的21号针上应用收缩线——其随后被除去以使血管狭窄一致，腹主动脉被收缩(腹主动脉狭窄或“AC”模型)。假手术组的大鼠经历相似的手术，但是不产生AC。手术之后，大鼠被随机地分成每组14只动物的治疗组(7只服药而7只服安慰剂)，并且被允许恢复7天。每组的治疗(对照组在每一测试情形下以安慰剂进行配对)是：(1)AC大鼠被经口施用sr-ISDN或安慰剂；(2)AC大鼠被IV施用本文描述的一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白或安慰剂(如失活的H-NOX蛋白)；(3)和(4)假手术组大鼠，分别如(1)或(2)进行处理。一天一次治疗，共12周，之后在动物被处死，心脏被切离，进行标准组织病理学分析，用于确定心肌细胞形态、纤维化、胶原沉积、心室直径、主动脉形态、以及其它标准分析，从而评价疾病进程或预防。
为了比较H-NOX蛋白与ISDN在介导急性心肌梗塞之后的长期左心室重塑中的效力，采用标准方案(Bodh I.Jugdutt，MBChB，MSc；Mohammad I.Khan，MBBS(1994).Circulation 89(S))，制作了犬模型，其中ISDN通过长期施用已经显示出一些功效。对于每一实验，40只健康的任一性别的杂种狗(体重，16至29千克)在全身麻醉(戊巴比妥钠，30毫克/千克，IV)下进行左外侧切口开胸手术。聚乙烯导管被***到颈外静脉、颈内动脉、以及左心房中，所述聚乙烯导管中充满肝素化盐水，并且它们的末端在颈后外露。丝绸绷带被放置在中左管状动脉前降支的周围，在第一和第二对角分支之间，并被系上。金属珠被缝合在左中心室水平处的短轴平面中的心内膜前表面、心内膜侧表面和心内膜后表面，以使系列局部图像的回波心脏描记的方向一致。心包和胸腔随后被关闭。青霉素(1百万单位)和链霉素(1克)被肌肉内给药，并且所述狗返回到它们的笼内。
冠状动脉结扎后两天，70只健康的生还者被随机进行硝酸盐治疗(n＝10)、H-NOX蛋白治疗(如，一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白，其已经任选地使用本文描述的任一测定方法进行了体外表征并且任选地进行了毒性和/或药物代谢动力学的优化)(10只)、以及匹配的对照亚组(没有治疗，n＝20)：亚组1(10只对照，10只硝酸盐)和亚组2(10只对照，10只H-NOX蛋白)。所述狗被允许自由进食流体，并且没有试图通过流体限制或药物治疗来治疗心力衰 竭。在第六周，存活的狗被麻醉，并且用过剂量的静脉内氯化钾将心脏固定在舒张期，切离心脏，在生理盐水溶液中洗涤并称重。取出血液样品，用于监测血液气体、血像、和电解质。应用标准程序，进行康复期间的测量(如ECG’s、血液动力学，等)，并且验尸分析包括上述对于慢性心力衰竭的那些测量(如，胶原堆积、肌细胞形态学，等等)。在心肌梗塞和/或慢性AC模型实验中与ISDN(用于急性和慢性心力衰竭的基于硝酸盐的治疗的护理标准)一样有效或更有效的H-NOX蛋白对于心力衰竭和/或慢性AC的治疗特别有用。预期这样的H-NOX蛋白对于治疗NO输送对其有益的其它指征也是有用的。
前述实施例和详细描述通过阐述的方式而非通过限制的方式给出。本说明书中引用的所有出版物、专利申请和专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或专利被具体地并各自地被指出通过引用而并入。尽管出于清楚理解的目的，前述发明已经通过举例说明和实施例的方式以一些细节进行了描述，但考虑根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言非常明显的是，可以对本发明进行某些变化和修改而不背离所附权利要求书的精神或范围。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域普通技术人员通常理解的那些。本领域普通技术人员也将理解，与本文所描述的那些相似或等价的任何方法及材料也可以用于实施或测试本发明。
对于本文中的使用，除非另外明确指出，术语“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”及类似表达的使用指的是一个(种)或多个(种)。
提到“大约”，本文的值或参数包括(并描述了)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提到“大约X”的描述包括“X”的描述。
应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“包含(comprising)”、“由……组成(consisting)”和“主要由……组成(consistingessentially of)”的方面和实施方式。
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Claims (21)

1.分离的H-NOX蛋白，所述蛋白具有一个或两个远侧袋突变，与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对NO的koff、k1或k2，O2解离常数，NO解离常数或NO反应性，
其中每个远侧袋突变是在对应于SEQ ID NO：54的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe82或Leu144的残基处的取代，
其中所述H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃在1×10-4s-1和10s-1之间，以及
其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少1μM，所述H-NOX蛋白的NO解离常数在人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍。
2.如权利要求1所述分离的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃在1×10-4s-1和0.012s-1之间。
3.如权利要求1所述分离的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的NO反应性为700s-1以下。
4.如权利要求1所述分离的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍。
5.如权利要求1所述分离的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为1h-1以下。
6.如权利要求1所述分离的H-NOX蛋白，其中所述相应的野生型H-NOX蛋白为人蛋白。
7.如权利要求1所述分离的H-NOX蛋白，其中所述相应的野生型H-NOX蛋白为腾冲嗜热厌氧菌蛋白。
8.融合蛋白，所述融合蛋白包含H-NOX蛋白，其中所述融合蛋白包括H-NOX结构域、和另一蛋白的部分或全部，并且所述H-N OX蛋白具有一个或两个远侧袋突变，与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对NO的koff、k1或k2，O2解离常数，NO解离常数或NO反应性，
其中每个远侧袋突变是在对应于SEQ ID NO：54的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe82或Leu144的残基处的取代，
其中所述H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃在1×10-4s-1和10s-1之间，以及
其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少1μM，所述H-NOX蛋白的NO解离常数在人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其中所述H-NOX蛋白是腾冲嗜热厌氧菌L144F。
10.修饰的H-NOX蛋白，所述H-NOX蛋白包含共价结合到另一分子的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白具有一个或两个远侧袋突变，与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对NO的koff、k1或k2，O2解离常数，NO解离常数或NO反应性，
其中每个远侧袋突变是在对应于SEQ ID NO：54的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe82或Leu144的残基处的取代，其中所述H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃在1×10-4s-1和10s-1之间，以及
其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少1μM，所述H-NOX蛋白的NO解离常数在人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍。
11.如权利要求10所述的修饰的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白是腾冲嗜热厌氧菌L144F。
12.如权利要求10所述修饰的H-NOX蛋白，所述H-NOX蛋白共价结合到聚乙二醇。
13.如权利要求11所述修饰的H-NOX蛋白，所述H-NOX蛋白共价结合到聚乙二醇。
14.重组核酸，其编码权利要求1-7任一项所述的H-NOX蛋白或权利要求8或9的融合蛋白。
15.载体，其包括权利要求14的核酸。
16.细胞，其包括权利要求14的核酸。
17.细胞，其含有权利要求15的载体。
18.产生H-NOX蛋白的方法，其包括在适合所述H-NOX蛋白质产生的条件下培养细胞，所述细胞包含编码权利要求1-7的任一项所述的H-NOX蛋白的核酸。
19.权利要求18所述的方法，其进一步包括纯化所述H-NOX蛋白的步骤。
20.产生融合蛋白的方法，其包括在适合所述融合蛋白质产生的条件下培养细胞，所述细胞包含编码权利要求8或9的融合蛋白的核酸。
21.如权利要求20所述的方法，其进一步包括纯化所述融合蛋白的步骤。
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