CN1398161A

CN1398161A - 酸－稳定性枯草蛋白酶在动物饲料中的用途

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Publication number: CN1398161A
Application number: CN01804705A
Authority: CN
Inventors: 彼得·R·奥斯特加尔德; 卡斯滕·肖霍姆; 安娜－玛丽·克伦特
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2003-02-19
Anticipated expiration: 2021-02-05
Also published as: MXPA02007614A; PL203212B1; CA2395266A1; CN100429990C; TWI259759B; EP1642506A2; DE60133802D1; ES2305061T3; PL357638A1; CN1293191C; TWI270348B; ATE393576T1; PL200047B1; PL357668A1; JP2003521907A; DE60115602T2; EP1257176B1; WO2001058275A3; AU3544601A; EP1257175A2

Abstract

枯草蛋白酶家族的酸－稳定性蛋白酶，它们在含有所述蛋白酶的动物饲料，饲料－添加剂和饲料组合物中的用途，以及使用所述蛋白酶处理植物蛋白质的方法。

Description

酸-稳定性枯草蛋白酶在动物饲料中的用途

技术领域

本发明涉及酸-稳定性枯草蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶在动物饲料中的(体内)用途，以及这种蛋白酶处理植物蛋白质的(体外)用途。

蛋白质是动物和人必不可少的营养因子。大多数牲畜和很多人从植物蛋白质来源中摄取必需的蛋白质。重要的植物蛋白质来源是例如油料种子作物，豆类和谷类。

例如，当在单胃动物，如猪和家禽的饲料中含有豆粉时，大部分豆粉固体不能被消化。例如，小猪和处于生长期的猪的表观回肠蛋白质消化能力仅为80％左右。

单胃动物和多种鱼的胃表现出强酸性pH。然而，大多数的蛋白质消化发生在小肠。因此，需要一种在流经胃之后仍能存活的酸-稳定性蛋白酶。

背景技术

从下列文献中可以了解蛋白酶在动物饲料中的用途，或其处理植物蛋白质的用途：

WO95/28850公开了一种含有植酸酶和蛋白酶的动物饲料添加剂。第7页详细说明了多种蛋白酶。

WO96/05739公开了含有木聚糖酶和蛋白酶的酶饲料添加剂。第25页列出了适当的蛋白酶。

WO95/02044公开了得自棘孢曲霉(Aspergillus aceleatus)的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。

US3966971公开了通过用酸性植酸酶并任选一种蛋白酶处理，由植物蛋白质来源获取蛋白质的方法。第2栏中详细说明了适当的蛋白酶。

US4073884，US5047240，US3868448，US3823072和US3683069描述了得自多个链霉菌(Streptomyces)属菌株的蛋白酶制品及其在动物饲料中的用途。

然而，这些蛋白酶不是酸-稳定性的和/或不是枯草蛋白酶家族的蛋白酶。

发明简述

本发明鉴定出的几种蛋白酶具有很好的酸-稳定性，有望在动物饲料中具有改良的性能。这些蛋白酶属于已知为枯草蛋白酶的蛋白酶组。

附图简述

以下将参照附图进一步阐明本发明，其中：

图1显示了4种蛋白酶(1种得自芽孢杆菌属(Nocardiopsis)菌种NCIMB40484的酸-稳定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶(PD498)，和3种参照蛋白酶(得自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的Sub.Novo和Sub.Novo(Y217L)，以及SAVINASE^TM))在温度为37℃，pH值范围为pH2至pH11的条件下保温2小时之后的pH-稳定性曲线，即残留的蛋白酶活性；所述活性是相对于在pH9.0和5℃下保温2小时之后的残留活性而言的；

图2显示了相同的4种蛋白酶在pH3至pH11的范围内的pH-活性曲线，即蛋白酶活性，所述活性是相对于最适pH时的蛋白酶活性而言的；和

图3显示了相同的4种蛋白酶在15℃至80℃的范围内，pH为9.0时的温度-活性曲线，即pH为9.0时的蛋白酶活性，所述活性是相对于最适温度下的蛋白酶活性而言的；

图4显示了类似于图1的pH-稳定性曲线，不同的是蛋白酶是6种其它的酸-稳定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶，它们得自嗜碱芽孢杆菌NCIMB10438，尖孢镰孢IFO 4471，Paecilmyces lilacinus CBS 102449，曲霉属菌种CBS 102448，Acremonium chrysogenum ATCC 48272，基利支顶孢ATCC20338；

图5显示了类似于图2的pH-活性曲线，但蛋白酶与图4中的相同；和

图6显示了类似于图3的，pH为9.0时的温度-活性曲线，但蛋白酶与图4中的相同。

发明详述

本文所用术语蛋白酶是水解肽键(具有蛋白酶活性)的酶。蛋白酶也被称为例如肽酶，肽水解酶或蛋白水解酶。

本发明优选使用的蛋白酶是在多肽链内部起作用的内在endo-型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，所述肽底物与所述蛋白酶的特异性相关。

上述的蛋白酶定义中包括属于EC目录(源自NC-IUBMB的酶名称1992版，1992)EC3.4酶组(包括其13种亚-亚类的每一种)的任何酶，该目录被定期添加和更新，具体可参见环球网(www)，网址为http：∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。

基于蛋白酶的催化机理将其分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)和未知的，或未被分类的蛋白酶(U)，参见蛋白酶手册，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(编)，Academic Press(1998)，尤其是总引言部分。

术语丝氨酸蛋白酶指的是上述手册中定义的丝氨酸肽酶及其异种集团。在1998年版的该手册中，第1-175章涉及丝氨酸肽酶及其异种集团。

在特定的实施方案中，丝氨酸蛋白酶是肽酶，其催化机理依赖于丝氨酸残基的羟基，所述羟基作为攻击肽键的亲核体起作用。

本文所用术语枯草蛋白酶或枯草蛋白酶家族欲包括所有SB异种集团的丝氨酸蛋白酶，尤其是其中的S8家族(上述手册的第93章中涉及SB异种集团)。在枯草蛋白酶中，催化三联体的顺序是Asp-His-Ser。三级结构包括α-螺旋和β折叠。SB异种集团包括内肽酶和外肽酶。已知这些肽酶可得自细菌，古细菌和真核生物；只有一个代表性例子得自DNA病毒。

为了测定给定的蛋白酶是否为枯草蛋白酶，可参考上述手册和其中所述的原理。这些检测可对所有类型的蛋白酶进行，而不论它们是天然或野生型蛋白酶，还是经基因工程改造的或合成的蛋白酶。

或者，可用SSI(链霉菌属枯草蛋白酶抑制剂)进行抑制作用的研究，将枯草蛋白酶定义为当用摩尔过量的SSI抑制时，残留活性高达10％的蛋白酶。可按实施例8所述进行该试验。在该定义的特定实施方案中，枯草蛋白酶具有高达8％，6％或5％的残留活性。术语“高达”被认为等于“低于或等于”。

可使用任何测定法测定蛋白酶活性，所述测定法中利用了底物，底物中包括与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。类似地，使pH-试验和温度-试验适应于所述蛋白酶。pH值-试验的例子是pH5，6，7，8，9，10或11。温度-试验的例子是25，30，35，37，40，45，50，55，60，65或70℃。

蛋白酶底物的例子是酪蛋白和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(可得自例如Sigma S-7388)。该pNA-底物中的大写字母指的是单字母氨基酸密码。另一个例子是Protazyme AK(由Megazyme T-PRAK制备成片剂的经azurine染色的交联酪蛋白)。pH-活性和pH-稳定性研究优选pNA-底物，而温度-活性研究优选Protazyme AK底物。

实验部分描述了蛋白酶检测法的例子。

对本发明所用蛋白酶的来源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括天然或野生型蛋白酶，也包括其表现出蛋白酶活性的任何突变体，变体，片段等，以及合成的蛋白酶，如经改组的蛋白酶和共有蛋白酶。可以按照本领域公知的技术，例如通过定点诱变，PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的一个引物)，或随机诱变制备经基因工程改造的蛋白酶。共有蛋白质的制备描述于例如EP897985。

本发明所用的枯草蛋白酶家族酸-稳定性蛋白酶的例子是：

(i)得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484，嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438，尖孢镰孢IFO 4471，Paecilomyces lilacinus CBS 102449，曲霉属菌种CBS102448，Acremonium chrysogenum ATCC 48272和基利支顶孢ATCC 20338的蛋白酶；

(ii)与(i)中的任何蛋白酶具有至少70，75，80，85，90或至少95％的氨基酸同一性的蛋白酶；

(iii)与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的任何一个具有至少70，75，80，85，90或至少95％的同一性的蛋白酶；

(iV)与SEQ ID NO：5(完整序列1-397，或其片断28-397或118-397)，SEQ ID NQ：6(完整序列1-367，或其片断70-367或84-367)或SEQ ID NO：7中的任何一个具有至少70，75，80，85，90或至少95％的氨基酸同一性的蛋白酶。

为了计算同一性百分比，可以使用本领域已知的任何计算机程序，例如GCG第8版程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of MolecularBiology，48，443-453)。使用具有下列设置的GAP进行多肽序列比较：GAP生成罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3。

在特定的实施方案中，本发明所用的蛋白酶是微生物蛋白酶，术语微生物表示蛋白酶得自，或源自微生物，或是得自微生物的蛋白酶类似物，片段，变体，突变体，或合成的蛋白酶。可在原始的野生型微生物菌株，在另一个微生物菌株或在植物中产生或表达所述蛋白酶，即该术语覆盖了表达野生型，天然蛋白酶，以及在任何宿主中表达重组的，经基因工程改造的或合成的蛋白酶。

本文所用术语微生物包括古细菌，细菌，真菌，病毒等。

微生物的例子是细菌，例如芽孢杆菌属细菌，如芽孢杆菌属菌种NCIMB40484，嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438，或其表现出蛋白酶活性的突变体或变体。

其它微生物的例子是真菌，例如酵母或丝状真菌，如选自拟青霉属，如Paecilomyces lilacinus CBS 102449，曲霉属，如曲霉属菌种CBS 102448，支顶孢属，如Acremonium chrysogenum ATCC 48272，基利支顶孢ATCC 20338或镰孢属，如尖孢镰孢IFO 4471；或其表现出蛋白酶活性的突变体或变体。

在另一个实施方案中，蛋白酶是植物蛋白酶。源自植物的蛋白酶的例子是得自瓜果果肉的蛋白酶(Kaneda等，J.Biochem，78，1287-1296(1975))。

术语动物包括所有动物，包括人。动物的例子有非-反刍动物和反刍动物，如奶牛，绵羊和马。在特定的实施方案中，动物是非-反刍动物。非-反刍动物包括单胃动物，如猪(包括但不限于小猪，处于生长期的猪和大母猪)；家禽，如火鸡和鸡(包括但不限于适于烤焙的小鸡，蛋鸡)；小牛；和鱼(包括但不限于鲑鱼)。

术语饲料或饲料组合物指的是适于或给动物摄入的任何化合物，制剂，混合物或组合物。

在本发明的应用中，可在喂食之前，之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选在喂食之后饲喂蛋白酶。

在本发明的上下文中，术语酸-稳定性指的是于37℃，在下列缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton^_X-100，pH3.5中保温2小时之后，稀释度相当于A₂₈₀＝1.0的纯蛋白酶的蛋白酶活性至少为参照活性的40％，所述活性是使用本文实施例2C中所述的检测法测定的(底物：Suc-AAPF-pNA，pH9.0，25℃)。

在上述酸-稳定性定义的特定实施方案中，蛋白酶活性至少为参照活性的45，50，55，60，65，70，75，80，85或至少为参照活性的90％。

术语参照活性指的是：稀释度相当于A₂₈₀＝1.0的纯品形式的相同蛋白酶于5℃，在下列缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton^_X-100，pH9.0中保温2小时之后的蛋白酶活性，其中按上文所述测定活性。

换句话说，测定酸-稳定性的方法包括下列步骤：

a)将待测的蛋白酶样品(纯品形式，A₂₈₀＝1.0)分成两等份(I和II)；

b)于37℃，pH3.5将等份I保温2小时；

c)测定等份I的残留活性(pH9.0和25℃)；

d)于5℃，pH9.0将等份II保温2小时；

e)测定等份II的残留活性(pH9.0和25℃)；

f)计算相对于等份II之残留活性的等份I残留活性的百分比。

或者，在上述酸-稳定性定义中，步骤b)缓冲液的pH值可以是2.0，2.5，3.0，3.1，3.2，3.3或3.4。

在与上述可替换的步骤b)缓冲液的pH值相关的上述酸-稳定性定义的其它可替换的实施方案中，与参照活性相比，残留的蛋白酶活性至少为5，10，15，20，25，30，35，40，45或至少为50％。

在其它实施方案中，步骤d)缓冲液的pH值可以是6.0，6.5，7.0，7.5，8.0或8.5。

在上述酸-稳定性定义中，术语A₂₈₀＝1.0指的是在光程长度为1cm的样品池中，280nm下相对于缓冲液空白对照的光吸收值为1.0时的所述纯蛋白酶浓度(稀释度)。

在上述酸-稳定性定义中，术语纯蛋白酶指的是A₂₈₀/A₂₆₀的比率大于或等于1.70(见实施例2E)，且通过扫描经考马斯-染色的SDS-PAGE凝胶测得其扫描强度至少约为对应于所述蛋白酶之带的扫描强度的95％(见实施例2A)的样品。或者，A₂₈₀/A₂₆₀的比率大于或等于1.50，1.60，1.65，1.70，1.75，1.80，1.85，或大于或等于1.90。

然而，对于本发明的应用而言，蛋白酶不必是纯的；它可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，此时可将其称为蛋白酶制品。然而，明确定义的蛋白酶制品是有利的。例如，正确确定饲料中的蛋白酶剂量则要容易得多，所述蛋白酶基本上不含干扰的或污染的其它蛋白酶。术语正确确定剂量特指获得持久不变的结果的目的，和基于所需结果最优化剂量的能力。

在特定的实施方案中，明确定义了添加至饲料中的，或包含在饲料添加剂中的蛋白酶。明确定义指的是经大小排阻层析测定，蛋白酶制品至少为50％纯(见实施例12)。

在其它特定的实施方案中，经此方法测定，蛋白酶制品至少为60，70，80，85，88，90，92，94纯或至少为95％纯。

在其它实施方案中，术语明确定义指的是：蛋白酶制品在适当大小排阻柱上的分级分离仅显示出一个主要的蛋白酶成分。

本领域技术人员会知道如何选择适当的大小排阻层析柱。起初可以在例如Amersham Pharmacia Biotech的Hiload26/60 Superdex75pg柱上分级分离蛋白酶制品(见实施例12)。如果不能清楚地分开峰，可以尝试不同的柱(例如改变柱颗粒的大小和/或柱的长度)，和/或改变样品的体积。通过简单而常用的尝试法，可以选择出具有足够分辨率(能清楚地分开峰)的柱，以此为基础，按实施例12所述进行纯度的计算。

蛋白酶制品可以(a)直接加入饲料中(或直接用于植物蛋白质的处理方法)，或(b)用于生产一种或多种随后要添加至饲料中(或用于处理方法)的中间体组合物，如饲料添加剂或预混物。上文所述的纯度指的是上述(a)或(b)用途中的原始蛋白酶制品的纯度。

使用重组生产方法可以特别地获得纯度为此数量级的蛋白酶制品，而当通过传统的发酵法生产蛋白酶时，获得它们却并非易事，而且批与批之间的变化较大。

当然可以将这种蛋白酶制品与其它酶混合。

在一个特定的实施方案中，本发明所用的蛋白酶除了具有酸-稳定性外，还具有接近中性的pH-活性最适值。

术语接近中性的pH-活性最适值指的是下列一个或多个：pH-最适值范围为pH6.0-11.0，或pH7.0-11.0，或pH6.0-10.0，或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0，或pH8.0-10.0(参见本文实施例2B和7以及图2和5)。

在另一个特定实施方案中，本发明所用的蛋白酶除了具有酸-稳定性外，还具有热稳定性。

术语热稳定性指的是下列一个或多个：温度最适值至少为50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，或至少为70℃，参见本文实施例2D和7以及图3和6。

在另一个特定的实施方案中，根据本文实施例4的体外模型，本发明所用的蛋白酶能溶解植物蛋白质。

本文所用术语植物蛋白质指的是包括至少一种得自或源自植物的蛋白质，包括经修饰的蛋白质和蛋白质衍生物的任何化合物，组合物，制品或混合物。在特定的实施方案中，植物蛋白质的蛋白质含量至少为10，20，30，40，50或60％(w/w)。

植物蛋白质可得自植物蛋白质来源，例如豆类和谷类，例如豆科(Fabaceae)，十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，禾本科(Poaceae)的植物材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。

在特定的实施方案中，植物蛋白质来源是豆科的一种或多种植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蚕豆的材料。

在另一个特定的实施方案中，植物蛋白质来源是藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖用甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。

植物蛋白质来源的其它例子是油菜籽和甘蓝。

大豆是优选的植物蛋白质来源。

植物蛋白质来源的其它例子是谷类植物，如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米，水稻和高粱。

根据本发明，用至少一种酸-稳定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶处理植物蛋白质，导致植物蛋白质的溶解性增加。

以下是使用本发明的蛋白酶可以获得的溶解蛋白质的百分比：至少为76.8％，77.0％，77.2％，77.4％，77.6％，77.8％，78.0％，78.2％，78.4％，78.6％或至少为78.8％，参见本文实施例4的体外模型。

术语溶解蛋白质基本上指将蛋白质释放至溶液中。这种溶解可能是在蛋白酶的介导下，从通常为复合的天然组合物，如饲料的其它成分中释放出蛋白质而引起的。溶解可被测定为相对于未经蛋白酶处理的样品而言，可溶性蛋白质量的增加(参见本文实施例4)。

在处理方法的特定实施方案中，所述蛋白酶影响，或作用于植物蛋白质或蛋白质来源，或对它们发挥其溶解作用。为此，一般将植物蛋白质或蛋白质来源悬浮于溶剂，如含水溶剂，如水中，并根据所述酶的特征调节pH和温度值。例如，可在使实际蛋白酶的相对活性至少为50，或60，或70，或80或90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在使实际蛋白酶的相对活性至少为50，或60，或70，或80或90％(本文实施例2中定义了这些相对活性)的温度下进行处理。继续进行酶反应，直至获得所需结果，然后，通过例如经热-处理步骤灭活酶，终止或不终止酶反应。

在本发明处理方法的另一个特定实施方案中，蛋白酶的作用是持久的，这意味着例如蛋白酶被加入到植物蛋白质或蛋白质来源中，但其溶解作用可以说并未启动，直至后来在需要时，一旦建立适当的溶解条件，或一旦灭活任何酶抑制剂，或使用任何其它方法延迟酶的作用时才被启动。

在一个实施方案中，处理是对动物饲料或动物饲料中所用的植物蛋白质进行预处理，即在摄入前溶解蛋白质。

术语改善动物饲料的营养价值指的是改善蛋白质的可利用性，导致蛋白质提取物增加，蛋白质产量提高，和/或蛋白质的利用情况有所改善。因此增加饲料的营养价值，改善动物的生长速率和/或体重的增加和/或饲料的转化(即相对于增加的体重而言所摄取饲料的重量)。

在特定的实施方案中，与对照相比，重量至少增加101％，102％，103％，104％，105％，106％或至少增加106.6％(参见本文实施例10)。

在另一个特定的实施方案中，饲料转化至多为(或不超过)99％，98％，97.5％，97％，或至多为96.6％。这等同于饲料转化高达99％，98％，97.5％，97％，或高达96.6％。同样也可参照本文实施例10(与对照相比)。

可以任何形式在饲料中加入蛋白酶，所述蛋白酶是相对较纯的蛋白酶，或者与欲添加至动物饲料中的其它成分相混合，即为动物饲料添加剂的形式，如所谓的动物饲料预混物。

动物饲料添加剂

除了酸-稳定性的枯草蛋白酶家族蛋白酶外，本发明的动物饲料添加剂还含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质，和/或至少一种宏量矿物质。

另外，任选的饲料-添加剂成分有生色剂，芳香化合物，稳定剂和/或至少一种选自下列的其它酶：植酸酶EC 3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC3.2.1.8；半乳聚糖酶EC 3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC 3.2.1.4(EC指的是源自NC-IUBMB的酶名称1992版，1992)，也可参见环球网(www)，网址为http：∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。

在特定的实施方案中，明确限定了这些其它酶(如同上文对蛋白酶制品所作的限定和举例那样，参见实施例12)。

通常，脂溶性和水溶性维生素以及痕量矿物质形成所谓的欲添加至饲料中的预混物的一部分，而宏量矿物质通常被单独加入到饲料中。当加入本发明的酸-稳定性蛋白酶时，这些组合物类型中的任一种都是本发明的动物饲料添加剂。

在特定的实施方案中，动物的食物或饲料中欲包含(或按规定必须包含)本发明的动物饲料添加剂，所述添加剂的水平为0.01-10.0％；更特别地为0.05-5.0％；或0.2-1.0％(％指的是每100克饲料中添加剂的克数)。预混物中更是如此。

因此，通过将相同成分在饲料中的终浓度分别乘以10-10000；20-2000；或100-500(指的是上述3个百分比包含的区间)，即可得出动物饲料添加剂，如预混物中各个成分的浓度。

下表A中显示了各个饲料成分和饲料添加剂成分合乎需要的终浓度，即在饲料中的浓度。

以下是这些成分实例非-排他性的列表：

脂溶性维生素的例子有维生素A，维生素D3，维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的例子有维生素B12，生物素和胆碱，维生素B1，维生素B2，维生素B6，烟酸，叶酸和泛酸盐，如D-泛酸钙。

痕量矿物质的例子有锰，锌，铁，铜，碘，硒和钴。

宏量矿物质的例子有钙，磷和钠。

下表A中列出了对这些成分的营养需求-以家禽和小猪/猪举例。营养需求指的是应该在食物中提供所示浓度的这些成分。这些数据汇编自：

NRC，猪的营养需求，第9次修订版，1988，国立研究委员会农业部动物营养学委员会猪营养学小组委员会。National Academy Press，Washington.D.C.1988；和

NRC，家禽的营养需求，第9次修订版，1994，国立研究委员会农业部动物营养学委员会家禽营养学小组委员会。National Academy Press，Washington，D.C.1994。

在可替换的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种表A中特指的单个成分。至少一种指的是一种，或两种，或三种，或四种，依此类推直至所有13种，或所有15种单个成分中的一种或多种。

更具体地，在本发明的添加剂中包含至少一种单个成分，所述成分的量能使其在饲料中的浓度处于表A第4栏，或第5栏，或第6栏所示的范围之内。

如上文所解释的，通过将这些范围的区限乘以10-10000；20-2000；或100-500，即可得出相应的饲料添加剂的浓度。例如，考虑到维生素A的预混含量对应于10-10000IU/kg的饲料-含量，此运算会产生下列区间：100-10⁸IU；或200-2×10⁷IU；或1000-5×10⁶IU/kg添加剂。

表A：营养需求-和优选范围

每kg食物提供的营养	家禽	小猪/猪/大母猪	范围1	范围2	范围3
每kg食物提供的营养	家禽	小猪/猪/大母猪	范围1	范围2	范围3	脂溶性维生素
维生素A/[IU]	-5000	1300-4000	10-10000	50-8000	100-6000	脂溶性维生素
维生素A/[IU]	-5000	1300-4000	10-10000	50-8000	100-6000	维生素D3/[IU]	-1100	150-200	2-3000	5-2000	10-1500
维生素E/[IU]	-12	11-22	0.02-100	0.2-80	0.5-50	维生素D3/[IU]	-1100	150-200	2-3000	5-2000	10-1500
维生素E/[IU]	-12	11-22	0.02-100	0.2-80	0.5-50	维生素K/[mg]	0.5-1.5	-0.5	0.005-10.0	0.05-5.0	0.1-3.0
						维生素K/[mg]	0.5-1.5	-0.5	0.005-10.0	0.05-5.0	0.1-3.0
						水溶性维生素
B12/[mg]	-0.003	0.005-0.02	0.0001-1.000	0.0005-0.500	0.001-0.100	水溶性维生素
B12/[mg]	-0.003	0.005-0.02	0.0001-1.000	0.0005-0.500	0.001-0.100	生物素/[mg]	0.100-0.25	0.05-0.08	0.001-10.00	0.005-5.00	0.01-1.00
胆碱/[mg]	800-1600	300-600	1-10000	5-5000	10-3000	生物素/[mg]	0.100-0.25	0.05-0.08	0.001-10.00	0.005-5.00	0.01-1.00
胆碱/[mg]	800-1600	300-600	1-10000	5-5000	10-3000
痕量矿物质
痕量矿物质						锰/[mg]	-60	2.0-4.0	0.1-1000	0.5-500	1.0-100
锌/[mg]	40-70	50-100	1-1000	5-500	10-300	锰/[mg]	-60	2.0-4.0	0.1-1000	0.5-500	1.0-100
锌/[mg]	40-70	50-100	1-1000	5-500	10-300	铁/[mg]	50-80	40-100	1-1000	5-500	10-300
铜/[mg]	6-8	3.0-6.0	0.1-1000	0.5-100	1.0-25	铁/[mg]	50-80	40-100	1-1000	5-500	10-300
铜/[mg]	6-8	3.0-6.0	0.1-1000	0.5-100	1.0-25	碘/[mg]	-0.4	-0.14	0.01-100	0.05-10	0.1-1.0
硒/[mg]	-0.2	0.10-0.30	0.005-100	0.01-10.0	0.05-1.0	碘/[mg]	-0.4	-0.14	0.01-100	0.05-10	0.1-1.0
硒/[mg]	-0.2	0.10-0.30	0.005-100	0.01-10.0	0.05-1.0
宏量矿物质
宏量矿物质						钙/[g]	8-40	5-9	0.1-200	0.5-150	1-100
磷作为可利用的磷/[g]	3-6	1.5-6	0.1-200	0.5-150	1-50	钙/[g]	8-40	5-9	0.1-200	0.5-150	1-100

动物饲料组合物

动物饲料组合物或食物具有相对较高的蛋白质含量。根据上文所述的国立研究委员会(NRC)出版物，家禽和猪的食物具有下表B第2-3栏所示的特征。鱼食具有表B第4栏所示的特征。另外，这种鱼食通常具有的粗脂肪含量为200-310g/kg。以鲑鱼食举例说明这些鱼食，所述鱼食是在Aquaculture，principles and practices，T.V R.Pillay编，Blackwell Scientific Publications Ltd.1990；Fish nutrition，第2版，John E.Halver编，Academic Press Inc.1989的基础上设计的。

本发明的动物饲料组合物的粗蛋白含量为50-800g/kg，另外还含有至少一种本文所要求的蛋白酶。

另外，或者在(上述粗蛋白含量的)替代实施方案中，本发明动物饲料组合物所具有的可代谢能量的含量为10-30MJ/kg；和/或钙含量为0.1-200g/kg；和/或可利用的磷的含量为0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸的含量为0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量为0.1-150g/kg；和/或赖氨酸的含量为0.5-50g/kg。

在特定的实施方案中，可代谢能量，粗蛋白，钙，磷，甲硫氨酸，甲硫氨酸加半胱氨酸，和/或赖氨酸的含量在下表B的范围2，3，4或5(R.2-5)的任一个之内。

如Animal Nutrition，第4版，第13章(P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh编，Longman Scientific and Technical，1988，ISBN0-582-40903-9)所述，粗蛋白被计算为氮(N)乘以系数6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通过Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis14^thed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)测定氮含量。

可在NRC出版物Nutrient Requirements of Swine(1988)pp.2-6和European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs，Spelderholt centre forpoultry research and extension，7361 DA Beekbergen，The Netherlands.GrafischbedrijfPonsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5的基础上计算出可代谢的能量。

可在饲料表的基础上计算出全部的动物食物中钙，可利用的磷和氨基酸的食物含量，所述饲料表如Veevoedertable 1997，gegevens over chemischesamenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7。

在特定的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种如上文所定义的植物蛋白质或蛋白质来源。

在另一个特定的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％玉米；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％豆粉；和/或0-10％鱼粉；和/或0-20％乳清。

例如，可将动物食物制备成捣碎的饲料(非-粒状)或粒状饲料。一般将磨碎的饲料相混合，再根据所需类别的详细说明添加足够量的必需维生素和矿物质。加入固体或液体酶制剂。例如，一般在混合步骤之前或之中加入固体酶制剂；一般在成粒步骤之后加入液体酶制品。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物中。食物中最终的酶浓度范围为0.01-200mg酶蛋白质/kg食物，例如5-30mg酶蛋白质/kg动物食物。

实施例11中显示了动物饲料组合物的例子。表B动物食物中能量，蛋白质和矿物质的数值范围

营养物质	家禽	小猪/猪/大母猪	鱼	R.1	R.2	R.3	R.4	R.5
营养物质	家禽	小猪/猪/大母猪	鱼	R.1	R.2	R.3	R.4	R.5		最低-最高	最低-最高	最低-最高
可代谢的能量，MJ/kg	12.1-13.4	12.9-13.5	14-25	10-30	11-28	11-26	12-25			最低-最高	最低-最高	最低-最高
可代谢的能量，MJ/kg	12.1-13.4	12.9-13.5	14-25	10-30	11-28	11-26	12-25		粗蛋白，g/kg	124-280	120-240	300-480	50-800	75-700	100-600	110-500	120-490
钙，g/kg	8-40	5-9	10-15	0.1-200	0.5-150	1-100	4-50		粗蛋白，g/kg	124-280	120-240	300-480	50-800	75-700	100-600	110-500	120-490
钙，g/kg	8-40	5-9	10-15	0.1-200	0.5-150	1-100	4-50		可利用的磷，g/kg	2.1-6.0	1.5-5.5	3-12	0.1-200	0.5-150	1-100	1-50	1-25
甲硫氨酸，g/kg	3.2-5.5	-	12-16	0.1-100	0.5-75	1-50	1-30		可利用的磷，g/kg	2.1-6.0	1.5-5.5	3-12	0.1-200	0.5-150	1-100	1-50	1-25
甲硫氨酸，g/kg	3.2-5.5	-	12-16	0.1-100	0.5-75	1-50	1-30		甲硫氨酸加半胱氨酸，g/kg	4-9	2.3-6.8	-	0.1-150	0.5-125	1-80
赖氨酸，g/kg	2.5-11	6-14	12-22	0.5-50	0.5-40	1-30			甲硫氨酸加半胱氨酸，g/kg	4-9	2.3-6.8	-	0.1-150	0.5-125	1-80

在本发明处理植物蛋白质的方法的特定实施方案中，还包括另一个步骤，即加入植酸酶。在另一个特定的实施方案中，除了联合使用植酸酶和蛋白酶进行处理以外，也可以加入其它酶，其中这些酶选自含有其它蛋白酶，植酸酶，脂解酶和葡糖苷酶/糖酶的组。WO95/28850中描述了这些酶的例子。

当然，应该使用有效量的蛋白酶，即所述量足以改善饲料的溶解性和/或改善饲料的营养价值。目前，希望以下列的一种或多种量(剂量范围)使用酶：0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10，所有这些范围皆为每kg饲料中蛋白酶的mg数(ppm)。

为了测定每kg饲料中蛋白酶的mg数，从饲料组合物中纯化出蛋白酶，使用相关测定法(参见蛋白酶活性，底物和测定法一节)测定纯化蛋白酶的比活。也使用相同的测定法测定所述饲料组合物的蛋白酶活性，在这两个测定结果的基础上，计算出以每kg饲料中所含蛋白酶的mg数计的剂量。

使用相同的原理测定饲料添加剂中蛋白酶的mg数。

当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用的蛋白酶样品，可测定该样品的比活(而不必从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。

很多植物含有抗-营养因子，如凝集素和胰蛋白酶抑制剂。最重要的大豆抗-营养因子是凝集素大豆凝集素(SBA)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)。

凝集素是以相当强的特异性与特定的含糖分子结合的蛋白质，当其被消化时，可与小肠上皮结合。这可能导致上皮细胞的存活力下降，从而使营养物质的吸收减少。

SBA是糖基化的四聚体凝集素，其亚单位的分子量约为30kDa，并对N-乙酰半乳糖胺具有高亲和力。

胰蛋白酶抑制剂影响小肠蛋白酶解，降低其消化蛋白质的能力，也会使胰腺分泌的消化酶增加，导致以消化酶的形式损失氨基酸。胰蛋白酶抑制剂的例子有Bowman-Birk抑制剂，其分子量约为8kDa，含有7个二硫键，并具有两个特异于胰蛋白酶-样和胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶的抑制性环。其它例子有所谓Kunitz抑制剂因子(例如大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂，其含有一个胰蛋白酶-样蛋白酶的结合位点，分子量约为20kDa)。

已证实本发明所用的蛋白酶可以水解抗-营养因子，如SBA凝集素，胰蛋白酶抑制剂Bowman Birk抑制剂和大豆Kunitz因子。参见实施例5的实验部分。

因此，本发明还涉及酸-稳定性蛋白酶水解，或减少抗-营养因子的量的用途，所述抗-营养因子如SBA凝集素和胰蛋白酶抑制剂，如Bowman Birk抑制剂和Kunitz因子，如大豆Kunitz因子。

实施例1

筛选酸-稳定性蛋白酶

分析多种蛋白酶在pH3时的稳定性，目的是鉴定出具有必要的稳定性，从而能流经单胃动物酸性胃的蛋白酶。

通过常规的层析法，如离子交换层析，疏水作用层析和大小排阻层析(参见例如Protein Purification，Principles，High Resolution Methods，andApplications，Jan-Christer Janson，Lars Ryden编，VCH Publishers，1989)纯化蛋白酶。

按下述测定蛋白酶活性：于25℃，pH9.5中将蛋白酶与1.67％Hammarsten酪蛋白保温30分钟，然后加入TCA(三氯醋酸)至终浓度为2％(w/w)，过滤混合物以除去沉淀物，分析滤液的游离一级氨基(在基于OPA(邻苯二醛)的比色试验中，通过使用丝氨酸标准，测定340nm处的光吸收值来进行检测(Biochemische Taschenbuch teil II，Springer-Verlag(1964)，p.93和p.102))。一个酪蛋白蛋白酶单位(CPU)被定义为：在标准条件下，即25℃和pH9.5，每分钟释放1mmol TCA-可溶性一级氨基所需酶的量。

用水将蛋白酶稀释至活性为0.6CPU/l，分成两等份，然后分别用100mM柠檬酸盐缓冲液，pH3和100mM磷酸盐缓冲液，pH7将每等份进一步稀释至0.3CPU/l。将稀释的样品置于37℃保温1小时，将20μl样品上样于含有1％脱脂奶的1％琼脂糖平板的孔中。37℃保温平板(pH7.0)过夜，测量清亮的区域。

在此试验中，42种蛋白酶表现较好。已鉴定出其中的多种蛋白酶，参见实施例2，6，7和8。这些蛋白酶都属于丝氨酸蛋白酶的枯草蛋白酶家族。

实施例2

得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的枯草蛋白酶的鉴定和比较研究

按WO93/24623的实施例1所述，制备得自芽孢杆菌属菌种NCIMB40484的蛋白酶。

鉴定的目的是研究它们相对于Sub.Novo，Sub.Novo(Y217L)和SAVINASE^TM而言的pH-稳定性，pH-活性和温度-活性分布图。

Sub.Novo是得自解淀粉芽孢杆菌的枯草蛋白酶，而Sub.Novo(Y217L)是其突变体，该突变体公开于WO96/05739中。使用常规方法从野生型菌株的培养物中制备和纯化Sub.Novo，并按照EP130756的实施例1-2和15-16所述制备突变体。

SAVINASE^TM是得自克劳氏芽孢杆菌(以前是迟缓芽孢杆菌NCIB 10309)的枯草蛋白酶，可购自丹麦，Novozymes A/S，Krogshoejvej，DK-2880Bagsvaerd。美国专利号3723250中描述了它的制备。

实施例2A

测定蛋白酶样品的SDS-PAGE纯度

通过下列方法测定蛋白酶样品的SDS-PAGE纯度：

在置于冰上的Eppendorf管中混合40μl蛋白酶溶液(A₂₈₀浓度＝0.025)与10μl 50％(w/v)TCA(三氯醋酸)。在冰上放置半小时之后，离心Eppendorf管(5分钟，0℃，14,000×g)，小心取出上清液。在沉淀中加入20μl SDS-PAGE样品缓冲液(200μl Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2×)(125mM Tris/HCl，pH6.8，4％(w/v)SDS，50ppm溴酚蓝，20％(v/v)甘油，得自NOVEX^TM的LC2676)+160μl蒸馏水+20μl β-巯基乙醇+20μl 3M未缓冲的Tris Base(SigmaT-1503))，将管煮沸3分钟。短暂离心Eppendorf管，将10μl样品上样于得自NOVEX^TM的4-20％梯度Tris-甘氨酸预制凝胶(基于Laemmli化学的聚丙烯酰胺梯度凝胶，但凝胶中不含SDS(Laemmli，U.K.，(1970)自然，vol.227，pp.680-685)，EC60255)。在两种缓冲液的槽中，用Tris-甘氨酸电泳缓冲液(2.9gTris Base，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加蒸馏水至1升)，以150V的恒定电压进行电泳，直至溴酚蓝示踪染料到达凝胶的底部。电泳之后，通过缓慢振荡，用100ml蒸馏水将凝胶浸洗3次，每次5分钟。然后用Gelcode^_ Blue StainReagent(得自PIERCE的胶状Comassie G-250产品，PIERCE目录号为24592)缓慢振荡凝胶1小时，再用蒸馏水缓慢振荡清洗8至16小时，其间更换几次蒸馏水。最后，在两片玻璃纸之间干燥凝胶。用装配有Fotolook 95 v2.08软件，得自AGFA的Arcus II扫描仪扫描干燥的凝胶，并通过具有下列(Fotolook 95 v2.08)设置的File/Acquire命令，将扫描图像引入Windows介面下的图像评价软件CREAM^TM(目录号990001和990005，Kem-En-Tec，丹麦)：Original＝Reflective，Mode＝Color RGB，Scan resolution＝240ppi，Outputresolution＝1201pi，Scale factor＝100％，Range＝Histogram with Globalselection和Min＝0和Max＝215，ToneCurve＝None，Sharpness＝None，Descreen＝None和Flavor＝None，从而产生SDS-PAGE凝胶的^*.img图形文件，用于在CREAM^TM中进行评价。用菜单命令Analysis/1-D评价^*.img图形文件。用Lane Place Tool将两条扫描线置于^*.img图形文件上：一条为样品扫描线，一条为背景扫描线。将样品扫描线置于自上样狭槽最下方至溴酚蓝示踪染料位置最上方的样品泳道(含所述蛋白酶)的中间。将背景扫描线置于与样品扫描线平行的位置，但此位置是图形化的SDS-PAGE凝胶上没有上样样品的位置，背景扫描线的起点和终点垂直于样品扫描线的起点和终点。背景扫描线代表真实的凝胶背景。扫描线的宽度和外形未经调节。用具有中度敏感性的1-D/Scan菜单命令纪录沿着扫描线的强度。使用1-D/Editor菜单命令，从样品扫描中扣除背景扫描。然后选择1-D/Results菜单命令，将通过CREAM^TM软件计算出的蛋白酶峰面积的百分比用作蛋白酶的SDS-PAGE纯度。

获得下列结果：

蛋白酶	SDS-PAGE纯度(面积％)
蛋白酶	SDS-PAGE纯度(面积％)	得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	96.3
Sub.Novo	95.5	得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	96.3
Sub.Novo	95.5	Sub.Novo(Y217L)	96.0
Savinase_	99.2	Sub.Novo(Y217L)	96.0

实施例2B

pH-活性试验

使用Suc-AAPF-pNA(Sigma^_S-7388)获得pH-活性分布图。

试验缓冲液：100mM琥珀酸(Merck 1.00682)，100mM HEPES(SigmaH-3375)，100mM CHES(Sigma C-2885)，100mM CABS(C-5580)，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％ Triton^_X-100，用HCl或NaOH调节至pH值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。

检测温度：25℃。

在各个pH值下，将300μl蛋白酶样品(用0.01％Triton^_X-100稀释)与1.5ml试验缓冲液混合，使混合物的pH达到试验缓冲液的pH。通过加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中，再用0.01％Triton^_X-100稀释45倍)以开始反应，混合之后，用分光光度计监测A₄₅₀的增加，作为在所述pH下蛋白酶活性的测量结果。用其它pH值的试验缓冲液重复进行试验，将活性的测量结果作图为针对pH的相对活性。用最高活性(pH-最适值)使相对活性归一化，即将pH-最适值下的活性设置为1，或100％。稀释蛋白酶样品以确保所有的活性测量结果都能落入该试验的剂量-反应曲线的线性部分。

实施例2C

pH-稳定性试验

使用Suc-AAPF-pNA(Sigma^_S-7388)获得pH-稳定性分布图。

试验缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％ Triton^_X-100，用HCl或NaOH调节至pH值为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。

用各个受试pH值下的试验缓冲液稀释各个蛋白酶样品(溶于1mM琥珀酸，2mM CaCl₂，100mM NaCl，pH6.0，A₂₈₀光吸收值＞10)至A₂₈₀＝1.0。于37℃将经稀释的蛋白酶样品保温2小时。保温之后，用100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％ Triton^_X-100，pH9.0稀释蛋白酶样品，使所有样品的pH为pH9.0。

在以下的活性测定中，温度为25℃。

将300μl经稀释的蛋白酶样品与1.5ml pH9.0试验缓冲液混合。通过加入1.5ml pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中，再用0.01％Triton^_X-100稀释45倍)以开始活性反应，混合之后，用分光光度计监测A₄₅₀的增加，作为(残留)蛋白酶活性的测量结果。在不同pH-值下进行37℃保温，将活性的测量结果作图为针对pH的残留活性。用平行保温的活性(对照)使残留活性归一化，其中在测定活性之前用pH9.0的检测缓冲液将蛋白酶稀释至A₂₈₀＝1.0，5℃保温2小时以作为其它的保温。在测定活性之前稀释蛋白酶样品，以确保所有的活性测量结果都能落入该试验的剂量-反应曲线的线性部分。

实施例2D

温度-活性试验

使用Protazyme AK片剂获得温度分布图。Protazyme AK片剂是由Megazyme制备成片剂的经azurine染色的交联酪蛋白。

试验缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton^_X-100，用NaOH调节至pH值为9.0。

通过缓慢搅拌将Protazyme AK片剂悬浮于2.0ml 0.01％Triton^_X-100。在Eppendorf管中混合500μl该悬浮液和500μl试验缓冲液，将管置于冰上。加入20μl蛋白酶样品(用0.01％Triton^_X-100稀释)。通过将Eppendorf管转移至设置为检测温度的Eppendorf热混合仪来启动试验。在处于最高振荡速率的Eppendorf热混合仪上将管保温15分钟。通过将管移回冰浴以终止试验性保温。在冰冷的离心机中将管离心几分钟，用分光光度计读出上清液的A₆₅₀。在此试验中包括空白缓冲液(替代酶)。A₆₅₀(蛋白酶)-A₆₅₀(空白)为蛋白酶活性的测量结果。在不同温度下进行试验，将活性的测量结果作图为针对保温温度的相对活性。用最高活性(温度最适值)使相对活性归一化。稀释蛋白酶样品，以确保所有的活性测量结果都能落入该试验的剂量-反应曲线的接近线性部分。

表1为活性最适值(pH-和温度活性)的一览表。图1-3为pH-稳定性，pH-活性和温度-活性的分布图，表2为蛋白酶在酸性pH-值下的pH-稳定性数据的详细比较。

表1多种蛋白酶的pH-和温度最适值

表2多种蛋白酶在pH2.0至5.0之间的pH-稳定性

蛋白酶	pH2.0	pH2.5	pH3.0	pH3.5	pH4.0	pH4.5	pH5.0
蛋白酶	pH2.0	pH2.5	pH3.0	pH3.5	pH4.0	pH4.5	pH5.0	芽孢杆菌属菌种NCIMB40484	0.001	0.001	0.428	0.940	0.991	0.989	0.991
Sub.Novo	0.007	0.003	0.000	0.000	0.024	0.784	0.942	芽孢杆菌属菌种NCIMB40484	0.001	0.001	0.428	0.940	0.991	0.989	0.991
Sub.Novo	0.007	0.003	0.000	0.000	0.024	0.784	0.942	Sub.Novo(Y217L)	0.000	0.000	0.002	0.003	0.350	0.951	0.996
Savinase	0.001	0.001	0.001	0.003	0.338	0.929	0.992	Sub.Novo(Y217L)	0.000	0.000	0.002	0.003	0.350	0.951	0.996

实施例2E

纯化的蛋白酶样品的光吸收纯度

测定A ₂₈₀ /A ₂₆₀ 比率

按下述测定纯化的蛋白酶样品的A₂₈₀/A₂₆₀比率。

A₂₆₀指的是在光程长度为1cm的样品池中，蛋白酶样品在260nm下相对于缓冲液空白的光吸收值。A₂₈₀指的是在光程长度为1cm的样品池中，相同蛋白酶样品在280nm下相对于缓冲液空白的光吸收值。

用缓冲液稀释实施例2和6中所得的纯化蛋白酶样品，直至分光光度计的A₂₈₀读数落入其反应曲线的线性部分。由读数测定A₂₈₀/A₂₆₀比率。

获得下列结果：

蛋白酶/枯草蛋白酶的来源	A₂₈₀/A₂₆₀
蛋白酶/枯草蛋白酶的来源	A₂₈₀/A₂₆₀	Sub.Novo	2.11
Sub.Novo(Y217L)	2.12	Sub.Novo	2.11
Sub.Novo(Y217L)	2.12	SAVINASE^TM	2.12
芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	2.19	SAVINASE^TM	2.12
芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	2.19	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	1.92
尖孢镰孢IFO 4471	1.89	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	1.92
尖孢镰孢IFO 4471	1.89	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	1.92
曲霉属菌种CBS 102448	1.96	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	1.92
曲霉属菌种CBS 102448	1.96	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	2.04
基利支顶孢ATCC 20338	1.71	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	2.04

实施例3

得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶降解大豆粉(SRM)不溶性部分的能力

检测得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。

将该蛋白酶的性能与两种按照WO95/02044所述制备的天冬氨酸蛋白酶，Protease I和Protease II相比较。所述文献还公开了这两种酶在饲料中的用途。Protease I是II型曲霉胃蛋白酶(Aspergillopepsin)类蛋白酶，Protease II是I型曲霉胃蛋白酶类蛋白酶(它们都是天冬氨酸蛋白酶，即非-枯草蛋白酶类的蛋白酶)，它们皆得自Aspergillus aculeatus(参见上文所述的Handbook ofProteolytic Enzymes)。

在模拟单胃动物消化道(包括在pH2时用胃蛋白酶处理，在pH7时用胰酶制剂处理)的过程中产生了受试底物，即所谓的豆粉残留物。

在用胰酶制剂处理的步骤中，加入了一系列高剂量的商品酶，以降解可靠近现存商品酶的SBM成分。

加入以下皆可购自丹麦，Novozymes A/S的酶：ALCALASE^TM 2.4L，NEUTRASE^TM 0.5L，FLAVOURZYME^TM 1000L，ENERGEX^TM L，BIOFEED^TMPlus L，PHYTASE NOVO^TM L。所用SBM是粒状的饲料用标准48％蛋白质SBM。

处理后，所得豆粉残留物中仅剩下5％的总蛋白质。

FITC标记方法

随后，按下述用FITC(Molecular Probes，F-143)标记残留物：将豆粉残留物(湿重为25g，干重约为5g)悬浮于100ml 0.1M碳酸盐缓冲液，pH9中，40℃搅拌1小时。使悬浮液冷却至室温，黑暗中用5-异硫氰酸荧光素(FITC)处理过夜。通过超滤(截留分子量为10,000)除去未结合的探针。

FITC-试验

使用下列测定法，用经FITC标记的豆粉残留物检测蛋白酶降解豆粉残留物的能力：于37℃混合0.4ml蛋白酶样品(A₂₈₀＝0.1)与0.4ml FITC-豆粉残留物(0.2M磷酸钠缓冲液pH6.5中的10mg/ml悬浮液)，在0小时之后，和保温22小时之后测定相对荧光单位(RFU 485/535nm；激发/监测波长)。测定RFU之前，以20,000×g离心样品1分钟，将250微升上清液转移至黑色的微滴盘中。使用VICTOR 1420 Multilabel计数器(体外，丹麦)进行测定。RFU的一般性描述可参见：Iain D.Johnson，Introduction to Fluorescence Techniques，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Richard P.Haugland，第6版，1996(ISBN 0-9652240-0-7)。

通过加入0.4ml缓冲液替代酶样品来制备空白对照样品。

RFU_样品＝ΔRFU_样品-ΔRFU_空白对照，其中ΔRFU＝RFU(22小时)-RFU(0小时)

所得FITC值(RFU_样品值)示于下表3。FITC值的误差容限一般为+/-20,000。与Protease I和Protease II形成对照的是，得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶能显著降解豆粉残留物。

表3蛋白酶降解豆粉残留物的能力

蛋白酶	FITC(+/-20000)
蛋白酶	FITC(+/-20000)	芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	61900
Protease I	-9200	芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	61900
Protease I	-9200	Protease II	-1200

实施例4

体外检测得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶

在自动化的体外消化***(模拟单胃动物的消化)中检测以下蛋白酶溶解玉米-SBM(玉米-豆粉)蛋白质的能力，所述蛋白酶是得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶，和其它枯草蛋白酶，如Sub-Novo，SubNovo(Y217L)，SAVINASE^TM和ALCALASE^TM。在缺乏外源性枯草蛋白酶-样蛋白酶时保温玉米-SBM以用作空白对照。

体外***由30个烧瓶组成，其中，先将玉米-SBM底物与HCl/胃蛋白酶保温-模拟胃消化，随后，与胰酶制剂保温-模拟肠消化。在胃-保温期结束时，取出体外消化样品，分析溶解的蛋白质。

底物

使用10g玉米-SBM食物，其中玉米-SBM的比例为6∶4(w/w)。SBM中的蛋白质含量为43％(w/w)，玉米粉中的蛋白质含量为8.2％(w/w)。10g玉米-SBM食物中的蛋白质总量为2.21g。

消化酶

胃蛋白酶(Sigma P-7000；539U/mg，固体)，胰酶制剂(Sigma P-7545；8xU.S.P(US Pharmacopeia))。

体外消化方法概况

烧瓶中添加的成分	pH	温度	时程	模拟的消化期
烧瓶中添加的成分	pH	温度	时程	模拟的消化期	10g玉米-SBM食物(6∶4)，HCl/胃蛋白酶(3000U/g食物)，蛋白酶(0.1mg蛋白酶酶蛋白质/g食物)	3.0	40℃	t＝0分钟	胃
NaOH	6.8	40℃	t＝60分钟	肠	10g玉米-SBM食物(6∶4)，HCl/胃蛋白酶(3000U/g食物)，蛋白酶(0.1mg蛋白酶酶蛋白质/g食物)	3.0	40℃	t＝0分钟	胃
NaOH	6.8	40℃	t＝60分钟		NaHCO₃/胰酶制剂(8mg/g食物)	6.8	40℃	t＝90分钟
终止保温，取出等分试样	7.0	0℃	t＝330分钟		NaHCO₃/胰酶制剂(8mg/g食物)	6.8	40℃	t＝90分钟

酶蛋白质的测定

使用S.C.Gill & PH.von Hippel，Analytical Biochemistry 182，319-326(1989)概述的原理，基于A₂₈₀值和氨基酸序列(氨基酸组成)计算蛋白酶酶蛋白质的量。

体外模型的实验方法

1.称取10g底物置于100ml烧瓶中。

2.于0分钟，在烧瓶中边混合边加入46ml含胃蛋白酶(3000U/g食物)的HCl(0.1M)和1ml蛋白酶(0.1mg酶蛋白质/g食物)。将烧瓶置于40℃下保温。

3.于30分钟，测定pH。

4.于45分钟，加入16ml H₂O。

5.于60分钟，加入7ml NaOH(0.39M)。

6.于90分钟，加入5ml含胰酶制剂(8.0mg/g食物)的NaHCO₃(1M)。

7.于120分钟，测定pH。

8.于300分钟，测定pH。

9.于330分钟，取出30ml样品，置于冰上，然后离心(10000×g，10分钟，4℃)。取出上清液，储存于-20℃。

通过凝胶过滤HPLC估计溶解的蛋白质

通过使用凝胶过滤HPLC定量粗蛋白(CP)，估计出体外消化样品上清液中的溶解蛋白质含量。融化上清液，流经0.45μm的聚碳酸酯滤器(Sartorius)过滤，并用H₂O稀释(1∶50，v/v)。通过使用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)凝胶过滤柱(Global)的HPLC层析经稀释的样品。用于等度洗脱的洗脱剂是含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)。每次层析所需洗脱剂的总体积是26ml，流速为0.4ml/min。纪录214nm处的洗脱分布图，通过积分法测定分布图下的总面积。为了由经积分的面积估计蛋白质含量，用经连续稀释的，具有已知总蛋白质含量的体外消化玉米-SBM参照样品绘制出校准曲线(R²＝0.9993)。通过Kjeldahl法(测定氮的百分比；A.O.A.C.(1984)，OfficialMethods of Analysis，第14版，Washington DC)进行该参照样品的蛋白质测定。

结果

下表4显示了结果，即多种蛋白酶在体外对蛋白质溶解性的作用。

根据体外消化反应过程中，溶解于总体积为75ml中的10g玉米-SBM食物(2.21g蛋白质)的蛋白质总量，计算出溶解蛋白质的相对量。假定蛋白质完全溶解(100％)，上清液中的蛋白质含量将为2.95％(w/v)。

通过单向分析方差(p＝0.0001)来分析结果。SD＝标准差；n＝每次处理重复的次数(n＝5)。

与其它蛋白酶相比，得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶对蛋白质溶解性的作用要好得多。

表4

酶	可溶性CP(占总量的％)	SD
酶	可溶性CP(占总量的％)	SD	得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶	78.8^A	0.48
Sub.Novo	76.7^B	0.37	得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶	78.8^A	0.48
Sub.Novo	76.7^B	0.37	ALCALASE^TM	73.9^C	1.04
Sub.Novo(Y217L)	75.8^B	0.91	ALCALASE^TM	73.9^C	1.04
Sub.Novo(Y217L)	75.8^B	0.91	SAVINASE^TM	75.8^B	0.85
空白对照	76.6^B	0.88	SAVINASE^TM	75.8^B	0.85

A，B，C：上标子母不相同的值显者不同(P＜0.05)。

实施例5

降解凝集素SBA和大豆Bowman-Birk及Kunitz抑制剂

检测得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶水解大豆凝集素(SBA)和大豆Bowman-Birk及Kunitz胰蛋白酶抑制剂的能力。

于37℃，pH6.5中将纯的SBA(Fluka 61763)，Bowman-Birk抑制剂(SigmaT-9777)或Kunitz抑制剂(大豆胰蛋白酶抑制剂，Boehringer Mannheim 109886)与蛋白酶保温2小时(蛋白酶∶抗-营养因子＝1∶10，基于A₂₈₀)。保温缓冲液：50mM二甲基戊二酸，150mM NaCl，1mM CaCl₂，0.01％ Triton X-100，pH6.5。

由SDS-PAGE凝胶上本来有的SBA或胰蛋白酶抑制剂带的消失，和低分子量降解产物的出现估计蛋白酶降解SBA和蛋白酶抑制剂的能力。用考马斯蓝染色凝胶，通过扫描测定带的强度。

下表5显示了结果，即所降解的抗-营养因子的百分比。

也期望在保温豆粉与候选蛋白酶之后，能应用Westem技术，用抗SBA，Bowman-Birk抑制剂或Kunitz抑制剂的抗体估计蛋白酶降解大豆中的抗-营养因子的能力(参见WO98/56260)。

表5

蛋白质的来源	SBA	Bowman-Birk抑制剂	Kunitz抑制剂
蛋白质的来源	SBA	Bowman-Birk抑制剂	Kunitz抑制剂	芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	21	41	100

实施例6

制备其它酸-稳定性的枯草蛋白酶

制备嗜碱芽孢杆菌蛋白酶

将嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438的冻干培养物接种于摇瓶中，所述摇瓶各含有100ml具有下列组成的BPX培养基：土豆淀粉100g/l，大麦粉50g/l，BAN 800 MG(得自Novozymes A/S)0.05g/l，酪蛋白酸钠10g/l，豆粉20g/l，磷酸氢二钠9g/l，Pluronic PE 6100 0.1ml/l，自来水若干。接种前，用10ml1M碳酸氢三钠将每个摇瓶的pH调节至9.7。于30℃，以300rpm将菌株发酵4天。将此培养物接种于含100ml BPX培养基的新摇瓶中发酵3天。

纯化

在1升烧杯中，以10000×g将培养液离心30分钟。混合上清液，通过流经Seitz K-250纵深滤板(depth filter plate)进行过滤以进一步澄清上清液。通过在截留分子量为3kDa的聚醚砜盒(Filtron)上进行超滤以浓缩已澄清的滤液。将浓缩的酶转移至G25 Sephadex柱(Amersham Pharmacia Biotech)上的50mM H₃BO₃，5mM 3，3′-二甲基戊二酸，1mM CaCl₂，pH7(缓冲液A)中，并上样于已用缓冲液A平衡的Bacitracin琼脂糖柱(Upfront ChromatographyA/S)。用缓冲液A清洗Bacitracin柱以除去未结合的蛋白质，然后使用添加有25％ 2-丙醇和1M氯化钠的缓冲液A从柱上洗脱蛋白酶。集中得自Bacitracin柱的，具有蛋白酶活性的级分，通过G25 Sephadex层析，将级分转移至20mM CH₃COOH/NaOH，1mM CaCl₂，pH5(缓冲液B)中。将缓冲液交换的蛋白酶收集物上样于已用缓冲液B平衡的SOURCE 30S柱(AmershamPharmacia Biotech)。用缓冲液B清洗SOURCE 30S柱，然后用缓冲液B中线性递增的NaCl梯度(0至0.5M)洗脱蛋白酶。检测柱级分的蛋白酶活性，通过SDS-PAGE分析含蛋白酶的级分。集中纯的级分，用于进一步鉴定。

制备其它酸-稳定性枯草蛋白酶

按照上文关于制备得自嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438的蛋白酶的一般性描述，使用常规方法制备尖孢镰孢(Fusarium Oxysporum)IFO 4471，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)NCIMB 10438，Paecilomyces lilacinus CBS102449，曲霉属菌种(Aspergillus sp.)CBS 102448，Acremonium chrysogenumATCC 48272和基利支顶孢(Acremonium kiliense)ATCC 20338的蛋白酶。

序列

测定下列部分氨基酸序列：

SEQ TD NO：1

得自Acremonium chrysogenum ATCC 48272的蛋白酶的N-末端：ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSYIY；

SEQ ID NO：2

得自嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438的蛋白酶的N-末端：NQVTPWGITRVQAPTAW；

SEQ ID NO：3

得自Paecilomyces lilacinus CBS 102449的蛋白酶的N-末端：AYTQQPGAPWGLGRISH；

SEQ ID NO：4

得自尖孢镰孢IFO 4471的蛋白酶的N-末端：ALTTQSGATWGLGTVSHRSRGS。

得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶的氨基酸序列，即本文中的SEQ ID NO：5先前已被测定(参见美国专利5650326，SEQ ID NO：4，6和8)。

在公开的蛋白质数据库中检索相关序列，揭示出以下结果：

SEQ ID NO：6

Geneseqp/r65936(指的是EP6236/2甲的得自Paecilo-myces lilacinus CBS143.75的蛋白酶)-与SEQ ID NO：3相关；

SEQ ID NO：7

Geneseqp/r74334(指的是JP-07095882中的得自芽孢杆菌属菌种THS-1001的蛋白酶)-与SEQ ID NO：2相关。

根据有关用于专利程序的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约，按下述将Paecilomyces lilacinus和曲霉属菌种的菌株保藏于荷兰的Centraalbureauvoor Schimmelcultures(CBS)，P.O Box 273，3740 AG Baam：

保藏日：2000年1月17日

CBS保藏号：曲霉属菌种102448

保藏日：2000年1月17日

CBS保藏号：Paecilomyces lilacinus 102449

由Novo Nordisk A/S进行保藏，后来转让给了Hoffmann-La Roche AG。

实施例7

其它枯草蛋白酶的鉴定和比较研究

制备自嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438，尖孢镰孢IFO 4471，Paecilomyceslilacinus CBS 102449，曲霉属菌种CBS 102448，Acremonium chrysogenumATCC 48272和基利支顶孢ATCC 20338的蛋白酶都是枯草蛋白酶。

按实施例2所述测定蛋白酶样品的纯度。

获得下列结果：

蛋白酶	SDS-PAGE纯度(面积％)
蛋白酶	SDS-PAGE纯度(面积％)	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	100.0
尖孢镰孢IFO 4471	n.d.	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	100.0
尖孢镰孢IFO 4471	n.d.	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	98.3
曲霉属菌种CBS 102448	n.d.	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	98.3
曲霉属菌种CBS 102448	n.d.	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	98.6
基利支顶孢ATCC 20338	n.d.	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	98.6

n.d.＝未检测

测定法

实施例2中描述了pH-活性，pH-稳定性和温度-活性的测定法(pNA底物Suc-AAPF-pNA(Sigma S-7388)被用于所有蛋白酶的pH-活性和-稳定性分布图，而Protazyme AK片剂被用于温度分布图)。

活性(pH-和温度活性)最适值的概况见表6。pH-稳定性，pH-活性和温度-活性的分布图见图4-6，蛋白酶在酸性pH-值下pH-稳定性数据的详细比较见表7。

表6多种蛋白酶的pH-和温度最适值

蛋白酶	pH-最适值	温度-最适值(℃)
蛋白酶	pH-最适值	温度-最适值(℃)	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	9	70
尖孢镰孢IFO 4471	11	60	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	9	70
尖孢镰孢IFO 4471	11	60	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	8	60
曲霉属菌种CBS 102448	10	60	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	8	60
曲霉属菌种CBS 102448	10	60	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	9	70
基利支顶孢ATCC 20338	11	70	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	9	70

表7多种蛋白酶在pH2.0至5.0之间的pH-稳定性

蛋白酶	pH2.0	pH2.5	pH3.0	pH3.5	pH4.0	pH4.5	pH5.0
蛋白酶	pH2.0	pH2.5	pH3.0	pH3.5	pH4.0	pH4.5	pH5.0	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	0.007	0.005	0.175	0.844	0.965	1.017	1.038
尖孢镰孢IFO 4471	0.000	0.000	0.003	0.649	0.929	1.030	1.056	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	0.007	0.005	0.175	0.844	0.965	1.017	1.038
尖孢镰孢IFO 4471	0.000	0.000	0.003	0.649	0.929	1.030	1.056	Paecilomyces lilacinus CBS102449	0.002	0.003	0.005	0.450	0.897	1.000	0.947
曲霉属菌种CBS 102448	0.002	0.002	0.002	0.532	0.860	0.970	0.976	Paecilomyces lilacinus CBS102449	0.002	0.003	0.005	0.450	0.897	1.000	0.947
曲霉属菌种CBS 102448	0.002	0.002	0.002	0.532	0.860	0.970	0.976	Acremonium chrysogenumATCC 48272	0.002	0.001	0.001	0.809	0.894	0.972	1.005
基利支顶孢ATCC 20338	0.008	0.003	0.023	0.412	0.843	0.955	1.009	Acremonium chrysogenumATCC 48272	0.002	0.001	0.001	0.809	0.894	0.972	1.005

实施例8

用链霉菌属枯草蛋白酶抑制剂(SSI)抑制蛋白酶

pNA底物：抑制后，使用Suc-AAPF-pNA(Sigma^_S-7388)测定残留活性。

试验缓冲液：100mM琥珀酸(Merck 1.00682)，100mM HEPES(SigmaH-3375)，100mM CHES(Sigma C-2885)，100mM CABS(C-5580)，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton^_X-100，pH9.0。

检测温度：25℃。

通过层析从白浅灰链霉菌FERM P-1205(S-3253)发酵上清液中纯化SSI。所用SSI制品的纯度超过95％-纯度是通过实施例2A所述的方法测定的。或者，可从日本的Wako公司获得SSI，其目录号为303-05201，这种SSI是由Daiwa Kasei K.K.生产的(参见例如http：∥search.wako-chem.cojp/lifedb_e/lifedocs_e/44834.asp)。

在进行下述抑制试验之前，用0.01％ Triton X-100将SSI稀释至A₂₈₀浓度＝0.01。

蛋白酶：所用蛋白酶的纯度超过95％-纯度是通过实施例2A所述的方法测定的。在进行下述抑制试验之前，用0.01％ Triton X-100将蛋白酶稀释至A₂₈₀浓度＝0.010。

通过下列方法测定链霉菌属枯草蛋白酶抑制剂(SSI)对蛋白酶的抑制作用。

将300μl蛋白酶样品(A₂₈₀浓度＝0.010)与300μl SSI(A₂₈₀浓度＝0.010)和1.5ml试验缓冲液混合。室温下保温15分钟，然后通过加入1.5ml pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMS0中，再用0.01％Triton^_X-100稀释45倍)，混合之后，用分光光度计监测A₄₅₀的增加，从而测定残留活性。作为对照(无SSI)，使用300μl 0.01％ Triton X-100替代SSI。

用对照活性(无SSI)使残留活性归一化，即未被SSI抑制给出100％残留活性，完全被SSI抑制给出0％残留活性。

获得下列结果：

蛋白酶，枯草蛋白酶的来源	残留活性(％)
蛋白酶，枯草蛋白酶的来源	残留活性(％)	芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	4.3
解淀粉芽孢杆菌	0.1	芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484	4.3
解淀粉芽孢杆菌	0.1	解淀粉芽孢杆菌(Y217L)	0.0
Bacillus clausii，(Savinase_)	0.0	解淀粉芽孢杆菌(Y217L)	0.0
Bacillus clausii，(Savinase_)	0.0	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	0.0
尖孢镰孢IFO 4471	0.1	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	0.0
尖孢镰孢IFO 4471	0.1	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	0.1
曲霉属菌种CBS 102448	0.1	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	0.1
曲霉属菌种CBS 102448	0.1	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	0.1
基利支顶孢ATCC 20338	n.d.^*	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	0.1

*^未测定

实施例9

其它酸-稳定性枯草蛋白酶降解大豆粉(SBM)不溶性部分的能力

按实施例3所述，检测按实施例6所述制备的其它酸-稳定性枯草蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。

所得结果示于下表8。为了进行比较，将实施例3中所得的Proteases I和II的结果也包括在表8中。

表8其它蛋白酶降解豆粉残留物的能力

蛋白酶，枯草蛋白酶的来源	FITC/(+/-20000)
蛋白酶，枯草蛋白酶的来源	FITC/(+/-20000)	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	81300
尖孢镰孢IFO 4471	102200	嗜碱芽孢杆菌NCIMB 10438	81300
尖孢镰孢IFO 4471	102200	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	98700
曲霉属菌种CBS 102448	123400	Paecilomyces lilacinus CBS 102449	98700
曲霉属菌种CBS 102448	123400	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	89600
基利支顶孢ATCC 20338	94600	Acremonium chrysogenum ATCC 48272	89600
基利支顶孢ATCC 20338	94600	Protease I	-9200
Protease II	-1200	Protease I	-9200

实施例10

得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的酸-稳定性枯草蛋白酶对适于烤焙的小鸡的生长特性的作用

根据法国官方指导活动物实验的说明，在Roche动物营养研究中心(CRNA，F-68305 Village-Neuf，法国)进行试验。性别分离的一日龄小鸡(“RossPM3”)由商业孵化所提供。

将小鸡圈养在用铁丝网作地面的多层鸡笼中，这些鸡笼被置于环境受控的室内。随意供给饲料和自来水。

第8天，按体重将小鸡分组，6只小鸡为一组，对它们进行对照处理，即接受不含酶的实验食物，或进行酶处理，即接受每kg饲料添加100mg芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶酶蛋白质的实验食物。

用12组重复每种处理，每个性别6组。在第8和29天给各组称重。测定中间期(intermedrate period)的饲料消耗，计算体重增加量和饲料转化率。

实验食物基于以玉米淀粉和豆粉(44％粗蛋白)为主要成分(表9)，所述食物由CRNA生产。在约70℃使饲料成为粒状(压模形状：3×20mm)。以固定量的水稀释适当量的芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶，喷洒在粒状的饲料上。对对照处理而言，用相同的方式使用足够量的水进行处理。

为了进行统计学评价，使用SAS包(SAS Institute Inc.，1985)中的GLM程序进行方差的双因子分析(因子：处理和性别)。当表现出显著的处理效果(p＜0.05)时，用Duncan试验分析处理方式之间的差异。由于技术上的原因，从统计学评价中排除一笼酶处理。

表2中列出了适于烤焙的小鸡自第8天至第29天的生长表现的结果。在处理和性别之间不存在相互作用，因此，提供了两种性别合并的总结果。添加有芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶的实验食物改善了体重增加，以数字表示为增加了6.6％。添加蛋白酶也略微增加了饲料摄入(3.1％)。芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶显著改善了适于烤焙的小鸡的饲料转化(3.4％)。

考虑到玉米淀粉是很容易消化的成分，可以假定所观察到的结果主要是由酶对豆粉的作用引起的。因此，结果表明芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶改善了豆粉的营养价值。

总之，研究表明：在含有大量豆粉的小鸡饲料中以100mg酶蛋白质/kg饲料的量添加芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶可导致体重在数字上的增加，并能显著改善饲料转化。

参考文献

EEC(1986)：Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthodede calcul de la valeur énérgetique des aliments composés destinés àla volaille.Journal Officiel des Communautés Européennes，L130，53-54。

SAS Institute Inc.(1985)：SAS_User’s Guide，Version 5 Edition.CaryNC。

表9实验食物的组成

成分(％)：玉米淀粉豆粉44¹动物脂豆油DL-甲硫氨酸MCP盐结合剂维生素和矿物质的预混物Avatec_15％CC²	45.8044.403.201.000.180.760.051.003.550.06
成分(％)：玉米淀粉豆粉44¹动物脂豆油DL-甲硫氨酸MCP盐结合剂维生素和矿物质的预混物Avatec_15％CC²	45.8044.403.201.000.180.760.051.003.550.06	所分析的含量：粗蛋白(％)ME，N-校正的(MJ/kg)³粗脂肪(％)	19.312.25.3

¹所分析的含量：90.6％干物质，45.3％粗蛋白，2.0％粗脂肪，4.9粗纤维

²相当于90mg拉沙里菌素-Na/kg饲料作为抗球虫剂(anticoccidial)

³基于所分析的营养物质的含量进行计算(EC-等式；EEC，1986)

饲料成分的供货商

玉米淀粉：法国Roquettes Frères，F-62136 Lestrem

豆粉44：德国Rekasan GmbH，D-07338 Kaulsdorf

动物脂：法国Fondoirs Gachot SA，F-67100 Strasbourg

豆油：法国Ewoco Sarl，F-68970 Guemar

DL-甲硫氨酸：法国Produit Roche SA，F-92521 Neuilly-sur-Seine

MCP：法国Brenntag Lorraine，F-54200 Toul

盐：法国Minoterie Modeme，F-68560 Hirsingue

结合剂：法国Minoterie Modeme，F-68560 Hirsingue

预混物(AM vol chair NS 4231)：法国Agrobase，F-01007 Bourg-en-Bresse

Avatec：法国Produit Roche SA，F-92521 Neuilly-sur-Seine

表10适于烤焙的小鸡自第8天至第29天的表现

两种性别合并的结果；平均值±st.dev.

产物每kg饲料的剂量笼数×鸡数	对照芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶0 100mg酶蛋白质12×6 11×6¹
产物每kg饲料的剂量笼数×鸡数	对照芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484蛋白酶0 100mg酶蛋白质12×6 11×6¹	体重增加(g/只鸡)(％)饲料摄入(g/只鸡)(％)饲料转化(g饲料/g增加)(％)	1155^A±94 1231^A±98100.0 106.61941^A±108 2002^A±145100.0 103.11.684^A±0.069 1.627^B±0.031100.0 96.6

一行内的平均值，如上标不同，则平均值显著不同(p＜0.05)

¹由于技术上的原因，从统计学评价中排除一笼

实施例11

用于火鸡和属于鲑科的鱼的，添加有酸-稳定性枯草蛋白酶的预混物和食物

制备具有下列组成的预混物(每千克的含量)：

5000000 IE 维生素A

1000000 IE 维生素D3

13333 mg 维生素E

1000 mg 维生素K3

750 mg 维生素B1

2500 mg 维生素B2

1500 mg 维生素B6

7666 mg 维生素B12

12333 mg 烟酸

33333 mg 生物素

300 mg 叶酸

3000 mg D-泛酸钙

1666 mg Cu

16666 mg Fe

16666 mg Zn

23333 mg Mn

133 mg Co

66 mg I

66 mg Se

5.8 ％钙

在此预混物中加入按实施例2所述制备的，得自芽孢杆菌属菌种NCIMB 40484的蛋白酶，加入量相当于10g蛋白酶酶蛋白质/kg。

按下述制备粒状火鸡起始和饲养食物，所述食物具有下表所示的组成(基于Leeson和Summers，1997，但通过使用最优化程序AGROSOFT_重新计算过，不含肉粉)，且每kg含100mg蛋白酶酶蛋白质：

在级联混合器中混合磨碎的玉米，豆粉，鱼粉和植物油。以10g/kg食物的量加入石灰石，磷酸钙和盐，以及上述预混物，接着进行混合。将所得混合物制成粒状(用蒸汽调节，然后进行成粒步骤)。

成分	起始食物，g/kg	饲养食物，g/kg	终止食物
成分	起始食物，g/kg	饲养食物，g/kg	终止食物	玉米	454.4	612.5	781.0
豆粉	391	279	61.7	玉米	454.4	612.5	781.0
豆粉	391	279	61.7	鱼粉	70	29.9	70
植物油	21	21	46	鱼粉	70	29.9	70
植物油	21	21	46	石灰石	19	16.9	9
磷酸钙	30	25.9	16.8	石灰石	19	16.9	9
磷酸钙	30	25.9	16.8	盐(NaCl)	2	2	2
维生素和矿物质预混物	10	10	10	盐(NaCl)	2	2	2
维生素和矿物质预混物	10	10	10	赖氨酸	1.3	1.49
甲硫氨酸	1.3	1.3	3.6	赖氨酸	1.3	1.49
甲硫氨酸	1.3	1.3	3.6	计算的营养物质
粗蛋白g/kg	279	21 3	152	计算的营养物质
粗蛋白g/kg	279	21 3	152	可代谢的能量MJ/kg	12.3	12.7	14.1
钙，g/kg	15.8	12.7	9	可代谢的能量MJ/kg	12.3	12.7	14.1
钙，g/kg	15.8	12.7	9	可利用的磷，g/kg	8.2	6.4	4.6
赖氨酸，g/kg	17.6	12.8	7.5	可利用的磷，g/kg	8.2	6.4	4.6
赖氨酸，g/kg	17.6	12.8	7.5	甲硫氨酸，g/kg	6.1	4.9	6.9

也按上文的一般性概述制备鲑鱼的两种食物。实际的组成示于下表(汇编自Refstie等(1998)，Aquaculture，vol.162，p.301-302)。通过使用Agrosoft_饲料最优化程序重新计算估计的营养物质含量。

在食物中加入按实施例2所述制备的，得自芽孢杆菌属菌种NCIMB40484的蛋白酶，加入的量相当于每kg食物100mg蛋白酶酶蛋白质。

成分	含鱼粉的常规食物	含豆粉的替代食物
成分	含鱼粉的常规食物	含豆粉的替代食物	小麦	245.3	75.2
鱼粉	505.0	310.0	小麦	245.3	75.2
鱼粉	505.0	310.0	豆粉		339.0
鱼油	185.0	200.0	豆粉		339.0
鱼油	185.0	200.0	DL-甲硫氨酸	13.9	23.0
磷酸一钙	-	2.0	DL-甲硫氨酸	13.9	23.0
磷酸一钙	-	2.0	维生素和矿物质预混物+粒状结合剂和变胞藻黄素	50.8	50.8
			维生素和矿物质预混物+粒状结合剂和变胞藻黄素	50.8	50.8
			计算的营养物质(基于鲜重)
粗蛋白g/kg	401	415	计算的营养物质(基于鲜重)
粗蛋白g/kg	401	415	粗脂肪g/kg	232	247
可代谢的能量MJ/kg	16.9	16.5	粗脂肪g/kg	232	247
可代谢的能量MJ/kg	16.9	16.5	钙，g/kg	13.9	9.8
磷，g/kg	10.8	9.0	钙，g/kg	13.9	9.8
磷，g/kg	10.8	9.0	赖氨酸，g/kg	27.7	26.7
甲硫氨酸，g/kg	24.4	31.6	赖氨酸，g/kg	27.7	26.7

实施例12

测定含蛋白酶的酶产品的纯度

可通过基于含蛋白酶的酶产品在大小排阻层析柱上的分级分离的方法，测定含蛋白酶的酶产品，例如商购的多-组分酶产品之类的蛋白酶制品的纯度。大小-排阻层析也被称为凝胶过滤层析，它基于多孔的凝胶基质(填充于柱中)，其孔径大小的分布与待分离的蛋白质分子的大小相当。相对较小的蛋白质分子可从***的溶液中扩散至凝胶中，而较大的分子因其大小的关系而不能以相同的程度扩散至凝胶中。结果，根据大小即可分离蛋白质分子，较大的分子比较小的分子先从柱中洗脱出来。

蛋白质浓度的测定

用购自PIERCE的BCA蛋白质检测试剂盒(等同于PIERCE目录号为23225)测定含蛋白酶的酶产品中的蛋白质浓度。双辛可宁酸的钠盐(BCA)是稳定的水溶性化合物，它能与碱性环境中的一价铜离子(Cu¹⁺)形成深紫色复合物。BCA试剂形成BCA蛋白质检测试剂盒的基础，该试剂盒能监测蛋白质与碱性Cu²⁺反应(Biuret反应)产生的一价铜离子。此反应产生的颜色是稳定的，并且随着蛋白质浓度的增加，而成比例的加深(Smith，P.K.(1985)，Analytical Biochemistry，vol.150，pp.76-85)。BCA工作溶液由50份试剂A与1份试剂B混合而成(试剂A是PIERCE目录号23223，它在碱性的碳酸盐缓冲液中含有BCA和酒石酸盐；试剂B是PIERCE目录号23224，它含有4％CuSO₄*5H₂O)。将300μl样品与3.0ml BCA工作溶液混合。于37℃保温30分钟，然后将样品冷却至室温，读出A₄₉₀值作为样品中蛋白质浓度的测量结果。在试验中包括牛血清白蛋白(PIERCE目录号23209)的稀释液作为标准。

样品预-处理

如果含蛋白酶的酶产品是固体，首先于5℃将产品溶解于/悬浮于20倍体积的100mM H₃BO₃，10mM 3，3′-二甲基戊二酸，2mM CaCl₂，pH6(缓冲液A)至少15分钟，如果此阶段的酶是悬浮液，则流经0.45μ的滤器以过滤悬浮液，给出清亮的溶液。从此时起，溶液即被处理成含蛋白酶的液体酶产品。

如果含蛋白酶的酶产品是液体，首先于5℃将产品置于6-8000Da截留分子量的SpectraPor透析管(得自Spectrum Medical Industries，目录号为132670)，对着100倍体积的缓冲液A+150mM NaCl(缓冲液B)透析至少5小时，以除去使含蛋白酶的液体酶产品具有高粘度的制剂化合物，所述化合物对大小-排阻层析不利。

如果在透析过程中形成沉淀物，则需流经0.45μ的滤器以过滤经透析的含蛋白酶的酶产品。用上述蛋白质浓度测定法测定经透析的酶产品中的蛋白质浓度，用缓冲液B稀释酶产品，得到准备进行大小-排阻层析的，蛋白质浓度为5mg/ml的样品。如果经透析的酶产品的蛋白质浓度低于5mg/ml，也可以使用。

大小-排阻层析

用缓冲液B(流速：1ml/min)平衡300ml HiLoad26/60 Superdex75pg柱(Amersham Pharmacia Biotech)。将1.0ml含蛋白酶的酶样品上样于柱，用缓冲液B(流速：1ml/min)洗脱柱。从柱的流出液中收集2.0ml级分，直至所有上样的样品都从柱上洗脱下来。通过适当的检测法分析收集的级分的蛋白质浓度(参见上述蛋白质浓度测定法)和蛋白酶活性。适当检测法的例子是Suc-AAPF-pNA试验(参见实施例2B)。其它适当的检测法是例如CPU试验(参见实施例1)和Protazyme AK试验(参见实施例2D)。调节蛋白酶活性试验的条件，例如pH，以尽可能多地测定经分级分离的样品中的蛋白酶。上文所提及的检测法的条件是适当条件的例子。其它适当的条件也在上文有关测定蛋白酶活性的章节中提到。将一个或多个蛋白酶检测法中具有活性的蛋白质峰定义为蛋白酶峰。蛋白酶峰纯度的计算方法为：用峰中的蛋白质量除以所有被鉴定的蛋白酶峰中的总蛋白质量。

使用上述方法将含蛋白酶的酶产品纯度计算为：用酸-稳定性蛋白酶峰中的蛋白质量除以所有被鉴定的蛋白酶峰中的蛋白质量。

序列表序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-la Roche AG)<120>酸稳定性枯草蛋白酶在动物饲料中的用途<130>6092.204-wo<140>DK 2000 00200<141>2000-02-08<160>7<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>27<212>PRT<213>Acremonium chrysogenum ATCC 48272<400>1Ala Leu Val Thr Gln Asn Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Thr Ile Ser1 5 10 15His Arg Gln Pro Gly Ser Thr Ser Tyr Ile Tyr

20 25<210>2<211>17<212>PRT<213>嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)NCIMB 10438<400>2Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala1 5 10 15Trp<210>3<211>17<212>PRT<213>Paecilomyces lilacinus CBS 102449<400>3Ala Tyr Thr Gln Gln Pro Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Arg Ile Ser1 5 10 15His<210>4<211>25<212>PRT<213>尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)IFO 4471<400>4Ala Leu Thr Thr Gln Ser Gly Ala Thr Trp Gly Leu Gly Thr Val Ser1 5 10 15His Arg Ser Arg Gly Ser

20<210>5<211>397<212>PRT<213>芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)NCIMB 40484<220><221>SIGNAL<222>(1)..(27)<220><221>peptide<222>(118)..(397)<220><221>mat_peptide<222>(28)..()<400>5Met Lys Phe Lys Lys Ile Ala Ala Leu Ser Leu Ala Thr Ser Leu Ala

-25 -20 -15Leu Phe Pro Ala Phe Gly Gly Ser Ser Leu Ala Lys Glu Ala Pro Lys

-10 -5 -1 1 5Pro Phe Gln Pro Ile Asn Lys Thr Leu Asp Lys Gly Ala Phe Glu Ser

10 15 20Gly Glu Val Ile Val Lys Phe Lys Asp Gly Val Ser Lys Lys Ala Gln

25 30 35Gly Ser Ala Leu Asn Lys Ala Glu Ala Asn Glu Gln Lys Ala Ser Ala

40 45 50Lys Asp Pro Phe Gln Val Leu Glu Val Ala Asp Val Asp Gln Ala Val

55 60 65Lys Ala Leu Glu Asn Asn Pro Asn Val Glu Tyr Ala Glu Pro Asn Tyr70 75 80 85Thr Phe Gln Ala Thr Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr

90 95 100Gln Tyr Gly Pro Gln Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr

105 110 115Arg Gly Ser Ser Thr Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp

120 125 130Tyr Asn His Pro Asp Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe

135 140 145Ile Asp Arg Asp Asn Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His150 155 160 165Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala

170 175 180Gly Met Ala Pro Asp Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala

185 190 195Asn Gly Ser Gly Ser Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala

200 205 210Ala Asp Gln Gly Ala Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys

215 220 225Asn Ser Thr Thr Leu Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly230 235 240 245Ala Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe

250 255 260Gln Pro Ala Ser Tyr Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser

265 270 275Asn Asp Arg Lys Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val

280 285 290Thr Ala Pro Gly Val Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr

295 300 305Ser Tyr Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu310 315 320 325Ala Ala Leu Leu Ala Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln

330 335 340Ala Ile Glu Gln Thr Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe

345 350 355Lys Tyr Gly Lys Ile Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr

360 365 370<210>6<211>367<212>PRT<213>Paecilomyces lilacinus CBS 143.75<220><221>peptide<222>(70)..(367)<220><221>peptide<222>(84)..(367)<400>6Ala Arg Ala Pro Leu Leu Thr Pro Arg Gly Ala Ser Ser Ser Ser Thr1 5 10 15Ala Ser Thr Leu Ser Ser Ser Arg Thr Ala Cys Pro Ser Pro Leu Ser

20 25 30Thr Arg Leu Ser Ala Leu Cys Pro Arg Arg Pro Thr Ala Ser Thr Thr

35 40 45Thr Phe Ser Glu Ala Ser Arg Asn Leu Asn Ala Asn Asp Leu Lys Thr

50 55 60Leu Arg Asp His Pro Asp Val Glu Tyr Ile Glu Gln Asp Ala Ile Ile65 70 75 80Thr Ile Asn Ala Tyr Thr Gln Gln Pro Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly

85 90 95Arg Ile Ser His Arg Ser Lys Gly Ser Thr Thr Tyr Glu Tyr Asp Thr

100 105 110Ser Gly Gly Ser Gly Thr Cys Ala Tyr Val Ile Asp Thr Gly Val Glu

115 120 125Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Ser Gln Ile Lys Ser Phe

130 135 140Ile Ser Gly Gln Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala145 150 155 160Gly Thr Ile Gly Ser Lys Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Lys Ile

165 170 175Tyr Gly Val Lys Val Leu Asp Asn Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly

180 185 190Ile Ile Ser Gly Met Asp Phe Ala Val Gln Asp Ser Lys Ser Arg Ser

195 200 205Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Lys Ala

210 215 220Gln Ser Val Asn Asp Gly Ala Ala Ala Met Ile Arg Ala Gly Val Phe225 230 235 240Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asn Ala Ala Asn Tyr Ser

245 250 255Pro Ala Ser Glu Pro Thr Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Thr Ser Ser

260 265 270Asp Ala Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Asn Leu Val Asp Ile Phe

275 280 285Ala Pro Gly Ser Asn Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Thr Thr Asn

290 295 300Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Ile Val Gly Leu Gly305 310 315 320Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Glu Gly Phe Pro Gly Ala Gln Ala Leu Cys

325 330 335Lys Arg Ile Gln Thr Leu Ser Thr Lys Asn Val Leu Thr Gly Ile Pro

340 345 350Ser Gly Thr Val Asn Tyr Leu Ala Phe Asn Gly Asn Pro Ser Gly

355 360 365<210>7<211>269<212>PRT<213>芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)THS-1001<400>7Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala1 5 10 15Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp

20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser

35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val65 70 75 80Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr

100 105 110Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val

115 120 125Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly

130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Ash Gly Ser Gly Thr Val Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile

180 185 190Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr

195 200 205Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val

210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile225 230 235 240Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln

245 250 255Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

Claims

1.至少一种酸-稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途，其中所述蛋白酶(i)是属于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)当用SSI抑制时，残留活性低于10％。

2.至少一种酸-稳定性蛋白酶在制备用于动物饲料的组合物中的用途，其中所述蛋白酶(i)是属于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)当用SSI抑制时，残留活性低于10％。

3.权利要求1的用途，其中所述蛋白酶的剂量是每kg饲料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白质。

4.权利要求2的用途，其中蛋白酶的所需剂量是每kg饲料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白质。

5.改善动物饲料的营养价值的方法，其中在所述饲料中添加至少一种酸-稳定性蛋白酶，其中所述蛋白酶(i)是属于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)当用SSI抑制时，残留活性低于10％。

6.动物饲料添加剂，其含有

(a)至少一种酸-稳定性蛋白酶；和

(b)至少一种脂溶性维生素，和/或

(c)至少一种水溶性维生素，和/或

(d)至少一种痕量矿物质，和/或

(e)至少一种宏量矿物质；

其中所述蛋白酶(i)是属于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)当用SSI抑制时，残留活性低于10％。

7.权利要求6的动物饲料添加剂，其中蛋白酶的量相当于每kg饲料需添加0.01-200mg蛋白酶蛋白质。

8.权利要求6-7中任一项的动物饲料添加剂，其进一步含有植酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，和/或β-葡聚糖酶。

9.动物饲料组合物，其粗蛋白含量为50-800g/kg，且含有至少一种酸-稳定性蛋白酶，其中所述蛋白酶(i)是属于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)当用SSI抑制时，残留活性低于10％。

10.权利要求9的动物饲料组合物，其中所述蛋白酶的量为每kg饲料0.01-200mg蛋白酶蛋白质。

11.处理植物蛋白质的方法，包括在至少一种植物蛋白质或蛋白质来源中添加至少一种酸-稳定性蛋白酶的步骤，其中所述蛋白酶(i)是属于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)当用SSI抑制时，残留活性低于10％。

12.权利要求11的方法，其中所述至少一种植物蛋白质来源中包括大豆。