JP4933013B2 - 動物飼料における酸安定性ズブチリシンプロテアーゼの使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、動物飼料におけるズブチリシンファミリーの酸安定性セリンプロテアーゼの使用（in vivo)、及び植物タンパク質を処理するための当該プロテアーゼの使用(in vitro)に関する。
【０００２】
タンパク質は動物及びヒトにとって必須の栄養因子である。多くの家畜及び多くの人間は、植物タンパク質源から必須タンパク質を摂取する。重要な植物タンパク質源は、例えば脂肪種子植物、マメ科植物及び穀物である。
【０００３】
例えば、ダイズ粉が単胃動物、例えばブタ及び家禽の飼料中に含まれる場合、かなりの比率の当該ダイズ粉の固体が消化されない。例えば、子ブタ及び成長期のブタにおける、見かけ上の回腸におけるタンパク質の消化率は、約８０％に過ぎない。
【０００４】
単胃動物及び多くの魚の胃は、強酸性のｐＨを示す。しかしながら、多くのタンパク質消化が小腸で起こる。従って、胃の通過で生存し得る酸安定性プロテアーゼについての必要性が存在している。
【０００５】
背景技術
動物飼料における、そして植物タンパク質の処理のためのプロテアーゼの使用は以下の文書によって知られている。
【０００６】
WO95/28850は、フィターゼ及びタンパク質分解酵素を含んで成る動物飼料添加物を開示している。様々なタンパク質分解酵素がｐ．７に詳述されている。
【０００７】
WO96/05739は、キシラナーゼ及びプロテアーゼを含んで成る動物飼料添加物を開示している。適当なプロテアーゼがｐ．２５に列挙されている。
【０００８】
WO95/02044はアスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus aculeatus)由来のプロテアーゼ及び動物飼料におけるその使用を開示している。
【０００９】
US3966971は酸性フィターゼ及び、任意にタンパク質分解酵素を用いる処理によって、植物タンパク質源からタンパク質を得る方法を開示する。適当なプロテアーゼは２段目に記載されている。
【００１０】
US4073884, US5047240, US3868448, US3823072, 及びUS3683069 は、ストレプトミセスの様々な菌株に由来するプロテアーゼ調製物及び動物飼料におけるそれらの使用を記載している。
【００１１】
しかしながら、これらのプロテアーゼは酸安定性ではなく、そして／あるいはズブチリシンファミリーのプロテアーゼではない。
【００１２】
本発明の簡単な説明
非常に酸安定性であり、そして動物飼料において向上した性能が期待される複数のプロテアーゼが今回同定された。これらのプロテアーゼはズブチリシンとして知られているプロテアーゼ群に属する。
【００１３】
本発明の詳細な説明
用語プロテアーゼは、本明細書で使用する場合、ペプチド結合を加水分解する酵素である（プロテアーゼ活性を有する）。プロテアーゼはまた、例えばペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ペプチド加水分解酵素、又はタンパク質分解酵素と称される。
【００１４】
本発明に従う使用にとって好ましいプロテアーゼは、ポリペプチド鎖の内部に作用するエンド型のものである（エンドペプチダーゼ）。エンドペプチダーゼは問題のプロテアーゼの特異性に関連する、Ｎ末端及びＣ末端でブロッキングされているペプチドの基質に対する活性を示す。
【００１５】
上文のプロテアーゼの定義に含まれるものに、定期的に補充され、そして更新されるECリスト（Enzyme Nomenclature 1992 from NC-IUBMB, 1992)のEC3.4酵素群（それらの１３個のサブクラスのいずれかを含む）に属する任意な酵素である。例えば、http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.のワールドワイドウェブ(www)を参照のこと。
【００１６】
プロテアーゼは、それらの触媒機構に基づいて以下の群：セリンプロテアーゼ（Ｓ）、システインプロテアーゼ（Ｃ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ）、メタロプロテアーゼ（Ｍ）、及び未知のもの、又は現時点で分類されていないもの（Ｕ）、に分類される。Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998)の、特にgeneral introductionの項を参照のこと。
【００１７】
用語セリンプロテアーゼは、上記Handbookで定義されているセリンペプチダーゼ及びそれらの一群を言及する。
【００１８】
特定の態様において、セリンプロテアーゼは、触媒機構がペプチド結合を攻撃する求核試薬として働くセリン残基のヒドロキシル基に依存しているペプチダーゼである。
【００１９】
用語ズブチリシン又はズブチリシンファミリーは、本明細書で使用する場合、全てのＳＢ族セリンプロテアーゼ、特にそのＳ８ファミリーを含むことが意図される（ＳＢ族は上記Handbookの第９３章で扱われている）。ズブチリシンにおいて、触媒の３配列の並びはAsp-His-Serである。三次構造はアルファへリックス及びベータシートを共に含む。ＳＢ族はエンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼを共に含む。これらのペプチダーゼは細菌、古細菌及び真核生物を含み；そこにはＤＮＡウイルス由来の単一の代表者が存在する。
【００２０】
所定のプロテアーゼがズブチリシンであるか否かを決定するために、上記Handbook及びその中に示されている原則を参照すること。その様な決定は全ての型のプロテアーゼ、例えば天然又は野生型プロテアーゼ；あるいは遺伝子操作したプロテアーゼ又は合成プロテアーゼについて実施されることがある。
【００２１】
あるいは、阻害研究はＳＳＩ（ストレプトミセス（Streptomyes）ズブチリシン阻害剤）で実施されることもあり、そしてズブチリシンは一定のモル過剰のＳＳＩで阻害した場合に、最大１０％の残留活性を有するプロテアーゼとして定義される。この試験は例８に記載の様に実施され得る。この定義の特定の態様において、ズブチリシンは最大８％、最大６％、又は最大５％の残留活性を有する。「最大」の表現は「以下」の表現と同一であるとみなされる。
【００２２】
プロテアーゼ活性は、問題のプロテアーゼの特異性に関与するペプチド結合を含む基質が利用される、任意なアッセイを用いて測定され得る。アッセイｐＨ及びアッセイ温度も同様に問題のプロテアーゼに適合される。アッセイｐＨ値の例は、ｐＨ５，６，７，８，９，１０，又は１１である。アッセイ温度の例は２５，３０，３５，３７，４０，４５，５０，５５，６０，６５，又は７０℃である。
【００２３】
プロテアーゼ基質の例はカゼイン、及びｐＮＡ基質、例えばSuc-AAPF-pNA（例えばSigma S-7388から入手可能）である。このｐＮＡ基質の大文字は、１文字アミノ酸コードを表している。別の例はプロタザイムＡＫ（Megazyme T-PRAKによって錠剤として調製されたアズリン色素架橋型カゼイン）である。ｐＨ−活性及びｐＨ−安定性の研究にとってｐＮＡ基質が好ましく、一方、温度−活性研究の場合、プロタザイムＡＫ基質が好ましい。
【００２４】
プロテアーゼアッセイの例は、実験の項目に記載されている。
【００２５】
本発明に従う使用にとって、プロテアーゼの起源に対する限定は存在しない。従って、用語プロテアーゼは、天然又は野生型プロテアーゼだけでなく、プロテアーゼ活性を示すその任意な突然変異体、変異体、フラグメント等、並びに合成プロテアーゼ、例えば混合プロテアーゼ、及び共通プロテアーゼを含む。そのような遺伝子操作したプロテアーゼは、当業界で知られている様に、例えば部位指定突然変異導入、ＰＣＲ（ＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして、所望の突然変異を含むＰＣＲフラグメントを用いる）、又はランダム突然変異法によって調製され得る。共通タンパク質の調製は、例えばEP897985に記載されている。
【００２６】
本発明に従う使用のための、ズブチリシンファミリーの酸安定性プロテアーゼの例は、
(i)バチルス（Bacillus）sp. NCIMB40484、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）NCIMB10438；フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）IFO 4471；パエシロマイセス・リラシナス（Paecilomyces liliacinus）CBS 102449、アスペルギルス（Aspergillus）sp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）ATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンス（Acremonium kiliense）ATCC 20338由来のプロテアーゼ；
(ii) (i)のプロテアーゼの任意なものと少なくとも７０，７５，８０，８５，９０，又は少なくとも９５％同一のプロテアーゼ；
(iii) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のいずれかと少なくとも７０，７５，８０，８５，９０，又は少なくとも９５％同一のプロテアーゼ、
（iv）配列番号５（全配列１〜３９７、又はそのフラグメント２８〜３９７若しくは１１８〜３９７）、配列番号６（全配列１〜３６７、又はそのフラグメント７０〜３６７若しくは８４〜３６７）、又は配列番号７のいずれかと少なくとも７０，７５，８０，８５，９０，又は少なくとも９５％同一のプロテアーゼ、である。
【００２７】
同一性のパーセンテージを計算するために当業界で知られている任意なコンピュータープログラムが使用されることがあり、例えばＧＣＧバージョン８のプログラムパッケージにおいて提供されるGAPプログラム(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)（Needleman，S.B．and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453）である。GAPを用いる場合、次の設定値がポリペプチド配列の比較に使用される：５．０のGAPクリエーションペナルティ及び０．３のGAPエクステンションペナルティ。
【００２８】
特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは微生物のプロテアーゼであり、ここで、用語「微生物の(microbial)」は当該プロテアーゼが微生物(microorganism)に由来し、又はそれから派生すること、あるいは微生物に由来する類似体、フラグメント、変異体、突然変異体、又は合成プロテアーゼであることを示す。それは、本来の野生型微生物菌株、別の微生物菌株、又は植物において産生し又は発現することがあり、すなわち当該用語は野生型の、天然プロテアーゼの発現、並びに任意な宿主における組換え体の、遺伝子操作型又は合成のプロテアーゼの発現を網羅する。
【００２９】
用語「微生物」は、本明細書で使用する場合、古細菌、細菌、真菌、ウイルス(vira)等を含む。
【００３０】
微生物の例は、細菌、例えばバチルス属の細菌、例えばバチルスsp. NCIMB40484、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）NCIMB10438；あるいはプロテアーゼ活性を示す突然変異体又は変異株である。
【００３１】
微生物の更なる例は、真菌、例えば酵母又は糸状菌類、例えばパエシロマイセス属から選択されるもの、例えばパエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルス、例えばアスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム、例えばアクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、アクレモニウム・キリエンスATCC 20338、又はフサリウム、例えばフサリウム・オキシスポラムIFO 4471；あるいはプロテアーゼ活性を示す突然変異体又は変異株である。
【００３２】
別の態様において、当該プロテアーゼは植物プロテアーゼである。植物起源のプロテアーゼの例は、メロン果肉由来のプロテアーゼである(Kaneda et al., J. Biochem. 78, 1287-1296(1975))。
【００３３】
用語「動物」は、全ての動物、例えば人間を含む。動物の例は非反芻動物、及び反芻動物、例えばウシ、ヒツジ及びウマである。特定の態様において、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単胃動物、例えばブタ又はイノシシ（swine）（限定しないが、子ブタ、成長期のブタ、及び雌ブタを含む）；家禽類、例えばシチメンチョウ及びニワトリ（限定しないが、ブロイラーのニワトリ、産卵ニワトリを含む）；若いウシ；及び魚類（限定しないが、サケを含む）を含む。
【００３４】
用語「飼料」又は「飼料組成物」は、動物による摂取に適した、又はそれが意図される、任意の化合物、調製物、混合物、又は組成物を意味する。
【００３５】
本発明に従う使用において、前記プロテアーゼは、食餌の前、後、又はそれと同時に、動物に給餌されることがある。後者のものが好ましい。
【００３６】
本文において、用語「酸安定性」は、A280=1.0に相当する希釈液中での、そして次の緩衝液：
１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ HEPES、１００ｍＭ CHES、１００ｍＭ CABS、１ｍＭ CaCl2、１５０ｍＭ KCl、０．０１％ Triton（商標）X-100、ｐＨ３．５、において３７℃で２時間インキュベーションした後の、純粋なプロテアーゼ酵素のプロテアーゼ活性が、本明細書の例２Ｃに記載のアッセイ（基質：Suc-AAPF-pNA、ｐＨ９．０、２５℃）を用いて測定した場合、参照活性の少なくとも４０％であることを意味する。
【００３７】
上記の酸安定性の定義の特定の態様において、プロテアーゼ活性は参照活性の少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、又は少なくとも９０％である。
【００３８】
用語「参照活性」は、次の緩衝液：
１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ HEPES、１００ｍＭ CHES、１００ｍＭ CABS、１ｍＭ CaCl2、１５０ｍＭ KCl、０．０１％ Triton（商標）X-100、ｐＨ９．０、において５℃で２時間インキュベーションした後の、A280=1.0に相当する希釈中での、純粋な型の、同一プロテアーゼのプロテアーゼ活性であって、上述の様に決定される活性を言及する。
【００３９】
換言すると、酸安定性を決定する方法は、次の段階：
ａ）試験すべきプロテアーゼ試料（純粋型、A280=1.0）を２つのアリコート（Ｉ及びII）に分け；
ｂ）アリコートＩを３７℃及びｐＨ３．５で２時間インキュベーションし；
ｃ）アリコートＩの残留活性を測定し（ｐＨ９．０及び２５℃）；
ｄ）アリコートIIを５℃及びｐＨ９．０で２時間インキュベーションし；
ｅ）アリコートIIの残留活性を測定し（ｐＨ９．０及び２５℃）；
ｆ）アリコートIIに対して相対的なアリコートＩの残留活性（％）を計算すること、
を含んで成る。
【００４０】
あるいは、上文の酸安定性の定義において、段階ｂ）の緩衝液のｐＨの値は２．０、２．５、３．０、３．１、３．２、３．３、又は３．４であってもよい。
【００４１】
上文の択一的な段階ｂ）の緩衝液のｐＨ値に関連する上文の酸安定性の定義の、他の択一的な態様において、参照のものと比較した場合の残留プロテアーゼ活性は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％である。
【００４２】
別の態様において、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、又は８．５のｐＨ値は段階ｄ）の緩衝液に適用され得る。
【００４３】
上文の酸安定性の定義において、用語「A280=1.0」は、緩衝液ブランクと比較して、１ｃｍの光路長のキュベットにおいて、２８０ｎｍで１．０の吸収を生じせしめる様な前記純粋プロテアーゼの濃度（希釈）を意味する。
【００４４】
そして、上文の酸安定性の定義において、用語「純粋プロテアーゼ」は、１．７０以上のA280／A260比を有する試料であって（例２Ｅを参照のこと）、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャニングによって、前記プロテアーゼに相当するバンドのそのスキャニング強度の少なくとも９５％を有することが測定されるもの（例２Ａを参照のこと）を言及する。あるいは、A280／A260比は、１．５０、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５以上であるか、あるいは１．９０以上である。
【００４５】
しかしながら、本発明に従う使用のために、プロテアーゼは純粋である必要はなく；それは、例えば他の酵素、他のプロテアーゼでさえも含むことがあり、この場合、それはプロテアーゼ調製物と称されることがある。それでもなお、明確に定義されるプロテアーゼ調製物が有利である。例えば、本質的に他のプロテアーゼから妨害を受けない又はそれを混入していないプロテアーゼの用量（dose）を飼料に正確に添加するほうがより対処しやすい。用語「用量」は、正確に言えば、特に一貫性のある、且つ一定の結果を得る目的、及び所望の効果に基づいて添加量を最適化した容量を言及する。
【００４６】
特定の態様において、飼料に加えられる型の、又は飼料添加物に含められる場合のプロテアーゼは、明確に定義される。明確に定義される、は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合（例１２を参照のこと）、プロテアーゼ調製物が少なくとも５０％純粋であることを意味する。
【００４７】
他の特定の態様において、プロテアーゼ調製物は、この方法によって決定した場合、少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９４、又は少なくとも９５％純粋である。
【００４８】
あるいは、用語「明確に定義される」は、適切なサイズ排除クロマトグラフィーによるプロテアーゼ調製物の画分が、１つの主要なプロテアーゼ成分のみを明らかにしていることを意味する。
【００４９】
当業者は、どのように適切なサイズ排除クロマトグラフィーカラムを選択するかを知っている。当業者は、例えば、Amersham Pharmacia BiotechのHiLoad26/60 Superdex75pgカラム上で調製物を分画することによって開始することがある（例１２を参照のこと）。ピークがはっきりと分かれない場合、当業者は異なるカラム（例えば変更したカラムの粒子サイズ及び／又はカラムの長さを有するもの）を試すことがあり、そして／あるいは試料の体積を変更することがある。単純且つ一般的な試行錯誤の方法によって、当業者は、例１２に記載される様に実施される純度の計算に基づいた、十分な分解能（ピークの明確な分離）を有するカラムに到達するであろう。
【００５０】
当該プロテアーゼ調製物は、（ａ）飼料に直接加えられてもよく（又は植物タンパク質の処理工程で直接使用されてもよい）、あるいは（ｂ）１又は複数の中間組成物、例えば後に飼料に加えられる飼料添加物又はプレミックスの製造において使用されてもよい（又は処理工程で使用されてもよい）。上述した純度の程度は、上文の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに従い使用される、本来のプロテアーゼ調製物の純度を言及する。
【００５１】
この程度の純度を有するプロテアーゼ調製物は、特に組換え産生方法を用いて得ることができ、一方、それらは、当該プロテアーゼが伝統的な発酵法で産生される場合、そのように容易には得られず、そして更により大きなバッチ間の変動性にもさらされる。
【００５２】
その様なプロテアーゼ調製物は、当然のことながら、他の酵素と混合され得る。
【００５３】
１つの特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、酸安定性に加えて、中性に近い至適ｐＨ−活性も有する。
【００５４】
用語「中性に近い至適ｐＨ−活性」は、１又は複数の以下のこと：至適ｐＨがｐＨ６．０〜１１．０、又はｐＨ７．０〜１１．０、又はｐＨ６．０〜１０．０、又はｐＨ７．０〜１０．０、又はｐＨ８．０〜１１．０、又はｐＨ８．０〜１０．０の間にあることを意味する（本明細書の例２Ｂ及び７、並びに図２及び５を参照のこと）。
【００５５】
別の特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、酸安定性に加えて、熱安定性でもある。
【００５６】
用語「熱安定性」は、１又は複数の以下のこと：至適温度が少なくとも５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６６℃、６８℃、又は少なくとも７０℃であることを意味する（本明細書の例２Ｄ及び７並びに図３及び６を参照のこと）。
【００５７】
更に特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは本明細書の例４のin vitroモデルに従い、植物タンパク質を可溶化し得る。
【００５８】
用語「植物タンパク質」は、本明細書で使用する場合、植物由来又は起源の少なくとも１つのタンパク質、例えば修飾型タンパク質及びタンパク質誘導体を含む、任意の化合物、組成物、調製物又は混合物を言及する。特定の態様において、植物タンパク質のタンパク質含量は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０％（ｗ／ｗ）である。
【００５９】
植物タンパク質は、植物タンパク質源、例えばマメ科植物及び穀物類に由来してもよく、例えばマメ科（Fabaceae)（マメ科(Leguminosae）)、アブラナ科、アカザ科、及びイネ科の植物由来の材料、例えばダイズ粉、ルピナス粉及びナタネ粉に由来してもよい。
【００６０】
特定の態様において、植物タンパク質源はマメ科の１又は複数の植物、例えばダイズ、ルピナス、エンドウマメ、又はマメ由来の材料である。
【００６１】
別の特定の態様において、植物タンパク質源は、アカザ科の１又は複数の植物、例えばビート、テンサイ、ホウレンソウ又はキノア由来の材料である。
【００６２】
植物タンパク質源の他の例は、ナタネ、及びキャベツである。
【００６３】
ダイズは好ましい植物タンパク質源である。
【００６４】
植物タンパク質源の他の例は、穀物類、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、トウモロコシ（コーン）、コメ、及びモロコシである。
【００６５】
少なくとも１つの、ズブチリシンファミリーの酸安定性プロテアーゼを用いる植物タンパク質の本発明に従う処理は、植物タンパク質の可溶化の増大をもたらす。
【００６６】
以下のものは、本発明のプロテアーゼを用いて得られる可溶化タンパク質のパーセンテージの例である：少なくとも７６．８％、７７．０％、７７．２％、７７．４％、７７．６％、７７．８％、７８．０％、７８．２％、７８．４％、７８．６％、又は少なくとも７８．８％（本明細書の例４のin vitroモデルを参照のこと）。
【００６７】
用語「タンパク質の可溶化」は、基本的にタンパク質を溶液にすることを意味する。その様な可溶化は、通常複合体の、天然の組成物、例えば飼料の、他の成分からのプロテアーゼを介するタンパク質の放出に起因することがある。可溶化はプロテアーゼ処理をしていない試料と比較した場合の、可溶性タンパク質の量の増大として測定され得る（本明細書の例４を参照のこと）。
【００６８】
処理工程の特定の態様において、問題のプロテアーゼは、その植物タンパク質又はタンパク質源に対するその可溶化作用に影響する（又は働きかけ、又は影響を及ぼす）。これを達成するために、植物タンパク質又はタンパク質源は典型的に溶媒、例えば水性溶媒、例えば水の中で懸濁され、そしてｐＨ及び温度の値は、問題の酵素の特性に関して注意を払って調整される。例えば、当該処理は、実際のプロテアーゼの相対活性が少なくとも５０、又は６０、又は７０、又は８０、又は９０％である、ｐＨ値で行ってもよい。同様に、例えば、当該処理は、実際のプロテアーゼの相対活性が少なくとも５０、又は６０、又は７０、又は８０、又は９０％である、温度で行ってもよい（これらの相対活性は本明細書の例２で定義される）。当該酵素反応は所望の結果が得られるまで続けられ、この後、それは酵素を不活性化することによって、例えば加熱処理段階によって停止しても、又はしなくてもよい。
【００６９】
本発明の処理工程の別の特定の態様において、プロテアーゼの働きは維持され、これは、例えば当該プロテアーゼが植物タンパク質又はタンパク質源に加えられるが、その可溶化作用は、いわば、一度適当な可溶化条件が確立されると、又は一度任意な酵素阻害剤が不活性化されると、又はどの様な他の手段が酵素の働きを延長するために適用されても、後に所望とされるまで変化しないことを意味する。
【００７０】
１つの態様において、当該処理は、動物飼料又は動物飼料における使用のための植物タンパク質の前処理であり、すなわちタンパク質は摂取前に可溶化される。
【００７１】
用語「動物飼料の栄養価の向上」は、タンパク質の利用性を向上させ、それによってタンパク質抽出の増大、より高いタンパク質の収率、及び／又はタンパク質の活用性の増大をもたらすことを意味する。その結果、当該飼料の栄養価が増大し、そして動物の成長速度及び／又は体重増加及び／又は飼料変換（すなわち体重増加と比較される摂取飼料の重量）が向上する。
【００７２】
特定の態様において、体重増加はコントロールの少なくとも１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、又は少なくとも１０６．６％である（本明細書の例１０を参照のこと）。
【００７３】
更に特定の態様において、飼料変換は多くとも（又は未満）９９％、９８％、９７．５％、９７％であり、又は多くとも９６．６％である。これは最大９９％、９８％、９７．５％、９７％、又は最大９６．６％の飼料変換に等しい。また、本明細書の例１０を参照とし、コントロールと比較すること。
【００７４】
当該プロテアーゼは、任意な型で、比較的純粋なプロテアーゼとして、又は動物飼料に加えることが意図される他の成分と一緒に、すなわち動物飼料添加物の型で、例えばいわゆる動物飼料のためのプレミックスとして、飼料に加えられ得る。
【００７５】
動物飼料添加物
ズブチリシンファミリーの酸安定性プロテアーゼの他に、本発明の動物飼料添加物は、少なくとも１つの脂溶性ビタミン、及び／又は少なくとも１つの水溶性ビタミン、及び／又は少なくとも１つの微量元素、及び／又は少なくとも１つの多量元素を含む。
【００７６】
更に、任意の飼料添加物成分として、着色剤、芳香性化合物、安定剤、及び／又は、フィターゼ EC3.1.3.8又はEC3.1.3.26；キシラナーゼ EC3.2.1.8；ガラクタナーゼ EC3.2.1.89；及び／又はベータグルカナーゼ EC3.2.1.4の中から選択される少なくとも１つの他の酵素がある（ECは、NC-IUBMB,1992に由来する、１９９２年の酵素命名法に従う酵素分類を意味する）（http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htmlのワールドワイドウェブ(www)も参照のこと）。
【００７７】
特定の態様において、これらの他の酵素は明確に定義されている（プロテアーゼ調製物について上文で定義し、そして例示したもの。例１２を参照のこと）。
【００７８】
通常、脂溶性及び水溶性ビタミン、並びに微量元素は、飼料に加えることが意図される、いわゆるプレミックスの一部を形成し、一方、多量元素は通常飼料に対して別々に加えられる。これらの組成物の型のいずれも、本発明に従う酸安定性ズブチリシンで強化された場合、本発明の動物飼料添加物である。
【００７９】
特定の態様において、本発明の動物飼料添加物は、動物の食餌又は飼料に、０．０１〜１０．０％；更に詳細には０．０５〜５．０％；あるいは０．２〜１．０％（１００ｇの飼料当たりの１ｇの添加物を意味する％）のレベルで含めることが意図される（又は含めねばならないと規定される）。このことは、特にプレミックスについても同様である。
【００８０】
従って、動物飼料添加物、例えばプレミックスの個々の成分の濃度は、同一成分の最終飼料中濃度に、それぞれ１０〜１００００；２０〜２０００；又は１００〜５００を掛けることによって明らかとなりうる（上記の、３つのパーセンテージの算入間隔を参照のこと）。
【００８１】
前記の個々の飼料及び飼料添加物成分の、所望の終濃度、すなわち飼料中濃度についての指針を、以下の表Ａに示す。
【００８２】
以下のものは、これらの成分の例の非限定的な列挙である。
【００８３】
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、及びビタミンＫ、例えばビタミンＫ３である。
【００８４】
水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチン及びコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、例えばパントテン酸カルシウムＤである。
【００８５】
微量元素の例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、及びコバルトである。
【００８６】
多量元素の例はカルシウム、リン及びナトリウムである。
【００８７】
家禽類及び子ブタ／ブタで実証された、これらの栄養要求量を、以下の表Ａに列記する。栄養要求量は、これらの成分が、示した濃度で食餌に提供されるべきであることを意味する。これらのデータは：
NRC, Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D. C. 1988；及び
NRC, Nutrient requirements in poultry, ninth revised edition 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D. C. 1994、
を編集したものである。
【００８８】
あるいは、本発明の動物飼料添加物は、表Ａで述べた少なくとも１つの個々の成分を含んで成る。少なくとも１つとは、１又は複数の、１個の、又は２個の、又は３個の、又は４個の、更にそれ以上、最大で合計１３個の、あるいは最大で合計１５個のいずれかの、個々の成分を意味する。
【００８９】
更に具体的には、この少なくとも１つの成分は、表Ａの第４列、又は第５列、又は第６列に含まれる範囲内の飼料中濃度を提供するような量で、本発明の添加物に含まれる。
【００９０】
上文で説明したように、相当する飼料添加物濃度は、これらの範囲の間隔限定に１０〜１００００；２０〜２０００；又は１００〜５００を掛けることによって明らかと成り得る。例えば、ビタミンＡのプレミックス含有量が１０〜１０００００IU/kgに相当することを考慮すると、この練習は以下の間隔を導く：添加物１ｋｇ当たり１００〜１０8IU；又は２００〜２×１０7IU；又は１０００〜５×１０6IU。
【表１】
【００９１】
動物飼料組成物
動物飼料組成物又は食餌は、比較的高い含有量のタンパク質を有する。上文で言及したNational Research Council(NRC)の刊行物に従い、家禽類及びブタの食餌は、以下の表Ｂの、列２〜３に示すように特徴づけられ得る。魚の食餌は、表Ｂの列４に示すように特徴づけられ得る。更に、その様な魚の食餌はサケ科の食餌で例示され、そしてAquaculture, principles and practices, ed. T.V.R. Pillay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; Fish nutrition, second edition, ed. John E. Halver, Academic Press Inc.1989に基づいて設計される。
【００９２】
本発明に従う動物飼料組成物は、５０〜８００ｇ／ｋｇの含有量の粗製タンパク質を有し、そして更に本明細書の請求項に記載の、少なくとも１つのプロテアーゼを含んで成る。
【００９３】
更に、又はあるいは（上文で示唆した粗製タンパク質含量に対して）、本発明の動物飼料組成物は、代謝エネルギーの含有量１０〜３０ＭＪ／ｋｇ;及び／又はカルシウム含有量０．１〜２００ｇ／ｋｇ；及び／又は利用可能なリンの含有量０．１〜２００ｇ／ｋｇ；及び／又はメチオニン含有量０．１〜１００ｇ／ｋｇ；及び／又はメチオニン＋システイン含有量０．１〜１５０ｇ／ｋｇ；及び／又はリジン含有量０．５〜５０ｇ／ｋｇを有する。
【００９４】
特定の態様において、代謝エネルギー、粗製タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニン＋システイン、及び／又はリジンの含有量は以下の表Ｂの範囲２、３、４又は５（Ｒ．２〜５）のいずれか１つの中にある。
【００９５】
粗製タンパク質は、Animal Nutrition, 4th edition, Chapter 13 (Eds. P.McDonald, R. A. Edwards and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1998, ISBN 0-582-40903-9)で述べられているように、６．２５の因子を掛けた窒素（Ｎ）として計算され、すなわち、粗製タンパク質（ｇ／ｋｇ）＝Ｎ（ｇ／ｋｇ）×６．２５である。窒素含有量は、ケルダール法によって決定される（A. O. A. C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)。
【００９６】
代謝エネルギーは、NRC publication Nutrient Requirements of Swine(1988) pp. 2-6、及びEuropean Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, wageningen. ISBN 90-71463-12-5に基づいて計算され得る。
【００９７】
完全な動物食餌中のカルシウム、利用可能なリン及びアミノ酸の食餌含有量は、飼料の表、例えばVeevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteebaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7に基づいて計算される。
【００９８】
特定の態様において、本発明の動物飼料組成物は、上文で定義した少なくとも１つの植物タンパク質又はタンパク質源を含む。
【００９９】
更に他の特定の態様において、本発明の動物飼料組成物は、０〜８０％のトウモロコシ；及び／又は０〜８０％のモロコシ；及び／又は０〜７０％のコムギ；及び／又は０〜７０％のオオムギ；及び／又は０〜３０％のカラスムギ；及び／又は０〜４０％のダイズ粉；及び／又は０〜１０％の魚粉；及び／又は０〜２０％のホエー、を含む。
【０１００】
動物食餌は、例えばすりつぶされた（mash）飼料（ペレット化されていない）又はペレット化された飼料として製造され得る。典型的には、ミル粉砕された飼料は混合され、そして十分な量の必須ビタミン及び鉱物は問題の種の特徴に従い加えられる。酵素は、固体又は液体酵素製剤として加えられることがある。例えば、固体酵素製剤は典型的に、混合段階の前又はその間に加えられ；そして液体酵素調製物は典型的にペレット化段階の後に加えられる。当該酵素は、飼料添加物又はプレミックス中に組み込まれることがある。食餌中の最終酵素濃度は食餌１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇの範囲内、例えば動物食餌１ｋｇ当たり５〜３０ｍｇの酵素タンパク質の範囲内にある。
【０１０１】
動物飼料組成物の例を、例１１に示す。
【表２】
【０１０２】
植物タンパク質を処理するための本発明の特定の態様において、フィターゼを加える追加の段階も含まれる。そして追加の特定の態様において、フィターゼ及びプロテアーゼを組み合わせた処理に加えて、追加の酵素が加えられることもあり、ここで、これらの酵素は他のプロテアーゼ、フィターゼ、脂肪分解酵素、及びグルコシダーゼ／カルボヒドラーゼ酵素を含んで成る群から選択される。その様な酵素の例は、WO95/28850に示されている。
【０１０３】
前記プロテアーゼは、当然ながら飼料の可溶化及び／又は栄養価を向上せしめるための有効量、すなわちそれに適した量で適用されるはずである。現段階で考えられているのは、前記酵素が１又は複数の以下の量で投与されるということである（投与範囲）：０．０１〜２００；又は０．０１〜１００；又は０．０５〜１００；又は０．０５〜５０；又は０．１０〜１０であり、これらの範囲全てが飼料１ｋｇ当たりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）である（ｐｐｍ）。
【０１０４】
飼料１ｋｇ当たりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）を決定するために、前記プロテアーゼは飼料組成物から精製され、そして精製プロテアーゼの比活性は、関連するアッセイを用いて決定される（プロテアーゼ活性、基質、及びアッセイを参照のこと）。飼料組成物自体のプロテアーゼ活性も、同一のアッセイを用いて決定され、そしてこれら２つの決定に基づいて、飼料１ｋｇ当たりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）の量が算出される。
【０１０５】
同一の原則が飼料添加物中のプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）を決定するために応用される。
【０１０６】
当然のことながら、試料が飼料添加物又は飼料を調製するために使用されるプロテアーゼに関して利用可能であるならば、比活性はこの試料から決定される（飼料組成物又は添加物から当該プロテアーゼを精製する必要なし）。
【０１０７】
多くの植物は、抗栄養因子、例えばレクチン及びトリプシン阻害剤を含む。ダイズの最も重要な抗栄養因子はレクチンダイズ凝集素（ＳＢＡ）、及びダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）である。
【０１０８】
レクチンは、かなりの特異性を有する特異的な炭水化物含有分子と結合するタンパク質であり、そして摂取された場合、それらは腸の上皮と結合する。これは、腸細胞の生存可能性の低下及び栄養の吸収の低下を招くことがある。
【０１０９】
ＳＢＡは約３０ｋＤａのサブユニット分子量及びＮ−アセチルガラクトサミンとの高い親和性を有する、グリコシル化された４量体レクチンである。
【０１１０】
トリプシン阻害剤は、タンパク質分解に影響を及ぼしタンパク質の消化率を低下させ、そして更に膵臓からの消化酵素の分泌を増大させ、消化酵素の形態でアミノ酸の損失を招く。トリプシン阻害剤の例は、約８ｋＤａの分子量を有し、７個のジスルフィド架橋を含み、そしてトリプシン様及びキモトリプシン様プロテアーゼに特異的な２つの阻害性ループを有するBowman-Birk阻害剤である。他の例は、いわゆるFactorのkunitz阻害剤である（例えばトリプシン様プロテアーゼのための１つの結合部位を含み、そして約２０ｋＤａの分子量を有するダイズkunitzトリプシン阻害剤）。
【０１１１】
本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、ＳＢＡレクチン、並びにトリプシン阻害剤であるBowman-Birk阻害剤及びダイズkunitz Factorの様な抗栄養因子を加水分解することが証明された。実験の項の例５を参照のこと。
【０１１２】
この様に、本発明はまた、抗栄養因子、例えばＳＢＡレクチン、並びにトリプシン阻害剤、例えばBowman-Birk阻害剤、及びkunitz Factor、例えばダイズkunitz Factorを加水分解し、又はその量を減少させるための酸安定性セリンプロテアーゼの使用に関する。
【０１１３】
例１
酸安定性プロテアーゼのスクリーニング
多数のプロテアーゼが、単胃動物の酸性の胃を通過するのに必要な安定性を有するプロテアーゼを同定するために、ｐＨ３での安定性について解析された。
【０１１４】
プロテアーゼは常用のクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（例えばProtein Purification, Principles, High Resolution Methods, and Applications. Editors: Jan-Christer Janson, Lars Ryden, VCH Publishers, 1989を参照のこと）。
【０１１５】
プロテアーゼ活性は以下の通りに決定した：プロテアーゼを１．６７％ Hammarstenカゼインと一緒に、２５℃、ｐＨ９．５で３０分間インキュベートし、次にＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を２％（ｗ／ｗ）の終濃度で加え、混合物を濾過して沈降物を除去し、そして濾液を遊離第１級アミノ基について解析した（セリンスタンダードを用いて３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、OPA(o-フタル−ジアルデヒド）に基づいた比色アッセイで決定した）(Biochemische Taschenbuch teil II, Springer-Verlag(1964), p.93 and p.102)。１カゼインプロテアーゼユニット（ＣＰＵ）は標準的な条件のもと、すなわち２５℃及びｐＨ９．５で、１分当たり１ｍｍｏｌのＴＣＡ可溶性第１級アミノ基を遊離する酵素量として定義される。
【０１１６】
前記プロテアーゼを、水中で０．６ＣＰＵ／Ｌの活性となるよう希釈し、２つのアリコートに分け、そして各アリコートを、続いてそれぞれ１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３及び１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７で更に希釈した。希釈した試料を３７℃で１時間インキュベートし、そして２０μｌの試料を１％スキムミルクを含む１％アガロースプレートの穴に適用した。当該プレート（ｐＨ７．０）を３７℃で一晩インキュベートし、そして透明になった範囲を測定した。
【０１１７】
４２個のプロテアーゼがこの試験で良好に実施された。これらのうちのいくつかが特徴づけられた（例２，６，７，及び８を参照のこと）。これらのプロテアーゼは全て、セリンプロテアーゼのズブチリシンファミリーに属する。
【０１１８】
例２
バチルス sp. NCIMB40484 由来のズブチリシンプロテアーゼの特徴付け及び比較研 究
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼを、WO93/24623の例１に記載のように調製した。
【０１１９】
この特徴付けの目的は、Sub. Novo、Sub. Novo(Y217L)、及びSAVINASE（商標）と比較して、それらのｐＨ−安定性、ｐＨ−活性及び温度−活性プロファイルを研究することであった。
【０１２０】
Sub. Novoはバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens)由来のズブチリシンであり、そしてSub. Novo(Y217L)はWO96/05739に開示されているその変異体である。Sub. Novoは常用の方法を用いて野生型菌株の培養物から調製され、そして精製され、一方、前記変異体はEP130756の例１〜２、及び１５〜１６に記載されているように調製した。
【０１２１】
SAVINASE（商標）はバチルス・クラウシイ（Bacillus clausii)由来のズブチリシンであり、これはNovozymes A/S(Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark)から販売されている。その調製は米国特許第３７２３２５０に記載されている。
【０１２２】
例２Ａ
プロテアーゼ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度の決定
プロテアーゼ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の手順によって決定した。
【０１２３】
４０μｌのプロテアーゼ溶液（Ａ280濃度＝０．０２５）を、１０μｌの５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）と氷上のエッペンドルフ管中で混合した。３０分後、氷上の管を遠心し（５分、０℃、１４，０００×ｇ）、そして上清を慎重に除去した。２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（２００μｌのトリス−グリシンＳＤＳ試料緩衝液（２倍）（１２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０ｐｐｍブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ＮＯＶＥＸ（商標）のＬＣ２６７６）＋１６０μｌの蒸留水＋２０μｌのβメルカプトエタノール＋２０μｌの３Ｍの緩衝化されていないトリス塩基（Sigma T-1503)を沈殿物に加え、そして管を３分間煮沸した。前記管を短期間遠心し、そして１０μｌの試料をＮＯＶＥＸ（商標）の４〜２０％のグラジエントトリス−グリシンプレキャストゲル（Laemmliの化学を基にしているが、ゲル中にＳＤＳを含まない、ポリアクリルアミドグラジエントゲル（Laemmili, U.K., (1970) Nature, vol. 227, pp.680-685), EC60255)に適用した。電気泳動は、ブロモフェノールブルーの追跡用色素がゲルの底面に達するまで、１５０Ｖの低電圧で、両方の緩衝液のリザーバー中で、トリス−グリシンランニング緩衝液（２．９ｇのトリス塩基、１４．４ｇのグリシン、１．０ｇのＳＤＳ、全体で１Ｌの液体となるように加えられる蒸留水）を用いて行った。電気泳動後、ゲルを１００ｍｌの蒸留水を用いて、穏やかに振とうすることによってそれぞれ３回、５回すすいだ。次にゲルをGelcode（商標）Blue Stain試薬（PIERCEの製品, コロイド性クーマシーG-250、PIERCEのカタログ番号２４５９２）と共に１時間穏やかに振とうし、そして蒸留水を用いて８〜１６時間穏やかに振とうし、そして蒸留水を複数回交換して洗浄した。最後に、ゲルを２枚のセロハンの間で乾燥した。乾燥したゲルをFotolook 95 v2.08ソフトウェアを備えたAGFAのArcus IIスキャナーでスキャニングし、そして以下の設定値（Fotolook 95 v2.08）を有するFile/Acquireコマンドによってウィンドウズ用のイメージ評価ソフトウェアCREAM（商標）（カタログ番号９９０００１及び９９０００５、Kem-En-Tec, Denmark）に取り込んだ：オリジナル＝リフレクティブ、モード＝カラーＲＧＢ、スキャンリゾリューション＝２４０ｐｐｉ、アウトプットリゾリューション＝１２０ｌｐｉ、スケールファクター＝１００％、レンジ＝グローバルセレクションによるヒストグラム並びにＭｉｎ＝０及びＭａｘ＝２１５、トーンカーブ＝無し、シャープネス＝無し、デスクリーン＝無し並びにフレーバー＝無し、これにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの*.imgピクチャーファイルが作り出され、これはＣＲＥＡＭ（商標）での評価に使用された。*.imgピクチャーファイルは、メニューコマンドアナリシス／１−Ｄで評価された。２つのスキャンラインはレーンプレイスツールで*.imgピクチャーファイル上に据えられた：試料スキャンライン及びバックグラウンドスキャンライン。試料スキャンラインは、アプリケーションスロットの真下からブロモフェノールブルーの追跡用色素の真上の位置の、中央の試料レーン（問題のプロテアーゼを有する）に据えられた。バックグラウンドスキャンラインは、試料スキャンラインと平行であるが、試料が全く適用されておらず、バックグラウンドスキャンラインが試料スキャンラインの開始及び終了の点に垂直な、ピクチャー形式のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの位置に据えられた。バックグラウンドスキャンラインはゲルの真のバックグラウンドを表している。スキャンラインの幅及び形状は調整されていない。スキャンラインに沿った強度は、直ちに中程度の感度による１−Ｄ／スキャンメニューコマンドで記録された。１−Ｄ／エディターメニューコマンドを用いて、バックグラウンドスキャンは試料スキャンからサブトレースされた。次に、１−Ｄ／リザルトメニューコマンドが選択され、そしてＣＲＥＡＭ（商標）ソフトウェアによって計算した場合のプロテアーゼピークのエリア（％）がプロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度として使用された。
【０１２４】
次の結果が得られた：
【表３】
【０１２５】
例２Ｂ
ｐＨ−活性アッセイ
Suc-AAPF-pNA(Sigma（商標）S-7388)は、ｐＨ−活性プロファイルを得るために使用した。
【０１２６】
アッセイ緩衝液：ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ値３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０又は１１．０に調整された、１００ｍＭコハク酸（Merck 100682）、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma H-3375）、１００ｍＭ ＣＨＥＳ（Sigma C-2885）、１００ｍＭ ＣＡＢＳ（Sigma C-5580）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００。
アッセイ温度：２５℃
【０１２７】
３００μのプロテアーゼ試料（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００中で希釈したもの）を、１．５ｍｌのアッセイ緩衝液と各ｐＨ値で混合し、混合物のｐＨをアッセイ緩衝液のｐＨにした。反応は１．５ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇのものを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中で希釈し、そして０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で４５倍に希釈した）を加えることによって開始し、そして混合後、Ａ405の増大を問題のｐＨでのプロテアーゼ活性の測定値として分光光度計によってモニタリングした。当該アッセイは他のｐＨ値のアッセイ緩衝液で繰り返し、そして当該活性の測定値をｐＨに対する相対的な活性としてプロットした。相対的な火星は最高の活性（至適ｐＨ）で標準化し、すなわち至適ｐＨでの活性を１、又は１００％に設定した。プロテアーゼ試料は、全ての活性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保証するために希釈された。
【０１２８】
例２Ｃ
ｐＨ−安定性アッセイ
Suc-AAPF-pNA(Sigma（商標）S-7388)は、ｐＨ−安定性プロファイルを得るために使用した。
【０１２９】
アッセイ緩衝液：ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ値２．０、２．５，３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０又は１１．０に調整された、１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００。
【０１３０】
各プロテアーゼ試料（１ｍＭ コハク酸、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中であり、且つ１０超のＡ280の吸光度を有する）を、試験される各ｐＨ値のアッセイ緩衝液中でＡ280＝１．０に希釈した。希釈したプロテアーゼ試料を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プロテアーゼ試料を１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、ｐＨ９．０、中で希釈し、全試料のｐＨをｐＨ９．０にした。
【０１３１】
以下の活性測定において、温度は２５℃であった。
【０１３２】
３００μｌの希釈したプロテアーゼ試料は１．５ｍｌの、ｐＨ９．０のアッセイ緩衝液と混合し、そして活性反応は１．５ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇのものを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中で希釈し、そして更に０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で４５倍に希釈した）を加えることによって開始し、そして混合後、Ａ405の増大を（残留）プロテアーゼ活性の測定値として分光光度計によってモニタリングした。３７℃のインキュベーションを異なるｐＨ値で行い、そして活性の測定値をｐＨに対する残留活性としてプロットした。残留活性を対応するインキュベーションの活性（コントロール）で標準化し、一方当該プロテアーゼをｐＨ９．０のアッセイ緩衝液中でＡ280＝１．０に希釈し、そして他のインキュベーションとして活性測定の前に５℃で２時間インキュベートした。当該プロテアーゼ試料は、全ての活性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保証するために、活性測定の前に希釈した。
【０１３３】
例２Ｄ
温度−活性アッセイ
プロタザイムＡＫ錠が、温度プロファイルを得るために使用された。プロタザイムＡＫ錠はＭｅｇａｚｙｍｅによって錠剤として調製されたアズリン色素架橋型カゼインである。
【０１３４】
アッセイ緩衝液：ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整された、１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００。
【０１３５】
プロタザイムＡＫ錠は、穏やかに撹拌することによって２．０ｍｌの０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００中で懸濁した。５００μｌのこの懸濁液及び５００μｌのアッセイ緩衝液をエッペンドルフ管中で混合し、そして氷上に据えた。２０μｌのプロテアーゼ試料（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００中で希釈したもの）を加えた。当該アッセイは、アッセイ温度に設定したエッペンドルフサーモミキサーにエッペンドルフ管を移すことによって開始した。当該管をエッペンドルフサーモミキサー上で、その最高振とう速度で１５分間インキュベーションした。当該管を氷浴に戻すことによって、アッセイのインキュベーションを停止させた。当該管を氷令した遠心管中で数分間遠心し、そして上清のＡ650を分光光度計で読みとった。緩衝液のブラインドは当該アッセイに含められた（酵素の代わり）。Ａ650（プロテアーゼ）−Ａ650（ブラインド）をプロテアーゼ活性の測定値とした。当該アッセイは異なる温度で実施し、そして活性の測定値をインキュベーション温度に対する相対活性としてプロットされた。相対活性は最高の活性で標準化した（至適温度）。プロテアーゼ試料は、全ての活性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保証するべく希釈した。
【０１３６】
至適活性の概要（ｐＨ−及び温度活性）を表１に示す。ｐＨ−安定性、ｐＨ−活性及び温度−活性プロファイルを図１〜３に示し、そして酸性ｐＨ値でのプロテアーゼについてのｐＨ−安定性の詳細な比較を表２に示す。
【表４】
【表５】
【０１３７】
例２Ｅ
精製したプロテアーゼ試料の吸収純度
Ａ 280 ／Ａ 260 比の決定
精製したプロテアーゼ試料のＡ280／Ａ260比は以下の通りに決定した。
【０１３８】
Ａ260は、緩衝液ブランクと比較される、１ｃｍの路長のキュベットにおける、２６０ｎｍでのプロテアーゼ試料の吸収を意味する。Ａ280は、緩衝液ブランクと比較される、１ｃｍの路長のキュベットにおける、２８０ｎｍでの同一プロテアーゼ試料の吸収を意味する。
【０１３９】
例２及び６に由来する精製したプロテアーゼ試料は、分光光度計のＡ280の読み取りがその応答曲線の直線部分内に収まるまで緩衝液中で希釈した。Ａ280／Ａ260比は、前記の読み取りから決定された。次の結果が得られた：
【表６】
【０１４０】
例３
バチルス sp. NCIMB40484 由来のプロテアーゼの、ダイズ粉（ＳＢＭ）の不溶性部分を分解する能力
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼは、不溶性／消化不能部分を、消化酵素及び／又は加えられた外来性酵素にとって接近可能にする能力について試験された。
【０１４１】
その性能は、WO95/02044に記載のように調製された２つのアスパラギン酸プロテアーゼ、プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIと比較された。この文書は飼料中でのそれらの使用も開示している。プロテアーゼＩはアスペルギロペプシンII型プロテアーゼであり、そしてプロテアーゼIIはアスペルギロペプシンＩ型プロテアーゼであり（共にアスパラギン酸プロテアーゼ、すなわち非ズブチリシンプロテアーゼである）、これらはアスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）由来である（上文で言及したHandbook of Proteolytic Enzymesを参照のこと）。
【０１４２】
試験物質、いわゆるダイズ残留物は、ｐＨ２でのペプシン処理、及びｐＨ７でのパンクレアチン処理を含む、単胃動物の消化管を模倣した過程で生成した。
【０１４３】
パンクレアチン処理段階において、様々な市販酵素が、存在している市販酵素にとって接近可能なＳＢＭ成分を分解するために大量に加えられた。
【０１４４】
全てNovozymes A/S(Denmark)から購入可能な次の酵素が加えられた：ALCALASE（商標）2.4L、NEUTRASE（商標）0.5L、FLAVOURZYME（商標）1000L、ENERGEX（商標）L、BIOFEED（商標）Plus L、PHYTASE NOVO（商標）L。使用したＳＢＭは、ペレット化された、飼料にとって標準的な４８％タンパク質ＳＢＭとした。
【０１４５】
当該処理後、全タンパク質のわずかに５％が生じたダイズ残留物中に残された。
【０１４６】
ＦＩＴＣ標識プロトコール
前記残留物は、引き続き以下のようにＦＩＴＣ（Molecular Probes, F-143）で標識された：ダイズ残留物（２５ｇの湿重量、〜５ｇの乾燥重量）を１００ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９、中で懸濁され、そして４０℃で１時間撹拌された。懸濁液をフルオレセイン５−イソチオシアネート(FITC)で一晩、暗室で処理された。カップリングしていないプローブは限外濾過（１０，０００Ｍｗのカットオフ値）によって除去した。
【０１４７】
ＦＩＴＣアッセイ
ＦＩＴＣ標識したダイズ残留物は、次のアッセイを用いてダイズ残留物を分解するプロテアーゼの能力を試験するために使用した：０．４ｍｌのプロテアーゼ試料（Ａ280＝０．１を有する）を、０．４ｍｌのＦＩＴＣダイズ残留物（ｐＨ６．５の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌの懸濁液）と３７℃で混合し、そしてインキュベーションの０時間後、そして２２時間後に相対的な蛍光単位（ＲＦＵ４８５／５３５ｎｍ；励起／モニタリング波長）を測定した。ＲＦＵの決定の前に、試料を２０，０００×Ｇで１分間遠心し、そして２５０μｌの上清を黒いマイクロタイタートレーに移した。測定はVICTOR 1420 Multilabel counter(in vitro, Denmark)を用いて実施した。ＲＦＵはIain D. JohnsonによってIntroduction to Fluorescence Tecniques, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Richard P. Haugland, 6th edition, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7)において広く記載されている。
【０１４８】
ブラインド試料は、０．４ｍｌの緩衝液を酵素試料の代わりに加えることによって調製した。
ＲＦＵ試料＝ΔＲＦＵ試料−ΔＲＦＵブラインド（ここで、ΔＲＦＵ＝ＲＦＵ（２２時間）−ＲＦＵ（０時間）である）
【０１４９】
生じたＦＩＴＣ値（ＲＦＵ試料値）を以下の表３に示す。ＦＩＴＣ値は、一般的に＋／−２０，０００の許容誤差を有する。プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIと反対に、バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼは有効な程度までダイズ残留物を分解した。
【表７】
【０１５０】
例４
バチルス sp. NCIMB40484 由来のプロテアーゼの in vitro での試験
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼは、他のズブチリシンプロテアーゼ、例えばSub. Novo、SubNovo(Y217L)、SAVINASE（商標）及びALCALASE（商標）と一緒に、in vitroでの消化系（単胃動物の消化を模倣したもの）におけるトウモロコシ−ＳＢＭ（トウモロコシ−ダイズ粉）タンパク質を可溶化するその能力について試験された。ブランクの処理のために、トウモロコシ−ＳＢＭを外来性ズブチリシン様プロテアーゼの非存在下でインキュベートした。
【０１５１】
前記のin vitroの系は、３０個のフラスコから構成され、この中で、トウモロコシ−ＳＢＭが最初にＨＣｌ／ペプシン（胃での消化を模倣したもの）と、そして次にパンクレアチン（腸での消化を模倣したもの）と一緒にインキュベートされた。胃でのインキュベーション期間の終わりに、in vitroでの消化物の試料が除去され、そして可溶化されたタンパク質について解析された。
【０１５２】
基質
トウモロコシ−ＳＢＭの比率が６：４（ｗ／ｗ）の１０ｇのトウモロコシ−ＳＢＭ食餌を使用した。タンパク質含量はＳＢＭ中で４３％（ｗ／ｗ）であり、そしてトウモロコシ粉中で８．２％（ｗ／ｗ）であった。１０ｇのトウモロコシ−ＳＢＭ食餌中のタンパク質の合計量は２．２１ｇであった。
【０１５３】
消化酵素
ペプシン（Sigma P-7000; 539U/mg、固体）、パンクレアチン（Sigma P-7545; 8xU.S.P. (US Pharmacopeia)）。
【表８】
【０１５４】
酵素タンパク質の決定
プロテアーゼ酵素タンパク質の量は、S. C. Gill & P. H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989)で概説されている原理を用いて、Ａ280値及びアミノ酸配列（アミノ酸組成）に基づいて計算される。
【０１５５】
in vitro モデルのための実験手順
１． １０ｇの基質を１００ｍｌのフラスコに量り入れる。
２． ０分時に、ペプシン（３０００Ｕ／ｇ食餌）及び１ｍｌのプロテアーゼ（０．１ｍｇ酵素タンパク質／ｇ食餌）を含む４６ｍｌのＨＣｌ（０．１Ｍ）を混合しながら加える。フラスコを４０℃でインキュベートする。
３． ３０分時に、ｐＨを測定する。
４． ４５分時に、１６ｍｌのＨ2Ｏを加える。
５． ６０分時に、７ｍｌのＮａＯＨ（０．３９Ｍ）を加える。
６． ９０分時に、パンクレアチン（８．０ｍｇ／ｇ食餌）を含む５ｍｌのＮａＨＣＯ3（１Ｍ）を加える。
７． １２０分時に、ｐＨを測定する。
８． ３００分時に、ｐＨを測定する。
９． ３２０分時に、３０ｍｌのアリコートを除去し、そして遠心する（１００００×Ｇ、１０分、４℃）。
上清を除去し、そして−２０℃で保存する。
【０１５６】
ゲル濾過ＨＰＬＣによる可溶化されたタンパク質の推定
in vitroで消化された試料に由来する上清中の可溶化されたタンパク質の含有量は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用いて粗製タンパク質（ＣＰ）を定量することによって推定した。上清を融解し、０．４５μのポリカーボネートフィルター（Sartorius）を介して濾過し、そしてＨ2Ｏで希釈した（１：５０、ｖ／ｖ）。希釈した試料は、Superdex Peptide PE（７．５×３００ｍｍ）ゲル濾過カラム（Global）を用いて、ＨＰＬＣによりクロマトグラフィーにかけた。定組成溶出に使用した溶出液は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）とした。一回の操作当たりの溶出液の合計量は２６ｍｌであり、そして流速は０．４ｍｌ／分であった。溶出プロファイルは、２１４ｎｍで記録し、そしてプロファイル下の全面積は積分によって決定した。積分した面積からタンパク質含量を推定するために、検量曲線（Ｒ2＝０．９９９３）が、既知の合計タンパク質含量を有するin vitroで消化した参照トウモロコシ−ＳＢＭ試料の一連の希釈液から作成された。この参照試料におけるタンパク質の決定は、ケルダール法によって実施された（窒素（％）の決定；A. O. A. C., (1984), Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)。
【０１５７】
結果
in vitroでのタンパク質溶解性に対する様々なプロテアーゼの結果、すなわち効果を、以下の表４に示す。
【０１５８】
可溶化されたタンパク質の相対的な量の計算は、in vitroでの消化反応の間に、合計量７５ｍｌに溶解した１０ｇのトウモロコシ−ＳＢＭ食餌中のタンパク質の合計量（２．２１ｇタンパク質）を基にしている。完全なタンパク質の可溶化（１００％）を仮定すると、上清中のタンパク質含量は、体積当たり２．９５％重量であろう。
【０１５９】
当該結果は、Ｐ＝０．０００１の分散の一方向解析によって解析された。ＳＤ＝標準偏差；ｎ＝処理当たり反復の回数（ｎ＝５）。
【０１６０】
バチルスｓｐ．ＮＣＩＭＢ４０４８４由来のプロテアーゼは、他のプロテアーゼと比較した場合に、タンパク質の可溶化に対して有意なより優れた効果を有する。
【表９】
【０１６１】
例５
レクチンＳＢＡ並びにダイズ Bowman-Birk 及び kunitz 阻害剤の分解
バチルスｓｐ．ＮＣＩＭＢ４０４８４由来のプロテアーゼの、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）並びにダイズBowman-Birk及びkunitzトリプシン阻害剤を加水分解する能力が試験された。
【０１６２】
純粋ＳＢＡ（Fluka 61763）、Bowman-Birk阻害剤（Sigma T-9777）又はkunitz阻害剤（ダイズ由来のトリプシン阻害剤、Boehringer Mannheim 109886）を、前記プロテアーゼと一緒に３７℃で２時間、ｐＨ６．５でインキュベートした（プロテアーゼ：抗栄養因子＝１：１０、Ａ280に基づく）。インキュベーション緩衝液：５０ｍＭジメチルグルタル酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ６．５。
【０１６３】
ＳＢＡ及びプロテアーゼ阻害剤を分解するプロテアーゼの能力は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の天然ＳＢＡ及びトリプシン阻害剤のバンドの消失並びに低分子量分解産物の出現から推定した。ゲルはクーマシーブルー染色し、そしてバンドの強度をスキャニングによって決定した。
【０１６４】
分解した抗栄養因子の％としての結果を、以下の表５に示す。
【０１６５】
ダイズ中の抗栄養因子を分解する能力はまた、ダイズ粉と候補プロテアーゼとのインキュベーション後に、ＳＢＡ、Bowman-Birk阻害剤又はkunitz阻害剤に対する抗体を用いるウェスタン技術を利用することによって推定され得る（WO98/56260を参照のこと）。
【表１０】
【０１６６】
例６
更に酸安定性のズブチリシンの調製
バチルス・アルカロフィラスプロテアーゼの調製
凍結乾燥した培養物に由来するバチルス・アルカロフィラスNCIMB10438が、以下の組成を有する１００ｍｌのＢＰＸ培地を含む振とうフラスコ内に接種された：水道水中、ジャガイモデンプン１００ｇ／ｌ、オオムギ粉５０ｇ／ｌ、ＢＡＮ８００ＭＧ（Novozymes A/Sから入手可能）０．０５ｇ／ｌ、カゼイン酸ナトリウム１０ｇ／ｌ、ダイズ粉２０ｇ／ｌ、リン酸二ナトリウム９ｇ／ｌ、Pluronic PE 6100 0.1ml/l。ｐＨは、接種前に各振とうフラスコフラスコ中で、１０ｍｌの１Ｍセスキ炭酸ナトリウムを用いてｐＨ９．７に調整された。菌株は、３０℃、３００ｒｐｍで４日間醗酵された。この培養物を、１０ｍｌのＢＰＸ培地を含む新しい振とうフラスコに接種し、そして３日間醗酵した。
【０１６７】
精製
１Ｌビーカー中の培養液を１００００×ｇで３０分間遠心した。上清を合わせ、そして更にSeitz K-250 depthフィルタープレートを通過する濾過によって清澄にした。透明な濾液を３ｋＤａカットオフポリエーテルスルホンカセット（Filtron)上での限外濾過によって濃縮した。濃縮した酵素を、G25 Sephadexカラム(Amersham Pharmacia Biotech)上で、50mM H3BO3、5mM 3,3'-ジメチルグルタル酸、1mM CaCl2,pH7（緩衝液Ａ）に移し、そして緩衝液Ａ中で平衡化したバシトラシンアガロースカラム(Upfront Chromatography A/S)にかけた。結合していないタンパク質を除去するために緩衝液Ａでバシトラシンかラムを洗浄した後、前記プロテアーゼは、２５％２−プロパノール及び１Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ａを用いてカラムから溶出した。プロテアーゼ活性を有するバシトラシンカラム由来の画分を集め、そしてG25 Sephadexカラム(Amersham Pharmacia Biotech)上でのクロマトグラフィーによって20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2、pH4.5（緩衝液Ｂ）に移した。緩衝液を交換したプロテアーゼのプールを、緩衝液Ｂで平衡化したSOURCE 30Sカラム(Amersham Pharmacia Biotech)にかけた。緩衝液ＢでSOURCE 30Sカラムを洗浄した後、緩衝液Ｂ中の直線ＮａＣｌ勾配（０〜０．５Ｍ）を増大させてプロテアーゼを溶出した。カラム由来の画分をプロテアーゼ活性について試験し、そしてプロテアーゼ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。純粋な画分を集め、そして更なる特徴付けに使用した。
【０１６８】
他の酸安定性ズブチリシンの調製
フサリウム・オキシスポラムIFO 4471；バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438；パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンスATCC 20338のプロテアーゼは、バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438のプロテアーゼに関して一般的に記載されている、常用の方法を用いて調製した。
【０１６９】
配列
次の部分的なアミノ酸配列が決定された：
配列番号１
アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272由来のプロテアーゼのＮ末端：ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSYIY；
配列番号２
バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438由来のプロテアーゼのＮ末端：NQVTPWGITRVQAPTAW；
配列番号３
パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449由来のプロテアーゼのＮ末端：AYTQQPGAPWGLGRISH；
配列番号 4
フサリウム・オキシスポラムIFO 4471由来のプロテアーゼのＮ末端：ALTTQSGATWGLGTVSHRSRGS.
【０１７０】
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼのアミノ酸配列である、本明細書の配列番号５は、既に決定されている（米国特許第５，６５０，３２６号の配列番号４，６及び８を参照のこと）。
【０１７１】
関連配列についての公的なタンパク質のデータベースのサーチは、次の事を明らかにした：
配列番号６
Geneseqp/r65936（EP 623672のパエシロマイセス・リラシナスCBS143.75のプロテアーゼを引用）−配列番号３と関連。
配列番号７
Geneseqp/r74334（JP-07095882のバチルスsp.THS-1001のプロテアーゼを引用）−配列番号２と関連。
【０１７２】
パエシロマイセス・リラシナス及びアスペルギルスsp.の菌株は、ブダペスト条約に従い、特許手続のための微生物の寄託の国際承認により、Centraalbureau voor Schmmelcultures (CBS), P. O Box 273, 3740 AG Baarn, The Netherlandsに以下の通りに寄託された。
寄託日：２０００年１月１７日
ＣＢＳ番号：アスペルギルスsp. 102448
寄託日：２０００年１月１７日
ＣＢＳ番号：パエシロマイセス・リラシナス102449
【０１７３】
当該寄託はNovozyme A/Sによって行われ、そして後にHoffmann-La Roche AGに譲渡された。
【０１７４】
当該寄託はNovozyme A/Sによって行われ、そして後にHoffmann-La Roche AGに譲渡された。
【０１７５】
例７
更なるズブチリシンプロテアーゼの特徴付け及び比較研究
バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438；フサリウム・オキシスポラムIFO 4471；パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンスATCC 20338から調製したプロテアーゼは、全てズブチリシンである。
【０１７６】
当該プロテアーゼ試料の純度は、例２に記載の通りに決定した。次の結果が得られた。
【表１１】
【０１７７】
アッセイ
ｐＨ−活性、ｐＨ−安定性、及び温度−活性のアッセイは例２に記載されている（pNA基質Suc-AAPF-pNA(Sigma S-7388)はｐＨ−活性及び−安定性のプロファイルのために、全てのプロテアーゼについて使用したが、プロタザイムＡＫ錠は温度のプロファイルに使用した）。
【０１７８】
至適活性（ｐＨ−及び温度−活性）の概要を表６に示す。ｐＨ−活性、ｐＨ−安定性、及び温度−活性のプロファイルは図４〜６に示し、そして酸性ｐＨ値での当該プロテアーゼのｐＨ−安定性のデータの詳細な比較は、表７に示す。
【表１２】
【表１３】
【０１７９】
例８
ストレプトミセスズブチリシン阻害剤 (SSI) によるプロテアーゼの阻害
pNA基質:Suc-AAPF-pNA(Sigma（商標）S-7388)が、阻害後の残留活性を測定するのに使用された。
アッセイ緩衝液：１００ｍＭコハク酸（Merck 100682）、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma H-3375）、１００ｍＭ ＣＨＥＳ（Sigma C-2885）、１００ｍＭ ＣＡＢＳ（Sigma C-5580）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、ｐＨ９．０。
アッセイ温度：２５℃
【０１８０】
SSIは、ストレプトミセス・アルボグリセオラス（Streptomyces albogriseolus)FERM P-1205(S-3253)の醗酵液の上清から、クロマトグラフィーによって精製した。使用したSSI調製物は、９５％超の純度を有しており、当該純度は例２Ａに記載の手順によって決定した。あるいは、SSIは日本のwakoから、カタログ番号303-05201で入手することもできる（製造業者Daiwa Kasei k.K.)（例えば、http://search.wako-chem.co.jp/lifeb e/lifedocs e/44834.aspを参照のこと）。
【０１８１】
次の阻害アッセイの前に、SSIを０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でＡ280
濃度＝０．０１０まで希釈した。
プロテアーゼ：使用したプロテアーゼは９５％超の純度を有しており、当該純度は例２Ａに記載の手順によって決定した。次の阻害アッセイの前に、当該プロテアーゼを０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でＡ280 濃度＝０．０１０まで希釈した。
【０１８２】
ストレプトミセスズブチリシン阻害剤(SSI)による当該プロテアーゼの阻害は、以下の手順で決定した。
【０１８３】
３００μのプロテアーゼ試料（Ａ280 濃度＝０．０１０）を、３００μｌのSSI（Ａ280 濃度＝０．０１０）及び１．５ｍｌのアッセイ緩衝液と混合した。室温での１５分間のインキュベーション後、残留活性は１．５ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇのものを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中で希釈し、そして０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で４５倍に希釈した）を加えることによって測定され、そして混合後、Ａ405の増大を分光光度計によってモニタリングした。コントロール（SSI無し）として、３００μｌの０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をSSIの代わりに使用した。
【０１８４】
残留活性はコントロール活性（SSI無し）で標準化し、すなわちSSIによる阻害無しは１００％の残留活性を示し、そしてSSIによる完全な阻害は０％の残留活性を示す。次の結果が得られた。
【表１４】
【０１８５】
例９
更に酸安定性ズブチリシンの、ダイズ粉（ＳＢＭ）の不溶性部分を分解する能力
例６に記載の様に調製した更に酸安定性ズブチリシンは、不溶性／消化不能部分を、消化酵素及び／又は加えられた外来性酵素にとって接近可能にする能力について、例３に記載の様に試験された。
【０１８６】
得られた結果を以下の表８に示す。比較のために、プロテアーゼＩ及びIIについて例３で得られた結果を更に表８に含める。
【表１５】
【０１８７】
例１０
ブロイラーのニワトリの成長能力に対するバチルス sp. NCIMB 40484 由来の酸安定性ズブチリシンの効果
生きている動物を用いる実験のための公的なフランスの指南書に従う試みを、Roche Research Center for Animal Nutrition (CRNA, F-68305 Village-Neuf, France)で行う。性別毎に分けられた、生まれて１日目のブロイラーのニワトリ（「Ross PM3」）は、商業的な孵化場から供給される。
【０１８８】
ニワトリは、環境的に調節された部屋に維持されている、ワイヤーが床に敷かれたバッテリーケージ内で飼育する。試料及び水道水は適宜供給する。
【０１８９】
８日目に、ニワトリを体重毎に６匹のニワトリの群に分け、これを酵素無しの実験用食餌を受けるコントロール処理、又は飼料１ｋｇ当たり１００ｍｇのバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼの酵素タンパク質を添加した実験用食餌を受ける酵素処理のいずれかが割り当てられた。
【０１９０】
各処理は、各性別毎に６つの群の、１２の群で繰り返された。当該群は８日目及び２９日目に秤量された。中間期の飼料消費量が決定され、そして体重の増加及び飼料変換率が計算された。
【０１９１】
実験食餌は、主成分としてトウモロコシデンプン及びダイズ粉（４４％粗製タンパク質）（表９）CRNAで製造された。飼料は約７０℃でペレット化された（ダイの構成：３×２０ｍｍ）。適当な量のバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼを一定量の水で希釈し、そしてペレット化された飼料に噴霧した。コントロール処理の場合、適切な量の水が同様の方法で当該処理を扱うために使用された。
【０１９２】
統計的な評価のために、２つの変動因子の解析（因子：処置及び性別）が、ＳＡＳパッケージのＧＬＭプロシージャ（SAS Institute Inc., 1985)を用いて実施された。有意な処置効果（ｐ＜０．０５）が示唆された場合、処置平均間の差異はダンカン試験で解析した。技術的な理由により、前記酵素処理の１つのケージは統計的な評価から除外された。
【０１９３】
表２において、８日目から２９日目までのブロイラーのニワトリの成長能力についての結果を列記する。処置と性別の間に相互関係は存在せず、それ故に両性別の集計結果を示す。バチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼによる実験食餌の補足は、数字の上で６．６％体重増加を改善した。当該プロテアーゼの追加は、飼料の摂取をわずかに３．１％増加させた。バチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼは、ブロイラーのニワトリの飼料変換をわずかに３．４％改善した。
【０１９４】
トウモロコシデンプンが高度に消化可能な成分であることを考慮して、観察された効果が、主にダイズ粉に対する当該酵素の作用によるものであると考えられる。従って、当該結果は、ダイズ分の栄養価がバチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼによって向上したことを示した。
【０１９５】
結論として、当該研究は、大量のダイズ粉を含有するブロイラー飼料への、バチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼの１００ｍｇ酵素タンパク質／ｋｇ飼料での添加が、体重増加の数字上の増大及び飼料変換の有意な改善をもたらしたことを証明した。
【０１９６】
引用文献
EEC(1986):Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la methode de calcul de la valeur energetique des aliments composes destines a la volaille. Journal Officiel des Communautes Europeennes, L130, 53-54
SAS Institute Inc. (1985):SAS（商標）User's Guide, Version 5 Edition. Cary NC
【表１６】
【０１９７】
飼料成分の供給元
【表１７】
【表１８】
【０１９８】
例１１
酸安定性ズブチリシンプロテアーゼを添加したシチメンチョウ及びサケのためのプレミックス及び食餌
次の組成のプレミックスを調製する（１ｋｇ当たりの含量）：
【表１９】
【０１９９】
このプレミックスに対して、例２に記載のように調製したバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼを、１０ｇのプロテアーゼ酵素タンパク質／ｋｇに相当する量で加える。
【０２００】
以下の表（Leeson and Summers, 1997を基にしたものであるが、最適化プログラムであるAGROSOFT（商標）を用いることによって肉粉無しで再計算がされた）に示す組成を有し、そして１ｋｇ当たり１００ｍｇのプロテアーゼ酵素タンパク質を有する、ペレット化したシチメンチョウの開始用食餌及び生育用食餌を以下のように調製する：
【０２０１】
製粉したトウモロコシ、ダイズ粉、魚粉及び植物性脂肪をカスケードミキサー内で混合する。石灰岩、リン酸カルシウム及び塩１０ｇ／ｋｇ食餌の量の上記プレミックスと一緒に加え、続いて混合する。生じた混合物をペレット化する（蒸気条件にペレット化段階が続く）。
【表２０】
【０２０２】
サケ用の２つの食餌が、上文で広く概説されているように更に調製される。実際の組成を以下の表に示す（Refstie et al(1998), Aquaculture, vol.162, p.301-302から編集した)。推定される栄養分は、AGROSOFT（商標）の飼料最適化プログラムを用いることによって再計算される。
【０２０３】
例２に記載のように調製したバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼが、１ｋｇ当たり１００ｍｇのプロテアーゼ酵素タンパク質に相当する量で食餌に加えられる。
【表２１】
【０２０４】
例１２
プロテアーゼ含有酵素産物の純度の決定
プロテアーゼ含有酵素産物、例えばプロテアーゼ調製物、例えば市販の多成分酵素産物の純度が、サイズ排除カラム上でのプロテアーゼ含有酵素産物の分画に基づいた方法によって決定されうる。ゲル濾過クロマトグラフィーとしても知られるサイズ排除クロマトグラフィーは、サイズにおいて分離され得るタンパク質分子に匹敵する孔のサイズ分布を有する、多孔性ゲルマトリックス（カラム内に詰め込まれる）を基にしている。比較的小さいタンパク質分子は、周囲の溶液からゲルの内部に拡散することがあり、一方、より大きな分子は、それらのサイズによって、同程度までゲル内部に拡散することが妨害されるだろう。結果として、タンパク質分子は、それらのサイズに従い、より大きな分子と分離され、より小さいものより前に当該カラムから溶出する。
【０２０５】
タンパク質濃度アッセイ
プロテアーゼ含有酵素産物のタンパク質濃度は、PIERCEのBCAタンパク質アッセイキット（PIERCEのカタログ番号２３２２５と同一のもの）によって決定される。ビシンコニン酸のナトリウム塩（ＢＣＡ）は、アルカリ性の環境で第一銅イオン（Ｃｕ1+）と強力な紫色の複合体を形成し得る、安定な水溶性化合物である。ＢＣＡ試薬は、タンパク質とアルカリＣｕ2+の反応（ビウレット反応）で産生する第一銅イオンをモニタリングし得るＢＣＡタンパク質アッセイキットの根底を成す。この反応から生まれる色は安定性があり、そしてタンパク質濃度の増大と共に比例の態様で増大する（Smith, P. K., et al. (1985), Analytical Biochemistry, vol. 150, pp 76-85）。ＢＣＡ検量用溶液は、５０部の試薬Ａと１部の試薬Ｂを混合することによって作成される（試薬ＡはPIERCEのカタログ番号２３２２３であり、アルカリ性炭酸緩衝液中にＢＣＡ及び酒石酸塩を含み；試薬ＢはPIERCEのカタログ番号２３２２４であり、４％ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏを含む）。３００μｌの試料が３．０ｍｌのＢＣＡ検量用溶液と混合される。３７℃で３０分放置した後、当該試料を室温に冷却し、そしてＡ490を当該試料中のタンパク質濃度の測定値として読み取る。ウシ血清アルブミン（PIERCEのカタログ番号２３２０９）の希釈液をスタンダードとして本アッセイに含める。
【０２０６】
試料の前処理
プロテアーゼ含有酵素産物が固体である場合、当該産物は、最初に２０倍量の１００ｍＭ Ｈ3ＢＯ3、１０ｍＭ ３，３’−ジメチルグルタル酸、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ６（緩衝液Ａ）中で少なくとも１５分間、５℃で溶解／懸濁され、そしてこの段階での酵素が懸濁液である場合、当該懸濁液は０．４５μのフィルターで濾過され、透明な溶液を与える。当該溶液は、この時点から、液体プロテアーゼ含有酵素産物として処理される。
【０２０７】
当該プロテアーゼ含有酵素産物が液体である場合、当該産物は最初に６〜８０００Ｄａのカットオフ値の、SpectraPorの透析チューブ（Spectrum Medical Industriesのカタログ番号１３２ ６７０）内で、１００倍量の緩衝液Ａ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）に対して、プロテアーゼ含有酵素産物を高粘度にし得る、サイズ排除クロマトグラフィーにとって有害な製剤化合物を除去するために５℃で少なくとも５時間透析される。
【０２０８】
透析されたプロテアーゼ含有酵素産物は、沈殿物が透析の間形成した場合、０．４５μのフィルターを介して濾過される。透析された酵素産物のタンパク質濃度は、上述のタンパク質濃度アッセイで決定され、そして当該酵素産物は緩衝液Ｂで希釈され、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するサイズ排除クロマトグラフィーに直ちに使用可能な試料を与える。当該酵素産物が５ｍｇ／ｍｌ未満のタンパク質濃度を透析後に有する場合、そのままで使用される。
【０２０９】
サイズ排除クロマトグラフィー
３００ｍｌのHiLoad26/60 Superdex75pgカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を緩衝液Ｂで平衡化する（流速：１ｍｌ／分）。１．０ｍｌのプロテアーゼ含有酵素試料をカラムに適用し、そして当該カラムを緩衝液Ｂで溶出する（流速：１ｍｌ／分）。２．０ｍｌの画分を、適用した試料全てがカラムから溶出されるまで、カラムの出口から回収する。回収した画分は、適当なアッセイによってタンパク質含量（上文のタンパク質濃度アッセイを参照のこと）及びプロテアーゼ活性について解析される。適当なアッセイの例はSuc-AAPF-pNAアッセイである（例２Ｂを参照のこと）。他の適当なアッセイは、例えばCPUアッセイ（例１を参照のこと）、及びプロタザイムＡＫアッセイ（例２Ｄを参照のこと）である。プロテアーゼ活性アッセイについての条件、例えばｐＨは、分画された試料中の、出来る限り多くのプロテアーゼを測定できるように調整される。上文で言及したアッセイの条件は、適当な条件の例である。他の適当な条件は、上記のプロテアーゼ活性の測定を扱う項目で挙げられている。１又は複数のプロテアーゼアッセイにおける活性を有するタンパク質のピークは、プロテアーゼピークとして定義される。プロテアーゼピークの純度は、全ての同定されたプロテアーゼピーク中の全タンパク質量で割ったピークのタンパク質量として計算される。
【０２１０】
プロテアーゼ含有酵素産物の純度は、上記の手順を用いて、全ての同定されたプロテアーゼピーク中のタンパク質量で割った酸安定性プロテアーゼピーク中のタンパク質量として計算される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、３７℃の温度、及びｐＨ２〜ｐＨ１１の範囲のｐＨ値での、２時間のインキュベーション後の、４つのプロテアーゼ（バチルスsp. NCIMB40484由来のズブチリシンファミリーの１つの酸安定性プロテアーゼ(PD498)、及び３つの参照プロテアーゼ（Sub. Novo、及びSub. Novo(Y217L)（共にバチルス・アミロリクエファシエンス由来）、及びSAVINASE（商標））の、ｐＨ−安定性曲線、すなわち残留プロテアーゼ活性を示す；当該活性はｐＨ９．０、及び５℃での２時間のインキュベーション後の残留活性に関連する。
【図２】 図２は、ｐＨ３〜ｐＨ１１の間のｐＨ−活性曲線、すなわちプロテアーゼ活性を示し、これは同じ４つのプロテアーゼの至適ｐＨでのプロテアーゼ活性と関連する。
【図３】 図３は、１５℃から８０℃の間の、ｐＨ９．０での温度−活性曲線、すなわちｐＨ９．０でのプロテアーゼ活性を示し、これは同じ４つのプロテアーゼの至適温度でのプロテアーゼ活性に関連する。
【図４】 図４は、図１に類似しているが、バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438、フサリウム・オキシスポラムIFO 4471、パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンスATCC 20338由来のズブチリシンファミリーの、６つの他の酸安定性プロテアーゼについてのｐＨ−安定性曲線を示す。
【図５】 図５は図２に類似しているが、図４と同じプロテアーゼについてのｐＨ−活性曲線を示す。
【図６】 図６は、図３に類似しているが、図４と同じプロテアーゼについての、ｐＨ９．０での温度−活性曲線を示す。
技術分野
本発明は、動物飼料におけるズブチリシンファミリーの酸安定性セリンプロテアーゼの使用（in vivo)、及び植物タンパク質を処理するための当該プロテアーゼの使用(in vitro)に関する。
【０００２】
タンパク質は動物及びヒトにとって必須の栄養因子である。多くの家畜及び多くの人間は、植物タンパク質源から必須タンパク質を摂取する。重要な植物タンパク質源は、例えば脂肪種子植物、マメ科植物及び穀物である。
【０００３】
例えば、ダイズ粉が単胃動物、例えばブタ及び家禽の飼料中に含まれる場合、かなりの比率の当該ダイズ粉の固体が消化されない。例えば、子ブタ及び成長期のブタにおける、見かけ上の回腸におけるタンパク質の消化率は、約８０％に過ぎない。
【０００４】
単胃動物及び多くの魚の胃は、強酸性のｐＨを示す。しかしながら、多くのタンパク質消化が小腸で起こる。従って、胃の通過で生存し得る酸安定性プロテアーゼについての必要性が存在している。
【０００５】
背景技術
動物飼料における、そして植物タンパク質の処理のためのプロテアーゼの使用は以下の文書によって知られている。
【０００６】
WO95/28850は、フィターゼ及びタンパク質分解酵素を含んで成る動物飼料添加物を開示している。様々なタンパク質分解酵素がｐ．７に詳述されている。
【０００７】
WO96/05739は、キシラナーゼ及びプロテアーゼを含んで成る動物飼料添加物を開示している。適当なプロテアーゼがｐ．２５に列挙されている。
【０００８】
WO95/02044はアスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus aculeatus)由来のプロテアーゼ及び動物飼料におけるその使用を開示している。
【０００９】
US3966971は酸性フィターゼ及び、任意にタンパク質分解酵素を用いる処理によって、植物タンパク質源からタンパク質を得る方法を開示する。適当なプロテアーゼは２段目に記載されている。
【００１０】
US4073884, US5047240, US3868448, US3823072, 及びUS3683069 は、ストレプトミセスの様々な菌株に由来するプロテアーゼ調製物及び動物飼料におけるそれらの使用を記載している。
【００１１】
しかしながら、これらのプロテアーゼは酸安定性ではなく、そして／あるいはズブチリシンファミリーのプロテアーゼではない。
【００１２】
本発明の簡単な説明
非常に酸安定性であり、そして動物飼料において向上した性能が期待される複数のプロテアーゼが今回同定された。これらのプロテアーゼはズブチリシンとして知られているプロテアーゼ群に属する。
【００１３】
本発明の詳細な説明
用語プロテアーゼは、本明細書で使用する場合、ペプチド結合を加水分解する酵素である（プロテアーゼ活性を有する）。プロテアーゼはまた、例えばペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ペプチド加水分解酵素、又はタンパク質分解酵素と称される。
【００１４】
本発明に従う使用にとって好ましいプロテアーゼは、ポリペプチド鎖の内部に作用するエンド型のものである（エンドペプチダーゼ）。エンドペプチダーゼは問題のプロテアーゼの特異性に関連する、Ｎ末端及びＣ末端でブロッキングされているペプチドの基質に対する活性を示す。
【００１５】
上文のプロテアーゼの定義に含まれるものに、定期的に補充され、そして更新されるECリスト（Enzyme Nomenclature 1992 from NC-IUBMB, 1992)のEC3.4酵素群（それらの１３個のサブクラスのいずれかを含む）に属する任意な酵素である。例えば、http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.のワールドワイドウェブ(www)を参照のこと。
【００１６】
プロテアーゼは、それらの触媒機構に基づいて以下の群：セリンプロテアーゼ（Ｓ）、システインプロテアーゼ（Ｃ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ）、メタロプロテアーゼ（Ｍ）、及び未知のもの、又は現時点で分類されていないもの（Ｕ）、に分類される。Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998)の、特にgeneral introductionの項を参照のこと。
【００１７】
用語セリンプロテアーゼは、上記Handbookで定義されているセリンペプチダーゼ及びそれらの一群を言及する。
【００１８】
特定の態様において、セリンプロテアーゼは、触媒機構がペプチド結合を攻撃する求核試薬として働くセリン残基のヒドロキシル基に依存しているペプチダーゼである。
【００１９】
用語ズブチリシン又はズブチリシンファミリーは、本明細書で使用する場合、全てのＳＢ族セリンプロテアーゼ、特にそのＳ８ファミリーを含むことが意図される（ＳＢ族は上記Handbookの第９３章で扱われている）。ズブチリシンにおいて、触媒の３配列の並びはAsp-His-Serである。三次構造はアルファへリックス及びベータシートを共に含む。ＳＢ族はエンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼを共に含む。これらのペプチダーゼは細菌、古細菌及び真核生物を含み；そこにはＤＮＡウイルス由来の単一の代表者が存在する。
【００２０】
所定のプロテアーゼがズブチリシンであるか否かを決定するために、上記Handbook及びその中に示されている原則を参照すること。その様な決定は全ての型のプロテアーゼ、例えば天然又は野生型プロテアーゼ；あるいは遺伝子操作したプロテアーゼ又は合成プロテアーゼについて実施されることがある。
【００２１】
あるいは、阻害研究はＳＳＩ（ストレプトミセス（Streptomyes）ズブチリシン阻害剤）で実施されることもあり、そしてズブチリシンは一定のモル過剰のＳＳＩで阻害した場合に、最大１０％の残留活性を有するプロテアーゼとして定義される。この試験は例８に記載の様に実施され得る。この定義の特定の態様において、ズブチリシンは最大８％、最大６％、又は最大５％の残留活性を有する。「最大」の表現は「以下」の表現と同一であるとみなされる。
【００２２】
プロテアーゼ活性は、問題のプロテアーゼの特異性に関与するペプチド結合を含む基質が利用される、任意なアッセイを用いて測定され得る。アッセイｐＨ及びアッセイ温度も同様に問題のプロテアーゼに適合される。アッセイｐＨ値の例は、ｐＨ５，６，７，８，９，１０，又は１１である。アッセイ温度の例は２５，３０，３５，３７，４０，４５，５０，５５，６０，６５，又は７０℃である。
【００２３】
プロテアーゼ基質の例はカゼイン、及びｐＮＡ基質、例えばSuc-AAPF-pNA（例えばSigma S-7388から入手可能）である。このｐＮＡ基質の大文字は、１文字アミノ酸コードを表している。別の例はプロタザイムＡＫ（Megazyme T-PRAKによって錠剤として調製されたアズリン色素架橋型カゼイン）である。ｐＨ−活性及びｐＨ−安定性の研究にとってｐＮＡ基質が好ましく、一方、温度−活性研究の場合、プロタザイムＡＫ基質が好ましい。
【００２４】
プロテアーゼアッセイの例は、実験の項目に記載されている。
【００２５】
本発明に従う使用にとって、プロテアーゼの起源に対する限定は存在しない。従って、用語プロテアーゼは、天然又は野生型プロテアーゼだけでなく、プロテアーゼ活性を示すその任意な突然変異体、変異体、フラグメント等、並びに合成プロテアーゼ、例えば混合プロテアーゼ、及び共通プロテアーゼを含む。そのような遺伝子操作したプロテアーゼは、当業界で知られている様に、例えば部位指定突然変異導入、ＰＣＲ（ＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして、所望の突然変異を含むＰＣＲフラグメントを用いる）、又はランダム突然変異法によって調製され得る。共通タンパク質の調製は、例えばEP897985に記載されている。
【００２６】
本発明に従う使用のための、ズブチリシンファミリーの酸安定性プロテアーゼの例は、
(i)バチルス（Bacillus）sp. NCIMB40484、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）NCIMB10438；フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）IFO 4471；パエシロマイセス・リラシナス（Paecilomyces liliacinus）CBS 102449、アスペルギルス（Aspergillus）sp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）ATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンス（Acremonium kiliense）ATCC 20338由来のプロテアーゼ；
(ii) (i)のプロテアーゼの任意なものと少なくとも７０，７５，８０，８５，９０，又は少なくとも９５％同一のプロテアーゼ；
(iii) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のいずれかと少なくとも７０，７５，８０，８５，９０，又は少なくとも９５％同一のプロテアーゼ、
（iv）配列番号５（全配列１〜３９７、又はそのフラグメント２８〜３９７若しくは１１８〜３９７）、配列番号６（全配列１〜３６７、又はそのフラグメント７０〜３６７若しくは８４〜３６７）、又は配列番号７のいずれかと少なくとも７０，７５，８０，８５，９０，又は少なくとも９５％同一のプロテアーゼ、である。
【００２７】
同一性のパーセンテージを計算するために当業界で知られている任意なコンピュータープログラムが使用されることがあり、例えばＧＣＧバージョン８のプログラムパッケージにおいて提供されるGAPプログラム(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)（Needleman，S.B．and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453）である。GAPを用いる場合、次の設定値がポリペプチド配列の比較に使用される：５．０のGAPクリエーションペナルティ及び０．３のGAPエクステンションペナルティ。
【００２８】
特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは微生物のプロテアーゼであり、ここで、用語「微生物の(microbial)」は当該プロテアーゼが微生物(microorganism)に由来し、又はそれから派生すること、あるいは微生物に由来する類似体、フラグメント、変異体、突然変異体、又は合成プロテアーゼであることを示す。それは、本来の野生型微生物菌株、別の微生物菌株、又は植物において産生し又は発現することがあり、すなわち当該用語は野生型の、天然プロテアーゼの発現、並びに任意な宿主における組換え体の、遺伝子操作型又は合成のプロテアーゼの発現を網羅する。
【００２９】
用語「微生物」は、本明細書で使用する場合、古細菌、細菌、真菌、ウイルス(vira)等を含む。
【００３０】
微生物の例は、細菌、例えばバチルス属の細菌、例えばバチルスsp. NCIMB40484、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）NCIMB10438；あるいはプロテアーゼ活性を示す突然変異体又は変異株である。
【００３１】
微生物の更なる例は、真菌、例えば酵母又は糸状菌類、例えばパエシロマイセス属から選択されるもの、例えばパエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルス、例えばアスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム、例えばアクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、アクレモニウム・キリエンスATCC 20338、又はフサリウム、例えばフサリウム・オキシスポラムIFO 4471；あるいはプロテアーゼ活性を示す突然変異体又は変異株である。
【００３２】
別の態様において、当該プロテアーゼは植物プロテアーゼである。植物起源のプロテアーゼの例は、メロン果肉由来のプロテアーゼである(Kaneda et al., J. Biochem. 78, 1287-1296(1975))。
【００３３】
用語「動物」は、全ての動物、例えば人間を含む。動物の例は非反芻動物、及び反芻動物、例えばウシ、ヒツジ及びウマである。特定の態様において、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単胃動物、例えばブタ又はイノシシ（swine）（限定しないが、子ブタ、成長期のブタ、及び雌ブタを含む）；家禽類、例えばシチメンチョウ及びニワトリ（限定しないが、ブロイラーのニワトリ、産卵ニワトリを含む）；若いウシ；及び魚類（限定しないが、サケを含む）を含む。
【００３４】
用語「飼料」又は「飼料組成物」は、動物による摂取に適した、又はそれが意図される、任意の化合物、調製物、混合物、又は組成物を意味する。
【００３５】
本発明に従う使用において、前記プロテアーゼは、食餌の前、後、又はそれと同時に、動物に給餌されることがある。後者のものが好ましい。
【００３６】
本文において、用語「酸安定性」は、A280=1.0に相当する希釈液中での、そして次の緩衝液：
１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ HEPES、１００ｍＭ CHES、１００ｍＭ CABS、１ｍＭ CaCl2、１５０ｍＭ KCl、０．０１％ Triton（商標）X-100、ｐＨ３．５、において３７℃で２時間インキュベーションした後の、純粋なプロテアーゼ酵素のプロテアーゼ活性が、本明細書の例２Ｃに記載のアッセイ（基質：Suc-AAPF-pNA、ｐＨ９．０、２５℃）を用いて測定した場合、参照活性の少なくとも４０％であることを意味する。
【００３７】
上記の酸安定性の定義の特定の態様において、プロテアーゼ活性は参照活性の少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、又は少なくとも９０％である。
【００３８】
用語「参照活性」は、次の緩衝液：
１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ HEPES、１００ｍＭ CHES、１００ｍＭ CABS、１ｍＭ CaCl2、１５０ｍＭ KCl、０．０１％ Triton（商標）X-100、ｐＨ９．０、において５℃で２時間インキュベーションした後の、A280=1.0に相当する希釈中での、純粋な型の、同一プロテアーゼのプロテアーゼ活性であって、上述の様に決定される活性を言及する。
【００３９】
換言すると、酸安定性を決定する方法は、次の段階：
ａ）試験すべきプロテアーゼ試料（純粋型、A280=1.0）を２つのアリコート（Ｉ及びII）に分け；
ｂ）アリコートＩを３７℃及びｐＨ３．５で２時間インキュベーションし；
ｃ）アリコートＩの残留活性を測定し（ｐＨ９．０及び２５℃）；
ｄ）アリコートIIを５℃及びｐＨ９．０で２時間インキュベーションし；
ｅ）アリコートIIの残留活性を測定し（ｐＨ９．０及び２５℃）；
ｆ）アリコートIIに対して相対的なアリコートＩの残留活性（％）を計算すること、
を含んで成る。
【００４０】
あるいは、上文の酸安定性の定義において、段階ｂ）の緩衝液のｐＨの値は２．０、２．５、３．０、３．１、３．２、３．３、又は３．４であってもよい。
【００４１】
上文の択一的な段階ｂ）の緩衝液のｐＨ値に関連する上文の酸安定性の定義の、他の択一的な態様において、参照のものと比較した場合の残留プロテアーゼ活性は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％である。
【００４２】
別の態様において、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、又は８．５のｐＨ値は段階ｄ）の緩衝液に適用され得る。
【００４３】
上文の酸安定性の定義において、用語「A280=1.0」は、緩衝液ブランクと比較して、１ｃｍの光路長のキュベットにおいて、２８０ｎｍで１．０の吸収を生じせしめる様な前記純粋プロテアーゼの濃度（希釈）を意味する。
【００４４】
そして、上文の酸安定性の定義において、用語「純粋プロテアーゼ」は、１．７０以上のA280／A260比を有する試料であって（例２Ｅを参照のこと）、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャニングによって、前記プロテアーゼに相当するバンドのそのスキャニング強度の少なくとも９５％を有することが測定されるもの（例２Ａを参照のこと）を言及する。あるいは、A280／A260比は、１．５０、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５以上であるか、あるいは１．９０以上である。
【００４５】
しかしながら、本発明に従う使用のために、プロテアーゼは純粋である必要はなく；それは、例えば他の酵素、他のプロテアーゼでさえも含むことがあり、この場合、それはプロテアーゼ調製物と称されることがある。それでもなお、明確に定義されるプロテアーゼ調製物が有利である。例えば、本質的に他のプロテアーゼから妨害を受けない又はそれを混入していないプロテアーゼの用量（dose）を飼料に正確に添加するほうがより対処しやすい。用語「用量」は、正確に言えば、特に一貫性のある、且つ一定の結果を得る目的、及び所望の効果に基づいて添加量を最適化した容量を言及する。
【００４６】
特定の態様において、飼料に加えられる型の、又は飼料添加物に含められる場合のプロテアーゼは、明確に定義される。明確に定義される、は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合（例１２を参照のこと）、プロテアーゼ調製物が少なくとも５０％純粋であることを意味する。
【００４７】
他の特定の態様において、プロテアーゼ調製物は、この方法によって決定した場合、少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９４、又は少なくとも９５％純粋である。
【００４８】
あるいは、用語「明確に定義される」は、適切なサイズ排除クロマトグラフィーによるプロテアーゼ調製物の画分が、１つの主要なプロテアーゼ成分のみを明らかにしていることを意味する。
【００４９】
当業者は、どのように適切なサイズ排除クロマトグラフィーカラムを選択するかを知っている。当業者は、例えば、Amersham Pharmacia BiotechのHiLoad26/60 Superdex75pgカラム上で調製物を分画することによって開始することがある（例１２を参照のこと）。ピークがはっきりと分かれない場合、当業者は異なるカラム（例えば変更したカラムの粒子サイズ及び／又はカラムの長さを有するもの）を試すことがあり、そして／あるいは試料の体積を変更することがある。単純且つ一般的な試行錯誤の方法によって、当業者は、例１２に記載される様に実施される純度の計算に基づいた、十分な分解能（ピークの明確な分離）を有するカラムに到達するであろう。
【００５０】
当該プロテアーゼ調製物は、（ａ）飼料に直接加えられてもよく（又は植物タンパク質の処理工程で直接使用されてもよい）、あるいは（ｂ）１又は複数の中間組成物、例えば後に飼料に加えられる飼料添加物又はプレミックスの製造において使用されてもよい（又は処理工程で使用されてもよい）。上述した純度の程度は、上文の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに従い使用される、本来のプロテアーゼ調製物の純度を言及する。
【００５１】
この程度の純度を有するプロテアーゼ調製物は、特に組換え産生方法を用いて得ることができ、一方、それらは、当該プロテアーゼが伝統的な発酵法で産生される場合、そのように容易には得られず、そして更により大きなバッチ間の変動性にもさらされる。
【００５２】
その様なプロテアーゼ調製物は、当然のことながら、他の酵素と混合され得る。
【００５３】
１つの特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、酸安定性に加えて、中性に近い至適ｐＨ−活性も有する。
【００５４】
用語「中性に近い至適ｐＨ−活性」は、１又は複数の以下のこと：至適ｐＨがｐＨ６．０〜１１．０、又はｐＨ７．０〜１１．０、又はｐＨ６．０〜１０．０、又はｐＨ７．０〜１０．０、又はｐＨ８．０〜１１．０、又はｐＨ８．０〜１０．０の間にあることを意味する（本明細書の例２Ｂ及び７、並びに図２及び５を参照のこと）。
【００５５】
別の特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、酸安定性に加えて、熱安定性でもある。
【００５６】
用語「熱安定性」は、１又は複数の以下のこと：至適温度が少なくとも５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６６℃、６８℃、又は少なくとも７０℃であることを意味する（本明細書の例２Ｄ及び７並びに図３及び６を参照のこと）。
【００５７】
更に特定の態様において、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは本明細書の例４のin vitroモデルに従い、植物タンパク質を可溶化し得る。
【００５８】
用語「植物タンパク質」は、本明細書で使用する場合、植物由来又は起源の少なくとも１つのタンパク質、例えば修飾型タンパク質及びタンパク質誘導体を含む、任意の化合物、組成物、調製物又は混合物を言及する。特定の態様において、植物タンパク質のタンパク質含量は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０％（ｗ／ｗ）である。
【００５９】
植物タンパク質は、植物タンパク質源、例えばマメ科植物及び穀物類に由来してもよく、例えばマメ科（Fabaceae)（マメ科(Leguminosae）)、アブラナ科、アカザ科、及びイネ科の植物由来の材料、例えばダイズ粉、ルピナス粉及びナタネ粉に由来してもよい。
【００６０】
特定の態様において、植物タンパク質源はマメ科の１又は複数の植物、例えばダイズ、ルピナス、エンドウマメ、又はマメ由来の材料である。
【００６１】
別の特定の態様において、植物タンパク質源は、アカザ科の１又は複数の植物、例えばビート、テンサイ、ホウレンソウ又はキノア由来の材料である。
【００６２】
植物タンパク質源の他の例は、ナタネ、及びキャベツである。
【００６３】
ダイズは好ましい植物タンパク質源である。
【００６４】
植物タンパク質源の他の例は、穀物類、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、トウモロコシ（コーン）、コメ、及びモロコシである。
【００６５】
少なくとも１つの、ズブチリシンファミリーの酸安定性プロテアーゼを用いる植物タンパク質の本発明に従う処理は、植物タンパク質の可溶化の増大をもたらす。
【００６６】
以下のものは、本発明のプロテアーゼを用いて得られる可溶化タンパク質のパーセンテージの例である：少なくとも７６．８％、７７．０％、７７．２％、７７．４％、７７．６％、７７．８％、７８．０％、７８．２％、７８．４％、７８．６％、又は少なくとも７８．８％（本明細書の例４のin vitroモデルを参照のこと）。
【００６７】
用語「タンパク質の可溶化」は、基本的にタンパク質を溶液にすることを意味する。その様な可溶化は、通常複合体の、天然の組成物、例えば飼料の、他の成分からのプロテアーゼを介するタンパク質の放出に起因することがある。可溶化はプロテアーゼ処理をしていない試料と比較した場合の、可溶性タンパク質の量の増大として測定され得る（本明細書の例４を参照のこと）。
【００６８】
処理工程の特定の態様において、問題のプロテアーゼは、その植物タンパク質又はタンパク質源に対するその可溶化作用に影響する（又は働きかけ、又は影響を及ぼす）。これを達成するために、植物タンパク質又はタンパク質源は典型的に溶媒、例えば水性溶媒、例えば水の中で懸濁され、そしてｐＨ及び温度の値は、問題の酵素の特性に関して注意を払って調整される。例えば、当該処理は、実際のプロテアーゼの相対活性が少なくとも５０、又は６０、又は７０、又は８０、又は９０％である、ｐＨ値で行ってもよい。同様に、例えば、当該処理は、実際のプロテアーゼの相対活性が少なくとも５０、又は６０、又は７０、又は８０、又は９０％である、温度で行ってもよい（これらの相対活性は本明細書の例２で定義される）。当該酵素反応は所望の結果が得られるまで続けられ、この後、それは酵素を不活性化することによって、例えば加熱処理段階によって停止しても、又はしなくてもよい。
【００６９】
本発明の処理工程の別の特定の態様において、プロテアーゼの働きは維持され、これは、例えば当該プロテアーゼが植物タンパク質又はタンパク質源に加えられるが、その可溶化作用は、いわば、一度適当な可溶化条件が確立されると、又は一度任意な酵素阻害剤が不活性化されると、又はどの様な他の手段が酵素の働きを延長するために適用されても、後に所望とされるまで変化しないことを意味する。
【００７０】
１つの態様において、当該処理は、動物飼料又は動物飼料における使用のための植物タンパク質の前処理であり、すなわちタンパク質は摂取前に可溶化される。
【００７１】
用語「動物飼料の栄養価の向上」は、タンパク質の利用性を向上させ、それによってタンパク質抽出の増大、より高いタンパク質の収率、及び／又はタンパク質の活用性の増大をもたらすことを意味する。その結果、当該飼料の栄養価が増大し、そして動物の成長速度及び／又は体重増加及び／又は飼料変換（すなわち体重増加と比較される摂取飼料の重量）が向上する。
【００７２】
特定の態様において、体重増加はコントロールの少なくとも１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、又は少なくとも１０６．６％である（本明細書の例１０を参照のこと）。
【００７３】
更に特定の態様において、飼料変換は多くとも（又は未満）９９％、９８％、９７．５％、９７％であり、又は多くとも９６．６％である。これは最大９９％、９８％、９７．５％、９７％、又は最大９６．６％の飼料変換に等しい。また、本明細書の例１０を参照とし、コントロールと比較すること。
【００７４】
当該プロテアーゼは、任意な型で、比較的純粋なプロテアーゼとして、又は動物飼料に加えることが意図される他の成分と一緒に、すなわち動物飼料添加物の型で、例えばいわゆる動物飼料のためのプレミックスとして、飼料に加えられ得る。
【００７５】
動物飼料添加物
ズブチリシンファミリーの酸安定性プロテアーゼの他に、本発明の動物飼料添加物は、少なくとも１つの脂溶性ビタミン、及び／又は少なくとも１つの水溶性ビタミン、及び／又は少なくとも１つの微量元素、及び／又は少なくとも１つの多量元素を含む。
【００７６】
更に、任意の飼料添加物成分として、着色剤、芳香性化合物、安定剤、及び／又は、フィターゼ EC3.1.3.8又はEC3.1.3.26；キシラナーゼ EC3.2.1.8；ガラクタナーゼ EC3.2.1.89；及び／又はベータグルカナーゼ EC3.2.1.4の中から選択される少なくとも１つの他の酵素がある（ECは、NC-IUBMB,1992に由来する、１９９２年の酵素命名法に従う酵素分類を意味する）（http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htmlのワールドワイドウェブ(www)も参照のこと）。
【００７７】
特定の態様において、これらの他の酵素は明確に定義されている（プロテアーゼ調製物について上文で定義し、そして例示したもの。例１２を参照のこと）。
【００７８】
通常、脂溶性及び水溶性ビタミン、並びに微量元素は、飼料に加えることが意図される、いわゆるプレミックスの一部を形成し、一方、多量元素は通常飼料に対して別々に加えられる。これらの組成物の型のいずれも、本発明に従う酸安定性ズブチリシンで強化された場合、本発明の動物飼料添加物である。
【００７９】
特定の態様において、本発明の動物飼料添加物は、動物の食餌又は飼料に、０．０１〜１０．０％；更に詳細には０．０５〜５．０％；あるいは０．２〜１．０％（１００ｇの飼料当たりの１ｇの添加物を意味する％）のレベルで含めることが意図される（又は含めねばならないと規定される）。このことは、特にプレミックスについても同様である。
【００８０】
従って、動物飼料添加物、例えばプレミックスの個々の成分の濃度は、同一成分の最終飼料中濃度に、それぞれ１０〜１００００；２０〜２０００；又は１００〜５００を掛けることによって明らかとなりうる（上記の、３つのパーセンテージの算入間隔を参照のこと）。
【００８１】
前記の個々の飼料及び飼料添加物成分の、所望の終濃度、すなわち飼料中濃度についての指針を、以下の表Ａに示す。
【００８２】
以下のものは、これらの成分の例の非限定的な列挙である。
【００８３】
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、及びビタミンＫ、例えばビタミンＫ３である。
【００８４】
水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチン及びコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、例えばパントテン酸カルシウムＤである。
【００８５】
微量元素の例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、及びコバルトである。
【００８６】
多量元素の例はカルシウム、リン及びナトリウムである。
【００８７】
家禽類及び子ブタ／ブタで実証された、これらの栄養要求量を、以下の表Ａに列記する。栄養要求量は、これらの成分が、示した濃度で食餌に提供されるべきであることを意味する。これらのデータは：
NRC, Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D. C. 1988；及び
NRC, Nutrient requirements in poultry, ninth revised edition 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D. C. 1994、
を編集したものである。
【００８８】
あるいは、本発明の動物飼料添加物は、表Ａで述べた少なくとも１つの個々の成分を含んで成る。少なくとも１つとは、１又は複数の、１個の、又は２個の、又は３個の、又は４個の、更にそれ以上、最大で合計１３個の、あるいは最大で合計１５個のいずれかの、個々の成分を意味する。
【００８９】
更に具体的には、この少なくとも１つの成分は、表Ａの第４列、又は第５列、又は第６列に含まれる範囲内の飼料中濃度を提供するような量で、本発明の添加物に含まれる。
【００９０】
上文で説明したように、相当する飼料添加物濃度は、これらの範囲の間隔限定に１０〜１００００；２０〜２０００；又は１００〜５００を掛けることによって明らかと成り得る。例えば、ビタミンＡのプレミックス含有量が１０〜１０００００IU/kgに相当することを考慮すると、この練習は以下の間隔を導く：添加物１ｋｇ当たり１００〜１０8IU；又は２００〜２×１０7IU；又は１０００〜５×１０6IU。
【表１】
動物飼料組成物
動物飼料組成物又は食餌は、比較的高い含有量のタンパク質を有する。上文で言及したNational Research Council(NRC)の刊行物に従い、家禽類及びブタの食餌は、以下の表Ｂの、列２〜３に示すように特徴づけられ得る。魚の食餌は、表Ｂの列４に示すように特徴づけられ得る。更に、その様な魚の食餌はサケ科の食餌で例示され、そしてAquaculture, principles and practices, ed. T.V.R. Pillay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; Fish nutrition, second edition, ed. John E. Halver, Academic Press Inc.1989に基づいて設計される。
【００９２】
本発明に従う動物飼料組成物は、５０〜８００ｇ／ｋｇの含有量の粗製タンパク質を有し、そして更に本明細書の請求項に記載の、少なくとも１つのプロテアーゼを含んで成る。
【００９３】
更に、又はあるいは（上文で示唆した粗製タンパク質含量に対して）、本発明の動物飼料組成物は、代謝エネルギーの含有量１０〜３０ＭＪ／ｋｇ;及び／又はカルシウム含有量０．１〜２００ｇ／ｋｇ；及び／又は利用可能なリンの含有量０．１〜２００ｇ／ｋｇ；及び／又はメチオニン含有量０．１〜１００ｇ／ｋｇ；及び／又はメチオニン＋システイン含有量０．１〜１５０ｇ／ｋｇ；及び／又はリジン含有量０．５〜５０ｇ／ｋｇを有する。
【００９４】
特定の態様において、代謝エネルギー、粗製タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニン＋システイン、及び／又はリジンの含有量は以下の表Ｂの範囲２、３、４又は５（Ｒ．２〜５）のいずれか１つの中にある。
【００９５】
粗製タンパク質は、Animal Nutrition, 4th edition, Chapter 13 (Eds. P.McDonald, R. A. Edwards and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1998, ISBN 0-582-40903-9)で述べられているように、６．２５の因子を掛けた窒素（Ｎ）として計算され、すなわち、粗製タンパク質（ｇ／ｋｇ）＝Ｎ（ｇ／ｋｇ）×６．２５である。窒素含有量は、ケルダール法によって決定される（A. O. A. C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)。
【００９６】
代謝エネルギーは、NRC publication Nutrient Requirements of Swine(1988) pp. 2-6、及びEuropean Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, wageningen. ISBN 90-71463-12-5に基づいて計算され得る。
【００９７】
完全な動物食餌中のカルシウム、利用可能なリン及びアミノ酸の食餌含有量は、飼料の表、例えばVeevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteebaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7に基づいて計算される。
【００９８】
特定の態様において、本発明の動物飼料組成物は、上文で定義した少なくとも１つの植物タンパク質又はタンパク質源を含む。
【００９９】
更に他の特定の態様において、本発明の動物飼料組成物は、０〜８０％のトウモロコシ；及び／又は０〜８０％のモロコシ；及び／又は０〜７０％のコムギ；及び／又は０〜７０％のオオムギ；及び／又は０〜３０％のカラスムギ；及び／又は０〜４０％のダイズ粉；及び／又は０〜１０％の魚粉；及び／又は０〜２０％のホエー、を含む。
【０１００】
動物食餌は、例えばすりつぶされた（mash）飼料（ペレット化されていない）又はペレット化された飼料として製造され得る。典型的には、ミル粉砕された飼料は混合され、そして十分な量の必須ビタミン及び鉱物は問題の種の特徴に従い加えられる。酵素は、固体又は液体酵素製剤として加えられることがある。例えば、固体酵素製剤は典型的に、混合段階の前又はその間に加えられ；そして液体酵素調製物は典型的にペレット化段階の後に加えられる。当該酵素は、飼料添加物又はプレミックス中に組み込まれることがある。食餌中の最終酵素濃度は食餌１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇの範囲内、例えば動物食餌１ｋｇ当たり５〜３０ｍｇの酵素タンパク質の範囲内にある。
【０１０１】
動物飼料組成物の例を、例１１に示す。
【表２】
植物タンパク質を処理するための本発明の特定の態様において、フィターゼを加える追加の段階も含まれる。そして追加の特定の態様において、フィターゼ及びプロテアーゼを組み合わせた処理に加えて、追加の酵素が加えられることもあり、ここで、これらの酵素は他のプロテアーゼ、フィターゼ、脂肪分解酵素、及びグルコシダーゼ／カルボヒドラーゼ酵素を含んで成る群から選択される。その様な酵素の例は、WO95/28850に示されている。
【０１０３】
前記プロテアーゼは、当然ながら飼料の可溶化及び／又は栄養価を向上せしめるための有効量、すなわちそれに適した量で適用されるはずである。現段階で考えられているのは、前記酵素が１又は複数の以下の量で投与されるということである（投与範囲）：０．０１〜２００；又は０．０１〜１００；又は０．０５〜１００；又は０．０５〜５０；又は０．１０〜１０であり、これらの範囲全てが飼料１ｋｇ当たりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）である（ｐｐｍ）。
【０１０４】
飼料１ｋｇ当たりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）を決定するために、前記プロテアーゼは飼料組成物から精製され、そして精製プロテアーゼの比活性は、関連するアッセイを用いて決定される（プロテアーゼ活性、基質、及びアッセイを参照のこと）。飼料組成物自体のプロテアーゼ活性も、同一のアッセイを用いて決定され、そしてこれら２つの決定に基づいて、飼料１ｋｇ当たりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）の量が算出される。
【０１０５】
同一の原則が飼料添加物中のプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）を決定するために応用される。
【０１０６】
当然のことながら、試料が飼料添加物又は飼料を調製するために使用されるプロテアーゼに関して利用可能であるならば、比活性はこの試料から決定される（飼料組成物又は添加物から当該プロテアーゼを精製する必要なし）。
【０１０７】
多くの植物は、抗栄養因子、例えばレクチン及びトリプシン阻害剤を含む。ダイズの最も重要な抗栄養因子はレクチンダイズ凝集素（ＳＢＡ）、及びダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）である。
【０１０８】
レクチンは、かなりの特異性を有する特異的な炭水化物含有分子と結合するタンパク質であり、そして摂取された場合、それらは腸の上皮と結合する。これは、腸細胞の生存可能性の低下及び栄養の吸収の低下を招くことがある。
【０１０９】
ＳＢＡは約３０ｋＤａのサブユニット分子量及びＮ−アセチルガラクトサミンとの高い親和性を有する、グリコシル化された４量体レクチンである。
【０１１０】
トリプシン阻害剤は、タンパク質分解に影響を及ぼしタンパク質の消化率を低下させ、そして更に膵臓からの消化酵素の分泌を増大させ、消化酵素の形態でアミノ酸の損失を招く。トリプシン阻害剤の例は、約８ｋＤａの分子量を有し、７個のジスルフィド架橋を含み、そしてトリプシン様及びキモトリプシン様プロテアーゼに特異的な２つの阻害性ループを有するBowman-Birk阻害剤である。他の例は、いわゆるFactorのkunitz阻害剤である（例えばトリプシン様プロテアーゼのための１つの結合部位を含み、そして約２０ｋＤａの分子量を有するダイズkunitzトリプシン阻害剤）。
【０１１１】
本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、ＳＢＡレクチン、並びにトリプシン阻害剤であるBowman-Birk阻害剤及びダイズkunitz Factorの様な抗栄養因子を加水分解することが証明された。実験の項の例５を参照のこと。
【０１１２】
この様に、本発明はまた、抗栄養因子、例えばＳＢＡレクチン、並びにトリプシン阻害剤、例えばBowman-Birk阻害剤、及びkunitz Factor、例えばダイズkunitz Factorを加水分解し、又はその量を減少させるための酸安定性セリンプロテアーゼの使用に関する。
【０１１３】
例１
酸安定性プロテアーゼのスクリーニング
多数のプロテアーゼが、単胃動物の酸性の胃を通過するのに必要な安定性を有するプロテアーゼを同定するために、ｐＨ３での安定性について解析された。
【０１１４】
プロテアーゼは常用のクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（例えばProtein Purification, Principles, High Resolution Methods, and Applications. Editors: Jan-Christer Janson, Lars Ryden, VCH Publishers, 1989を参照のこと）。
【０１１５】
プロテアーゼ活性は以下の通りに決定した：プロテアーゼを１．６７％ Hammarstenカゼインと一緒に、２５℃、ｐＨ９．５で３０分間インキュベートし、次にＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を２％（ｗ／ｗ）の終濃度で加え、混合物を濾過して沈降物を除去し、そして濾液を遊離第１級アミノ基について解析した（セリンスタンダードを用いて３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、OPA(o-フタル−ジアルデヒド）に基づいた比色アッセイで決定した）(Biochemische Taschenbuch teil II, Springer-Verlag(1964), p.93 and p.102)。１カゼインプロテアーゼユニット（ＣＰＵ）は標準的な条件のもと、すなわち２５℃及びｐＨ９．５で、１分当たり１ｍｍｏｌのＴＣＡ可溶性第１級アミノ基を遊離する酵素量として定義される。
【０１１６】
前記プロテアーゼを、水中で０．６ＣＰＵ／Ｌの活性となるよう希釈し、２つのアリコートに分け、そして各アリコートを、続いてそれぞれ１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３及び１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７で更に希釈した。希釈した試料を３７℃で１時間インキュベートし、そして２０μｌの試料を１％スキムミルクを含む１％アガロースプレートの穴に適用した。当該プレート（ｐＨ７．０）を３７℃で一晩インキュベートし、そして透明になった範囲を測定した。
【０１１７】
４２個のプロテアーゼがこの試験で良好に実施された。これらのうちのいくつかが特徴づけられた（例２，６，７，及び８を参照のこと）。これらのプロテアーゼは全て、セリンプロテアーゼのズブチリシンファミリーに属する。
【０１１８】
例２
バチルス sp. NCIMB40484 由来のズブチリシンプロテアーゼの特徴付け及び比較研 究
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼを、WO93/24623の例１に記載のように調製した。
【０１１９】
この特徴付けの目的は、Sub. Novo、Sub. Novo(Y217L)、及びSAVINASE（商標）と比較して、それらのｐＨ−安定性、ｐＨ−活性及び温度−活性プロファイルを研究することであった。
【０１２０】
Sub. Novoはバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens)由来のズブチリシンであり、そしてSub. Novo(Y217L)はWO96/05739に開示されているその変異体である。Sub. Novoは常用の方法を用いて野生型菌株の培養物から調製され、そして精製され、一方、前記変異体はEP130756の例１〜２、及び１５〜１６に記載されているように調製した。
【０１２１】
SAVINASE（商標）はバチルス・クラウシイ（Bacillus clausii)由来のズブチリシンであり、これはNovozymes A/S(Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark)から販売されている。その調製は米国特許第３７２３２５０に記載されている。
【０１２２】
例２Ａ
プロテアーゼ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度の決定
プロテアーゼ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の手順によって決定した。
【０１２３】
４０μｌのプロテアーゼ溶液（Ａ280濃度＝０．０２５）を、１０μｌの５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）と氷上のエッペンドルフ管中で混合した。３０分後、氷上の管を遠心し（５分、０℃、１４，０００×ｇ）、そして上清を慎重に除去した。２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（２００μｌのトリス−グリシンＳＤＳ試料緩衝液（２倍）（１２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０ｐｐｍブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ＮＯＶＥＸ（商標）のＬＣ２６７６）＋１６０μｌの蒸留水＋２０μｌのβメルカプトエタノール＋２０μｌの３Ｍの緩衝化されていないトリス塩基（Sigma T-1503)を沈殿物に加え、そして管を３分間煮沸した。前記管を短期間遠心し、そして１０μｌの試料をＮＯＶＥＸ（商標）の４〜２０％のグラジエントトリス−グリシンプレキャストゲル（Laemmliの化学を基にしているが、ゲル中にＳＤＳを含まない、ポリアクリルアミドグラジエントゲル（Laemmili, U.K., (1970) Nature, vol. 227, pp.680-685), EC60255)に適用した。電気泳動は、ブロモフェノールブルーの追跡用色素がゲルの底面に達するまで、１５０Ｖの低電圧で、両方の緩衝液のリザーバー中で、トリス−グリシンランニング緩衝液（２．９ｇのトリス塩基、１４．４ｇのグリシン、１．０ｇのＳＤＳ、全体で１Ｌの液体となるように加えられる蒸留水）を用いて行った。電気泳動後、ゲルを１００ｍｌの蒸留水を用いて、穏やかに振とうすることによってそれぞれ３回、５回すすいだ。次にゲルをGelcode（商標）Blue Stain試薬（PIERCEの製品, コロイド性クーマシーG-250、PIERCEのカタログ番号２４５９２）と共に１時間穏やかに振とうし、そして蒸留水を用いて８〜１６時間穏やかに振とうし、そして蒸留水を複数回交換して洗浄した。最後に、ゲルを２枚のセロハンの間で乾燥した。乾燥したゲルをFotolook 95 v2.08ソフトウェアを備えたAGFAのArcus IIスキャナーでスキャニングし、そして以下の設定値（Fotolook 95 v2.08）を有するFile/Acquireコマンドによってウィンドウズ用のイメージ評価ソフトウェアCREAM（商標）（カタログ番号９９０００１及び９９０００５、Kem-En-Tec, Denmark）に取り込んだ：オリジナル＝リフレクティブ、モード＝カラーＲＧＢ、スキャンリゾリューション＝２４０ｐｐｉ、アウトプットリゾリューション＝１２０ｌｐｉ、スケールファクター＝１００％、レンジ＝グローバルセレクションによるヒストグラム並びにＭｉｎ＝０及びＭａｘ＝２１５、トーンカーブ＝無し、シャープネス＝無し、デスクリーン＝無し並びにフレーバー＝無し、これにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの*.imgピクチャーファイルが作り出され、これはＣＲＥＡＭ（商標）での評価に使用された。*.imgピクチャーファイルは、メニューコマンドアナリシス／１−Ｄで評価された。２つのスキャンラインはレーンプレイスツールで*.imgピクチャーファイル上に据えられた：試料スキャンライン及びバックグラウンドスキャンライン。試料スキャンラインは、アプリケーションスロットの真下からブロモフェノールブルーの追跡用色素の真上の位置の、中央の試料レーン（問題のプロテアーゼを有する）に据えられた。バックグラウンドスキャンラインは、試料スキャンラインと平行であるが、試料が全く適用されておらず、バックグラウンドスキャンラインが試料スキャンラインの開始及び終了の点に垂直な、ピクチャー形式のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの位置に据えられた。バックグラウンドスキャンラインはゲルの真のバックグラウンドを表している。スキャンラインの幅及び形状は調整されていない。スキャンラインに沿った強度は、直ちに中程度の感度による１−Ｄ／スキャンメニューコマンドで記録された。１−Ｄ／エディターメニューコマンドを用いて、バックグラウンドスキャンは試料スキャンからサブトレースされた。次に、１−Ｄ／リザルトメニューコマンドが選択され、そしてＣＲＥＡＭ（商標）ソフトウェアによって計算した場合のプロテアーゼピークのエリア（％）がプロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度として使用された。
【０１２４】
次の結果が得られた：
【表３】
例２Ｂ
ｐＨ−活性アッセイ
Suc-AAPF-pNA(Sigma（商標）S-7388)は、ｐＨ−活性プロファイルを得るために使用した。
【０１２６】
アッセイ緩衝液：ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ値３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０又は１１．０に調整された、１００ｍＭコハク酸（Merck 100682）、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma H-3375）、１００ｍＭ ＣＨＥＳ（Sigma C-2885）、１００ｍＭ ＣＡＢＳ（Sigma C-5580）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００。
アッセイ温度：２５℃
【０１２７】
３００μのプロテアーゼ試料（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００中で希釈したもの）を、１．５ｍｌのアッセイ緩衝液と各ｐＨ値で混合し、混合物のｐＨをアッセイ緩衝液のｐＨにした。反応は１．５ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇのものを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中で希釈し、そして０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で４５倍に希釈した）を加えることによって開始し、そして混合後、Ａ405の増大を問題のｐＨでのプロテアーゼ活性の測定値として分光光度計によってモニタリングした。当該アッセイは他のｐＨ値のアッセイ緩衝液で繰り返し、そして当該活性の測定値をｐＨに対する相対的な活性としてプロットした。相対的な火星は最高の活性（至適ｐＨ）で標準化し、すなわち至適ｐＨでの活性を１、又は１００％に設定した。プロテアーゼ試料は、全ての活性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保証するために希釈された。
【０１２８】
例２Ｃ
ｐＨ−安定性アッセイ
Suc-AAPF-pNA(Sigma（商標）S-7388)は、ｐＨ−安定性プロファイルを得るために使用した。
【０１２９】
アッセイ緩衝液：ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ値２．０、２．５，３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０又は１１．０に調整された、１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００。
【０１３０】
各プロテアーゼ試料（１ｍＭ コハク酸、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中であり、且つ１０超のＡ280の吸光度を有する）を、試験される各ｐＨ値のアッセイ緩衝液中でＡ280＝１．０に希釈した。希釈したプロテアーゼ試料を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プロテアーゼ試料を１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、ｐＨ９．０、中で希釈し、全試料のｐＨをｐＨ９．０にした。
【０１３１】
以下の活性測定において、温度は２５℃であった。
【０１３２】
３００μｌの希釈したプロテアーゼ試料は１．５ｍｌの、ｐＨ９．０のアッセイ緩衝液と混合し、そして活性反応は１．５ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇのものを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中で希釈し、そして更に０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で４５倍に希釈した）を加えることによって開始し、そして混合後、Ａ405の増大を（残留）プロテアーゼ活性の測定値として分光光度計によってモニタリングした。３７℃のインキュベーションを異なるｐＨ値で行い、そして活性の測定値をｐＨに対する残留活性としてプロットした。残留活性を対応するインキュベーションの活性（コントロール）で標準化し、一方当該プロテアーゼをｐＨ９．０のアッセイ緩衝液中でＡ280＝１．０に希釈し、そして他のインキュベーションとして活性測定の前に５℃で２時間インキュベートした。当該プロテアーゼ試料は、全ての活性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保証するために、活性測定の前に希釈した。
【０１３３】
例２Ｄ
温度−活性アッセイ
プロタザイムＡＫ錠が、温度プロファイルを得るために使用された。プロタザイムＡＫ錠はＭｅｇａｚｙｍｅによって錠剤として調製されたアズリン色素架橋型カゼインである。
【０１３４】
アッセイ緩衝液：ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整された、１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣＨＥＳ、１００ｍＭ ＣＡＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００。
【０１３５】
プロタザイムＡＫ錠は、穏やかに撹拌することによって２．０ｍｌの０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００中で懸濁した。５００μｌのこの懸濁液及び５００μｌのアッセイ緩衝液をエッペンドルフ管中で混合し、そして氷上に据えた。２０μｌのプロテアーゼ試料（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００中で希釈したもの）を加えた。当該アッセイは、アッセイ温度に設定したエッペンドルフサーモミキサーにエッペンドルフ管を移すことによって開始した。当該管をエッペンドルフサーモミキサー上で、その最高振とう速度で１５分間インキュベーションした。当該管を氷浴に戻すことによって、アッセイのインキュベーションを停止させた。当該管を氷令した遠心管中で数分間遠心し、そして上清のＡ650を分光光度計で読みとった。緩衝液のブラインドは当該アッセイに含められた（酵素の代わり）。Ａ650（プロテアーゼ）−Ａ650（ブラインド）をプロテアーゼ活性の測定値とした。当該アッセイは異なる温度で実施し、そして活性の測定値をインキュベーション温度に対する相対活性としてプロットされた。相対活性は最高の活性で標準化した（至適温度）。プロテアーゼ試料は、全ての活性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保証するべく希釈した。
【０１３６】
至適活性の概要（ｐＨ−及び温度活性）を表１に示す。ｐＨ−安定性、ｐＨ−活性及び温度−活性プロファイルを図１〜３に示し、そして酸性ｐＨ値でのプロテアーゼについてのｐＨ−安定性の詳細な比較を表２に示す。
【表４】
例２Ｅ
精製したプロテアーゼ試料の吸収純度
Ａ 280 ／Ａ 260 比の決定
精製したプロテアーゼ試料のＡ280／Ａ260比は以下の通りに決定した。
【０１３８】
Ａ260は、緩衝液ブランクと比較される、１ｃｍの路長のキュベットにおける、２６０ｎｍでのプロテアーゼ試料の吸収を意味する。Ａ280は、緩衝液ブランクと比較される、１ｃｍの路長のキュベットにおける、２８０ｎｍでの同一プロテアーゼ試料の吸収を意味する。
【０１３９】
例２及び６に由来する精製したプロテアーゼ試料は、分光光度計のＡ280の読み取りがその応答曲線の直線部分内に収まるまで緩衝液中で希釈した。Ａ280／Ａ260比は、前記の読み取りから決定された。次の結果が得られた：
【表６】
例３
バチルス sp. NCIMB40484 由来のプロテアーゼの、ダイズ粉（ＳＢＭ）の不溶性部分を分解する能力
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼは、不溶性／消化不能部分を、消化酵素及び／又は加えられた外来性酵素にとって接近可能にする能力について試験された。
【０１４１】
その性能は、WO95/02044に記載のように調製された２つのアスパラギン酸プロテアーゼ、プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIと比較された。この文書は飼料中でのそれらの使用も開示している。プロテアーゼＩはアスペルギロペプシンII型プロテアーゼであり、そしてプロテアーゼIIはアスペルギロペプシンＩ型プロテアーゼであり（共にアスパラギン酸プロテアーゼ、すなわち非ズブチリシンプロテアーゼである）、これらはアスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）由来である（上文で言及したHandbook of Proteolytic Enzymesを参照のこと）。
【０１４２】
試験物質、いわゆるダイズ残留物は、ｐＨ２でのペプシン処理、及びｐＨ７でのパンクレアチン処理を含む、単胃動物の消化管を模倣した過程で生成した。
【０１４３】
パンクレアチン処理段階において、様々な市販酵素が、存在している市販酵素にとって接近可能なＳＢＭ成分を分解するために大量に加えられた。
【０１４４】
全てNovozymes A/S(Denmark)から購入可能な次の酵素が加えられた：ALCALASE（商標）2.4L、NEUTRASE（商標）0.5L、FLAVOURZYME（商標）1000L、ENERGEX（商標）L、BIOFEED（商標）Plus L、PHYTASE NOVO（商標）L。使用したＳＢＭは、ペレット化された、飼料にとって標準的な４８％タンパク質ＳＢＭとした。
【０１４５】
当該処理後、全タンパク質のわずかに５％が生じたダイズ残留物中に残された。
【０１４６】
ＦＩＴＣ標識プロトコール
前記残留物は、引き続き以下のようにＦＩＴＣ（Molecular Probes, F-143）で標識された：ダイズ残留物（２５ｇの湿重量、〜５ｇの乾燥重量）を１００ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９、中で懸濁され、そして４０℃で１時間撹拌された。懸濁液をフルオレセイン５−イソチオシアネート(FITC)で一晩、暗室で処理された。カップリングしていないプローブは限外濾過（１０，０００Ｍｗのカットオフ値）によって除去した。
【０１４７】
ＦＩＴＣアッセイ
ＦＩＴＣ標識したダイズ残留物は、次のアッセイを用いてダイズ残留物を分解するプロテアーゼの能力を試験するために使用した：０．４ｍｌのプロテアーゼ試料（Ａ280＝０．１を有する）を、０．４ｍｌのＦＩＴＣダイズ残留物（ｐＨ６．５の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌの懸濁液）と３７℃で混合し、そしてインキュベーションの０時間後、そして２２時間後に相対的な蛍光単位（ＲＦＵ４８５／５３５ｎｍ；励起／モニタリング波長）を測定した。ＲＦＵの決定の前に、試料を２０，０００×Ｇで１分間遠心し、そして２５０μｌの上清を黒いマイクロタイタートレーに移した。測定はVICTOR 1420 Multilabel counter(in vitro, Denmark)を用いて実施した。ＲＦＵはIain D. JohnsonによってIntroduction to Fluorescence Tecniques, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Richard P. Haugland, 6th edition, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7)において広く記載されている。
【０１４８】
ブラインド試料は、０．４ｍｌの緩衝液を酵素試料の代わりに加えることによって調製した。
ＲＦＵ試料＝ΔＲＦＵ試料−ΔＲＦＵブラインド（ここで、ΔＲＦＵ＝ＲＦＵ（２２時間）−ＲＦＵ（０時間）である）
【０１４９】
生じたＦＩＴＣ値（ＲＦＵ試料値）を以下の表３に示す。ＦＩＴＣ値は、一般的に＋／−２０，０００の許容誤差を有する。プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIと反対に、バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼは有効な程度までダイズ残留物を分解した。
【表７】
例４
バチルス sp. NCIMB40484 由来のプロテアーゼの in vitro での試験
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼは、他のズブチリシンプロテアーゼ、例えばSub. Novo、SubNovo(Y217L)、SAVINASE（商標）及びALCALASE（商標）と一緒に、in vitroでの消化系（単胃動物の消化を模倣したもの）におけるトウモロコシ−ＳＢＭ（トウモロコシ−ダイズ粉）タンパク質を可溶化するその能力について試験された。ブランクの処理のために、トウモロコシ−ＳＢＭを外来性ズブチリシン様プロテアーゼの非存在下でインキュベートした。
【０１５１】
前記のin vitroの系は、３０個のフラスコから構成され、この中で、トウモロコシ−ＳＢＭが最初にＨＣｌ／ペプシン（胃での消化を模倣したもの）と、そして次にパンクレアチン（腸での消化を模倣したもの）と一緒にインキュベートされた。胃でのインキュベーション期間の終わりに、in vitroでの消化物の試料が除去され、そして可溶化されたタンパク質について解析された。
【０１５２】
基質
トウモロコシ−ＳＢＭの比率が６：４（ｗ／ｗ）の１０ｇのトウモロコシ−ＳＢＭ食餌を使用した。タンパク質含量はＳＢＭ中で４３％（ｗ／ｗ）であり、そしてトウモロコシ粉中で８．２％（ｗ／ｗ）であった。１０ｇのトウモロコシ−ＳＢＭ食餌中のタンパク質の合計量は２．２１ｇであった。
【０１５３】
消化酵素
ペプシン（Sigma P-7000; 539U/mg、固体）、パンクレアチン（Sigma P-7545; 8xU.S.P. (US Pharmacopeia)）。
【表８】
酵素タンパク質の決定
プロテアーゼ酵素タンパク質の量は、S. C. Gill & P. H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989)で概説されている原理を用いて、Ａ280値及びアミノ酸配列（アミノ酸組成）に基づいて計算される。
【０１５５】
in vitro モデルのための実験手順
１． １０ｇの基質を１００ｍｌのフラスコに量り入れる。
２． ０分時に、ペプシン（３０００Ｕ／ｇ食餌）及び１ｍｌのプロテアーゼ（０．１ｍｇ酵素タンパク質／ｇ食餌）を含む４６ｍｌのＨＣｌ（０．１Ｍ）を混合しながら加える。フラスコを４０℃でインキュベートする。
３． ３０分時に、ｐＨを測定する。
４． ４５分時に、１６ｍｌのＨ2Ｏを加える。
５． ６０分時に、７ｍｌのＮａＯＨ（０．３９Ｍ）を加える。
６． ９０分時に、パンクレアチン（８．０ｍｇ／ｇ食餌）を含む５ｍｌのＮａＨＣＯ3（１Ｍ）を加える。
７． １２０分時に、ｐＨを測定する。
８． ３００分時に、ｐＨを測定する。
９． ３２０分時に、３０ｍｌのアリコートを除去し、そして遠心する（１００００×Ｇ、１０分、４℃）。
上清を除去し、そして−２０℃で保存する。
【０１５６】
ゲル濾過ＨＰＬＣによる可溶化されたタンパク質の推定
in vitroで消化された試料に由来する上清中の可溶化されたタンパク質の含有量は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用いて粗製タンパク質（ＣＰ）を定量することによって推定した。上清を融解し、０．４５μのポリカーボネートフィルター（Sartorius）を介して濾過し、そしてＨ2Ｏで希釈した（１：５０、ｖ／ｖ）。希釈した試料は、Superdex Peptide PE（７．５×３００ｍｍ）ゲル濾過カラム（Global）を用いて、ＨＰＬＣによりクロマトグラフィーにかけた。定組成溶出に使用した溶出液は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）とした。一回の操作当たりの溶出液の合計量は２６ｍｌであり、そして流速は０．４ｍｌ／分であった。溶出プロファイルは、２１４ｎｍで記録し、そしてプロファイル下の全面積は積分によって決定した。積分した面積からタンパク質含量を推定するために、検量曲線（Ｒ2＝０．９９９３）が、既知の合計タンパク質含量を有するin vitroで消化した参照トウモロコシ−ＳＢＭ試料の一連の希釈液から作成された。この参照試料におけるタンパク質の決定は、ケルダール法によって実施された（窒素（％）の決定；A. O. A. C., (1984), Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)。
【０１５７】
結果
in vitroでのタンパク質溶解性に対する様々なプロテアーゼの結果、すなわち効果を、以下の表４に示す。
【０１５８】
可溶化されたタンパク質の相対的な量の計算は、in vitroでの消化反応の間に、合計量７５ｍｌに溶解した１０ｇのトウモロコシ−ＳＢＭ食餌中のタンパク質の合計量（２．２１ｇタンパク質）を基にしている。完全なタンパク質の可溶化（１００％）を仮定すると、上清中のタンパク質含量は、体積当たり２．９５％重量であろう。
【０１５９】
当該結果は、Ｐ＝０．０００１の分散の一方向解析によって解析された。ＳＤ＝標準偏差；ｎ＝処理当たり反復の回数（ｎ＝５）。
【０１６０】
バチルスｓｐ．ＮＣＩＭＢ４０４８４由来のプロテアーゼは、他のプロテアーゼと比較した場合に、タンパク質の可溶化に対して有意なより優れた効果を有する。
【表９】
例５
レクチンＳＢＡ並びにダイズ Bowman-Birk 及び kunitz 阻害剤の分解
バチルスｓｐ．ＮＣＩＭＢ４０４８４由来のプロテアーゼの、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）並びにダイズBowman-Birk及びkunitzトリプシン阻害剤を加水分解する能力が試験された。
【０１６２】
純粋ＳＢＡ（Fluka 61763）、Bowman-Birk阻害剤（Sigma T-9777）又はkunitz阻害剤（ダイズ由来のトリプシン阻害剤、Boehringer Mannheim 109886）を、前記プロテアーゼと一緒に３７℃で２時間、ｐＨ６．５でインキュベートした（プロテアーゼ：抗栄養因子＝１：１０、Ａ280に基づく）。インキュベーション緩衝液：５０ｍＭジメチルグルタル酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ６．５。
【０１６３】
ＳＢＡ及びプロテアーゼ阻害剤を分解するプロテアーゼの能力は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の天然ＳＢＡ及びトリプシン阻害剤のバンドの消失並びに低分子量分解産物の出現から推定した。ゲルはクーマシーブルー染色し、そしてバンドの強度をスキャニングによって決定した。
【０１６４】
分解した抗栄養因子の％としての結果を、以下の表５に示す。
【０１６５】
ダイズ中の抗栄養因子を分解する能力はまた、ダイズ粉と候補プロテアーゼとのインキュベーション後に、ＳＢＡ、Bowman-Birk阻害剤又はkunitz阻害剤に対する抗体を用いるウェスタン技術を利用することによって推定され得る（WO98/56260を参照のこと）。
【表１０】
例６
更に酸安定性のズブチリシンの調製
バチルス・アルカロフィラスプロテアーゼの調製
凍結乾燥した培養物に由来するバチルス・アルカロフィラスNCIMB10438が、以下の組成を有する１００ｍｌのＢＰＸ培地を含む振とうフラスコ内に接種された：水道水中、ジャガイモデンプン１００ｇ／ｌ、オオムギ粉５０ｇ／ｌ、ＢＡＮ８００ＭＧ（Novozymes A/Sから入手可能）０．０５ｇ／ｌ、カゼイン酸ナトリウム１０ｇ／ｌ、ダイズ粉２０ｇ／ｌ、リン酸二ナトリウム９ｇ／ｌ、Pluronic PE 6100 0.1ml/l。ｐＨは、接種前に各振とうフラスコフラスコ中で、１０ｍｌの１Ｍセスキ炭酸ナトリウムを用いてｐＨ９．７に調整された。菌株は、３０℃、３００ｒｐｍで４日間醗酵された。この培養物を、１０ｍｌのＢＰＸ培地を含む新しい振とうフラスコに接種し、そして３日間醗酵した。
【０１６７】
精製
１Ｌビーカー中の培養液を１００００×ｇで３０分間遠心した。上清を合わせ、そして更にSeitz K-250 depthフィルタープレートを通過する濾過によって清澄にした。透明な濾液を３ｋＤａカットオフポリエーテルスルホンカセット（Filtron)上での限外濾過によって濃縮した。濃縮した酵素を、G25 Sephadexカラム(Amersham Pharmacia Biotech)上で、50mM H3BO3、5mM 3,3'-ジメチルグルタル酸、1mM CaCl2,pH7（緩衝液Ａ）に移し、そして緩衝液Ａ中で平衡化したバシトラシンアガロースカラム(Upfront Chromatography A/S)にかけた。結合していないタンパク質を除去するために緩衝液Ａでバシトラシンかラムを洗浄した後、前記プロテアーゼは、２５％２−プロパノール及び１Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ａを用いてカラムから溶出した。プロテアーゼ活性を有するバシトラシンカラム由来の画分を集め、そしてG25 Sephadexカラム(Amersham Pharmacia Biotech)上でのクロマトグラフィーによって20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2、pH4.5（緩衝液Ｂ）に移した。緩衝液を交換したプロテアーゼのプールを、緩衝液Ｂで平衡化したSOURCE 30Sカラム(Amersham Pharmacia Biotech)にかけた。緩衝液ＢでSOURCE 30Sカラムを洗浄した後、緩衝液Ｂ中の直線ＮａＣｌ勾配（０〜０．５Ｍ）を増大させてプロテアーゼを溶出した。カラム由来の画分をプロテアーゼ活性について試験し、そしてプロテアーゼ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。純粋な画分を集め、そして更なる特徴付けに使用した。
【０１６８】
他の酸安定性ズブチリシンの調製
フサリウム・オキシスポラムIFO 4471；バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438；パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンスATCC 20338のプロテアーゼは、バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438のプロテアーゼに関して一般的に記載されている、常用の方法を用いて調製した。
【０１６９】
配列
次の部分的なアミノ酸配列が決定された：
配列番号１
アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272由来のプロテアーゼのＮ末端：ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSYIY；
配列番号２
バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438由来のプロテアーゼのＮ末端：NQVTPWGITRVQAPTAW；
配列番号３
パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449由来のプロテアーゼのＮ末端：AYTQQPGAPWGLGRISH；
配列番号 4
フサリウム・オキシスポラムIFO 4471由来のプロテアーゼのＮ末端：ALTTQSGATWGLGTVSHRSRGS.
【０１７０】
バチルスsp. NCIMB40484由来のプロテアーゼのアミノ酸配列である、本明細書の配列番号５は、既に決定されている（米国特許第５，６５０，３２６号の配列番号４，６及び８を参照のこと）。
【０１７１】
関連配列についての公的なタンパク質のデータベースのサーチは、次の事を明らかにした：
配列番号６
Geneseqp/r65936（EP 623672のパエシロマイセス・リラシナスCBS143.75のプロテアーゼを引用）−配列番号３と関連。
配列番号７
Geneseqp/r74334（JP-07095882のバチルスsp.THS-1001のプロテアーゼを引用）−配列番号２と関連。
【０１７２】
パエシロマイセス・リラシナス及びアスペルギルスsp.の菌株は、ブダペスト条約に従い、特許手続のための微生物の寄託の国際承認により、Centraalbureau voor Schmmelcultures (CBS), P. O Box 273, 3740 AG Baarn, The Netherlandsに以下の通りに寄託された。
寄託日：２０００年１月１７日
ＣＢＳ番号：アスペルギルスsp. 102448
寄託日：２０００年１月１７日
ＣＢＳ番号：パエシロマイセス・リラシナス102449
【０１７３】
当該寄託はNovozyme A/Sによって行われ、そして後にHoffmann-La Roche AGに譲渡された。
【０１７４】
当該寄託はNovozyme A/Sによって行われ、そして後にHoffmann-La Roche AGに譲渡された。
【０１７５】
例７
更なるズブチリシンプロテアーゼの特徴付け及び比較研究
バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438；フサリウム・オキシスポラムIFO 4471；パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンスATCC 20338から調製したプロテアーゼは、全てズブチリシンである。
【０１７６】
当該プロテアーゼ試料の純度は、例２に記載の通りに決定した。次の結果が得られた。
【表１１】
アッセイ
ｐＨ−活性、ｐＨ−安定性、及び温度−活性のアッセイは例２に記載されている（pNA基質Suc-AAPF-pNA(Sigma S-7388)はｐＨ−活性及び−安定性のプロファイルのために、全てのプロテアーゼについて使用したが、プロタザイムＡＫ錠は温度のプロファイルに使用した）。
【０１７８】
至適活性（ｐＨ−及び温度−活性）の概要を表６に示す。ｐＨ−活性、ｐＨ−安定性、及び温度−活性のプロファイルは図４〜６に示し、そして酸性ｐＨ値での当該プロテアーゼのｐＨ−安定性のデータの詳細な比較は、表７に示す。
【表１２】
例８
ストレプトミセスズブチリシン阻害剤 (SSI) によるプロテアーゼの阻害
pNA基質:Suc-AAPF-pNA(Sigma（商標）S-7388)が、阻害後の残留活性を測定するのに使用された。
アッセイ緩衝液：１００ｍＭコハク酸（Merck 100682）、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma H-3375）、１００ｍＭ ＣＨＥＳ（Sigma C-2885）、１００ｍＭ ＣＡＢＳ（Sigma C-5580）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、ｐＨ９．０。
アッセイ温度：２５℃
【０１８０】
SSIは、ストレプトミセス・アルボグリセオラス（Streptomyces albogriseolus)FERM P-1205(S-3253)の醗酵液の上清から、クロマトグラフィーによって精製した。使用したSSI調製物は、９５％超の純度を有しており、当該純度は例２Ａに記載の手順によって決定した。あるいは、SSIは日本のwakoから、カタログ番号303-05201で入手することもできる（製造業者Daiwa Kasei k.K.)（例えば、http://search.wako-chem.co.jp/lifeb e/lifedocs e/44834.aspを参照のこと）。
【０１８１】
次の阻害アッセイの前に、SSIを０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でＡ280
濃度＝０．０１０まで希釈した。
プロテアーゼ：使用したプロテアーゼは９５％超の純度を有しており、当該純度は例２Ａに記載の手順によって決定した。次の阻害アッセイの前に、当該プロテアーゼを０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でＡ280 濃度＝０．０１０まで希釈した。
【０１８２】
ストレプトミセスズブチリシン阻害剤(SSI)による当該プロテアーゼの阻害は、以下の手順で決定した。
【０１８３】
３００μのプロテアーゼ試料（Ａ280 濃度＝０．０１０）を、３００μｌのSSI（Ａ280 濃度＝０．０１０）及び１．５ｍｌのアッセイ緩衝液と混合した。室温での１５分間のインキュベーション後、残留活性は１．５ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇのものを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中で希釈し、そして０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で４５倍に希釈した）を加えることによって測定され、そして混合後、Ａ405の増大を分光光度計によってモニタリングした。コントロール（SSI無し）として、３００μｌの０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をSSIの代わりに使用した。
【０１８４】
残留活性はコントロール活性（SSI無し）で標準化し、すなわちSSIによる阻害無しは１００％の残留活性を示し、そしてSSIによる完全な阻害は０％の残留活性を示す。次の結果が得られた。
【表１４】
例９
更に酸安定性ズブチリシンの、ダイズ粉（ＳＢＭ）の不溶性部分を分解する能力
例６に記載の様に調製した更に酸安定性ズブチリシンは、不溶性／消化不能部分を、消化酵素及び／又は加えられた外来性酵素にとって接近可能にする能力について、例３に記載の様に試験された。
【０１８６】
得られた結果を以下の表８に示す。比較のために、プロテアーゼＩ及びIIについて例３で得られた結果を更に表８に含める。
【表１５】
例１０
ブロイラーのニワトリの成長能力に対するバチルス sp. NCIMB 40484 由来の酸安定性ズブチリシンの効果
生きている動物を用いる実験のための公的なフランスの指南書に従う試みを、Roche Research Center for Animal Nutrition (CRNA, F-68305 Village-Neuf, France)で行う。性別毎に分けられた、生まれて１日目のブロイラーのニワトリ（「Ross PM3」）は、商業的な孵化場から供給される。
【０１８８】
ニワトリは、環境的に調節された部屋に維持されている、ワイヤーが床に敷かれたバッテリーケージ内で飼育する。試料及び水道水は適宜供給する。
【０１８９】
８日目に、ニワトリを体重毎に６匹のニワトリの群に分け、これを酵素無しの実験用食餌を受けるコントロール処理、又は飼料１ｋｇ当たり１００ｍｇのバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼの酵素タンパク質を添加した実験用食餌を受ける酵素処理のいずれかが割り当てられた。
【０１９０】
各処理は、各性別毎に６つの群の、１２の群で繰り返された。当該群は８日目及び２９日目に秤量された。中間期の飼料消費量が決定され、そして体重の増加及び飼料変換率が計算された。
【０１９１】
実験食餌は、主成分としてトウモロコシデンプン及びダイズ粉（４４％粗製タンパク質）（表９）CRNAで製造された。飼料は約７０℃でペレット化された（ダイの構成：３×２０ｍｍ）。適当な量のバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼを一定量の水で希釈し、そしてペレット化された飼料に噴霧した。コントロール処理の場合、適切な量の水が同様の方法で当該処理を扱うために使用された。
【０１９２】
統計的な評価のために、２つの変動因子の解析（因子：処置及び性別）が、ＳＡＳパッケージのＧＬＭプロシージャ（SAS Institute Inc., 1985)を用いて実施された。有意な処置効果（ｐ＜０．０５）が示唆された場合、処置平均間の差異はダンカン試験で解析した。技術的な理由により、前記酵素処理の１つのケージは統計的な評価から除外された。
【０１９３】
表２において、８日目から２９日目までのブロイラーのニワトリの成長能力についての結果を列記する。処置と性別の間に相互関係は存在せず、それ故に両性別の集計結果を示す。バチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼによる実験食餌の補足は、数字の上で６．６％体重増加を改善した。当該プロテアーゼの追加は、飼料の摂取をわずかに３．１％増加させた。バチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼは、ブロイラーのニワトリの飼料変換をわずかに３．４％改善した。
【０１９４】
トウモロコシデンプンが高度に消化可能な成分であることを考慮して、観察された効果が、主にダイズ粉に対する当該酵素の作用によるものであると考えられる。従って、当該結果は、ダイズ分の栄養価がバチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼによって向上したことを示した。
【０１９５】
結論として、当該研究は、大量のダイズ粉を含有するブロイラー飼料への、バチルスsp. NCIMB40484プロテアーゼの１００ｍｇ酵素タンパク質／ｋｇ飼料での添加が、体重増加の数字上の増大及び飼料変換の有意な改善をもたらしたことを証明した。
【０１９６】
引用文献
EEC(1986):Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la methode de calcul de la valeur energetique des aliments composes destines a la volaille. Journal Officiel des Communautes Europeennes, L130, 53-54
SAS Institute Inc. (1985):SAS（商標）User's Guide, Version 5 Edition. Cary NC
【表１６】
飼料成分の供給元
【表１７】
例１１
酸安定性ズブチリシンプロテアーゼを添加したシチメンチョウ及びサケのためのプレミックス及び食餌
次の組成のプレミックスを調製する（１ｋｇ当たりの含量）：
【表１９】
このプレミックスに対して、例２に記載のように調製したバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼを、１０ｇのプロテアーゼ酵素タンパク質／ｋｇに相当する量で加える。
【０２００】
以下の表（Leeson and Summers, 1997を基にしたものであるが、最適化プログラムであるAGROSOFT（商標）を用いることによって肉粉無しで再計算がされた）に示す組成を有し、そして１ｋｇ当たり１００ｍｇのプロテアーゼ酵素タンパク質を有する、ペレット化したシチメンチョウの開始用食餌及び生育用食餌を以下のように調製する：
【０２０１】
製粉したトウモロコシ、ダイズ粉、魚粉及び植物性脂肪をカスケードミキサー内で混合する。石灰岩、リン酸カルシウム及び塩１０ｇ／ｋｇ食餌の量の上記プレミックスと一緒に加え、続いて混合する。生じた混合物をペレット化する（蒸気条件にペレット化段階が続く）。
【表２０】
サケ用の２つの食餌が、上文で広く概説されているように更に調製される。実際の組成を以下の表に示す（Refstie et al(1998), Aquaculture, vol.162, p.301-302から編集した)。推定される栄養分は、AGROSOFT（商標）の飼料最適化プログラムを用いることによって再計算される。
【０２０３】
例２に記載のように調製したバチルスsp. NCIMB40484のプロテアーゼが、１ｋｇ当たり１００ｍｇのプロテアーゼ酵素タンパク質に相当する量で食餌に加えられる。
【表２１】
例１２
プロテアーゼ含有酵素産物の純度の決定
プロテアーゼ含有酵素産物、例えばプロテアーゼ調製物、例えば市販の多成分酵素産物の純度が、サイズ排除カラム上でのプロテアーゼ含有酵素産物の分画に基づいた方法によって決定されうる。ゲル濾過クロマトグラフィーとしても知られるサイズ排除クロマトグラフィーは、サイズにおいて分離され得るタンパク質分子に匹敵する孔のサイズ分布を有する、多孔性ゲルマトリックス（カラム内に詰め込まれる）を基にしている。比較的小さいタンパク質分子は、周囲の溶液からゲルの内部に拡散することがあり、一方、より大きな分子は、それらのサイズによって、同程度までゲル内部に拡散することが妨害されるだろう。結果として、タンパク質分子は、それらのサイズに従い、より大きな分子と分離され、より小さいものより前に当該カラムから溶出する。
【０２０５】
タンパク質濃度アッセイ
プロテアーゼ含有酵素産物のタンパク質濃度は、PIERCEのBCAタンパク質アッセイキット（PIERCEのカタログ番号２３２２５と同一のもの）によって決定される。ビシンコニン酸のナトリウム塩（ＢＣＡ）は、アルカリ性の環境で第一銅イオン（Ｃｕ1+）と強力な紫色の複合体を形成し得る、安定な水溶性化合物である。ＢＣＡ試薬は、タンパク質とアルカリＣｕ2+の反応（ビウレット反応）で産生する第一銅イオンをモニタリングし得るＢＣＡタンパク質アッセイキットの根底を成す。この反応から生まれる色は安定性があり、そしてタンパク質濃度の増大と共に比例の態様で増大する（Smith, P. K., et al. (1985), Analytical Biochemistry, vol. 150, pp 76-85）。ＢＣＡ検量用溶液は、５０部の試薬Ａと１部の試薬Ｂを混合することによって作成される（試薬ＡはPIERCEのカタログ番号２３２２３であり、アルカリ性炭酸緩衝液中にＢＣＡ及び酒石酸塩を含み；試薬ＢはPIERCEのカタログ番号２３２２４であり、４％ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏを含む）。３００μｌの試料が３．０ｍｌのＢＣＡ検量用溶液と混合される。３７℃で３０分放置した後、当該試料を室温に冷却し、そしてＡ490を当該試料中のタンパク質濃度の測定値として読み取る。ウシ血清アルブミン（PIERCEのカタログ番号２３２０９）の希釈液をスタンダードとして本アッセイに含める。
【０２０６】
試料の前処理
プロテアーゼ含有酵素産物が固体である場合、当該産物は、最初に２０倍量の１００ｍＭ Ｈ3ＢＯ3、１０ｍＭ ３，３’−ジメチルグルタル酸、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ６（緩衝液Ａ）中で少なくとも１５分間、５℃で溶解／懸濁され、そしてこの段階での酵素が懸濁液である場合、当該懸濁液は０．４５μのフィルターで濾過され、透明な溶液を与える。当該溶液は、この時点から、液体プロテアーゼ含有酵素産物として処理される。
【０２０７】
当該プロテアーゼ含有酵素産物が液体である場合、当該産物は最初に６〜８０００Ｄａのカットオフ値の、SpectraPorの透析チューブ（Spectrum Medical Industriesのカタログ番号１３２ ６７０）内で、１００倍量の緩衝液Ａ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）に対して、プロテアーゼ含有酵素産物を高粘度にし得る、サイズ排除クロマトグラフィーにとって有害な製剤化合物を除去するために５℃で少なくとも５時間透析される。
【０２０８】
透析されたプロテアーゼ含有酵素産物は、沈殿物が透析の間形成した場合、０．４５μのフィルターを介して濾過される。透析された酵素産物のタンパク質濃度は、上述のタンパク質濃度アッセイで決定され、そして当該酵素産物は緩衝液Ｂで希釈され、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するサイズ排除クロマトグラフィーに直ちに使用可能な試料を与える。当該酵素産物が５ｍｇ／ｍｌ未満のタンパク質濃度を透析後に有する場合、そのままで使用される。
【０２０９】
サイズ排除クロマトグラフィー
３００ｍｌのHiLoad26/60 Superdex75pgカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を緩衝液Ｂで平衡化する（流速：１ｍｌ／分）。１．０ｍｌのプロテアーゼ含有酵素試料をカラムに適用し、そして当該カラムを緩衝液Ｂで溶出する（流速：１ｍｌ／分）。２．０ｍｌの画分を、適用した試料全てがカラムから溶出されるまで、カラムの出口から回収する。回収した画分は、適当なアッセイによってタンパク質含量（上文のタンパク質濃度アッセイを参照のこと）及びプロテアーゼ活性について解析される。適当なアッセイの例はSuc-AAPF-pNAアッセイである（例２Ｂを参照のこと）。他の適当なアッセイは、例えばCPUアッセイ（例１を参照のこと）、及びプロタザイムＡＫアッセイ（例２Ｄを参照のこと）である。プロテアーゼ活性アッセイについての条件、例えばｐＨは、分画された試料中の、出来る限り多くのプロテアーゼを測定できるように調整される。上文で言及したアッセイの条件は、適当な条件の例である。他の適当な条件は、上記のプロテアーゼ活性の測定を扱う項目で挙げられている。１又は複数のプロテアーゼアッセイにおける活性を有するタンパク質のピークは、プロテアーゼピークとして定義される。プロテアーゼピークの純度は、全ての同定されたプロテアーゼピーク中の全タンパク質量で割ったピークのタンパク質量として計算される。
【０２１０】
プロテアーゼ含有酵素産物の純度は、上記の手順を用いて、全ての同定されたプロテアーゼピーク中のタンパク質量で割った酸安定性プロテアーゼピーク中のタンパク質量として計算される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、３７℃の温度、及びｐＨ２〜ｐＨ１１の範囲のｐＨ値での、２時間のインキュベーション後の、４つのプロテアーゼ（バチルスsp. NCIMB40484由来のズブチリシンファミリーの１つの酸安定性プロテアーゼ(PD498)、及び３つの参照プロテアーゼ（Sub. Novo、及びSub. Novo(Y217L)（共にバチルス・アミロリクエファシエンス由来）、及びSAVINASE（商標））の、ｐＨ−安定性曲線、すなわち残留プロテアーゼ活性を示す；当該活性はｐＨ９．０、及び５℃での２時間のインキュベーション後の残留活性に関連する。
【図２】 図２は、ｐＨ３〜ｐＨ１１の間のｐＨ−活性曲線、すなわちプロテアーゼ活性を示し、これは同じ４つのプロテアーゼの至適ｐＨでのプロテアーゼ活性と関連する。
【図３】 図３は、１５℃から８０℃の間の、ｐＨ９．０での温度−活性曲線、すなわちｐＨ９．０でのプロテアーゼ活性を示し、これは同じ４つのプロテアーゼの至適温度でのプロテアーゼ活性に関連する。
【図４】 図４は、図１に類似しているが、バチルス・アルカロフィラスNCIMB10438、フサリウム・オキシスポラムIFO 4471、パエシロマイセス・リラシナスCBS 102449、アスペルギルスsp. CBS 102448、アクレモニウム・クリソゲナムATCC 48272、及びアクレモニウム・キリエンスATCC 20338由来のズブチリシンファミリーの、６つの他の酸安定性プロテアーゼについてのｐＨ−安定性曲線を示す。
【図５】 図５は図２に類似しているが、図４と同じプロテアーゼについてのｐＨ−活性曲線を示す。
【図６】 図６は、図３に類似しているが、図４と同じプロテアーゼについての、ｐＨ９．０での温度−活性曲線を示す。
Claims (12)
- 動物飼料を製造する方法であって、当該方法が少なくとも１つの酸安定性プロテアーゼを動物試料に加える段階を含んで成り、当該プロテアーゼが
（i）ズブチリシンファミリーに由来し、そして／あるいは
（ii）ＳＳＩで阻害された場合に１０％未満の残留活性を有し、そして、
（iii）３７℃及びｐＨ３．５での２時間のインキュベーション後の、当該プロテアーゼの残留活性が、５℃及びｐＨ９．０での２時間のインキュベーション後の残留活性の少なくとも４０％であり、ここで、当該プロテアーゼが純粋型で、Ａ 280 =1.0の濃度でインキュベートされたものであり、そして当該残留活性がｐＨ９．０及び２５℃でSuc-AAPF-pNAに対して測定されたものである、方法。 - 動物飼料で使用するための組成物を製造する方法であって、当該方法が少なくとも１つの酸安定性プロテアーゼを組成物に加える段階を含んで成り、当該プロテアーゼが
（i）ズブチリシンファミリーに由来し、そして／あるいは
（ii）ＳＳＩで阻害された場合に１０％未満の残留活性を有し、そしてこの中で、
（iii）３７℃及びｐＨ３．５での２時間のインキュベーション後の、当該プロテアーゼの残留活性が、５℃及びｐＨ９．０での２時間のインキュベーション後の残留活性の少なくとも４０％であり、ここで、当該プロテアーゼが純粋型で、Ａ 280 =1.0の濃度でインキュベートされたものであり、そして当該残留活性がｐＨ９．０及び２５℃でSuc-AAPF-pNAに対して測定されたものである、方法。 - プロテアーゼの量が飼料１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇのプロテアーゼ酵素タンパク質である、請求項１に記載の方法。
- プロテアーゼの意図される量が飼料１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇのプロテアーゼ酵素タンパク質である、請求項２に記載の方法。
- 動物飼料の栄養価を向上させるための方法であって、当該方法が少なくとも１つの酸安定性プロテアーゼを動物飼料に加える段階を含んで成り、当該プロテアーゼが
（i）ズブチリシンファミリーに由来し、そして／あるいは
（ii）ＳＳＩで阻害された場合に１０％未満の残留活性を有し、そしてこの中で、
（iii）３７℃及びｐＨ３．５での２時間のインキュベーション後の、当該プロテアーゼの残留活性が、５℃及びｐＨ９．０での２時間のインキュベーション後の残留活性の少なくとも４０％であり、ここで、当該プロテアーゼが純粋型で、Ａ 280 =1.0の濃度でインキュベートされたものであり、そして当該残留活性がｐＨ９．０及び２５℃でSuc-AAPF-pNAに対して測定されたものである、方法。 - （ａ）少なくとも１つの酸安定性プロテアーゼ；及び
（ｂ）少なくとも１つの脂溶性ビタミン、及び／又は
（ｃ）少なくとも１つの水溶性ビタミン、及び／又は
（ｄ）少なくとも１つの微量元素、及び／又は
（ｅ）少なくとも１つの多量元素；
を含んで成る動物飼料添加物であって、
当該プロテアーゼが
（i）ズブチリシンファミリーに由来し、そして／あるいは
（ii）ＳＳＩで阻害された場合に１０％未満の残留活性を有し、そしてこの中で、
（iii）３７℃及びｐＨ３．５での２時間のインキュベーション後の、当該プロテアーゼの残留活性が、５℃及びｐＨ９．０での２時間のインキュベーション後の残留活性の少なくとも４０％であり、ここで、当該プロテアーゼが純粋型で、Ａ 280 =1.0の濃度でインキュベートされたものであり、そして当該残留活性がｐＨ９．０及び２５℃でSuc-AAPF-pNAに対して測定されたものである、添加物。 - プロテアーゼの量が飼料１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇのプロテアーゼタンパク質の意図される添加に相当する、請求項６に記載の動物飼料添加物。
- フィターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、及び／又はベータ−グルカナーゼを更に含んで成る、請求項６又は７に記載の動物飼料添加物。
- ５０〜８００ｇ／ｋｇの粗製タンパク質含量を有し、そして少なくとも１つの酸安定性プロテアーゼを含んで成る動物飼料組成物であって、当該プロテアーゼが
（i）ズブチリシンファミリーに由来し、そして／あるいは
（ii）ＳＳＩで阻害された場合に１０％未満の残留活性を有し、そしてこの中で、
（iii）３７℃及びｐＨ３．５での２時間のインキュベーション後の、当該プロテアーゼの残留活性が、５℃及びｐＨ９．０での２時間のインキュベーション後の残留活性の少なくとも４０％であり、ここで、当該プロテアーゼが純粋型、Ａ 280 =1.0の濃度でインキュベートされたものであり、そして当該残留活性がｐＨ９．０及び２５℃でSuc-AAPF-pNAに対して測定されたものである、組成物。 - プロテアーゼの量が飼料１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇのプロテアーゼタンパク質である、請求項９に記載の動物飼料組成物。
- 少なくとも１つの植物タンパク質又はタンパク質源に少なくとも１つの酸安定性プロテアーゼを加える段階を含んで成る、植物タンパク質の処理方法であって、当該プロテアーゼが
（i）ズブチリシンファミリーに由来し、そして／あるいは
（ii）ＳＳＩで阻害された場合に１０％未満の残留活性を有し、そしてこの中で、
（iii）３７℃及びｐＨ３．５での２時間のインキュベーション後の、当該プロテアーゼの残留活性が、５℃及びｐＨ９．０での２時間のインキュベーション後の残留活性の少なくとも４０％であり、ここで、当該プロテアーゼが純粋型、Ａ 280 =1.0の濃度でインキュベートされたものであり、そして当該残留活性がｐＨ９．０及び２５℃でSuc-AAPF-pNAに対して測定されたものである、方法。 - 少なくとも１つの植物タンパク質源の中にダイズが含まれる、請求項１１に記載の方法。
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