CN1159145A - 酶饲料添加剂以及含有这种添加剂的动物饲料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含有木聚糖酶、蛋白酶、及可含或可不含的β-葡聚糖酶的酶饲料添加剂。每单位量饲料添加剂的木聚糖酶的活力单位与同样单位量的饲料添加剂的β-葡聚糖酶的活力单位的比为1∶0-0.25。木聚糖酶优选为从木霉属Longibrachiatum中得到的低PI木聚糖酶和/或高PI木聚糖酶。蛋白酶优选为在对应于Si(解淀粉芽孢杆菌)的tyr+217氨基酸残基位置处含有取代氨基酸突变的枯草溶菌素，该突变的枯草溶菌素在该位的取代为亮氨酸。

Description

酶饲料添加剂以及含有这种添加剂的动物饲料
本发明涉及一种酶饲料添加剂，具体地说本发明涉及可以降低谷类基动物饲料的饲料转化比的添加剂。
人们一直在寻求改进动物饲料，使动物能够更有效地对其消化。主要关心的一点是改进饲料的饲料转化比(FCR)，同时不增加其每单位重量的成本。FCR是所消耗的饲料量与动物增重的比值。FCR低表明给定量的饲料导致生长动物增重的比例更大。这意味着动物能够更有效地利用饲料。改进饲料FCR的一种途径是提高它的消化性。
饲料的营养成分如它的淀粉、脂肪、蛋白质和氨基酸含量，它们的消化受到各种因素的抑制。这些抑制因素包括：
(I)存在于动物肠中的物质的粘性。这种粘性起因于、至少是部分起因于可溶性非淀粉类多糖如混合交联的β-葡聚糖和***糖基木聚糖；
(II)位于饲料细胞壁内的营养物的截留，特别是谷类糊粉层对营养物的截留。这种截留是谷类细胞壁中的高含量非淀粉类多糖引起的，这些非淀粉类多糖对动物消化***的降解有相当的抵抗力。这会阻止动物对截留在细胞内的营养物的获得利用；以及
(III)动物的内源酶活性不足，特别是幼龄动物中肠微生物群的内源酶活性不足。
对谷物基食料、特别是对那些小麦含量高的食料而言，上述影响消化性的问题尤为显著。
由于饲料中营养物的可消化性差，所以一般配制饲料时需要含有大量的提供能量的物质，以满足动物的营养需要。这类提供能量的物质通常包括淀粉、脂肪、糖、纤维等。在饲料中包含这些提供能量的物质或这类物质来源，这种需求导致了增加相当额外的费用，从经济观点来看这是不利的。
做为解决谷类基饲料消化性差这一问题的尝试，公知的方法包括在动物饲料中添加酶如β-葡聚糖酶或木聚糖酶。例如，WO 91/04673公开了一种用于减轻家禽吸收不良综合症的饲料添加剂，所说的病症使消化力减弱。其中的添加剂含有纤维素酶和木聚糖酶。JP-A-60-75238公开了一种家畜饲料，其中含有包括蛋白酶-、纤维素酶-、淀粉酶-和脂肪酶-活性的混合酶。该文献推测，这些各种酶活性能促进发酵微生物生长，并且这些酶变成饲料可利用的营养成分。
全纤维素酶(即纤维素酶体系)是不同酶的混合物，这些酶水解纤维素(β-1，4-D-葡聚糖)和/或其衍生物(如磷酸溶胀纤维素)并生成初级产物葡萄糖、纤维二糖、和纤维素低聚糖等等。由给定的微生物产生的纤维素酶体系由许多不同种的酶类别组成，这些酶类别包括那些鉴定为外纤维素生物水解酶(EC3.2.1.91)(＂CBH＂)、内葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(＂EG＂)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)(“BG”)活性的酶(Schulein，M.，1988)。而且，这些类别还可进一步分成单个成分。例如，从各种细菌和真菌源如木霉属longibrachiatum的纤维素酶复合物中分离出的多种CBH成分和EG成分，所述的纤维素酶复合物由两种外纤维素生物水解酶、CBH I和CBH II、至少三种内葡聚糖酶、EG I、EG II和EGIII，以及至少一种β-葡萄糖苷酶组成。人们认为在纤维素水解的过程中，内葡聚糖酶和外纤维素生物水解协同作用，而使纤维素变成小的纤维素-低聚糖(主要是纤维二糖)，这些小的纤维素-低聚糖随后在β-葡萄糖苷酶的作用下水解为葡萄糖。除水解纤维素β-1，4键之外，内(endo)-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2 1.4)还水解也含有1，3-键的β-葡聚糖的1，4键。内葡聚糖酶作用于内键生成纤维二糖、葡萄糖和纤维素-低聚糖。外纤维素生物水解酶作用于纤维素聚合物的非还原端生成作为主要产物的纤维二糖。
产生或表达纤维素酶复合物的生物常常还表达木聚糖酶的活性。例如，已经鉴定了由木霉属longibrachiatum产生的两种不同的木聚糖酶。在WO 92/06209中详细叙述了这两种不同的木聚糖酶的纯化以及每种木聚糖酶基因的克隆和测序；这两种木聚糖酶中的一种称为高PI木聚糖酶(PI为约9.0)，另一种称为低PI木聚糖酶(PI为约5.2)。该文献的图16列出了低PI和高PI基因产物的推导氨基酸序列。实施例22还讲授了如何产生超表达低PI和高PI木聚糖酶基因的木霉属longibrachiatum，并且菌株不产生通常与木霉属longibrachiatum有关的非木聚糖酶纤维素酶成分如CBHI、CBH II、EG I、EG II、EGIII和BG。
如上所述，已经知道纤维素酶和木聚糖酶在动物饲料中的作用和蛋白酶的作用一样。然而，人们发现许多天然来源的木聚糖酶含有明显相对较高的β-葡聚糖酶活性。例如，在木霉属longibrachatum天然菌株中，木聚糖酶活性与β-葡聚糖酶活性的比为1∶5。最领人惊奇的是，人们发现当谷物基食料含有最适用量或最适用量左右的木聚糖酶时，同时存在的具有β-葡聚糖酶活性的酶使饲料的FCR增加，这当然是不利的。鉴于该令人惊奇的发现，人们得出的结论是具有β-葡聚糖酶活性的酶不仅不必与木聚糖酶一起添加到饲料中，而且事实上它们的存在还对由于有木聚糖酶和/或蛋白酶的存在而得到的益处产生损害。
在下面的描述和权利要求中，涉及到木聚糖酶活力单位、蛋白酶活力单位和β-葡聚糖酶活力单位。本说明书所用的这三种活力由下列三种试验方法测定。
                   木聚糖酶活性的试验方法
一单位的木聚糖酶活力为在所述的条件下，在一分钟内使一微摩尔还原糖(由木糖等同物表示)从底物中释放出来的酶量。试剂
1.1％(W/V)木聚糖底物
向1.0g木聚糖(Fluka95590)中加入0.5M氢氧化钠10ml。用磁力搅拌器混合30分钟。加入大约40ml的0.05M、pH5.3的乙酸钠缓冲液。用1M乙酸调节pH至5.3。用0.05M、pH5.3的乙酸钠缓冲液补满至100ml。当使用时，应一直混合底物。
2.1M乙酸
用移液管将5.7ml的冰乙酸加到有体积刻度的烧瓶中，并用蒸馏水补至100ml。
3.0.05M的乙酶钠缓冲液，pH5.3
A.用蒸馏水溶解4.1g乙酸钠，并用蒸馏水补至1000ml。
B.用蒸馏水溶解3.0g冰乙酸，并用蒸馏水补至1000ml。
用溶液B将溶液A的pH调节至pH5.3。
4.二硝基水杨酸(DNS)试剂
将20.0g的3，5-二硝基水杨酸悬浮于约800ml的蒸馏水中。边连续搅拌边逐渐加入300ml的氢氧化钠溶液(32.0g的NaOH溶于300ml的蒸馏水中)。边搅拌边用水浴(温度不能超过+48℃)温热该悬浮液，直至溶液澄清。逐渐加入600g酒石酸钾钠。如果需要，温热该溶液(温度不能超过+48℃)直至溶液澄清。
用蒸馏水补至2000ml并用粗烧结的玻璃过滤器过滤。
在黑色的瓶中于室温下贮存。该试剂最多稳定6个月。步骤
1.酶样品
在50℃下平衡1ml的酶稀释液(用0.05M的乙酸钠缓冲液稀释，pH5.3)。加入1ml的木聚糖底物，搅拌并在50℃下保温，精确至30分钟。加入3ml的DNS试剂，搅拌并煮沸反应混合物，精确至5分钟。将反应混合物在冷水浴中冷却至室温，并以蒸馏水为对照在540nm测吸光度。
2.酶空白
将1ml木聚糖底物在+50℃保温30分钟。加入3ml的DNS试剂并搅拌。加入1ml的酶稀释液(溶于0.05M的乙酶钠缓冲液，pH5.3)并搅拌。煮沸混合物，精确至5分钟。将反应混合物在冷水浴中冷却至室温，并以蒸馏水为对照在540nm测吸光度。
酶样品和酶空白之间的吸光度的差异应为0.3-0.5。
3.标准曲线
制备无水木糖在0.05M乙酸钠缓冲液(pH5.3)中的标准溶液。标准溶液的木糖浓度应为0.05-0.5mg/ml。用移液管移取1ml的标准溶液、1ml的木聚糖底物和3ml的DNS试剂至试管中。搅拌并煮沸，精确至5分钟。在冷水浴中冷却至室温并以标准空白为对照在540nm测吸光度。在标准空白中，用1ml的0.05M乙酸钠缓冲液(pH5.3)来替代木糖溶液。除此之外，标准空白像木糖标准样那样进行处理。
绘制木糖浓度对吸光度的函数曲线。对每个新的DNS-试剂制作新的标准曲线。计算
按照下式计算样品的木聚糖酶的活力：
Figure A9519464800091
其中：
A(X)＝酶样品的吸光度
A(O)＝酶空白的吸光度
k＝标准曲线的斜率
Co＝木糖标准曲线的截距
1000＝因子，mmol-＞μmol
Df＝稀释因子(ml/g)
MWxyl＝木糖的分子量(150.13mg/mmol)
t＝反应时间(30分钟)
                    蛋白酶活性的试验方法一单位的蛋白酶活力为在所述条件下，在一分钟内使一微克酚类化合物(由络氨酸等同物表示)从底物中释放出来的酶量。
试剂
1. 0.6％(W/V)的酪蛋白底物
称0.6g干燥的Hammarsten酪蛋白加到200ml烧杯中。用少量的蒸馏水(大约5ml)润湿。当络蛋白被彻底润湿时加入20ml 0.2M的磷酸二氢钠。边搅拌边在+60C下温热该混合物直至酪蛋白溶解，得到乳白色的溶液。加入60ml的蒸馏水，如果必要加入1至2滴的辛基乙醇(抗-发泡剂，也可使用类似的产物)。待冷却至室温后，用0.5M的氢氧化钠和1M的乳酸将pH调节至7.5。将溶液转入带有体积刻度的烧瓶中，并用蒸馏水补至100ml。
如果贮存于冷冻室，底物溶液可用一周。
2.0.2M Na2HPO4溶液：
将17.80g的二水合磷酸氢二钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水补加至500ml。
3.0.02M NaCl溶液：
将1.168g的氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水补加至1000ml。
4.沉淀试剂(TCA)
将18.80g的三氯乙酸(CCl3COOH)、18.10g的无水乙酸钠(CH3COONa和18.80g的乙酸(CH3COOH)溶于蒸馏水中，并用蒸馏水补加至1000ml。
5.苯酚试剂
在试验之前，将一份福林-塞尔卡托(Folin-Ciocalteau)苯酚试剂与一份蒸馏水混合。
6.0.55M Na2CO3溶液
将58.295g的碳酸二钠溶于蒸溜水中，并用蒸馏水补加至1000ml。步骤：
1.酶样品
在+40℃下平衡1ml的酶稀释液(用0.02M的NaCl溶液稀释)(约5分钟)。加入5ml的平衡过的酪蛋白底物，搅拌并在+40℃下保温，精确至30分钟。加入5ml的沉淀试剂并搅拌。在+40℃下保温，精确至30分钟，并立即用滤纸(Whatman 1号滤纸或Macherey Nagel 640 we滤纸)过滤。
用移液管移取2ml的滤液、5ml的0.55M的Na2CO3溶液和1ml的苯酚试剂。搅拌并在+40℃下保温30分钟。冷却至室温，并以蒸馏水为对照测量在660nm的吸光度。
2.酶空白
在+40℃下平衡1ml的酶稀释液(用0.02M的NaCl溶液稀释)(约5分钟)。加入5ml的沉淀试剂，搅拌并在+40℃下保温，精确至30分钟。加入5ml的酪蛋白底物，搅拌并在+40℃下保温，精确至30分钟。立即用滤纸(Whatman 1号滤纸或Macherey Nagel 640 we滤纸)过滤。
像处理酶样品一样处理该滤液。
酶样品和酶空白间的吸光度的差异应在0.2-0.5。
3.标准曲线
称量10mg的L-酪氨酸，倒入标有体积刻度的烧瓶中，使之溶解于0.02M的NaCl溶液中，并用0.02M的NaCl溶液补加至100ml，以此制备酪氨酸贮液。
用0.02M的NaCl溶液对酪氨酸贮液进行下列稀释，制备酪氨酸稀释液：
1∶50＝2μg/ml
1∶20＝5μg/ml
1∶10＝10μg/ml
1∶5＝20μg/ml
1∶3＝33μg/ml
1∶2＝50μg/ml
用移液管移取各酪氨酸稀释液2ml、0.55M的Na2CO3溶液5ml和苯酚试剂1ml。搅拌并在+40℃下保温30分钟。冷却至室温，并以蒸馏水为对照测其在660nm的吸光度。
绘制酪氨酸浓度对吸光度的函数曲线。计算
按下列公式计算样品的蛋白酶活力：
其中：
A(X)＝酶样品的吸光度
A(O)＝酶空白的吸光度
K   ＝标准曲线的斜率
F   ＝反应稀释因子(＝11)
Df  ＝稀释因子(ml/g)
t   ＝反应时间(30分钟)
                  β-葡聚糖酶活力的试验方法
一单位的β-葡聚糖酶活力是在所述条件下，在1分钟内从底物中释放1μmol还原糖(以葡萄糖对应物表示)的酶量。试剂
1.1.0％(w/v)β-葡聚糖底物
用10ml的乙醇将1.0g混合交联的β-(1、3)(1、4)-葡聚糖(BioconBiochemicals Ltd.)润湿。加入约80ml的蒸馏水并加热至沸腾。在用力搅拌的同时继续煮沸直至葡聚糖溶解，并得到混浊的溶液。连续搅拌将该混浊的溶液冷却至室温，加入蒸馏水将β-葡聚糖的浓度调整到1.0％(w/w)。通过玻璃纤维滤纸过滤。
该底物可以立即使用。如果贮存于冷冻室中，该底物可用2天。
2.0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0
A.将8.2g无水乙酸钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水补加至1000ml。
B.将6.0g冰乙酸溶于蒸馏水中，并用蒸馏水补加至1000ml。
用溶液B将溶液A的pH调节到5.0。
3.二硝基水杨酸(DNS)试剂
将20.0g 3，5-二硝基水杨酸悬浮于约800ml的蒸馏水中。边连续搅拌边逐渐加入300ml的氢氧化钠溶液(32.0g的NaOH溶于300ml的蒸馏水中)。边搅拌边在水浴(温度不能超过+48℃)中温热该悬浮液，直至溶液澄清。逐渐加入600g的酒石酸钾钠。如果需要，温热该溶液(温度不能超过+48℃)直至溶液澄清。
用蒸馏水补至2000ml并用粗烧结的玻璃过滤器过滤。
于室温下在黑色的瓶中贮存。该试剂最多稳定6个月。步骤
1.酶样品
在30℃下平衡1ml的酶稀释液(用0.05M的乙酸钠缓冲液稀释，pH5.0)。加入1ml的β-葡聚糖酶底物，搅拌之并在30℃下保温，精确至10分钟。加入3ml的DNS试剂，搅拌并煮沸反应混合物，精确至5分钟。将反应混合物在冷水浴中冷却至室温，并以蒸馏水为对照在540nm测吸光度。
2.酶空白
将1ml β-葡聚糖酶底物在+30℃下保温10分钟。加入3ml的DNS溶液并且搅拌。加入1ml酶稀释液(用0.1M的乙酸钠缓冲液稀释，pH5.0)并且搅拌。煮沸混合物精确至5分钟。将反应混合物在冷水浴中冷却至室温，并以蒸馏水为对照在540nm测吸光度。
酶样品和酶空白之间的吸光度的差异应为0.3-0.5。
3.标准曲线
将无水葡萄糖溶于蒸馏水中，以此来制备标准溶液。标准溶液的葡萄糖浓度应为0.1-0.6mg/ml。用移液管移取1ml葡萄糖标准溶液、1ml蒸馏水和3mlDNS试剂加到试管中。搅拌并煮沸，精确至5分钟。在冷水浴中冷却至室温，并以标准空白为对照在540nm测吸光度。在标准空白中，用1ml的蒸馏水替代葡萄糖溶液，除此之外，像葡萄糖标准样那样处理标准空白。
绘制葡萄糖浓度对吸光度的函数曲线。对每个新的DNS-试剂制作新的标准曲线。计算
按照下式计算样品的β-葡聚糖酶的活力：
Figure A9519464800131
其中：
A(X)＝酶样品的吸光度
A(O)＝酶空白的吸光度
k＝标准曲线的斜率
Co＝葡萄糖标准曲线的截距
1000＝因子，mmol-＞μmol
Df＝稀释因子(ml/g)
MWglu＝葡萄糖的分子量(180.16mg/mmol)
t＝反应时间(10分钟)
基于上述考虑，本发明的目的在于提供酶饲料添加剂，以改进谷物基饲料的FCR(和/或)提高饲料的消化性。
因此，本发明提供的酶饲料添加剂含有：
(i)木聚糖酶；
(ii)蛋白酶；以及可含或可不含的
(iii)β-葡聚糖酶
其中每克饲料添加剂的木聚糖酶活力单位与每克饲料添加剂的β-葡聚糖酶活力单位间的比值为1∶0-0.25。
已经发现包含有上述酶饲料添加剂的动物食料可使动物更有效地对之进行消化。因此，向饲料中加入该添加剂能够提高动物从饲料中所得到的饲料蛋白和能量的比例。这反过来改进了饲料的FCR，使它使用起来更经济。
通过改良常规饲料也可以使本发明的这一目的得到利用，即通过降低常规饲料的能量和/或蛋白质和/或氨基酸含量而同时保持可被动物利用的同样能量、蛋白质和氨基酸的营养水平。这意味着与常规饲料相比，可降低通常包含在动物饲料里的费用较高的补充能量和蛋白质的量。补充能量的物质包括脂肪。补充蛋白质的物质包括鱼粉、肉粉、大豆、油菜籽和canola。这样可以在不降低其营养价值的前提下，使单位重量的动物饲料的成本明显下降。或者，与常规的饲料相比甚至可以另外降低补充氨基酸的量，这也能导致明显的成本降低。
可用多种方式制备本发明的酶饲料添加剂。例如，可以通过简单将具有适当活力的不同的酶混合而产生酶混合物来制备。既可将该酶混合物直接与饲料混合，也可以更常规地将之浸渗到谷物基载体原料如小麦、玉米或大豆粉上。根据本发明，这样浸渗过的载体也形成酶饲料添加剂。
另外，由例如磨碎的小麦或玉米形成的谷物基载体既可与具有适当活力的酶同时浸渗，也可以相继浸渗。例如，可以首先用木聚糖酶喷淋磨碎的小麦载体，然后再用蛋白酶喷淋，最后选择性地用β-葡聚糖酶喷淋。根据本发明，与这些酶一起浸渗的载体材料也形成酶饲料添加剂。
本发明的饲料添加剂可直接与动物饲料混合，或者与一种或多种饲料添加剂如维生素饲料添加剂、矿物质饲料添加剂、及氨基酸饲料添加剂相混合。然后将适当量的含有几种不同类型成分的所得饲料添加剂与饲料混合。
含有谷物基载体的本发明的饲料添加剂在饲料中的混合量一般为每千克饲料0.01-50g，优选每千克饲料0.1-10g，更优选每千克饲料约1g。
制备本发明酶饲料添加剂的另一种途径是通过重组DNA技术来构建微生物，该微生物产生具有相对希望量的所需的酶。这可通过增加木聚糖酶编码基因的拷贝数和/或通过在木聚糖酶基因前面使用强启动子来实现。另外，可使该微生物菌株缺失一些纤维素酶基因，特别是缺失外葡聚糖酶基因。
本发明提供的酶饲料添加剂还可以包含其它的酶，如α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露糖酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶和脂肪酶中的一种或多种。例如，既可以将具有所需活力的酶，在浸渗到谷物基载体上之前和木聚糖酶和蛋白酶混合，也可以将这些酶与木聚糖酶和蛋白酶同时浸渗到或相继浸渗到谷物基载体上。然后将该载体与谷物基饲料混合以制备最终的饲料。还可将酶饲料添加剂配制成单个酶活性溶液，然后将该溶液和预先加工成丸或浆状饲料原料混合。
通过将酶饲料添加剂掺入到动物可利用的辅助饲料(并且是不同的)或饮用水中，也可将酶饲料添加剂包含在动物的食料中。因此，虽然将本发明提供的酶混合物掺入到谷物基饲料本身中是本发明特别优选的方面，但这种掺入并不是必需的。
本发明提供的酶混合物含有的主要成分是木聚糖酶。该木聚糖酶可得自细菌，如杆菌、链霉菌、梭状芽孢杆菌、热单孢菌(Thermonospora)、小四孢菌(Microtetra-spora)、或瘤胃球菌。但优选的木聚糖酶得自真菌如木霉、曲霉、腐殖霉或Neocallimastix，特别优选的木聚糖酶是得自木霉属longibrachiatum的低PI(PI＝5.2)木聚糖酶和/或高PI(PI＝9.0)木聚糖酶，所述的木霉属longibrachitum可由W92/06209中的实施例22的方法制得。特别优选的木聚糖酶是高PI木聚糖酶。这样的木聚糖酶组合物，其每单位量的木聚糖酶活力单位与每相同单位量的β-葡聚糖酶活力单位的比值约为1∶0.005。该木聚糖酶可能是突变的木聚糖酶，它具有未在自然界在发现过的氨基酸序列，所述的序列对应于经修饰的天然存在的木聚糖酶经过修饰的序列，即在天然存在的木聚糖酶的相应序列的相应序列中***、缺失或置换一个或多个氨基酸残基而得的修饰过的序列。
酶生产领域的技术人员很容易认识到诸如这里所述的那些酶的组合物可由几种不同的方法制备。例如，通过遗传工程改造表达木聚糖酶的宿主有机体，使不需要的基因缺失或者被修饰，以钝化基因或其表达产物，由此可以生产出含有木聚糖酶并且仅具有有限量β-葡聚糖酶活性的酶组合物。此外，可通过纯化的方法来制备酶组合物，例如，可以从全部的纤维素酶复合物中纯化出特别需要的活性(木聚糖酶)。WO92/06209中描述了适当的方法。其它纯化方法描述于美国专利5,328,841中，包括使用聚乙二醇等等进行的纯化。同样，通过发酵优化过程也可以制备所述的酶组合物，在发酵优化过程中改变pH、温度、碳源、或者将这些因素结合起来以此改变酶成分活性的比值。
根据本发明最优选的方面，木聚糖酶来自由转化宿主产生的超表达高pI或低pI木聚糖酶的木霉属longibrachiatum，其中的转化宿主缺乏有功能的内葡聚糖酶I(EG I)、有功能的内葡聚糖酶II(EG II)、有功能的纤维素生物水解酶I(CBH I)和有功能的纤维素生物水解酶II(CBH II)中的一种或几种。上面提到的WO92/06209中描述了这种转化宿主的制备及高pI和低pI木聚糖酶的产生。
与得自天然来源的木聚糖酶相比，从这种宿主中得到的木聚糖酶具有明显较低水平的具有β(1、4)-葡聚糖活力的酶。通过使用这种宿主，可得到含有与每单位量中1单位木聚糖酶活力相比仅为每相同单位量中0.005单位的β-葡聚糖酶活力的酶组合物。本发明优选的情况是酶饲料添加剂中含有的木聚糖酶活力与β-葡聚糖酶活力的比值为1∶0-0.01，且更优选1∶0-0.005。
每克饲料添加剂中木聚糖酶活力单位与每克饲料添加剂中蛋白酶活力单位的比值优选为1∶0.001-1,000，更优选1∶0.01-100，最优选1∶0.1-10。
本发明提供的酶混合物中的主要成分还包括蛋白酶。蛋白酶优选为可从杆菌属的菌种如(包括，但不限于此)解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)中得到的枯草溶菌素。
适宜的蛋白酶包括(但不限于此)下列可商购得到的蛋白酶：NovoNEUTRASE(商标)(可从Novo Nordisk购得)；PURAFECT(可从Genencor International，Inc购得)；SAVINASE(可从Novo Nordisk购得)；MAXACAL(可从Gist-Brocades购得)；BURAZYM(可从NovoNordisk购得)；及MAXAPEM(可从Gist-Brocades购得)。
枯草溶菌素也可以是具有未在自然界中发现的氨基酸序列的突变枯草溶菌素，所述的序列对应于天然存在的枯草溶菌素经修饰的序列，即在天然存在的枯草溶菌素的相应序列中***缺失或置换一个或多个氨基酸残基而得的序列。适宜的突变枯草溶菌素在EP-A-0130756(相应于美国的再审查专利US-Re-34606)(包括在+155、+104、+222、+166、+33、+169、+189、+217、+156、+152位置处的突变)；EP-A-0251446；WO91/06637等中有所描述。最优选的枯草溶菌素是得自解淀粉芽孢杆菌的突变枯草溶菌素，该突变枯草溶菌素含有在相应于tyr+217氨基酸残基位置处被亮氨酸取代的突变。
文献US-Re-34606和EP-A-0251446中详细描述了产生这些突变枯草溶菌素的方法。
包含在本发明的酶混合物中的蛋白酶应当不含或相对不含β-葡聚糖酶活性。这是为了保证使通过将蛋白酶与木聚糖酶混合制备得到的酶饲料添加剂，具有如前所述的低水平β-葡聚糖酶活性，或者无β-葡聚糖酶活性。与饲料添加剂中的木聚糖酶成分相比，蛋白酶的问题较少，这是因为天然产生蛋白酶的微生物不会产生高含量的β-葡聚糖酶。
人们发现，本发明酶饲料添加剂中这种将木聚糖酶和蛋白酶的结合，使得它们能够按照彼此增强相互作用而具有互补协同的效用，本发明以此获得了降低谷物基动物饲料FCR的优点。
如上所述，本发明提供的酶混合物优选用作在制备谷物基饲料时的饲料添加剂。
根据本发明的另一目的，该谷物基饲料含有至少25％重量的、更优选含有至少35％重量的小麦或玉米或这两种谷物的混合物，该饲料还含有木聚糖酶，其含量为每千克饲料包含100-100,000单位的木聚糖酶活力；另外饲料中还含有蛋白酶，其含量为每千克饲料包含100-100,000单位的蛋白酶活力；并且可含或可不含β-葡聚糖酶。每千克饲料木聚糖酶的活力单位与每千克饲料的β-葡聚糖酶的活力单位的比值落在1∶0-0.25范围之内。
加入到饲料中的饲料添加剂的量优选为使所得饲料每千克分别含有1,000-10,000单位的木聚糖酶活力和蛋白酶活力。
本发明的另一个目的提供了谷物基饲料，该饲料含有至少25％重量的小麦和/或玉米以及每千克100,000单位的突变枯草溶菌素，该突变枯草溶菌素含有得自解淀粉芽孢杆菌的枯草溶菌素，对应于其tyr+217位的氨基酸残基被亮氨酸所取代。
本发明的谷物基饲料适合于如火鸡、鹅、鸭、猪、羊和牛等动物。该饲料特别适合于禽类和猪，特别适合于肉用雏鸡。
本发明更进一步的目的提供了含有低pI木聚糖酶和/或高pI木聚糖酶以及选择性含有的β-葡聚糖酶的组合物作为饲料添加剂的用途，其中所述的木聚糖酶可从木霉属longibrachitum中得到，该组合物的特征在于每克组合物的木聚糖酶活力单位与每克组合物的β-葡聚糖酶活力单位间的比为1∶0-0.25。
将上述组合物用作饲料添加剂得到了具有改进FCR的谷物基饲料。根据本发明这个目的，该饲料含有(i)至少25％重量的小麦和/或玉米；(ii)可得自木霉属longibrachitum的高pI木聚糖酶和/或低pI木聚糖酶，木聚糖酶的含量为每千克饲料中含有100-100,000单位的木聚糖酶活力。
上述用途以及掺入高pI和/或低pI木聚糖酶的谷物基饲料能够使动物更有效地消化其饲料。因此，将这种含有木聚糖酶的饲料添加剂加入到饲料中，提高了动物可从饲料中获得营养即饲料蛋白质和能量的比例。同样，饲料FCR的改善可使其更经济实用。含有这种木聚糖酶的饲料添加剂，当然可用与前面描述的制备饲料添加剂方法相同的方法来生产。
下面通过实施例的方式对本发明作进一步阐述。
                        实施例1
用下面表1所列的小麦基初始饲料喂养Cobb雄性肉用雏鸡，直至21天的鸡龄。
                   表1
成分                             浓度
                                 (g/kg)
小麦                             637.1
大豆粉                           300.0
石灰石                            13.3
磷酸二钙                          13.0
DL-蛋氨酸                          3.1
精氨酸                             1.2
L-赖氨酸HCl                        1.3
维生素混合物                       1.0
矿物质混合物                       1.0
玉米油                            35.0
盐                                 4.0
计算出的组成
ME Kcal/kg                      3004.0
CP％                              22.8
钙％                              0.87
可利用的磷                        0.40
蛋氨酸                            0.64
蛋氨酸+半胱氨酸                   1.01
赖氨酸                            1.29
上述的起始鸡食中补充了不同量的从绿色木霉(Trichoderma Viride)获到的木聚糖酶以及/或者从木霉属longibrachiatum得到的β-葡聚糖酶。所述的绿色木霉是突变的且因有相对高的木聚糖酶的活性而被选择得到的菌株，每单位量的该绿色木霉产生55单位的β-葡聚糖酶活力对1,000单位的木聚糖酶活力。将鸡群分成24个分别独立的组，每组30只鸡。向24组鸡食中补充0、500、1,000、2,000、4,000和8,000单位/千克木聚糖酶与0、250、500和1,000单位/千克β-葡聚糖酶组合的一种组合。
测得这些试验的各个饲料转化比，所得数值列于下表2：
                                     表2
加入的β-葡聚糖酶(单位/kg)     0      250     500     1,000    平均值
    木聚糖酶(单位/kg)
         0    1.54     1.54    1.48     1.53     1.52
       500    1.52     1.51    1.51     1.50     1.51
      1000    1.47     1.49    1.52     1.54     1.51
      2000    1.45     1.48    1.51     1.49     1.48
      4000    1.50     1.51    1.46     1.49     1.49
      8000    1.55     1.58    1.54     1.51     1.55
从上面表2所列数据中明显地看出，β-葡聚糖酶活性的存在产生了不利的影响，它使FCR值增加，尤其是在木聚糖酶的1,000-3,000单位/千克左右的最佳含量时。
从上表2所列结果中得出的结论是，存在于饲料中的木聚糖酶的活力单位应当至少比β-葡聚糖酶的活力单位高4倍，以便FCR值可以得到改善。木聚糖酶的活力单位优选应当至少比β-葡聚糖酶活力单位高100倍，更优选至少高1,000倍。
                       实施例2
用列于下表3中的初始食料和结束时食料分别在其寿命的第0-21天和第22-42天喂养几组(Ross1)肉用雏鸡(雄性雌性皆有)。每组包括90只鸡。
                   表3
成分(千克/吨)               初始食料     结束时的食料
   小麦                      612.2        668.9
   大豆粉                    318.8        240.9
   大豆油                     32.6         55.4
   盐                         3.03         3.01
   DL蛋氨酸                   2.01          0.4
   石灰石                     13.8         14.7
   磷酸二钙                   12.5         11.7
   矿物质/矿物质              10.0         10.0
   补加物
   计算分析(％)             初始食料     结束时的食料
   粗蛋白质                   23.0         20.0
   钙                         0.90         0.90
   总的磷                     0.67         0.63
   可利用的磷                 0.42         0.40
   脂肪                       4.63         6.82
   纤维                       2.58         2.46
   赖氨酸                     1.21         0.99
   蛋氨酸                     0.54         0.33
   钠                         0.15         0.15
   钾                         0.92         0.78
   氯                         0.24         0.24
对照组雏鸡的食料不补加任何酶。第二组Z的食料中补加3,000单位/千克的高pI木聚糖酶，该酶是由如WO92/06209所述缺乏功能EGI、EG II、CBH I和CBH II的longibrachiatum木霉转化菌株产生的。A、C、E组的食料中除了分别补加2,00、4,000和6,000单位/千克的从Novo Nordisk获得的Novo Neutrase(TM)外，还补加了同样量的木聚糖酶。B、D和F组的食料中除了分别补加2,000、4,000和6,000单位/千克的突变枯草溶菌素外，还补加了相同量的高pI木聚糖酶，其中的突变枯草溶菌素，如同US-Re.-34606专利中描述的那样，对应于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的tyr+217位置的氨基酸残基被亮氨酸取代。这些试验的结果列于下表4。
                                                    表4
    组   对照组     Z     A     B     C     D     E     F
最终体量(kg)    2.21    2.20    2.20    2.20    2.22    2.19    2.23    2.20
每只小鸡每天摄入的饲料(g)    93.1    94.5    94.6    92.4    93.2    92.2    94.2    92.7
PCR(致死调整后的)    1.85    1.85    1.85    1.82    1.85    1.82    1.82    1.82
从以上数据可以计算出，当使用木聚糖酶和Novo Neutrase蛋白酶时，FCR的平值为1.84。而使用木聚糖酶和本发明的突变枯草溶菌素时，FCR的平均值为1.82。Z组和A-F各组造成FCR值增加，它们的FCR值要么等于要么优于对照组所得的FCR值。
                       实施例3
用实施例1中表1所列的小麦基初始饲料喂养两组0-7天的Ross 1肉用雏鸡。初始饲料中不补加任何抗生素、抗球虫病药(anticoccidial)或任何酶。到了第7-21天，用下表5所列的麦芽汁形式的小麦基基础饲料喂养各组：
             表5
成分                      数量(wt.％)
软质小麦                    65.5
大豆粉48％C.P.              27.3
豆油                         3.1
盐                           0.3
DL蛋氨酸                     0.2
石灰石                       1.4
磷酸二钙                     1.2
维生素/矿物质                1.0
补加物
第一对照组的鸡食中不补加任何酶。喂养第二试验组的上述小麦基饲料中补加得自木霉属longibrachitum的富含低pI木聚糖酶的酶；所述的菌株(如WO 92/06209描述)，缺乏功能EG I、EG II、CBH I和CBHII。在小麦食料中掺入木聚糖酶的量为184单位/千克。对照组的FCR平均值为2.00。相反，用补加了低pI木聚糖酶的饲料喂养的试验组具有1.89的FCR。通过加入木聚糖酶使饲料的FCR值降低表明饲料的营养性能得到了改善。
                         实施例4
为评估得自木霉属longibrachitum的富含高pI木聚糖酶的酶的效用，各包括12只***过的PIC市售遗传型公猪的6个组分别用6种不同的丸料型食料喂养。在开始试验时，受试的猪龄均为10周龄左右。因此，按照下表6配制3种具有不同玉米/小麦比值的基础饲料，在表6中各组分的含量以千克/每吨饲料表示。
                              表6
玉米小麦小麦麦麸大豆粉(44)肉和骨头粉Canola油L-赖氨酸维生素和矿物质 20％小麦食料42420010020050-1.3525  40％小麦食料22440010020050-1.1525  60％小麦食料196001002005050.9525
对每种食料进行空白(不补加酶)对照测试，并且对每千克饲料补加6,270单位木聚糖酶后再进行测试。测试用的木聚糖酶如WO 92/06209中描述的那样是得自缺乏功能EG I、EG II、CBH I和CBH II的木霉属longibrachitum的富含高pI木聚糖酶的酶。
这些不同试验的结果列于下面的表7。
                                     表7
小麦(％)          20            40          60
玉米(％)          42            22          2
  对照饲料  饲料加木聚糖酶   对照饲料  饲料加木聚糖酶   对照饲料   饲料加木聚糖酶
开始时的体重(kg)   22.9    22.6   21.8    21.8   24.6    23.4
结束时的体重(kg)   75.0    82.7   78.7    82.2   78.8    82.8
每日增重(g)   930    1073   1015    1076   974    1061
每日摄入的饲料量(g)   2546    2773   2680    2638   2826    2942
FCR   2.76    2.59   2.68    2.47   2.93    2.81
从表7所列的结果可以看出，加入木聚糖酶后，食用了含有60％重量的由不同比例玉米和小麦组成的谷物食料，猪在试验结束前的每日活体重增重得到了平均增加9％的明显提高。总之，饲料的摄入量和FCR得到了明显改善。
                        实施例5
用表8所列的玉米基浆型初始饲料喂养4组Nicholas雄性火鸡直至其到21天的鸡龄。
                 表8
成分                         数量(wt.％)
玉米                          36.65
大豆粉(45.6％CP)               55.4
动物-植物脂肪                   3.2
磷酸二钙                        2.3
石灰石                          1.5
矿物质预混物                    0.3
维生素预混物                    0.3
氯化钠                          0.15
DL蛋氨酸                        0.2
第一组(对照组)用表8的未添加补加物的饲料进行喂养。其它三组(试验组)的饲料分别补加2,000单位/kg、4,000单位/kg及6,000单位/kg的突变枯草溶菌素；所述的枯草溶菌素在US-Re.-34606专利中有所描述，即在相应于解淀粉芽孢杆菌草杆菌蛋白酶的tyr+217氨基酸残基位置被亮氨酸取代。测试结果列于下面的表9。
                表9
处理食料           21天体重(克/鸡) FCR对照饲料                 570       1.39饲料+2000U/kg的蛋白酶    543       1.37饲料+4000U/kg的蛋白酶    570       1.36饲料+6000U/kg的蛋白酶    566       1.35
从以上的数据可以看出，增加加入到饲料中的蛋白酶的含量可获得使饲料FCR值降低的有益结果。
用根据本发明制备的饲料喂养鹅、鸭、羊和牛、以及鸡、火鸡和猪时，可以取得上面已证明的改善FCR值的效果。

Claims (28)

1.一种酶饲料添加剂，含有：
    (i)木聚糖酶；
    (ii)蛋白酶；并且可含或可不含
    (iii)β-葡聚糖酶；
其中每克饲料添加剂的木聚糖酶活力单位与每克饲料添加剂的β-葡聚糖酶活力单位的比值为1∶0-0.25。
2.根据权利要求1的酶饲料添加剂，其中的木聚糖酶得自细菌。
3.根据权利要求2的酶饲料添加剂，其中的细菌为杆菌属、链霉菌属、梭状芽孢杆菌属或瘤胃球菌属细菌。
4.根据权利要求1的酶饲料添加剂，其中的木聚糖酶得自真菌。
5.根据权利要求4的酶饲料添加剂，其中的真菌为木霉属、曲霉属、腐质霉属或Neocallimastix真菌。
6.根据权利要求5的酶饲料添加剂，其中的木聚糖酶为可得自木霉属longibrachiatum的低PI木聚糖酶和/或高PI木聚糖酶。
7.根据权利要求6的酶饲料添加剂，含有高PI木聚糖酶。
8.根据权利要求1的酶饲料添加剂，其中木聚糖酶为具有在自然界中未发现的氨基酸序列的突变木聚糖酶，所述的序列对应于天然存在的木聚糖酶的序列，通过***、缺失或置换天然存在的木聚糖酶中的一个或多个氨基酸残基加以修饰。
9.根据前述任一权利要求的酶饲料添加剂，其中的蛋白酶为枯草溶菌素。
10.根据权利要求9的酶饲料添加剂，其中的枯草溶菌素衍生自杆菌属。
11.根据权利要求10的酶饲料添加剂，其中枯草溶菌素衍生自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、缓慢芽孢杆菌(Busilluslentus)、地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)。
12.根据权利要求9的酶饲料添加剂，其中枯草溶菌素为具有在自然界中未发现的氨基酸序列的突变枯草溶菌素，所述的序列对应于天然存在的枯草溶菌素的序列，通过***、缺失或置换天然存在的枯草溶菌素的一个或多个氨基酸残基加以修饰。
13.根据权利要求12的酶饲料添加剂，其中突变枯草溶菌素在相应于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的asn+155、tyr+104、met+222、gly+166、ser+33、gly+169、phe+189、tyr+217、glu+156或ala+152氨基酸残基位置处含有为自然界中存在的其它19种氨基酸中的一种所取代的氨基酸。
14.根据权利要求13的酶饲料添加剂，其中突变枯草溶菌素在相应于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的tyr+217氨基酸残基位置处被亮氨酸取代。
15.根据前述任一权利要求的酶饲料添加剂，其中木聚糖酶与β-葡聚糖酶的活力单位的比值为1∶0-0.01。
16.根据权利要求15的酶饲料添加剂，其中木聚糖酶与β-葡聚糖酶的活力单位的比值为1∶0-0.005。
17.根据前述任一权利要求的酶饲料添加剂，其中每克饲料添加剂的木聚糖酶的活力单位与每克饲料添加剂的β-葡聚糖酶的活力单位的比值为1∶001-1000。
18.根据前述任一权利要求的酶饲料添加剂，还至少含有α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露糖酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶和脂肪酶中的一种。
19.根据前述任一权利要求的酶饲料添加剂，还含有载体。
20.根据权利要求19的酶饲料添加剂，其中的载体为磨碎的小麦、玉米、大豆或任何这些原料的副产品。
21.前述任一权利要求的酶饲料添加剂的用途，用于改善饲料的转化比和/或提高谷物基饲料的可消化性。
22.一种谷物基饲料，含有(i)至少25％重量的小麦和/或玉米；(ii)木聚糖酶，其量为每千克饲料含有100-100,000单位的木聚糖酶活力；(iii)蛋白酶，其量为每千克饲料含有100-100,000单位的蛋白酶活力；及可含或者可不含(iv)β-葡聚糖酶；其中每千克饲料的木聚糖酶活力单位与每千克饲料的β-葡聚糖酶活力单位的比值为1∶0-0.25。
23.根据权利要求22的谷物基饲料，含有1,000-10,000单位/千克的木聚糖酶活力和1,000-10,000单位/千克的蛋白酶活力。
24.根据权利要求22或23的谷物基饲料，含有至少35％重量的小麦和/或玉米。
25.一种谷物基饲料，含有至少25％重量的小麦和/或玉米及100-100,000单位/千克的突变枯草溶菌素；所述的突变枯草溶菌素在相应于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的tyr+217氨基酸残基位置处被亮氨酸取代。
26.一种谷物基饲料，含有(i)至少25％重量的小麦和/或玉米；及(ii)从木霉属longibrachiatum中得到的高PI木聚糖酶和/或低PI木聚糖酶，其量为每千克饲料具有100-100,000单位的木聚糖酶活力。
27.根据权利要求22-26中任一权利要求的谷物基饲料作为家禽饲料或猪饲料的用途。
28.将含有高PI木聚糖酶和/或低PI木聚糖酶以及或含或不含β-葡聚糖酶的组合物作为饲料添加剂的用途，所述的木聚糖酶是从木霉属longibrachiatum中得到的，其特征在于每克组合物的木聚糖酶活力单位与β-葡聚糖酶活力单位的比为1∶0-0.25。
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