CN1206237C - 低免疫原性蛋白质变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种筛选与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的方法,其包括下列步骤:用抗任一目的蛋白质的抗体筛查随机肽展示包装文库;对抗体结合肽的氨基酸序列或编码抗体结合肽的DNA序列测序;通过反应性肽序列的序列对比鉴定表位模式;表位模式在亲本蛋白质一级结构和三维结构上的定位;确定包括距表位氨基酸5之内的氨基酸并影响抗体与表位结合的表位区;通过编码亲本蛋白质的DNA序列的遗传工程突变,改变定位的表位模式或限定亲本蛋白质表位区的氨基酸而不损害该蛋白质的功能性,方法是利用现有的表位数据库去除可产生新的表位模式或复制现有表位模式的氨基酸置换;将突变DNA序列导入合适的宿主中,培养该宿主并表达该蛋白质变体;和用亲本蛋白质作为参照评价该蛋白质变体的免疫原性。本发明还涉及该蛋白质变体及其用途,以及产生该蛋白质变体的方法。
Description
本发明涉及一种筛选与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的方法,该蛋白质变体及其用途,以及产生该蛋白质变体的方法。
发明背景
已经工业生产越来越多的蛋白质包括酶用于不同工业、家务和医学用途。蛋白质可能在人和动物中刺激免疫反应,包括***反应。
在本说明书中,术语变应性反应、***反应、变应原的和变应原性按照其通常的定义使用,即描述由免疫应答引起的反应,其中抗体最常见的是IgE,有时是IgG4,和由该免疫应答引起的疾病。变应性疾病包括荨麻疹、枯草热、哮喘和特应性皮炎。它们甚至可发展为过敏性休克。
因此,敏感个体中***反应的预防是极重要的研究领域。根据应用,个体通过吸入、直接接触皮肤和眼睛或注射对各自的变应原敏感。***反应的一般机理分为致敏期和症状期。致敏期包括个体与变应原的初次接触。这一事件激活特异性T和B淋巴细胞,并导致变应原特异的免疫球蛋白E(IgE)抗体的产生。这些IgE抗体最终促进症状期开始时的变应原捕获及对T淋巴细胞的呈递。该阶段由第二次接触相同或类似的抗原引发。特异性IgE抗体尤其与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的特异性IgE受体结合,并同时捕获变应原。该过程的多克隆性质导致IgE受体的桥接和聚簇,随后导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞的激活。这种激活引发不同化学介质的释放,涉及应态反应症状期的早期及晚期反应。
在本说明书中,抗体如常表示,即免疫球蛋白E表示为IgE等。
曾经进行了降低多肽及蛋白质免疫原性的不同尝试。发现表位的微小变化可影响与抗体的结合。这可导致这种表位的重要性降低,或许使其由高亲和力表位转化为低亲和力表位,或者甚至可导致表位丢失,即该表位不能充分结合抗体引发免疫原性反应。
在WO92/10755中描述了一种修饰蛋白质以获得低免疫原性变体的方法。筛选与亲本酶相比显示与亲本酶的抗体结合降低的随机构建的蛋白质变体,用于在动物模型中对变应原性的检测。最后,估计免疫原性的降低是由于表位的真正消除还是由于抗体亲和力的降低。该方法的缺点是其“反复尝试”特征,这使之成为耗时长且昂贵的方法。而且,不能提供关于所述表位的信息,这意味着对一种蛋白质获得的信息不能适用于另一种,因为有限数量的有关动物不允许鉴定表位模式(epitope pattern)。
发明概述
本发明涉及一种筛选与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的方法,其包括下列步骤:
用抗任一目的蛋白质的抗体筛查随机肽展示包装文库,
对抗体结合肽的氨基酸序列或编码抗体结合肽的DNA序列测序,
通过反应性肽序列的序列对比鉴定表位模式,
表位模式在亲本蛋白质一级结构和三维结构上的定位,
确定包括距表位氨基酸5之内的氨基酸的表位区,
通过编码亲本蛋白质的DNA序列的遗传工程突变,改变定位的表位模式或限定亲本蛋白质表位区的氨基酸而不损害该蛋白质的功能性,方法是利用现有的表位数据库去除可产生新的表位模式或复制现有表位模式的氨基酸置换,
将突变DNA序列导入合适的宿主中,培养该宿主并表达该蛋白质变体,和
用亲本蛋白质作为参照评价该蛋白质变体的免疫原性。
本发明的第二方面是与亲本蛋白质相比具有降低的免疫原性的蛋白质变体。就亲本蛋白质的至少一种表位模式而言,该蛋白质变体的氨基酸序列不同于亲本蛋白质的氨基酸序列,使得蛋白质变体的免疫原性较亲本蛋白质的免疫原性降低。优选地,去污酶的蛋白质变体的免疫原性比亲本蛋白质的免疫原性至少低10倍,优选地比亲本蛋白质的免疫原性低25倍。特别是对于个人护理产品中使用的蛋白质变体,免疫原性比亲本蛋白质的免疫原性优选地低100倍,更优选地低200倍,再更优选地低500倍。此外,对于食品和药品,免疫原性优选地比亲本蛋白质的免疫原性低1000倍。对于所有的蛋白质用途,至多50000倍的免疫原性降低通常是足够的。在本说明书中,根据蛋白质引起抗体应答主要是IgE应答的能力估计免疫原性。
根据与所研究的变体相比,用不同亲本蛋白质剂量获得的动力学中观察到的差异,确定上文中免疫原性的降低。在本研究中,通过使用所研究的单剂量蛋白质的动力学研究估计表位指导的蛋白质工程的作用。
蛋白质变体的免疫原性用动物试验测定,其中用蛋白质变体免疫动物,并测定免疫应答。根据本发明,与亲本蛋白质的免疫原性相比,免疫原性至少降低100倍,优选地降低200倍,更优选地500倍。
然而,本发明人已证明,竞争性ELISA中的表现与在动物试验中测定的免疫原性反应密切相关。
为了获得有用的蛋白质免疫原性的降低,蛋白质变体的免疫原性必须降低到至少低于亲本蛋白质免疫原性的75%,优选地低于50%,这根据竞争性ELISA中的表现测定,假定亲本蛋白质的免疫原性值设为100%。当免疫原性低于亲本蛋白质免疫原性的50%时,该蛋白质变体实际上是非变应原性的,即,在动物试验中检测不到IgE应答。
本发明的另一方面是含有上述蛋白质变体的组合物,以及该组合物在工业上的用途,如个人护理产品(例如洗发剂;肥皂;润肤、手、面液;润肤、手、面霜;染发剂;牙膏)、食品(例如烘烤食品工业中)、洗涤剂和药品的生产。
再另一方面是编码如上所述的蛋白质变体的DNA分子。
其他方面是含有如上所述的DNA分子的载体,以及含有该DNA分子的宿主细胞。
另一方面是生产与上述亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的方法。
附图简述
图1显示具有4个表位位置及其相应的表位区的Savinase和Lipoprime的三维结构。
图2显示竞争性ELISA的数据。
发明详述
术语与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体是指在一个或多个氨基酸上不同于亲本蛋白质由此变体的免疫原性降低的蛋白质变体。可通过检测蛋白质变体引起IgE应答的能力证实免疫原性的降低。
在本说明书中,术语蛋白质意在包括寡肽、多肽及蛋白质。
展示包装能来源于如细菌病毒。一种优选的展示包装可以是一种噬菌体展示***。在噬菌体展示***中,将编码希望的氨基酸序列的序列掺入编码在噬菌体表面展示的蛋白质的噬菌体基因中。因而,该噬菌体在其表面形成并展示杂合蛋白质,在此该蛋白质能与特异的靶因子相互作用。假定每种噬菌体具有一种确定长度的特异序列,则平均噬菌体展示文库能表达108-1012种不同的随机序列。如果掺入的序列是一种表位,则靶因子可以是如表位特异性抗体。因此,能从大量噬菌体中筛选特异的噬菌体,其每种表达一种杂合蛋白质。
在一个优选的实施方案中,掺入的肽的长度为9个氨基酸。
用于与展示包装反应的抗体优选地是IgE抗体,以确保所鉴定的表位是IgE表位,即诱导并结合IgE的表位。在一个优选的实施方案中,抗体是多克隆抗体,任选地是单特异抗体。
术语“单特异抗体”意思是根据其对特定表位模式的特异性分离的多克隆抗体。这些单特异抗体只能与一种表位模式结合,但最常见地是由多种抗体产生细胞产生,识别类似的表位模式,因此是多克隆的。
对于本发明,为了获得关于蛋白质表位的更广泛的知识,优选多克隆抗体。
此外,IgE抗体通常以极低浓度存在于血清中。正常血清IgE抗体浓度为低于10-3g/l,而正常IgG浓度为12g/l。因此,实际上极难获得一种覆盖完整蛋白质上所有可能的表位模式的单克隆抗体文库。然而,在从抗蛋白质的血清中亲和纯化IgE抗体后,能获得适用于本发明的多克隆或单特异IgE抗体。
被抗体识别并结合的蛋白质的部分,即表位,通常可以是线性的或结构性的。线性表位意为表位的氨基酸位于蛋白质一级结构的序列中。结构性表位不同于线性表位,因为它们只有在形成蛋白质的三维结构之后才出现。结构性表位由蛋白质一级结构不同部分的氨基酸序列组成,只有在蛋白质序列折叠形成二级和/或三级结构后才集合在一起,从而形成邻近的表位表面。术语表位模式或表位基元(motif)是指蛋白质的表位构成表面,这不依赖于表位是线性的还是结构性的。就结合亲和力而言,某些表位(高亲和力表位)比其他表位(低亲和力)更重要。
一种蛋白质可具有一个以上的表位。由理论模型可以估计出,分子大小为30000道尔顿的蛋白质在其表面上可具有6个表位区。而实际的表位总数肯定更高。例如,9-mer氨基酸序列可引起与至少5个不同单克隆抗体结合,认为5-mer为最小表位大小。
已经发现,某些IgG1抗体结合表位不能结合IgE抗体,反之亦然。因此,表位对于特异的抗体种类可能特异性更高或更低。
认为超过80%的IgE表位为结构性表位,因而在蛋白质加热过程中、使用洗涤剂或导致变性的其他方法能破坏表位。这一百分数可因不同蛋白质而不同。因此,覆盖完整蛋白质的重叠肽片段在鉴定IgE表位中的应用是不适用的。然而,本发明者发现,根据所表达寡肽的序列的随机特征,利用展示包装中的小氨基酸序列,能确定线性及结构性表位的表位模式。
然后将展示包装上存在并用抗体鉴定的肽测序,或通过相应DNA序列的翻译产生其序列。这两种序列都可通过遗传工程领域的技术人员周知的技术获得。
通过比较可被抗体结合的肽的序列鉴定表位模式。随后将鉴定的模式定位于亲本蛋白质的一级及三维结构上,最后定位于任何目的蛋白质上。在表位模式中,某些氨基酸可以是高度保守的,称为锚定(anchor)氨基酸。锚定氨基酸将在可与单特异抗体结合的所有肽中再现,并确定表位模式。
极其重要的是,展示包装呈现的肽的氨基酸序列长度足以呈现待鉴定的表位的重要部分。在本发明优选的实施方案中,肽展示包装文库的肽是含有5-25个氨基酸,优选地至少8个氨基酸,如9个氨基酸的寡肽。包装文库的复杂性,即适当表现所有可能的表位的展示包装的数量,可根据待鉴定的表位的估计长度计算,如利用下列公式计算:
包装数=20n,其中n是表位中的残基数。
构建模型结构所需的典型步骤是:存在三维结构的同源序列的对比,结构保守区(SCR)的确定,对SCR的坐标分配,在结构数据库中检索结构片段/环以替换可变区,对这些区域的坐标分配,根据能量最小化的结构完善(refinement)。已知含有相对于已知三维结构较大的***片段(≥3个残基)的区域极难建模,故结构预测必须仔细考虑。
获得所述多肽的三维结构或基于与已知结构的同源性的结构模型后,该结构作为完成下述方法的必要前提条件。
当表位确定后,可通过编码亲本蛋白质的DNA序列的突变和/或遗传工程,改变亲本蛋白质的确定表位模式,由此产生显示降低的免疫原性的蛋白质变体。
可通过置换表位区的至少一个氨基酸改变确定的表位。在一个优选的实施方案中,至少改变一个锚定氨基酸。这种改变通常是不同大小、亲水性和/或极性的氨基酸的置换,如小氨基酸对大氨基酸,亲水性氨基酸对疏水性氨基酸,极性氨基酸对非极性氨基酸,碱性对酸性氨基酸的置换。
其他改变可以是表位的至少一个氨基酸的添加或删除,优选地删除一个锚定氨基酸。此外,可通过置换某些氨基酸并删除添加其他氨基酸改变表位模式。
为了随后与表位区中氨基酸共价结合的置换/***
将要置换和/或***的氨基酸通常依赖于所应用的偶联化学。制备共价生物偶联物的化学可见于《生物结合技术》,Hermanson,G.T.(1996),Academic Press Inc.,在此引用作为参考。
优选的是将活化的聚合物与表位区中的氨基酸偶联。
优选的是在将要偶联多肽时在该多肽中进行保守置换,因为保守置换可保证该置换对多肽结构的影响有限。
为了提供额外氨基,可以用赖氨酸替换精氨酸,这两种残基都带正电,但仅赖氨酸具有适于用作连接基团的游离氨基。
为提供额外羧酸基团,保守置换可以是例如天冬酰胺至天冬氨酸或者谷氨酰胺至谷氨酸的置换。这些残基在大小和形状上彼此相象,只是在酸性残基上才存在羧基。
为提供SH基,可通过将苏氨酸或丝氨酸置换为半胱氨酸进行保守置换。
聚合物的活化
如果将与所述多肽偶联的聚合物分子没有活性,就必须使用合适方法使其活化。根据本发明,可以想见,可通过连接体将聚合物分子与多肽偶联。合适的连接体为熟练技术人员所熟知。
用于活化聚合物分子以及用于偶联多肽的方法和化学在文献中有详细描述。一般用于活化不溶性聚合物的方法包括:用下列化合物活化官能团:溴化氰、高碘酸、戊二醛、二环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等(参见R.F.Taylor,(1991),《蛋白质固定,基础和应用》,Marcel Dekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992),“蛋白质结合和交联的化学”,CRC出版社,Boca Raton;G.T.Hermanson等人,(1993),《固定的亲和配体技术》,学院出版社,N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化,但是也适用于可溶性聚合物的活化,如高碘酸,三氯三嗪、磺酰基卤化物、二乙烯基砜、碳二亚胺等。在选择活化与偶联化学方法时,必须考虑聚合物上的官能团是氨基、羟基、巯基、羧基、醛基或硫氢基,以及蛋白质上选定的连接基团,活化与偶联化学通常包括:i)聚合物的活化,ii)偶联,iii)残余活性基团的封闭。
下面简要描述多种合适的聚合物活化方法。然而,应该理解也可以使用其他方法。
将聚合物分子偶联到多肽的游离酸基团上可以借助于二酰亚胺和例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等人,(1976),美国化学学会杂志(J.Amr.Chem.Soc.),98,289-291)或重氮基乙酸酯/酰胺(Wong等人,(1992),《蛋白质结合和交联化学》,CRC出版社)进行。
将聚合物分子偶联到羟基通常是非常困难的,因为这必须在水中进行。而通常水解反应比与羟基的反应更占优势。
将聚合物分子偶联到游离硫氢基可以用特定基团(如马来酰亚胺或正吡啶基二硫化物)达到。乙烯基砜(美国专利号5,414,135,(1995),Snow等人)也适用于硫氢基,但是不象提到的其他化合物那样有选择性。
可以通过包含两个邻近羰基的基团靶向多肽链中的可及精氨酸残基。
包括将亲电活化的PEG偶联到赖氨酸的氨基上的技术也是有用的。醇的许多常规离去基团能形成胺键。例如,可以使用烷基磺酸酯,如tresylates(Nilsson等人,(1984),《酶学方法》,104卷,Jacoby W.B.编,学院出版社:Orlando,56-66;Nilsson等人,(1987),《酶学方法》,135卷,Mosbach K.编,学院出版社:Orlando,65-79;Scouten等人,(1987),《酶学方法》,135卷,Mosbach K.编,学院出版社:Orlando,79-84;Crossland等人,(1971),美国化学学会杂志1971,93,4217-4219)、甲磺酸酯(Harris,1985,同上;Harris等人,(1984),聚合物科学与聚合物化学杂志(J.Polym.Sci.Polym.Chem.)22版,341-352)、芳基磺酸酯(如甲苯磺酸酯)以及对硝基苯磺酸酯。
有机磺酰氯(例如Tresyl Chloride)可有效地将许多聚合物(例如PEG)中的羟基有效转化成良好的离去基团(磺酸酯),当与多肽中的亲核基团(如氨基)进行反应时,该离去基团使得可以在聚合物和多肽之间形成稳定的键。除了要有高偶联产率之外,反应条件通常是温和的(中性或微碱性pH,以避免变性,且活性极少或没有破坏),并且满足多肽需要的非破坏性条件。
甲苯磺酸酯比甲磺酸酯反应性更强,而且更不稳定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky,(1995),生物结合物化学,6,150-165)。环氧化物也可以用于产生胺键,但反应性比上述基团弱得多。
用光气将PEG转化成氯甲酸酯将产生与赖氨酸的氨基甲酸酯键。这一转变可以多种变化形式进行,如用N-羟基琥珀酰亚胺(美国专利号5,122,614,(1992);Zalipsky等人,(1992),生物技术应用和生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.),15,100-114;Monfardini等人,(1995),生物结合物化学,6,62-69)、用咪唑(Allen等人,(1991),碳水化合物研究(Carbohydr.Res.),213,309-319)、用对硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1,(1993),Looze,Y.)等替换氯。通常通过使氯甲酸酯与所需的离去基团反应来制备衍生物。所有这些基团均产生与肽的氨基甲酸酯键。
此外,可以分别使用异氰酸酯和异硫氰酸来产生脲和硫脲。
使用如上所述的相同的离去基团和环亚胺thrones,可以从PEG酸获得酰胺(美国专利号5,349,001,(1994),Greenwald等人)。这些化合物的反应性极高,但是可能会使水解变快。
也可以使用从与琥珀酸酐反应制备的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使偶联物对水解更加敏感(美国专利号5,122,614,(1992),Zalipsky)。这一基团可以用N-羟基琥珀酰亚胺活化。
此外,可以引入一个特殊的连接体。最常用的是氰尿酰氯(Abuchowski等人,(1977),生物化学杂志,252,3578-3581;美国专利号4,179,337,(1979),Davis等人;Shafer等人,(1986),聚合物科学与聚合物化学杂志24版,375-378)。
将PEG偶联到芳香胺上,随后重氮化,将产生极具反应性的重氮盐,其在原位即可与肽反应。通过使PEG的二氢唑酮衍生物(美国专利号5,321,095,(1994),Greenwald,R.B.)反应,也可以形成酰胺键,这样即可引入一个额外的酰胺键。
由于一些肽不包含许多赖氨酸,因此,将一个以上的PEG连接到同一赖氨酸上可能会是有利的。这可以通过例如使用1,3-二氨-2-丙醇进行。
也可以通过氨基甲酸酯键将PEG连接到酶的氨基上(WO95/11924,Greenwald等人)。赖氨酸残基也可以用作骨架。
实施例中所用的偶联技术是WO90/13590(Enzon)中所述的琥珀酰亚胺碳酸酯偶联技术。
为了共价结合,聚合物分子与置换和/或***变体的偶联
只有提供当在动物模型中评价时免疫应答降低的多肽结合物的置换和/或***属于本发明的范围之内。进行的突变可通过本领域中周知的标准技术进行,如定点诱变(见,如Sambrook等人(1989),《分子克隆:实验室手册》,Cold Spring harbor,NY.)。
核苷酸置换的一般描述见于如Ford等人,1991,《蛋白质表达与纯化》2,95-107页。
上述DNA序列可通过遗传工程领域技术人员周知的适当技术产生。将该DNA序列导入合适的宿主中,培养并表达蛋白质变体。
与为了消除表位的蛋白质工程有关的危险是产生了新的表位,或复制了现有的表位。为了降低这一危险,将计划在特定位点处的突变置于目的蛋白质的三维结构上,并对出现的氨基酸排列构象检索表位数据库。本发明证明,能用该方法鉴定危险突变,从而降低每一位点的可能突变数。
一个众所周知的事实是,B细胞和T细胞表位周围的氨基酸能影响抗体或T细胞受体与配体的结合。为了预见这一可能性,在目的蛋白质的三维结构上确定一个表位区。
十分重要的是,表位的改变不影响或削弱亲本蛋白质的功能性。因此,这些改变不能明显改变蛋白质的二级结构。利用计算机模拟,能估计一个或多个表位的改变是否能显著影响蛋白质的功能性。术语“功能性”是指蛋白质的正常功能,如酶促活性、热稳定性、化学稳定性和糖基化。
在本发明的一个优选实施方案中,替换、添加或删除一个以上的氨基酸,这些氨基酸优选地位于不同表位区中。在那种情况中,很难预先评价蛋白质功能性保持及抗原性、免疫原性和/或变应原性降低的程度如何,特别是因为突变组合的可能数量变得极大,甚至对于少量突变也如此。在此情况下,建立一种多样化突变体文库是有利的,其中的突变体各自导入了一个或多个改变的氨基酸,选择显示功能保持良好同时抗原性大大降低的那些变体。对于蛋白酶,可通过分析分泌变体的酶活性和抗原结合(如通过竞争性ELISA)来检验(如下面实验部分所述)。本发明这类实施例的范围无论如何不限于蛋白酶,其仅用作提供一个实例。可通过本领域技术人员已知的多种技术建立多样化文库(Reetz MT;Jaeger KE,生物催化:从发现到应用,Fessner WE编,200卷,31-57页(1999);Stemmer,自然370,389-391,1994;Zhao和Arnold,美国国家科学院院报(Proceedingsof the National Academy of Sciences USA),94,7997-8000,1997;或Yano等人,美国国家科学院院报,95,5511-5515,1998)。在一个更优选的实施方案中,通过包括如下步骤的方法发现替换:1)列出包括几种表位区的置换、添加和/或删除的范围,2)设计文库,其向靶基因中导入了一套随机的氨基酸序列改变,如通过随机诱变,3)表达该文库,选择优选的变体。在最优选的实施方案中,此方法还补充了从首轮筛选获得的候选物之额外的筛选或/和家族改组步骤(J.E.Ness等人,自然杂志生物工程分册,17,893-896,1999)和/或与其他由遗传学方法降低变应原性的方法(如WO92/10755中所公开的)相结合。
本发明的另一目的是与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体,其中对于亲本蛋白质的一个或多个氨基酸而言,该蛋白质变体的氨基酸序列不同于亲本蛋白质的氨基酸序列,使得该蛋白质变体的免疫原性较亲本蛋白质的免疫原性降低。
可通过在动物实验中检测该蛋白质变体引发IgE应答的能力证实降低的免疫原性。试验动物可以是任何合适的动物。优选地,试验动物可以是大鼠,如Brown Norway大鼠,或小鼠,如BaBallb/c、BDF1和CB6F1株。
动物试验可如下所述进行。
下面是涉及试验动物中免疫原性测定的方法的描述。在实施例中,试验动物是Brown Norway大鼠。
材料:
蛋白质变体的分子
ELISA试剂:
辣根过氧化物酶标记的猪抗兔免疫球蛋白(Dako,DK,P217,稀释度1∶1000)。
大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA 419;稀释度1∶100)。
小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA 193;稀释度1∶200)。
生物素标记的小鼠抗大鼠IgG1单克隆抗体(Zymed 03-9140;稀释度1∶1000)。
生物素标记的大鼠抗小鼠IgG1单克隆抗体(Serotec MCA 336B;稀释度1∶2000)
链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(Kirkegard和Perry14-30-00;稀释度1∶1000)
缓冲液和溶液:
-PBS(pH7.2(1升))
NaCl 8.00克
KCl 0.20克
K2HPO4 1.04克
KH2PO4 0.32g
-洗涤缓冲液:PBS,0.05%(v/v)吐温20
-封闭缓冲液:PBS,2%(wt/v)脱脂奶粉
-稀释缓冲液:PBS,0.05%(v/v)吐温20,0.5%(wt/v)脱脂奶粉
-柠檬酸缓冲液(0.1M,pH5.0-5.2(1升))
柠檬酸钠 20.60克
柠檬酸 6.30克
-终止溶液(DMG缓冲液)
-硼酸钠、硼砂(Sigma)
-3,3-二甲基戊二酸(Sigma)
-CaCl2(Sigma)
-吐温20:聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸(Merck目录号822184)
-N-羟基琥珀酰亚胺(Fluka art.56480)
-光气(Fluka art.79380)
-乳糖(Merck 7656)
-PMSF(苯甲基磺酰氟)来自Sigma
-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸基对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma号S-7388,分子量624.6克/摩尔。
-mPEG(Fluka)
显色底物:
OPD:邻苯二胺(Kementec目录号4260)
试验动物:
雌性Balb/c小鼠(约20克)购自Bomholdtgaard,Ry,丹麦。
设备:
XCEL II(Novex)
ELISA读数仪(UVmax,Molecular Devices)
HPLC(Waters)
PFLC(Pharmacia)
Superdex-75柱,Mono-Q,Mono S,来自Pharmacia,SW。
SLT:Fotometer,来自SLT LabInstruments
大小排阻层析(Spherogel TSK-G 2000 SW)
大小排阻层析(Superdex 200,Pharmacia,SW)
Amicon室
方法
Balb/c小鼠的皮下(SC)免疫
对于分子的皮下施用,沉淀0.05ml该分子的溶液。
试验动物是10组Balb/c小鼠。开始时的重量超过20克。
测定BALB/C小鼠中IgE抗体相对浓度的ELISA方法
使用三层夹心ELISA测定特异性IgE血清抗体的相对浓度。
1)用缓冲液1中10mg大鼠抗小鼠IgE包被ELISA板(50微升/孔)。在4℃下温育过夜。
2)倒空板并以封闭缓冲液在室温下封闭至少1/2小时(200微升/孔)。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
3)与小鼠血清温育(50微升/孔),从未稀释的血清开始,并以2倍稀释度连续稀释。留一些孔仅含缓冲液4(空白)。在室温下温育30分钟。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
4)在稀释缓冲液中将酶稀释成适当的蛋白质浓度。50微升/孔在室温下温育30分钟。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
5)用稀释缓冲液稀释特异性多克隆抗酶抗血清血清(pIg)以用于检测结合的抗体。50微升/孔在室温下温育30分钟。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
6)用稀释缓冲液稀释辣根过氧化物酶偶联的抗pIg抗体。50微升/孔在室温下温育30分钟。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
7)于底物缓冲液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。制备好该溶液后立即使用。温育10分钟。50μl/孔。
8)终止反应:每孔加入50微升终止溶液。
9)在492nm对平板读数,以620nm的读数作为参照。
分子量的测定
用标准方法在4-20%的梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上进行蛋白质的电泳分离。蛋白质用银染法检测。以来自Novex的Mark-12大范围分子量标准的迁移率为参照确定分子量。
蛋白酶活性
用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析:
蛋白酶切割肽和对硝基苯胺之间的键,产生在405nm吸收的可见黄色。
缓冲液:例如Britton和Robinson缓冲液pH8.3
底物:将100μg suc-AAPF-pNa溶解在1ml二甲基亚砜(DMSO)中。将100μl的这种溶液用Britton和Robinson缓冲液稀释成10ml。
分析:
混合底物和蛋白酶溶液,在405nm下监测为时间和ABS405nm/min的函数的吸光度。应该控制温度(为20-50℃,取决于蛋白酶)。这是样品中的蛋白酶活性的测量。
亲本蛋白质可以是任何蛋白质,如任何天然存在的蛋白质及其任何变体,任选地是一种为了获得所述蛋白质的更好功能性的变体。
药用多肽
术语“药用多肽”定义为当导入人体和/或动物体内的循环***中时具有生理学活性的多肽,包括肽如肽激素、蛋白质和/或酶。
导入至循环***中时,药用多肽具有潜在免疫原性。
本发明涉及的“药用多肽”的例子包括胰岛素、ACTH、胰高血糖素、促生长素抑制素、促生长素、胸腺素、甲状旁腺素、色素激素(pigmentary hormones)、生长调节素、红细胞生成素、***、绒毛膜***、下丘脑释放因子、抗利尿素、促甲状腺素、松弛素、干扰素、血小板生成素(TPO)和促乳素。
然而,这些蛋白质优选地用于工业、家务和/或医学中,如用于个人护理产品(例如洗发剂;肥皂;润肤、手、面液;润肤、手、面霜;染发剂;牙膏)、食物(例如烘烤食品工业中)、洗涤剂和药品的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中,蛋白质是一种酶,如糖基水解酶、糖酶、过氧化物酶、蛋白酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、多糖裂合酶、氧化还原酶、转谷氨酰胺酶和糖基异构酶(glycoseisomerase),特别是下列酶。
亲本蛋白酶
亲本蛋白酶(即依据国际生物化学与分子生物学学会(IUBMB)的推荐命名(1992)按照酶分类号E.C.3.4所归类的酶)包括该类内的蛋白酶。
实例包括选自归类于如下酶分类(E.C.)号的那些蛋白酶:
3.4.11(即所谓的氨肽酶),包括3.4.11.5(脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.9(X-pro氨肽酶)、3.4.11.10(细菌亮氨酰氨肽酶)、3.4.11.12(嗜热氨肽酶)、3.4.11.15(赖氨酰氨肽酶)、3.4.11.17(色氨酰氨肽酶)、3.4.11.18(甲硫氨酰氨肽酶);
3.4.21(即所谓的丝氨酸内肽酶),包括3.4.21.1(胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.25(黄瓜素)、3.4.21.32(Brachyurin)、3.4.21.48(Cerevisin)和3.4.21.62(枯草杆菌蛋白酶);
3.4.22(即所谓的半胱氨酸内肽酶),包括3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、3.4.22.3(无花果蛋白酶)、3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7(萝摩蛋白酶)、3.4.22.14(猕猴桃素)、3.4.22.30(Caricain)、3.4.22.31(Ananain);
3.4.23(即所谓的天冬氨酸内肽酶),包括3.4.23.1(胃蛋白酶A)、3.4.23.18(曲霉胃蛋白酶I)、3.4.23.20(青霉胃蛋白酶)和3.4.23.25(酵母胃蛋白酶);和
3.4.24(即所谓的金属内肽酶),包括3.4.24.28(芽孢杆菌溶素)。
相关枯草杆菌蛋白酶的实例包括枯草杆菌蛋白酶BPN’、淀粉糖(amylosacchariticus)枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶肠膜肽酶、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、thermitase、aqualysin、芽孢杆菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7和蛋白酶TW3。
这些可方便购得的蛋白酶的具体实例包括Esperase、Alcalase、Neutrase、Dyrazym、Savinase、Pyrase、胰蛋白酶NOVO(PTN)、Bio-FeedTM Pro、Clear-Lens Pro(所有酶均可从NOVO Nordisk A/S获得)。
其他商业蛋白酶的实例包括Gist-Brocades N.V.所售的Maxtase、Maxacal、Maxapem,Solvay et Cie所售的Opticlean和Genencor International所售的Purafect。
应当理解,蛋白酶变体也可构思用作亲本蛋白酶。这些蛋白酶变体的实例公开于:EP 130.756(Genentech)、EP 214.435(Henkel)、WO 87/04461(Amgen)、WO 87/05050(Genex)、EP 251.446(Genencor)、EP 260.105(Genencor)、Thomas等人(1985)自然318,375-376、Thomas等人(1987)分子生物学杂志193,803-813、Russel等人(1987)自然328,496-500、WO88/08028(Genex)、WO 88/08033(Amgen)、WO 89/06279(NOVO Nordisk A/S)、WO 91/00345(NOVO Nordisk A/S)、EP525 610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.)。
蛋白酶的活性能如《酶促分析方法》第三版,1984,VerlagChemie,Weinheim,第5卷所述测定。
亲本脂肪酶
亲本脂肪酶(即,依据国际生物化学和分子生物学学会(IUBMB)的推荐命名(1992)按照酶分类号E.C.3.1.1(羧基酯水解酶类)归类的酶)包括该类别的脂肪酶。
实例包括选自归类于如下酶分类(E.C.)号的那些脂肪酶:
3.1.1(即所谓的羧基酯水解酶),包括(3.1.1.3)三酰基甘油脂肪酶、(3.1.1.4)磷脂酶A2。
脂肪酶的实例包括来源于下列微生物的脂肪酶。所指的专利公开文本在此引用作为参考:
腐质霉属(Humicola),例如H.brevispora、短腐质霉(H.brevis)thermoidea变种和H.insolens(US 4,810,414)。
假单胞菌属(Pseudomonas),例如莓实假单胞菌(Ps.fragi)、施氏假单胞菌(Ps.stutzeri)、洋葱假单胞菌(Ps.cepacia)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)(WO 89/04361)或植物假单胞菌(Ps.plantarii)或唐菖蒲假单孢菌(Ps.gladioli)(美国专利号4,950,417(Solvay enzymes))或产碱假单胞菌(Ps.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)(EP 218272)或门多萨假单胞菌(Ps.mendocina)(WO 88/09367;US 5,389,536)。
镰孢属(Fusarium),例如尖孢镰孢(F.oxysporum)(EP130,064)或腐皮镰孢(F.solani pisi)(WO 90/09446)。
毛霉属(Mucor)(也称为根毛霉属(Rhizomucor)),例如米黑毛霉(M.miehei)(EP 238023)。
色杆菌属(Chromobacterium)(特别是粘稠色杆菌(C.viscosum))。
曲霉属(Aspergillus)(特别是黑曲霉(A.niger))。
假丝酵母属(Candida),例如,C.cylindracea(也称为皱落假丝酵母(C.rugosa))或南极假丝酵母(C.antarctica)(WO88/02775)或南极假丝酵母脂肪酶A或B(WO 94/01541和WO89/02916)。
地霉属(Geotricum),例如白地霉(G.candidum)(Schimada等人(1989),生物化学杂志,106,383-388)。
青霉属(Penicillium),例如沙门柏干酪青霉(P.camembertii)(Yamaguchi等人,(1991),基因103,61-67)。
根霉属(Rhizopus),例如R.delemar(Hass等人,(1991),基因109,107-113)或雪白根霉(R.niveus)(Kugimiya等人,(1992)生物科学、生物技术与生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)56,716-719)或米根霉(R.oryzae)。
芽孢杆菌属(Bacillus),例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等人,(1993)生物化学与生物物理学学报(Biochemicaet Biophysica acta)1131,253-260)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/7744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。
可方便购得的脂肪酶的具体实例包括Lipolase、LipolaseTMUltra、Lipozyme、Palatase、Novozym435、Lecitase(全都可从NOVO Nordisk A/S获得)。
其他脂肪酶的实例是LumafastTM,获自Genencor Int.Inc.的门多萨假单胞菌脂肪酶;LipomaxTM,获自Gist Brocades/Genencor Int.Inc.的类产碱假单胞菌脂肪酶;获自Unilever的腐皮镰孢(Fusariumsolani)脂肪酶(cutinase);获自Solvay enzymes的芽孢杆菌脂肪酶。其他脂肪酶可从其他公司获得。
可以理解,脂肪酶变体也可作为亲本酶。例如WO 93/01285和WO 95/22615中描述了其实例。
脂肪酶的活性能如《酶促分析方法》第三版,1984,VerlagChemie,Weinheim,第4卷所述,或如AF 95/5 GB(可从NOVONordisk A/S索取)所述测定。
亲本氧化还原酶
亲本氧化还原酶(即,依据国际生物化学和分子生物学学会(IUBMB)的推荐命名(1992)按照酶分类号E.C.1(氧化还原酶类)所归类的酶)包括该类别的氧化还原酶。
实例包括选自归类于如下酶分类(E.C.)号的那些酶:
甘油-3-磷酸脱氢酶_NAD+_(1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶_NAD(P)+_(1.1.1.94)、甘油-3-磷酸1-脱氢酶_NADP_(1.1.1.94)、葡萄糖氧化酶(1.1.3.4)、己糖氧化酶(1.1.3.5)、儿茶酚氧化酶(1.1.3.14)、胆红素氧化酶(1.3.3.5)、丙氨酸脱氢酶(1.4.1.1)、谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2)、谷氨酸脱氢酶_NAD(P)+_(1.4.1.3)、谷氨酸脱氢酶_NADP+_(1.4.1.4)、L-氨基酸脱氢酶(1.4.1.5)、丝氨酸脱氢酶(1.4.1.7)、缬氨酸脱氢酶_NADP+_(1.4.1.8)、亮氨酸脱氢酶(1.4.1.9)、甘氨酸脱氢酶(1.4.1.10)、L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酶(1.4.3.3)、L-谷氨酸氧化酶(1.4.3.11)、蛋白质-赖氨酸6-氧化酶(1.4.3.13)、L-赖氨酸氧化酶(1.4.3.14)、L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)、D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)、蛋白质二硫化物还原酶(1.6.4.4)、硫氧还蛋白还原酶(1.6.4.5)、蛋白质二硫化物还原酶(谷胱甘肽)(1.8.4.2)、漆酶(1.10.3.2)、过氧化氢酶(1.11.1.6)、过氧化物酶(1.11.1.7)、脂肪氧化酶(1.13.11.12)、超氧化物歧化酶(1.15.1.1)。
所述葡萄糖氧化酶可来源于黑曲霉。
所述漆酶可来源于Polyporus pinstitus、嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophila)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Rhizoctonia praticola、嗜热柱霉(Scytalidium thermophilum)和Rhus vernicifera。
胆红素氧化酶可来源于疣孢漆斑菌(Myrothecheciumverrucaria)。
过氧化物酶可来源于例如大豆、辣根或灰盖鬼伞。
蛋白质二硫化物还原酶可以是在此引用作为参考的DK专利申请号768/93、265/94和264/94(Novo Nordisk A/S)所述的任一种,包括牛源蛋白质二硫化物还原酶、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉的蛋白质二硫化物还原酶和来源于大肠杆菌的DsbA或DsbC。
可方便购得的氧化还原酶的具体实例包括GluzymeTM(可从NovoNordisk A/S获得的酶)。然而,其他氧化还原酶可从其他公司获得。
可以理解,氧化还原酶的变体也可作为亲本酶。
氧化还原酶的活性能如《酶促分析方法》第三版,1984,VerlagChemie,Weinheim,第3卷所述测定。
亲本糖酶
亲本糖酶可以被定义为所有能水解尤其是5元和6元环结构的糖链(如,淀粉)的酶(即,依据国际生物化学和分子生物学学会(IUBMB)的推荐命名(1992)按照酶分类号E.C.3.2(糖苷酶类)所归类的酶)。根据本发明的糖酶类别中也包括能使如六元环结构的碳水化合物如D-葡萄糖异构为如五元环结构如D-果糖的酶。
实例包括选自归类于如下酶分类(E.C.)号的那些酶:
α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-糖苷酶(3.2.1.3)、纤维素酶(3.2.1.4)、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、内切-1,4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、壳多糖酶(3.2.1.14)、聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1,6-糖苷酶(3.2.1.33)、木糖1,4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖内切-1,3-α-β-D-糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精内切-1,6-糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖内切-1,3-α-糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖内切-1,4-β-糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖内切-1,6-β-糖苷酶(3.2.1.75)、阿聚糖内切-1,5-α-阿聚糖酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、壳聚糖酶(chitonanase)(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)。
相关糖酶的实例包括来自Trichoderma harzianum的α-1,3葡聚糖酶;来自拟青霉属(Paecilomyces)的菌株的α-1,6葡聚糖酶;来自枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶;来自Humicola insolens的β-葡聚糖酶;来自黑曲霉的β-葡聚糖酶;来自木霉属的菌株的β-葡聚糖酶;来自溶黄嘌呤厄氏菌(Oerskovia xanthineolytica)的菌株的β-葡聚糖酶;来自黑曲霉的外切-1,4-α-D-糖苷酶(葡糖淀粉酶);来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶;来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的α-淀粉酶;来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶;来自米曲霉的α-淀粉酶;来自非致病性微生物的α-淀粉酶;来自黑曲霉的α-半乳糖苷酶;来自Humicola insolens的戊聚糖酶、木聚糖酶、纤维二糖酶、纤维素酶、半纤维素酶;来自Trichoderma reesei的纤维素酶;来自非致病性霉菌的纤维素酶;来自黑曲霉的果胶酶、纤维素酶、阿聚糖酶、半纤维素酶;来自薄青霉(Penicillium lilacinum)的葡聚糖酶;来自非致病性霉菌的内切葡聚糖酶;来自Bacillus acidopullyticus的支链淀粉酶;来自脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)的β-半乳糖苷酶;来自Trichoderma reesei的木聚糖酶。
可方便购得的糖酶的实例包括:Alpha-GalTM、Bio-FeedTMAlpha、Bio-FeedTM Beta、Bio-FeedTM Plus、Bio-FeedTM Plus、Novozyme188、Carezyme、Celluclast、Cellusoft、Ceremyl、CitrozymTM、DenimaxTM、DezymeTM、DextrozymeTM、Finizym、FungamylTM、GamanaseTM、Glucanex、Lactozym、MaltogenaseTM、PentopanTM、PectinexTM、Promozyme、PulpzymeTM、NovamylTM、Termamyl、AMG(淀粉葡糖苷酶Novo)、Maltogenase、Sweetzyme、Aquazym、Natalase(所有酶均可获自Novo Nordisk A/S)。其他糖酶也可从其他公司获得。
应当理解糖酶的变体也可作为亲本酶。
糖酶的活性可如《酶促分析方法》第3版,1984,VerlagChemie,Weinheim,第4卷所述测定。
亲本转移酶
亲本转移酶(即,依据国际生物化学和分子生物学学会(IUBMB)的推荐命名(1992)按照酶分类号E.C.2所归类的酶)包括该类别的转移酶。
亲本转移酶可以是转移酶亚类的任何转移酶:转移一碳基的转移酶(E.C.2.1);转移醛或残基的转移酶(E.C.2.2);酰基转移酶(E.C.2.3);葡糖基转移酶(E.C.2.4);转移除甲基外的烷基或芳基的转移酶(E.C.2.5);转移含氮基团的转移酶(2.6)。
在一个优选实施方案中,亲本转移酶是一种转谷氨酰胺酶E.C.2.3.2.13(蛋白质-谷氨酰胺μ-谷氨酰转移酶)。
转谷氨酰胺酶是一种催化酰基转化反应的酶,其中肽结合的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基是酰基供体。许多化合物中的伯氨基可作为酰基受体,随后可形成肽结合谷氨酸的单取代的γ-酰胺。当肽链中赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体时,转移酶形成分子内或分子间γ-谷氨酰-ε-赖氨酰交联。
未决的DK专利申请号990/94(Novo Nordisk A/S)中描述了转谷氨酰胺酶的实例。
亲本转谷氨酰胺酶可以是人、动物(例如牛)或微生物来源的。
这些亲本转谷氨酰胺酶的实例包括:动物衍生的转谷氨酰胺酶,FXIIIa;来源于Physarum polycephalum的微生物转谷氨酰胺酶(Klein等人,细菌学杂志174,2599-2605);来源于下列种的转谷氨酰胺酶:链霉菌属的种,包括淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)(以前的黎巴嫩链霉菌(Streptomyces libani)),和链轮丝菌属(Streptoverticillium)的种,包括茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)、肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)和灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)(Motoki等人,US 5,156,956;Andou等人,US 5,252,469;Kaempfer等人,普通微生物学杂志(Journal of General Microbiology)137,1831-1892;Ochi等人,国际***细菌学杂志(International Journal of SytematicBacteriology)44,285-292;Andou等人,US 5,252,469;Williams等人,普通微生物学杂志,129,1743-1813)。
应当理解转移酶的变体也可作为亲本酶。
转谷氨酰胺酶的活性可如《酶促分析方法》第3版,1984,Verlag Chemie,Weinheim,第1-10卷所述测定。
亲本肌醇六磷酸酶
亲本肌醇六磷酸酶包含于依据国际生物化学和分子生物学学会(IUBMB)的推荐命名(1992)按照酶分类号E.C.3.1.3(磷酸单酯水解酶类)所归类的酶的类别中。
肌醇六磷酸酶是可催化肌醇六磷酸盐转化为肌醇和无机磷的微生物产生的酶。
产肌醇六磷酸酶的微生物包括如枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)和假单胞菌的细菌;如酿酒酵母的酵母;如黑曲霉、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、泡盛曲霉、米曲霉、土曲霉(Aspergillus terreus)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和其他多种曲霉属的种的真菌。
亲本肌醇六磷酸酶的实例包括选自按酶分类(E.C.)号归类的肌醇六磷酸酶:3-肌醇六磷酸酶(3.1.3.8)和6-肌醇六磷酸酶(3.1.3.26)。
肌醇六磷酸酶的活性可如《酶促分析方法》第3版,1984,Verlag Chemie,Weinheim,第1-10卷所述测定,或可按照EP-A1-0420 358,实施例2A所述的方法测定。
裂合酶
合适的裂合酶包括多糖裂合酶:果胶酸裂合酶(4.2.2.2)和果胶裂合酶(4.2.2.10),如WO99/27083中公开的来源于地衣芽孢杆菌的裂合酶。
本发明的另一方面是包含至少一种本发明的蛋白质(多肽)或酶的组合物。该组合物可包含其他多肽、蛋白质或酶和/或在个人护理产品中常用的成分,这类产品如洗发剂、皂条、润肤液、润肤霜、染发剂、牙膏、家用物品、农用化学品、个人护理产品,例如用于隐形眼镜、化妆品、口腔和皮肤药品的洗涤剂,用于处理纺织品的组合物,用于生产食品(如烘烤)和饲料等的组合物。
所述蛋白质(多肽)/酶的实例包括显示蛋白酶、脂肪酶、氧化还原酶、糖酶、转移酶如转谷氨酰胺酶、肌醇六磷酸酶和/或抗微生物多肽活性的酶。这些酶可以是具有降低活性的偶联物。
此外,本发明的蛋白质一般可在洗涤组合物中使用。其可以无粉尘颗粒、稳定液体或被保护的酶的形式包含于洗涤组合物中。无粉尘颗粒可如US 4,106,991和4,661,452(均为Novo Nordisk A/S)所公开的生产,或任选地可用本领域周知的方法包被。蜡表面覆盖剂的实例是平均分子量为1000-20000的聚环氧乙烷产品(聚乙二醇,PEG);含有16-50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚;乙氧基化脂肪族醇,其中的醇含有12-20个碳原子并有15-80个环氧乙烷单位;脂肪族醇;脂肪酸;和脂肪酸的单甘油酯、甘油二酯和甘油三酯。专利GB 1483591中给出了适于流化床技术使用的成膜表面覆盖剂的实例。例如,可通过按已确立的方法加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定液体酶制剂。其他酶稳定剂在本领域中众所周知。可按照EP 238,216中公开的方法制备被保护的酶。
洗涤组合物可以是任何方便的形式,例如粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水样的,一般含有高达70%的水和0-30%的有机溶剂,或是非水的。
洗涤组合物含有一种或多种表面活性剂,每种均可以是阴离子的、非离子的、阳离子的或两性离子的。洗涤剂通常含有0-50%的阴离子表面活性剂,如线性烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯属磺酸酯(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、二级链烷磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。其也可含有0-40%的非离子表面活性剂,如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟烷基脂肪酸酰胺(如WO92/06154所述)。
洗涤组合物另外可含有一种或多种其他酶,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、cutinase、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶和其他抗微生物多肽。
洗涤剂可含有1-65%的洗涤剂助剂或络合剂,如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、柠檬酸盐、氨三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或分层硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助洗剂的,即,基本上不含洗涤剂助剂。
洗涤剂可含有一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有一种漂白***,该***可含有H2O2来源如过硼酸盐或过碳酸盐,其可与形成过酸的漂白活性剂如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基羟苯磺酸盐(NOBS)结合。另外,该漂白***也可含有如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。
可用常规稳定剂如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳族硼酸酯稳定含有本发明的多肽的本发明的洗涤组合物,该组合物可如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制。
洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成份,如织物调节剂,包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、防污垢再沾着剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。
pH(以使用浓度在水溶液中测定)通常为中性或碱性,例如为7-11。
洗碟组合物
此外,根据本发明的改性酶也可用于洗碟洗涤剂中。
洗碟洗涤组合物含有一种可以是阴离子、非离子、阳离子、两性或这些类型混合物的表面活性剂。该洗涤剂可含有0-90%的非离子型表面活性剂,如低泡至无泡乙氧基化丙氧基化直链醇。
该洗涤组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助剂盐。这些洗涤剂助剂可再分为含磷和不含磷类型。该洗涤组合物通常含有1-90%的洗涤剂助剂。
当存在时,含磷无机碱性洗涤剂助剂的实例包括水溶性盐,特别是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在时,含磷有机碱性洗涤剂助剂的实例包括水溶性膦酸酯。当存在时,不含磷无机助剂的实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐,以及不同类型的水不溶性晶体或非晶形硅酸铝,沸石是其最著名的代表。
合适的有机助剂的实例包括碱金属、铵和取代的铵、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸酯、琥珀酸羧基甲氧酯、多乙酸铵、羧酸盐、多羧酸盐、氨基聚羧酸盐、聚乙酰基羧酸盐和聚羟基磺酸盐。
其他合适的有机助剂包括已知具有助剂性质的较高分子量聚合物和共聚物,例如合适的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物及其盐。
洗碟洗涤组合物可含有氯/溴型或氧型漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的实例是次氯酸和次溴酸锂、钠或钙,以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺,如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸,及其与水溶性阳离子如钾和钠的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。
氧漂白剂是优选的,例如为无机过酸盐的形式,优选地用漂白前体或作为过氧酸化合物。合适的过氧漂白化合物的典型例子是四水合和一水合碱金属过硼酸盐、碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。优选的活化剂是TAED和甘油三乙酸。
可用酶的常规稳定剂,如多元醇,如聚乙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物,例如芳族硼酸酯,来稳定本发明的洗碟洗涤组合物。
本发明的洗碟洗涤组合物也可含有其他常规洗涤剂成分,例如抗絮凝剂、填充剂、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、螯合剂、防污垢再沾着剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂或香料。
最后,本发明的酶也可用于常规洗碟洗涤剂中,例如在下列任一专利文本中所述的任何洗涤剂中:
EP 518719,EP 518720,EP 518721,EP 516553,EP 516554,EP 516555,GB 2200132,DE 3741617,DE 3727911,DE 4212166,DE 4137470,DE 3833047,WO 93/17089,DE 4205071,WO52/09680,WO 93/18129,WO 93/04153,WO 92/06157,WO92/08777,EP 429124,WO 93/21299,US 5141664,EP 561452,EP561446,GB 2234980,WO 93/03129,EP 481547,EP 530870,EP533239,EP 554943,EP 346137,US 5112518,EP 318204,EP318279,EP 271155,EP 271156,EP 346136,GB 2228945,CA2006687,WO 93/25651,EP 530635,EP 414197,US 5240632。
个人护理用途
本发明的蛋白质在个人护理用途方面也是有意义的。
蛋白酶
蛋白酶是众所周知的用于清洁隐形眼镜的活性成份。它们能水解镜片上的蛋白质污垢,从而使之可溶。蛋白质污垢的去除对于佩戴舒适是必需的。
蛋白酶也是皮肤清洁产品中的有效成份,它们能除去上层死亡角质皮肤细胞,从而使皮肤看起来更亮更新鲜。
蛋白酶也用于口腔护理产品,特别是用于假牙的清洗,及牙粉中。
此外,蛋白酶也用于化妆品、淋浴产品,包括洗发剂、调节剂、洗剂、乳油、皂条、香皂和液体皂。
脂肪酶
脂肪酶能作为皮肤清洁产品和抗痤疮产品中的活性成份用于化妆品用途,用以除去过多的皮肤脂肪,并作为护肤的活性成份用于沐浴产品如乳油和洗剂中。
脂肪酶也能用于洗发产品中(例如洗发剂)用以从头发表面有效去除皮脂和其他脂肪物质。
脂肪酶也是隐形眼镜清洁产品中的有效成份,它们能从镜片表面除去脂类沉淀物。
氧化还原酶
个人护理用途中最常用的氧化还原酶是具有确保产生H2O2的底物(例如葡萄糖)的氧化酶(通常是葡萄糖氧化酶),然后通过过氧化物酶(通常是乳过氧化物酶)引发如SCN-或I-氧化为抗微生物剂(SCNO-或I2)。已知这种酶复合物实际上来源于例如牛奶和唾液。
其在商业上用作口腔护理产品(嗽口液、牙粉、口香糖)中的抗微生物***,它也能与淀粉葡萄糖苷酶结合产生葡萄糖。已知这些***也在化妆品中用于防腐。
已知含有氧化酶与过氧化物酶组合的抗微生物***用于隐形眼镜的清洁。
氧化还原酶的另一种用途是应用氧化酶、过氧化物酶和漆酶的氧化染发。
已知在皮肤(和头发)表面形成的自由基与皮肤的老化过程(头发的损坏)有关。自由基激活链反应,这导致脂膜、胶原蛋白和细胞的破坏。向化妆品中添加自由基清除剂如超氧化物歧化酶是众所周知的(R.L.Goldemberg,DCI,Nov.93,48-52)。
蛋白质二硫化物异构酶(PDI)也是一种氧化还原酶。它能用于卷发(头发中二硫键的还原和再氧化)和损坏的头发的修复(损害主要是存在的二硫键的还原)。
糖酶
在牙齿表面形成的牙斑主要由多糖组成。它们粘附于牙齿和微生物表面。多糖主要是α-1,6结合的葡萄糖(葡聚糖)和α-1,3结合的葡萄糖(mutan)。不同类型葡聚糖酶如mutanase和葡聚糖酶的应用有助于水解牙斑的粘性基质,使之易于通过机械作用去除。
其他种类的生物膜如在镜头罩中形成的生物膜也能通过葡聚糖酶的作用去除。
食品与饲料
根据本发明的免疫原性降低的其他结合酶或多肽也可方便地用于食品与饲料的生产。
蛋白酶
小麦面粉中的谷蛋白是负责面粉用于烤制食品的能力的必需成份。有时需要蛋白水解酶修饰生面团的谷蛋白,例如能用蛋白酶软化硬麦面粉。
Neutrase是一种可购得的中性金属蛋白酶,它能用以确保均匀的生面团质量和面包质地,并提高香味。谷蛋白适度或更广泛地降解为肽,因此为了避免生面团的过度软化精确控制是必需的。
蛋白酶也用于修饰乳蛋白。
为了在生产干酪时凝结牛奶中的酪蛋白,可使用蛋白酶如粗制凝乳酶或凝乳酶。
在酿造工业中,蛋白酶用于酿造未发芽的谷类及控制含氮量。
在动物饲料产品中,用蛋白酶扩大动物消化***。
脂肪酶
脂肪酶在烘烤食品工业中的用途更新。脂肪酶的添加导致生面团性质改进且面包制造质量提高,如较大体积、改进的面包屑结构和更白的面包屑颜色。观察到的效应能用脂肪酶在生面团混合过程中改变谷蛋白与某些脂类片段的相互作用的机理来解释。这导致改进的谷蛋白网络。
暗黄褐色干酪(例如Danablue)、某些意大利型干酪和其他含乳脂的乳制品的香味产生依赖于乳脂降解为游离脂肪酸。脂肪酶可用于在这些产品中产生香味。
在油脂生产工业中,脂肪酶用于例如使不希望的副产品的量减至最小,通过酯交换修饰脂肪,及酯的合成。
氧化还原酶
根据本发明的免疫原性降低的氧化还原酶也可方便地用于食品与饲料的生产。
有几种氧化还原酶用于烘烤:葡萄糖氧化酶、脂肪氧合酶、过氧化物酶、过氧化氢酶及其组合。传统上,面包师通过加入抗坏血酸和溴化钾强化谷蛋白。某些氧化还原酶能用于通过谷蛋白中游离巯基单元的氧化代替生面团***中的溴酸盐。从而形成二硫键,产生更强、更有弹性、更有抵抗力的生面团。
GluzymeTM(Novo Nordisk A/S)是一种具有过氧化氢酶活性的葡萄糖氧化酶制剂,它能用来代替溴酸盐。生面团的强化测定为对机械冲击的更强的抵抗力、更好的烤制弹性和更大的面包体积。
糖酶
面粉具有不同的淀粉酶含量,这导致烤制质量的差异。添加淀粉酶是标准化面粉所必需的。淀粉酶和戊聚糖酶通常为酵母发酵提供糖,增强面包体积,延缓退化,降低老化速度和由戊聚糖胶引起的粘性。下面列出了糖酶的实例。
某些生麦芽糖淀粉酶能用于使面包的保存限期延长2天或更长,而不引起产品的粘性。通过从淀粉分子的非还原端切割低分子量糖和糊精选择性修饰胶化淀粉。以不可能发生退化的方式修饰淀粉。产生的低分子量糖提高了烤制物品的水分保持能力,而不产生导致成品粘性的中等长度糊精。该酶在面包烤制过程中灭活,因此能认为它是不必在标签上注明的加工助料。几乎能排除Novamyl的过量。
能用真菌α-淀粉酶提高面包体积,其进一步提供良好且均匀的面包屑结构。该α-淀粉酶是可产生麦芽糖、糊精和葡萄糖的内切酶。谷类和某些细菌的α-淀粉酶在淀粉胶凝温度以上的温度下失活,因此当加入小麦生面团时导致小面包体积和粘性面包内部。Fungamyl具有热不稳定的优点,在刚好低于胶凝温度时失活。
含有大量戊聚糖酶和半纤维素酶活性的酶制剂能提高生面团的处理和稳定性,并提高新鲜度、面包屑结构和面包体积。
通过水解面粉中的戊聚糖组分,其将丢失大量水结合能力,然后水将为淀粉和谷蛋白所利用。谷蛋白成为更柔性的和更可延伸的,而淀粉更易于胶凝。戊聚糖酶能与乳化剂一起或作为其代用品使用。
糖酶还可用于由淀粉生产糖浆,其广泛用于软饮料、糖果、肉类食品、乳制品、面包产品、冰淇淋、婴儿食品、果酱等。
淀粉的转化通常分三步进行。第一步用α-淀粉酶液化淀粉。获得主要由寡糖和糊精组成的麦芽糖糊精。
然后用淀粉葡萄糖苷酶处理该混合物,以将寡糖和糊***解为葡萄糖。这样获得更甜的产品。如果希望获得富含麦芽糖的糖浆,则可单独或与支链淀粉酶(脱支酶)一起使用β-淀粉酶。
通过异构化为果糖能使葡萄糖混合物更甜。为此能使用固定的葡萄糖异构酶。
在制糖工业中,其通常用于加速蔗汁中的淀粉的分解。从而降低粗糖中的淀粉含量,并利于炼糖厂的过滤。
此外,也用葡聚糖酶分解原糖汁和糖浆中的葡聚糖。
在酒精工业中,α-淀粉酶方便地用于蒸馏麦芽浆中淀粉的稀释。
在酿造工业中,α-淀粉酶用于辅助液化。
在乳品工业中,当为患有乳糖吸收不良的病人生产低乳糖牛奶时使用β-半乳糖苷酶(乳糖酶)。
当由乳糖酶处理的牛奶生产调味牛奶饮料时,能减少糖的添加而不降低产品的甜度。
在浓缩牛奶的生产中,能通过乳糖酶处理避免乳糖结晶,从而降低由乳糖晶体中酪蛋白凝结引起的增稠的危险。
当由乳糖处理的牛奶(或乳清)生产冰淇淋时,不形成乳糖晶体,并且不发生缺陷沙质。
此外,如WO 94/21785(Novo Nordisk A/S)所述,已知木聚糖酶用于大量食品/饲料工业用途。
α-淀粉酶在动物饲料工业中用于添加到含谷物饲料中以提高淀粉的消化性。
抗微生物多肽
某些溶菌酶可用于例如在肉类包装工业中清洗畜体(见美国专利号5,354,681,Novo Nordisk A/S)。
转移酶
根据本发明的免疫原性降低的转谷氨酰胺酶可方便地用于食品与饲料的生产。
转谷氨酰胺酶具有交联蛋白质的能力。
这种性质能用于含水相蛋白质的胶凝。这可用于涂抹食品的生产(DK专利申请号1071/84,Novo Nordisk A/S)。
转谷氨酰胺酶用于例如通过改进小麦面粉提高面粉的烘烤质量,以用于制造质量提高的蛋糕,如改进味道、凹痕、口感和更大的体积(见JP 1-110147)。
还可用于生产糊状食物材料,例如在食品如冰淇淋、topping、冷冻甜食、蛋黄酱和低脂涂抹食品中用作脂肪代用品(见WO93/22930,Novo Nordisk A/S)。
此外,可用于由牛奶和牛奶样产品制造酸乳酪、奶油冻、干酪、布丁、橘子汁胶,及切碎的肉类食品的结合、味道的改进和食品蛋白质的质地(见WO 94/21120和WO 94/21129,Novo Nordisk A/S)。
肌醇六磷酸酶
本发明的肌醇六磷酸酶可方便地用于食品如早餐谷类食品、蛋糕、糖果、饮料、面包或汤等及动物饲料的生产。
肌醇六磷酸酶可用于开发植物蛋白质来源中存在的肌醇六磷酸盐(酯)/肌醇六磷酸中结合的磷,或用于开发肌醇六磷酸复合物中结合的营养重要的矿物质。
可向单胃动物饲料中加入微生物肌醇六磷酸酶以代替向饲料中添加无机磷(见美国专利号3,297,548)。
肌醇六磷酸酶还可用于大豆加工中。大豆粉可含有高水平的抗营养因子肌醇六磷酸,这使该蛋白质来源不适用于婴儿食品和鱼、牛犊和其他非反刍类动物的饲料,因为肌醇六磷酸螯合其中存在的必需矿物质(见EP 0420 358)。
肌醇六磷酸也可用于烘烤目的。通过烘烤含小麦面粉等和肌醇六磷酸酶的碎片生面团能制成具有较好质量的面包(见JP-0-3076529-A)。
已知曲霉中的高肌醇六磷酸酶活性已用于生产清酒(见JP-0-6070749-A)。
纺织用途
蛋白酶
蛋白酶用于丝的脱胶和砂洗。
脂肪酶
脂肪酶用于在制造纺织品过程中除去含疏水酯(例如甘油三酯)的脂肪物质(见,例如WO 93/13256,Novo Nordisk A/S)。
氧化还原酶
在纺织品的漂白清洗中,过氧化氢酶可用于除去过量的过氧化氢。
糖酶
纤维素水解酶广泛用于帆布服装的制造,以引起织物色彩密度的定位改变(酶促“石洗”)。
纤维素水解酶也可用于生物抛光方法。生物抛光是一种对纱表面的特殊处理,其可在触感和外观方面提高织物质量,而不损失织物的可湿性。可利用如WO 93/20278所述的方法实现生物抛光。
在纺织品的纺织过程中,线将承受相当大的机械应力。为了防止断裂,通常用胶状物质(胶料)包涂(上浆)使线增强。最常用的上浆剂是天然或修饰形式的淀粉。因此只有在从织物上除去胶料,即所谓的脱浆后,才能获得均匀和耐久的涂层。优选地利用淀粉水解酶促进用含淀粉或改性淀粉的胶料上浆的织物的脱浆。
口服与皮肤药品
蛋白酶
在药品中使用高度纯化的蛋白酶(例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的不同组合,以生产口服及皮肤药品,用以治疗例如炎症、水肿和创伤。
皮革生产
转移酶
已知转谷氨酰胺酶通过作为硬化剂用于酪蛋白处理的皮革(见WO 94/13839,Novo Nordisk)。
硬表面的清洗
例如食品工业中硬表面的清洗通常是困难的,因为用于生产乳制品、肉类、海鲜产品、饮料等的设备通常具有复杂的形状。含酶的凝胶和泡沫形式的表面活性剂组合物的使用有利于并改善了硬面的清洗。可方便地加入这些表面活性剂组合物中的酶特别是蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。
这些含酶的硬面清洗组合物也可方便地用于运输部分,例如用于洗车和普通的船只清洗。
最后,本发明涉及本发明的蛋白质或本发明的组合物在含多肽的产品中的用途。
首先,本发明的偶联物或组合物能方便地用于个人护理产品,如护发和头发处理产品。这包括如洗发剂、香脂、头发调节剂、卷发剂、染发剂、生发油、发液、头发油、洗发剂、洗发水、发胶。
还涉及口腔护理产品如牙粉、漱口水、口香糖。
也涉及护肤品和化妆品,如润肤霜、润肤乳、清洁霜、清洁液、清洁奶、冷霜、油皂、滋养素、润肤液、乳液、锌液、润手香脂、粉皂、透明皂、防晒油、防晒霜、剃须泡沫、剃须膏、小儿油口红、唇膏、乳底(creamy foundation)、香粉、粉状眼影、粉底、化妆品基底、香精粉、增白粉。
对于隐形眼镜保健产品也能方便地使用本发明的偶联物。这些产品包括隐形眼镜用清洁和消毒产品。
也涉及洗涤剂如洗衣粉、肥皂、皂条和液体皂的用途。
此外,本发明还涉及合成并在宿主细胞中表达蛋白质变体的方法。其实现方法包括培养能在适当培养基中表达一种多肽的宿主细胞,以获得该多肽向培养基中的表达和分泌,随后从培养基中分离该多肽。该宿主细胞可以是适于大规模生产蛋白质,能表达蛋白质并被表达载体转化的任何细胞。
宿主细胞包含如上所述的DNA构建体,任选地可用含有如上所述的DNA构建体的表达载体转化这些细胞。该宿主细胞选自任何合适的细胞,如细菌细胞、真菌细胞、动物细胞,如昆虫细胞或哺乳动物细胞,或植物细胞。
宿主细胞
本发明也涉及含有本发明的核酸序列的重组宿主细胞,其方便地用于多肽的重组生产中。术语“宿主细胞”包括由于在复制中发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
细胞优选地用含有本发明的核酸序列的载体转化,随后该载体整合到宿主染色体中。“转化”是指将一种含有本发明的核酸序列的载体导入宿主细胞中,使得该载体作为一种染色体整合体或自我复制染色体外载体保持。当核酸序列更可能在细胞中稳定保持时,一般认为整合是有利的。可通过如上所述的同源或非同源重组进行载体向宿主染色体中的整合。
宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物,如原核生物,或非单细胞微生物,如真核生物。有用的单细胞细胞是细菌细胞,如革兰氏阳性菌,包括但不限于芽孢杆菌细胞,例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis);或链霉菌属细胞,例如,浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus),或革兰氏阴性菌,如大肠杆菌和假单胞菌属的种。在一个优选的实施方案中,细菌宿主细胞是一种迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。例如,细菌宿主细胞的转化可以经原生质体转化(见,例如Chang和Cohen,1979,分子普通遗传学(Molecular General Genetics)168:111-115)、利用感受态细胞(见,例如Young和Spizizin,1961,细菌学杂志(Journal of Bacteriology)81:823-829,或Dubnar和Davidoff-Abelson,1971,分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)56:209-221)、电穿孔(见,例如Shigekawa和Dower,1988,生物技术(Biotechniques)6:742-751)或接合(见,例如,Koehler和Thorne,1987,细菌学杂志169:5771-5278)实现。
宿主细胞可以是真核细胞,如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。有用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞,或例如可从美国模式培养物保藏所获得的其他任何无限增殖化细胞系。
在一个优选的实施方案中,宿主细胞是一种真菌细胞。此处使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等人,《Ainsworth和Bisby′s真菌词典》(Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi)第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK定义)及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人,1995,同上,171页所述)和所有有丝***孢子真菌(Hawksworth等人,1995,同上)。子囊菌门的代表性类别包括,例如,脉孢菌属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium)(=青霉属)、裸孢壳属(Emericella)(=曲霉属)、散囊菌属(Eurotium)(=曲霉属),和以上列出的真酵母。担子菌门的实例包括蘑菇、锈菌和黑粉菌。壶菌门的代表性类别包括,例如,异水霉属(Allomyces)、小芽枝霉属(Blastocladiella)、雕蚀菌属(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌门的代表性类别包括,例如,水霉属(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉菌),如绵霉属(Achlya)。有丝***孢子真菌的实例包括曲霉属、青霉属、假丝酵母属和链格孢属(Alternaria)。接合菌门的代表性类别包括,例如,根霉属和毛霉属。
在一个优选的实施方案中,真菌宿主细胞是一种酵母细胞。此处所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous),和属于半知菌类的酵母芽酵母属(Blastomycetes)。产子囊孢子酵母分为蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包括4个亚科:裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如,毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。产担子孢子囊酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidim)、红冬孢酵母属(Rhodosporidiuro)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、Filobasidium和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌类的真菌分为2个科:掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如,掷孢酵母属(Sorobolomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如,假丝酵母属)。由于酵母的分类将来有可能改变,所以对于本发明而言,酵母如《酵母的生物学与活性》(Biology andActivities of Yeast)(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium系列号9,1980)所述定义。酵母的生物学和酵母遗传学的操作在本领域中众所周知(见,例如,《酵母的生物化学和遗传学》(Biochemistry andGenetics of Yeast),Bacil,M.,Horecker,B.J.和Stopani,A.O.M.,编,第2版,1987;《酵母》,Rose,A.H.和Harrison,J.S.编,第2版,1987;和《酵母属酵母的分子生物学》(The MolecularBiology of the Yeast Saccharomyces),Strathern等人编,1981)。
在一个更优选的实施方案,酵母宿主细胞是假丝酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或Yarrowia的种的细胞。
在另一个优选的实施方案中,酵母宿主细胞是Saccharomycesuvae、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、Schizosaccharomycespombe、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、乳酸酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Pichia methanolica、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、Yarrowia lipolytica、假丝酵母属的种、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、地霉属(Geotrichum)的种、发酵地霉(Geotrichum fermentans),优选地,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在另一个实施方案中,蛋白质变体可以在选自真菌,如曲霉属的种或柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)或米曲霉的细胞中产生。
在一个优选的实施方案中,真菌宿主细胞是一种丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚类的所有丝状形式(如Hawksworth等人,1995,同上所述)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的营养菌丝体。营养生长是通过菌丝延长,而碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞原植体的芽殖,而碳分解代谢可以是发酵性的。
在一个更优选的实施方案中,丝状真菌宿主细胞是顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium和木霉属的种或其有性型或类似物的细胞,但不限于此。
在另一个优选实施方案中,丝状真菌宿主细胞是曲霉细胞。
在另一个优选实施方案中,丝状真菌宿主细胞是顶孢霉细胞、镰孢细胞、腐质霉细胞、毛霉细胞、毁丝霉属细胞、脉孢菌细胞、青霉细胞、梭孢壳细胞、Tolypocladium细胞或木霉细胞。
在一个更优选的实施方案中,丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉或米曲霉细胞。
在另一个优选的实施方案中,丝状真菌宿主细胞是变色组(也称为镰孢组)的镰孢细胞。例如,丝状真菌亲本细胞可以是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、Fusarium sulphureum或Fusarium trichothecioides细胞。
在另一个优选的实施方案中,丝状真菌亲本细胞是Elegans的镰孢菌株,例如尖孢镰孢。
此外,在另一个优选的实施方案中,丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、柔毛腐质霉细胞、米黑毛霉(Mucor miehei)细胞、嗜热毁丝霉细胞、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)细胞、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)细胞、Thielavia terrestris细胞。
在另一个优选的实施方案中,木霉细胞是Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。
可以通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁以原本已知的方式再生的方法转化真菌细胞。EP 238 023和Yelton等人,1984,美国国家科学院院报81:1470-1474中描述了转化曲霉宿主细胞的适当方法。Malardier等人,1989,基因78:147-156或共同未决的US系列号08/269,449中描述了一种转化镰孢属的种的合适方法。可以用Decker和Guarente,于:Abelson,J.N.和Simon,M.I.编的《酵母遗传学和分子生物学指南,酶学方法》(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology),第194卷,182-187,AcademicPress,Inc.,纽约;Ito等人,1983,细菌学杂志153:163;和Hinnen等人,1978,美国国家科学院院报75:1920所述的方法转化酵母。可利用Graham和Van der Eb(1978,病毒学(Virology)52:546)的磷酸钙沉淀法通过直接摄取转化哺乳动物细胞。
在另一个优选的实施方案中,宿主选自植物细胞,如马铃薯细胞,或宿主选自动物细胞,如昆虫细胞,例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9和Sf21卵巢细胞和来自于粉斑夜蛾(Trichoplusiani)卵的High Five Line,或哺乳动物细胞,如猴CV1和COS细胞、鼠C127成纤维细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
表达载体可以是经受重组DNA方法,随后在宿主生物中成功表达的任何载体。当导入细胞中时,载体可以自主方式起作用。质粒利用复制起点能独立于宿主细胞复制。此外,它也能掺入宿主细胞基因组中,并与宿主细胞基因组一起复制。
本发明的另一实施方案涉及随机肽展示包装文库如噬菌体展示***在筛选如上所述的蛋白质变体中的用途。
实施例
实施例1
表位模式
用抗亲本蛋白质的IgG抗体筛查随机噬菌体展示肽文库显示下列表位模式。
以(*)标记的序列可存在于Cys-Cys桥中。
黑体:锚定氨基酸
斜体:保守突变
表1:
1)亲本蛋白质
漆酶
表位模式
1.P R S D P G T P T
P R T D P G W L A
P S S D P G A R S
2.W P K S D A G D S
G P S R D A G L L
3.G P S R D A G L L
G A A R D A R S A
4.H V F D K N V T R
2)亲本蛋白质
JE-1(NATALASE)(淀粉酶):
表位模式
1.Q L Y G D E Q L P
2.G S A T I D P R Q(*)
3)亲本蛋白质
Lipoprime:
表位模式
1.H E Y P M D F H L
S E Y S M S I T P
P E Y T M N A L S
2.Q R P P R Y E L E
3.R K L T L S G R S
4)亲本蛋白质
PD498(蛋白酶)
表位模式
1.T R Y H R R P P L
S R Y N K K P H L
2.N K L A T R E P M
3.V N H F R K R S A
4.R G L S M I M G K
5)亲本蛋白质
Carezyme(*)
表位模式
1. V H A G P R A G T
V H S G P R A G Y
V H A G P R A G T
2. V H A G P R A G T
V H A G P R A G T
V T R G P N A G S
3. V H A G P R A G T
V H S G P R A G Y
V H A G P R A G T
V H A G P R A G T
V H A G P R A G T
V T R G P N A G S
L S G P L A G R V
6)亲本蛋白质
Savinase:
表位模式
1.F N D A F F V K M
T F H D A P A L Q
2.T F H D A P A L Q
D F H V K Y A A Q
3.A N P I W S R S A
4.T A R L R A G N A (*)
5.R A F R R N A N W
实施例2
利用噬菌体展示文库和三维分析的表位作图
表位序列和表位模式的鉴定
针对结合纯化的特异性兔IgG及结合纯化的大鼠和小鼠IgG1和IgE抗体的能力筛查表达随机六肽、九肽或十二肽作为其膜蛋白部分的噬菌体的高度多样性文库(1012)。噬菌体文库按照现有技术获得(见WO 9215679,在此引用作为参考)。
通过皮下、皮内或气管内注射溶解于磷酸缓冲盐液(PBS)中的有关蛋白质(例如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化还原酶)在各自动物中产生抗体。用加载猪抗兔IgG、小鼠抗大鼠IgG1或IgE或大鼠抗小鼠IgG1或IgE抗体的顺磁免疫磁珠(Dynal AS)经亲和层析从免疫动物的血清中纯化各自抗体。
将各个噬菌体文库与IgG、IgG1和IgE抗体包被的磁珠温育。通过将这些顺磁珠暴露于磁场中收集表达对兔IgG或大鼠或小鼠IgG1或IgE抗体有亲和力的寡肽的噬菌体。经弱酸处理或用完整酶洗脱从固定的抗体中洗脱下合并的噬菌体。如专家所知扩增分离的噬菌体。此外,固定的噬菌体也可直接与大肠杆菌温育进行感染。简言之,在辅助噬菌体(例如M13K07)存在下用M13衍生载体感染F因子阳性的大肠杆菌(例如XL-1 Blue、JM101、TG1),并且通常在含葡萄糖或IPTG和适当选择用抗生素的2×YT中温育。最后,离心分离细胞。最小2×、最大5×重复该循环操作各自细胞上清液。2、3、4和5轮筛选后,在选择性2×YT琼脂平板上温育感染的大肠杆菌的级分,并免疫学评估出现的噬菌体的特异性。然后,将噬菌体转移到硝酸纤维素(NC)膜上。对于每一平板,制备2个NC复制品。一个复制品与选择抗体温育,另一个复制品与选择抗体和用来获得作为竞争剂的抗体的免疫原温育。在免疫原存在下不出现的噬斑被认为是特异的,并按照上述方法扩增。
在聚乙二醇存在下从细胞上清液中离心分离特异的噬菌体克隆。按照标准方法,分离DNA,PCR扩增编码寡肽的DNA序列,测定DNA序列。由DNA序列推断相应寡肽的氨基酸序列。
这样获得了对上述蛋白质特异性抗体特异的大量肽序列。将这些序列收集于数据库中,经序列对比分析以确定表位模式。保守交换(例如天冬氨酸与谷氨酸、赖氨酸与精氨酸、丝氨酸与苏氨酸的交换)被认为是其中的一种。这表明大多数序列对于抗体所针对的蛋白质特异。然而,只从通过2轮筛选的噬菌体中获得几种交叉反应序列。但鉴定出22种表位模式。
以下表2中列出了这些表位模式。
表2:表位数据库的提取物。
序列对比 酶 表位模式
T R Y H > R R P P LS R Y N > K K P H LR R Y P > K L M P PR R Y S > Q R T I QC V H S G P R A G Y C GC I T S G P R A G N C GC > L S G P L A G R V C GP R S D P G T P TP R T D P G W L AP S S D P G A R S | PD498PD498PD498PD498CarezymeCarezymeCarezymeLaccaseLaccaseLaccase | R Y P RKS G P R A GTP R S D P GK |
P > R S D T G F GD P V R D > T G A GD P A R D > T G D VR A F R R N A > N WC T A R L R > A G N A C GC T A R V V > A L G V C GF C T N N C E L SR R F S N N D E LK R F A N > T E L AR R F S N A T AR R F S N N D E LK R F A N T E L AK R F A N T E P AH E Y D M R V A WS E Y S M S I T PP E Y T M N A L SL E Y P M S A S QC S F P L P A P R S CC L F P S P A P R S CC D G P A P A P W S CC V Y P S P A P W S CA K I D P K P DC S V A K I D P R T CC G S A T I D P R Q CR Y A Q I D P R WC N A D S W G Y P R CC D A A S S G Y P L CC D A D D R R Y P R CC N A D N Q M Y P Q CG A A R D A R S AV N H F R K R S AC S R S A K A R L C GA N P I W S R S AR K L T L S G R SG E F N L > G R S SG R F S N S K F K | LaccaseLaccaseLaccaseSavinaseSavinaseSavinaseSavinaseSavinaseSavinaseSavinaseSavinaseSavinaseSavinaseLipoprimeLipoprimeLipoprimeLipoprimeLipoprimeLipoprimeLipoprimeLipoprimeJE-1(NATALASE)JE-1(NATALASE)JE-1(NATALASE)JE-1(NATALASE)JE-1(NATALASE)JE-1(NATALASE)JE-1(NATALASE)LaccasePD498LipoprimeSavinaseLipoprimeJE-1(NATALASE)Savinase | D P > R D T GA R > R > A > NN N > E LR R F A N > EK S DE Y > MP > P A P > SA K I D P RKA D S > G Y PS R S AL > G R S S |
在本实施例中,对于四种不同的酶(漆酶、一种真菌脂肪酶和两种细菌蛋白酶)发现了表位SRSA。类似地,对于不同的亲本蛋白质发现了表位L>GRSS。这证明不同结构、功能和微生物来源的蛋白质可共有一种或多种表位模式。
实施例3
各自的表位和表位区在蛋白质三维结构上的定位
应用适当的软件(例如Swiss Pdb Viewer,WebLite Viewer)对目的蛋白质的三维结构评估每种表位。
第一步,使鉴定的表位模式符合酶的三维结构。将确定一种特异表位模式的至少3种氨基酸的一种序列被定位于蛋白质的三维结构上。保守突变(例如天冬氨酸代替谷氨酸、赖氨酸代替精氨酸、丝氨酸代替苏氨酸)被认为是噬菌体展示证实发生这些交换的模式的一种。在蛋白质结构提供的可能的序列中,只保留那些序列匹配一级序列,或匹配氨基酸的结构序列,每种氨基酸距下一种5之内的序列。偶尔,为达到这一标准必须考虑软件程序提供的氨基酸侧链的迁移率。该步骤一般产生每个蛋白质0-7个可能的表位。
第二,在第一步定位的不同氨基酸序列周围的区域中评估剩余的锚定氨基酸,以及可变氨基酸,即不能确定模式但存在于经噬菌体文库筛查鉴定的单个序列中的氨基酸。只包括距下一个5内的氨基酸。该步骤一般产生0-3个可能的候选者。
最后,引入可及性标准。该标准是,至少一半锚定氨基酸具有>30%可及的表面。一般保留<2个表位。
因此,鉴定大量表位序列,并定位于不同蛋白质的表面上。如序列对比所提示的,结构分析证实大多数表位是酶特异的,只有极少数例外。总而言之,大多数鉴定的表位至少部分是结构性的。但是,某些蛋白质(例如淀粉酶)主要表达一级序列表位。一般而言,这些表位位于酶的极不连续区,且不同表位常共有氨基酸(热点)。
众所周知,结合序列周围的氨基酸能在不积极参与结合过程的情况下影响配体的结合。基于这一认识,将对表位-抗体相互作用具有潜在空间作用的氨基酸所覆盖的区域确定在所鉴定的表位周围。实际上,包括距确定表位的氨基酸5之内的所有氨基酸。不包括可及性标准,因为隐藏的氨基酸可影响周围结构。
图1显示了表示不同酶的各自表位和表位区的三维结构。
实施例4
抗原性或免疫原性降低的酶变体的产生、筛选和评价
利用本领域专家所知的技术(例如定点诱变、易错PCR)突变热点或表位。
在以下所示的实施例中,通过定点诱变制备变体。诱变法避免产生新表位或根据表位数据库中收集的信息(见实施例1)复制存在的表位的氨基酸交换。
为降低的抗主链酶抗体的结合筛查酶变体。用建立的试验(例如竞争性ELISA、凝集试验)评估该抗体结合。
进一步在动物研究中评价抗体结合能力降低的变体。
每周皮下注射50μl 0.9%(重量/体积)NaCl(对照组)或50μl含10μg蛋白质的0.9%(重量/体积)NaCl,持续20周,免疫小鼠。每次第二次免疫一周后从眼睛中采集血样(100μl)。通过血液凝固和离心获得血清。
用对小鼠或大鼠IgG1或IgE特异的ELISA测定特异性IgG1和IgE水平。用适当的统计学方法分析数据组之间的差异。
A.确定表位的氨基酸的定点诱变,其对小鼠中的IgG1和/或IgE应答
有影响
表位:A172/A169 R170 A194 G193 N261
模式:AR>R>A>N
抗体:IgG1+IgE
主链:Savinase
该变体具有突变R170F。
在竞争性IgE ELISA中,该变体在与抗Savinase抗体的竞争中效率较低,终点抑制比Savinase主链低15%。
小鼠研究表明,与Savinase主链相比,特异性IgE水平降低80%(p<0.01)。IgG1水平未受显著影响。
表位:S216 E219 Y220
模式:EY>M
抗体:IgG1
主链:Lipoprime
该变体具有突变S216W。
在竞争性IgG ELISA中,该变体在与Lipolase抗体的竞争中效率较低,终点抑制比酶主链低38%。
小鼠研究表明,与lipolase主链相比,特异性IgG1水平降低69%(p<0.05)。IgE水平未受显著影响。
B.表位的定点诱变,实例为分别由表位数据库预测的表位复制和新
表位形成
表位:T143 N173 N140 E136 L135
模式:S/TNN>EL
抗体:IgG1
主链:Savinase
该变体具有突变E136R。
在竞争性IgG ELISA中,该变体在与Savinase抗体的竞争中效率较低,终点抑制比Savinase主链低38%。
小鼠研究表明,与Savinase主链相比,特异性IgG1水平显著降低(p<0.01)。IgE水平未受显著影响。
突变E136R建立了RYPR/K模式的IgG1表位,这以前在PD498上鉴定。显然,这种新表位在小鼠中比现有的表位更具抗原性。Savinase主链上Savinase无关表位的引入能解释观察到的在竞争性ELISA与动物研究之间的差异。
在本实施例中发现,利用只用抗PD498抗体筛查噬菌体文库(用以鉴定表2的RYPR/K表位模式)获得的信息,能预测对Savinase的遗传工程实验的结果,其中E136R突变在Savinase表面上产生PD498表位,导致该Savinase变体免疫原性提高。这证明,鉴定的表位模式可用来预测对蛋白质置换的免疫原性的影响,其不同于用来鉴定表位模式的亲本蛋白质。
C.确定表位区的氨基酸的定点诱变,其分别对小鼠中的IgG1和IgE
抗体水平有不同影响,并对IgG结合有抑制作用。
表位:A172/A169 R170 A194 G193 N261
模式:AR>R>A>N
抗体:IgG1+IgE
主链:Savinase
表位区:P131,S132,A133,L135,E136,V139,A151,A152,S153,G161,S162,I165,S166,Y167,P168,Y171,N173,A174,A176,Q191,Y192,G195,L196,R247,S259,T260,L262,Y263,G264。
该变体由于Y167I突变而在Y167位点处不同。
在竞争性IgE ELISA中,该变体在与抗Savinase抗体的竞争中效率较低,终点抑制比其主链低8%。
小鼠研究表明,与主链相比,特异性IgE水平降低75%(p<0.01)。相反,IgG1水平显著提高(p<0.01)。
表位:T143 N173 N140 E136 L135
模式:S/TNN>EL
抗体:IgG1
主链:Savinase
表位区:V10A,I107,A108,L111,E112,G115,S132,A133,T134,Q137,A138,V139,S141,A142,S144,R145,G146,V147,V149,Y167,P168,Y171,A172,A174,M175,N243,R247。
1号变体在表位位点(N140D)处突变,而2号变体在N140处(N140D)也在表位区位点(A172D)处突变。
在竞争性IgG ELISA中,与Savinase相比,1号变体在与Savinase抗体的竞争中效率较低。该变体显示比其主链低21%的终点抑制。
2号变体产生比Savinase低60%,比1号变体低40%的终点抑制。
实施例5
Savinase变体E136K与活化的双PEG1000的偶联
在含有12mg N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的双PEG1000的50mM硼酸钠(pH9.5)溶液中以约2ml的反应体积温育4.9mg Savinase变体。利用磁力搅拌,同时通过加入0.5M NaOH使pH保持为9.0-9.5,在室温下进行反应。反应时间为2小时。
通过在50mM硼酸钠、5mM琥珀酸、150mM NaCl、1mM CaCl2pH6.0平衡的Superdex-75柱(Pharmacia)上大小排阻层析纯化衍生物,并除去过量的试剂。
偶联物在-20℃下贮存于上述缓冲液中。
与亲本酶变体相比,偶联物的蛋白酶活性基本持平(利用pH9的二甲基酪蛋白作为底物,为97%)。
实施例6
竞争性ELISA根据建立的步骤进行。简言之,96孔ELISA平板用亲本蛋白质包被。适当封闭并洗涤后,包被抗原与兔抗酶多克隆抗血清在不同量的改性蛋白质(竞争剂)存在下温育。
用辣根过氧化物酶标记的猪抗兔免疫球蛋白检测残余的兔抗血清的量。
表位:T143 N173 N140 E136 L135
模式:S/TNN>EL
抗体:IgG1
主链:Savinase
突变:E136K
修饰:双NHS-PEG1000
对PEG化的衍生物的未修饰酶进行竞争性ELISA。结果显示于图2中。
数据表明,与亲本蛋白质(100%终点抑制)相比,衍生物具有降低的结合酶特异性免疫球蛋白的能力(60%终点抑制)。
Claims (37)
1.一种筛选与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的方法,
其包括下列步骤:
用抗任一目的蛋白质的抗体筛查随机肽展示包装文库,
对抗体结合肽的氨基酸序列或编码抗体结合肽的DNA序列测序,
通过反应性肽序列的序列对比鉴定表位模式,
结构性表位模式在亲本蛋白质三维结构上的定位,
确定包括距表位氨基酸5之内的氨基酸的表位区,
通过编码亲本蛋白质的DNA序列的遗传工程突变,改变定位的表位模式或限定亲本蛋白质表位区的氨基酸而不损害该蛋白质的功能性,方法是利用现有的表位数据库去除可产生新的表位模式或复制现有表位模式的氨基酸置换,
将突变DNA序列导入合适的宿主中,培养该宿主并表达该蛋白质变体,和
用亲本蛋白质作为参照评价该蛋白质变体的免疫原性。
2.根据权利要求1的方法,其中所述蛋白质变体具有降低的变应原性。
3.根据权利要求1的方法,其中通过在评价变应原性之前评价抗原性和/或功能性,选择蛋白质变体。
4.根据权利要求1的方法,其中通过比较抗体结合肽序列与亲本蛋白质的序列和三维结构,鉴定亲本蛋白质的表位模式。
5.根据权利要求1的方法,其中通过比较抗体结合肽序列与亲本蛋白质的序列和三维结构,鉴定亲本蛋白质的表位区。
6.根据权利要求1的方法,其中亲本蛋白质是一种酶。
7.根据权利要求6的方法,其中所述的酶选自:糖基水解酶、糖酶、过氧化物酶、蛋白酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、多糖裂合酶、氧化还原酶、转谷氨酰胺酶和糖基异构酶。
8.根据权利要求1的方法,其中所述抗体是IgG或IgE抗体。
9.根据权利要求1的方法,其中随机肽展示包装文库是一种噬菌体展示文库。
10.根据权利要求1的方法,其中随机肽展示包装文库的肽是含有5-25个氨基酸的寡肽。
11.根据权利要求1的方法,其中通过置换表位区的至少一个氨基酸改变该表位区。
12.根据权利要求1的方法,其中通过添加或删除表位区的至少一个氨基酸改变该表位区。
13.根据权利要求1的方法,其中通过置换表位模式的至少一个氨基酸改变该表位模式。
14.根据权利要求1的方法,其中通过添加或删除表位模式的至少一个氨基酸改变该表位模式。
15.根据权利要求1的方法,其中通过置换和/或***至少一种氨基酸将表位区中的氨基酸改变,置换和/或***所用的氨基酸使置换和/或***的氨基酸成为与活化分子共价偶联的靶标。
16.根据权利要求15的方法,其中用于置换和/或***的氨基酸选自K、R、C、D、E。
17.根据权利要求15的方法,其中用于共价偶联的分子选自活化的合成或天然聚合物。
18.根据权利要求17的方法,其中活化的合成聚合物是聚乙二醇。
19.根据权利要求1的方法,其中用竞争性ELISA测定免疫原性。
20.根据权利要求19的方法,其中蛋白质变体的免疫原性低于亲本蛋白质免疫原性的75%。
21.根据权利要求19的方法,其中蛋白质变体的免疫原性低于亲本蛋白质免疫原性的50%。
22.一种与其野生型蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质,其中就亲本蛋白质的至少一个表位区而言,该蛋白质变体的氨基酸序列不同于亲本蛋白质的氨基酸序列,使得该蛋白质变体的免疫原性低于亲本蛋白质免疫原性的75%,表位区对应于表位模式,所述表位模式对应于可与抗野生型蛋白质抗体反应的反应性肽序列。
23.根据权利要求22的蛋白质,其中所述表位模式是IgE表位模式。
24.根据权利要求22-23中任一项的蛋白质,其中置换或删除表位的锚定氨基酸。
25.根据权利要求22的蛋白质,其中免疫原性低于亲本蛋白质免疫原性的50%。
26.根据权利要求22的蛋白质,其中通过将表位区定位于距下列任一表位模式不到5而将其限定于野生型蛋白质结构上:RYPR/K、SGPRAG、PR/K SDPG、DP>RDTG、AR>R>A>N、NN>EL、R/KRFA/SN>E/D、EY>M、P>PAP>S、AKIDPR/K、ADS>GYP、SRSA、L>GRSS。
27.一种包含权利要求22所述的蛋白质的组合物。
28.如权利要求27所述的组合物在药品生产中的用途。
29.如权利要求27所述的组合物在个人护理产品、食品、洗涤剂生产中的用途。
30.一种含有编码权利要求22所述的蛋白质的DNA序列的DNA构建体。
31.一种含有根据权利要求30的DNA构建体的表达载体。
32.一种能表达一种多肽并含有如权利要求30所述的DNA构建体的宿主细胞。
33.一种能表达一种多肽并被根据权利要求31的表达载体转化的宿主细胞。
34.根据权利要求32或33的宿主细胞,它是一种真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。
35.一种生产与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的方法,其包括:
在适当培养基中培养一种根据权利要求32或33的宿主细胞,以获得蛋白质的表达及向培养基中的分泌,随后
从培养基中分离该蛋白质。
36.随机肽展示包装文库在筛选与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体中的应用,其包括下列步骤:
用抗亲本蛋白质的抗体筛查随机肽展示包装文库,
对抗体结合肽的氨基酸序列或编码抗体结合肽的DNA序列测序,
通过肽序列与亲本蛋白质序列和三维结构的对比鉴定亲本蛋白质的结构性表位模式,
通过编码亲本蛋白质的DNA序列的遗传工程突变,改变鉴定的亲本蛋白质的表位模式,而不损害该蛋白质的功能性,
将突变DNA序列导入合适的宿主中,培养该宿主并表达该蛋白质变体,和
用亲本蛋白质作为参照评价该蛋白质变体的免疫原性。
37.一种与其野生型蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体,其中就亲本蛋白质的至少一个表位区而言,该蛋白质变体的氨基酸序列不同于亲本蛋白质的氨基酸序列,使得该蛋白质变体的免疫原性低于亲本蛋白质免疫原性的75%,通过将表位区定位于距下列任一表位模式不到5而将其限定于野生型蛋白质结构上:RYP R/K、SGPRAG、PR/K SDPG、DP>RDTG、AR>R>A>N、NN>EL、R/KRF A/SN>E/D、EY>M、P>PAP>S、AKIDPR/K、ADS>GYP、SRSA、L>GRSS。
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