CN1379683A - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一个由单一的变异体或基本上单一的变异体的减毒轮状病毒种群,所述变异体由编码称为VP4和VP7的主要病毒蛋白中至少一种的核苷酸序列限定。本发明特别提供一个称为P43的轮状病毒种群。本发明还提供一种轮状病毒疫苗的新型制剂,所述制剂为置于舌上时立即溶解的速溶形式。

Description

疫苗
本发明涉及新的疫苗制剂、制备它们的方法及其在治疗中的应用。本发明尤其涉及新的轮状病毒疫苗制剂。
在世界上的许多地区，急性感染性腹泻是疾病和死亡的一个主要病因。在发展中国家里，腹泻病的影响是惊人的。对于亚洲、非洲及拉丁美洲，估计每年有三十亿至四十亿的腹泻病例，且那些病例中的大约500-1000万病例导致死亡(Walsh，J.A.等：N.Engl.J.Med.，301：967-974(1979))。
已判明轮状病毒为婴幼儿重症腹泻的最重要病因之一(Estes，M.K.Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology，第三版，由Fields等编辑，Raven Publishers，Philadelphia，1996)。估计轮状病毒病是造成每年超过一百万人死亡的主要原因。轮状病毒诱发的疾病最常侵袭年龄在6个月和24个月之间的儿童，且所述疾病的流行高峰一般发生于温带气候中较凉的月份期间以及热带地区的全年期间。轮状病毒一般通过粪便-口途径在人群中传播，其潜伏期大约1天至大约3天。和6个月至24个月年龄组的感染不同，新生儿通常是无症状的或仅有轻度的病。与在幼儿中通常遇到的重症疾病比较起来，大多数成年人由于先前的轮状病毒感染而得到保护，因此大多数成年人的感染是轻度的或是无症状的(Offit，P.A.等，Comp.Ther.，8(8)：21-26，1982)。
轮状病毒通常是球形的，且它们的名字来源于其特殊的外部和内部衣壳结构或双层衣壳结构。通常，轮状病毒的双层衣壳结构包围着一个包含基因组的蛋白内壳或核心。轮状病毒的基因组由11个双链RNA节段组成；所述11个双链RNA节段至少编码11种特殊的病毒蛋白。这些病毒蛋白中称为VP4和VP7的两种蛋白排列在双层衣壳结构的外部。轮状病毒的内衣壳呈现一种蛋白，该蛋白是名为VP6的轮状病毒蛋白。还不清楚这三种特殊的轮状病毒蛋白在引发轮状病毒感染后的免疫应答方面的相对重要性。然而，VP6蛋白决定组抗原和亚组抗原，而VP4和VP7蛋白是血清型特异性的决定因子。
VP7蛋白是一种38,000MW的糖蛋白(而非糖基化的该蛋白为34,000MW)，所述蛋白是基因组节段7、8或9的翻译产物，具体的基因组节段号随病毒株而定。在轮状病毒感染后，这种蛋白刺激主要中和抗体的形成。VP4蛋白是一种非糖基化的、大约88,000MW的蛋白，该蛋白是基因组节段4的翻译产物。在轮状病毒感染后，这种蛋白也激发中和抗体。
因为VP4和VP7蛋白是中和抗体所针对的病毒蛋白，所以相信它们是用于开发轮状病毒疫苗、从而提供抗轮状病毒病的保护作用的主要候选物。
已知在儿童期早期天然轮状病毒感染引起保护性免疫。因此，一种减毒的轮状病毒活疫苗是非常合乎需要的。这种疫苗最好应该是一种口服疫苗，因为这是该病毒的天然感染途径。
预防轮状病毒感染的早期疫苗开发开始于发现该病毒后的二十世纪七十年代。最初，研究了来自动物和人的减毒株，且得到了混淆的或令人失望的结果。近来，更多的工作集中在更为成功的人-动物重配体(reassortant)上。
Ward描述了称为89-12的轮状病毒株，参见美国专利第5,474,773号和Bernstein，D.L.等，Vaccine，16(4)，381-387，1998。从一份大便样品中分离出89-12病毒株，该大便样品于1988年采集自一位14个月大的、患有天然轮状病毒病的儿童。接着，按照美国专利第5,474,773号，如Ward在J.Clin.Microbiol.，19，748-753，1984中所述，通过在原代非洲绿猴肾(AGMK)细胞中传代2次以及在MA-104细胞中传代4次，使所述HRV 89-12人轮状病毒适应培养。然后，在MA-104细胞中将其噬斑纯化3次(达到第9次传代)，且在另外2次传代后，使其于这些细胞中生长。进行了一次另外的传代(第12次传代)，以保藏于ATCC，保藏号为ATCCVR 2272。将所保藏的病毒株称为89-12C2。
在下文将1998年在Vaccine杂志中由Bernstein等发表的论文称为Vaccine(1998)论文。该论文描述了一种口服的人轮状病毒活疫苗候选物的安全性和免疫源性。由病毒株89-12获得这种疫苗；即通过在原代AGMK细胞中不经噬斑纯化传代26次将其减毒，然后，在一种建立的AGMK细胞系中将其再传代7次(总计传代33次)。
在下文里，把上述连续传代26次的材料称为P26，且把连续传代33次的材料称为P33。总的来说，把通过将89-12传代n次而获得的轮状病毒称为Pn。
在下文的实施例中，用Vero细胞将P33材料进一步传代5次。把这种病毒称为P38。
在Vaccine(1998)论文中描述的P26和P33分离物并没有保藏在培养物保藏中心，也没有分析确定它们的遗传特性。
现已发现，在该文献中描述的P26种群包含变异体的混合物。正如在下文中描述的(参见实施例)，根据遗传鉴定，已证实了这一点。因此，P26不是一种用于进一步传代的、尤其不是用于所述疫苗批量生产的可靠一致的种群。同样，P33包含变异体的混合物，且对于疫苗的批量生产，P33不是可靠一致的。
已发现P26材料是至少三种VP4基因变异体的混合物。同样，P33和P38是两种变异体的混合物。如果评价来自用P33接种过的婴儿的血清针对这些变异体中和抗体效价，则依据中和表位看来，这些变异体在抗原性方面是不同于保藏在ATCC的89-12C2病毒株的。在图3中阐明了这一点。
此外，已发现当将P33材料给予婴儿时，复制及***出两种标记的变异体。在100个接种过的婴儿中，只有2个显示出由于轮状病毒感染引起的胃肠炎体征，而安慰剂组有20％被感染。这些研究的结果暗示：所述已鉴定的变异体与保护人或动物不患轮状病毒病有关。本发明提供一种分离轮状病毒变异体的方法，且提供一种来源于一个经克隆的(均一的)人轮状病毒株的、减毒轮状病毒改良活疫苗。
因此，按照第一个方面，本发明提供一个减毒轮状病毒种群(分离物)，其特点在于：减毒轮状病毒种群由单一的变异体或基本上由单一的变异体组成；所述的变异体由编码称为VP4和VP7的主要病毒蛋白中的至少一种之核苷酸序列来限定。
按照本发明的轮状病毒种群最好是一个克隆变异体。
所谓由单一的变异体或基本上单一的变异体组成的种群指的是：含有不多于10％、优选少于5％、最优选少于1％的一种或多种不同变异体的一个轮状病毒种群。可通过在合适的细胞类型中传代，或通过进行一系列的一个或多个克隆步骤，将病毒种群纯化为均质或基本均质。
本发明的一个优点是：由单一的变异体组成的种群更适合于一种一致的批量疫苗的配制。由编码该主要病毒蛋白的核苷酸序列限定的特定变异体也可能与增强的预防轮状病毒感染的功效有关。
在一个优选的方面，本发明轮状病毒种群中的单一或基本上单一的变异体是其中VP4基因包含一段特定核苷酸序列的变异体，所述的特定核苷酸序列包括下面碱基中的至少一种：从起始密码子起在788位的腺嘌呤碱基(A)、在802位的腺嘌呤碱基(A)以及在501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
在另外的一个方面，本发明病毒种群中的单一或基本上单一的变异体是其中VP7基因包含一段特定核苷酸序列的变异体，所述的特定核苷酸序列包括下面碱基中的至少一种：从起始密码子起在605位的胸腺嘧啶(T)、在897位的腺嘌呤(A)或在897位的鸟嘌呤(G)。在897位最好有一个腺嘌呤(A)。
在一个优选的方面，按照本发明的所述种群中的单一变异体在VP4基因序列中从起始密码子起的788位和802位具有腺嘌呤(A)及在501位具有胸腺嘧啶(T)。
在另一个优选的方面，按照本发明的所述种群中的单一变异体在VP7序列中从起始密码子起的605位具有胸腺嘧啶(T)和在897位具有腺嘌呤/鸟嘌呤(A/G)。最优选在VP7序列中于897位有一个腺嘌呤(A)。
在一个特别优选的方面，按照本发明的所述种群中的单一变异体在VP4基因序列中从起始密码子起的788位和802位具有腺嘌呤(A)及在501位具有胸腺嘧啶(T)以及在VP7序列中从起始密码子起的605位具有胸腺嘧啶(T)和在897位具有腺嘌呤/鸟嘌呤(A/G)。最优选在VP7序列中于897位有一个腺嘌呤(A)。
在另一个方面，所述单一变异体包含：编码VP4蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如图1所示；和/或编码VP7蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如图2所示。
本发明也提供一种产生由基本上单一的变异体组成的轮状病毒种群的方法，该方法包括：
将轮状病毒制剂在合适的细胞类型上传代；
任选地采用以下任一步骤选择均一的培养物：
a)有限稀释；或
b)分离单个的噬斑；以及
通过对VP4和/或VP7基因序列的适当区域进行序列测定而检验基本上单一的变异体的存在。
用诸如狭线印迹杂交或噬斑杂交之类的定量或半定量杂交技术，可适当地进行序列测定。
当把起始轮状病毒制剂给予一位人类对象、尤其是儿童时，所选定的变异体最好是一种被复制及***的变异体。
通过在一种合适的细胞系中进一步传代，可扩增通过按照本发明方法而产生的克隆的病毒种群。
适合于用上述方法使轮状病毒种群传代的细胞类型包括非洲绿猴肾(AGMK)细胞，所述非洲绿猴肾细胞可以是建立的细胞系或原代AGMK细胞。合适的AGMK细胞系包括：例如Vero(ATCC CCL-81)、DBS-FRhL-2(ATCC CL-160)、BSC-1(ECACC 85011422)和CV-1(ATCCCCL-70)。同样合适的是MA-104(恒河猴)细胞系和MRC-5(人的-ATCCCCL-171)细胞系。为了扩增的目的，尤其优选Vero细胞。在Vero细胞中传代产生高产量的病毒。
用于检验在一个用所述方法产生的病毒种群中是否有单一变异体的技术以及测定该单一变异体性质的技术，涉及本技术领域已知的标准测序步骤或杂交步骤；且在下文描述它们。
在一个优选的方面，用一种合适的轮状病毒，特别是用具有89-12病毒株或其传代衍生物之特性的轮状病毒，来实施本发明的方法。
一个特别优选的单一变异体种群是P43；通过一系列终点稀释克隆步骤，继之以在Vero细胞中将克隆的病毒传代以进行扩增，由P33(一种分离的人轮状病毒在适当的细胞类型培养物中传代33次)获得该P43。
根据布达佩斯条约的条款，将P43种群于1999年8月13日保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心-European Collection of Animal CellCultures(ECACC)，Vaccine Research and Production Laboratory，PublicHealth Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏号为99081301。
虽然这表明公众可得到是获得人轮状病毒P43的最简易方式，但是，根据本发明的内容，用这些或其它方法可以产生类似的和功能基本等同的轮状病毒并不是完全不可能的、或者不是不大可能发生的。这样的功能基本等同的轮状病毒被认为是在生物学上等同于本发明的人轮状病毒P43的，且因此它们是在本发明的总体范围内的。因此，应明白本发明包括具有本文中描述的P43变异体特征的轮状病毒种群。
人们会理解，本发明包括由于使该P43经受另外的处理的来源于所保藏的P43 ECACC 99081301的材料；所述另外的处理例如：通过进一步地传代、克隆或使用所述活病毒的其它步骤来繁殖它，或者以包括通过用基因工程技术或重配技术的任一方式来修饰P43。在本技术领域中，这样的步骤和技术是众所周知的。
来源于本发明所包括的保藏的P43的材料包括蛋白和遗传物质。值得特别关注的是包含P43的至少一种抗原或至少一个节段的重配轮状病毒；例如，由一种毒性轮状病毒株组成的重配子，在所述重配子中，11个基因组节段中的一个或一个的一部分已被P43基因组节段或其一部分取代。具体地讲，其中编码NSP4的节段或部分节段为P43之节段或部分节段的轮状病毒重配子可具有有用的特性。重配轮状病毒和用于制备它们的技术是众所周知的(Foster，R.H.和Wagstaff，A.J..TetravelentRotavirus Vaccine，a review.ADIS drug evaluation，BioDrugs，Gev，9(2)，155-178，1998)。
值得特别关注的材料是P43的后代及P43的免疫学活性衍生物。免疫学活性衍生物是指由P43病毒或用P43病毒获得的、当被注射到宿主动物体内时能够引起对轮状病毒反应的免疫应答的物质，尤其是该病毒的抗原。
为了使轮状病毒适应于例如Vero细胞的合适细胞系，处理该病毒以便除去任何潜在的污染物可能是必需的；所述潜在的污染物例如可能存在的且在其它方面可能导致污染的任何意外产生的因子。在意外产生的醚敏感型病毒的情况下，通过进行如同下文描述的***处理，则可以完成这种除去。本发明也涉及：在获得一种减毒活轮状病毒或以此配制的疫苗之全过程中，包含作为一个可任选步骤的这样的***处理。
同样在本发明范围内的是P43与其它轮状病毒变异体(例如其它克隆的变异体)的混合物，或者是P43与其它病毒、尤其是其它减毒病毒的混合物。在下文描述的本发明疫苗中，这样的混合物是有用的。
本发明也提供一种减毒轮状病毒活疫苗，所述疫苗包括与一种合适佐剂或药用载体混合的一个基本上单一的变异体种群。
按照本发明的轮状病毒疫苗最好是一种包含单一轮状病毒株的单价轮状病毒疫苗。
在提供轮状病毒活疫苗方面，本发明是特别有益的；在所述轮状病毒活疫苗中，减毒的活轮状病毒是人轮状病毒，且不导致肠套叠。
用于按照本发明的疫苗中的合适药用载体包括：适合于口服给药的本领域已知的那些载体，尤其是适用于婴儿的那些载体。这样的载体包括但不限于：糖类、多元醇、氨基酸、氢氧化铝、氢氧化镁、羟基磷灰石、滑石、氧化钛、氢氧化铁、硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、明胶、营养蛋白胨(vegetal peptone)、黄原胶、角叉藻聚糖、***树胶、β-环糊精。
本发明也提供一种用于制备轮状病毒疫苗的方法；例如，通过在存在合适稳定剂的情况下冻干该病毒，或将按照本发明的病毒与一种合适的佐剂或药用载体混合来制备。
将本发明的病毒配制在例如病毒体或脂质体的基于脂质的载体中、配制在水包油乳状液或用载体粒子配制，也可能是有益的。另一方面或另外，在所述制剂中可包含免疫刺激剂，诸如本技术领域中已知的用于口服疫苗的免疫刺激剂。这样的免疫刺激剂包括细菌毒素、尤其是全毒素(holotoxin)(完整分子)或仅B链(CTB)形式的霍乱毒素(CT)、以及大肠杆菌的热不稳定肠毒素(LT)。在WO 96/06627、WO 93/13202和US5,182,109中，描述了与天然LT相比不太可能转变成活性形式的突变型LT(mLT)。
可能最好包括的另外的免疫刺激剂是例如QS21的皂苷衍生物及单磷酰脂质A，尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。在WO98/56415中描述了作为口服佐剂的纯化的皂苷。可分别地或以联合方式使用皂苷和单磷酰脂质A(例如WO 94/00153)，且可以将其与其它因子一起配制为佐剂***。3D-MPL是由Ribi Immunochem，Montana制造的一种众所周知的佐剂，且在GB 2122204中描述了其制造。
在Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman编辑，Plenum Press，New York，1995中，可找到用于口服免疫的载体和佐剂的一般论述。
本发明也提供一种方法，用于通过将有效量的按照本发明的疫苗组合物给予需要接种的人类对象，尤其是婴儿，来为所述对象接种。最好是通过口服给药而给予减毒的活疫苗。
在一个优选的方面，用一种抗酸剂配制本发明的疫苗组合物，从而将由于胃酸所致的所述疫苗的失活减至最小。合适的抗酸剂组分包括例如氢氧化铝Al(OH)3和氢氧化镁Mg(OH)2的无机抗酸剂。适用于本发明的市售抗酸剂包括：含有氢氧化铝和氢氧化镁的Mylanta(商标)。这些抗酸剂在水中是不溶的，因而将其以悬浮液的形式给予。
氢氧化铝是根据本发明的疫苗组合物中的特别优选的组分；因为它不仅能提供抗酸剂的效应，而且能提供佐剂(adjuvantation)的效应。
同样适合于在本发明疫苗中用作抗酸剂的是诸如有机酸羧酸盐之类的有机抗酸剂。本发明疫苗组合物中的一种优选的抗酸剂包含一种有机酸羧酸盐，最好是例如柠檬酸钠或柠檬酸钾的一种柠檬酸盐。
可用于本发明疫苗组合物中的一种特别优选的抗酸剂是不溶性无机盐碳酸钙(CaCO3)。碳酸钙能与轮状病毒结合，且在轮状病毒与碳酸钙结合期间保持该轮状病毒的活性。
为了防止在填充步骤期间碳酸钙沉降，最好在所述制剂中存在粘性剂。
可使用的可能的粘性剂包括假塑性赋形剂。假塑性溶液的定义为：与溶液在搅动期间的粘度相比在静置时具有较高粘度的溶液。这种类型的赋形剂是天然的聚合物或是半合成的聚合物；所述天然的聚合物例如***树胶、黄耆胶(adragante gum)、琼脂、藻酸盐、果胶，所述半合成的聚合物例如羧甲基纤维素(Tyloses C)、甲基纤维素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)、羟丙基纤维素(Klucels)以及羟丙基甲基纤维素(Methocels E和K、Viscontrans MPHC)。通常，同触变剂一起使用这些假塑性赋形剂。可使用的其它粘性剂是具有低流动能力的假塑性赋形剂。那些聚合物在足够浓度下发生产生在静置时具有低流动能力的高粘度溶液的结构流体排列。需要给予该***一定量的能量，从而让其流动和转移。为了获得流体溶液，需要外来能量(搅动)暂时破坏该结构流体排列。这样的聚合物的实例是Carbopols和黄原胶。
在静置时，触变赋形剂变成一种凝胶结构；而在搅动时，它们形成一种流体溶液。触变赋形剂的实例是：Veegum(硅酸铝镁)和AvicelRC(大约89％的微晶纤维素和11％的羧甲基纤维素钠)。
本发明的疫苗组合物最好包括一种选自黄原胶或淀粉的粘性剂。
因此，最好用碳酸钙和黄原胶的组合来配制本发明的疫苗组合物。
用于本发明组合物的其它组分适当地包括：例如蔗糖和/或乳糖的糖。
根据本发明的疫苗组合物可包含另外的组分，包括例如调味剂(特别是用于口服疫苗的)和抑菌剂。
设想了根据本发明的疫苗组合物的不同规格。
在一个优选的实施方案中，以液体制剂形式给予所述的疫苗。最好在给予之前，由至少下面两种组分重建该液体制剂：
i)病毒组分，
ii)液体组分。
在这个实施方案中，所述病毒组分和液体组分通常存在于单独的容器中；所述容器可以便利地为单个容器的分隔室；或是可以以这样的一种方式连通的分隔室，以致在不暴露最终的疫苗组合物于空气的情况下重建最终的疫苗组合物。
在重建之前，该病毒可以呈干的状态，或呈液体状态。最好冻干该病毒组分。冻干的病毒比在水溶液中的病毒更加稳定。该冻干的病毒可以用一种液体抗酸组合物来适当地重建，从而产生液体疫苗制剂。用另一种方法，该冻干病毒可以用水或水溶液来重建；在这种情况中，所述冻干病毒组合物最好包含一种抗酸剂组分。
所述疫苗制剂最好包括在一个分隔室或容器中用碳酸钙和黄原胶配制的一种病毒组分，且这种病毒组分用存在于第二个分隔室或容器中的水或水溶液来重建。
在另一个优选的实施方案中，所述的疫苗组合物是一种固体制剂，最好是一种适合于当放置于口中时立即溶解的冻干块。可以以药用泡罩片中的片剂形式方便地提供冻干制剂。
在另一方面，本发明提供一种用于口服给药的、速溶片剂形式的轮状病毒疫苗。
在另一方面，本发明提供一种包含一种减毒活轮状病毒株、尤其是人轮状病毒株的组合物；其中，该组合物是一种当放置于口中时能立即溶解的冻干固体。
根据本发明的速溶片剂最好在受接种者口中足够快地溶解，从而防止吞下未溶解的片剂。这种途径对儿科轮状病毒疫苗是特别有益的。
所述病毒最好是与一种例如碳酸钙的无机抗酸剂及一种例如黄原胶的粘性剂一起配制的、活的减毒人轮状病毒。
本发明的再一方面是提供一种冻干制剂；在所述的冻干制剂中，该病毒组分是用碳酸钙和黄原胶配制的任一轮状病毒株。
本发明的疫苗可以用已知技术，用提供针对轮状病毒感染的有效保护且没有常用疫苗之显著有害副作用的适宜量的活病毒配制和给予。每一剂活病毒的适宜量通常在104和107ffu之间。疫苗的常用剂量可包括：每一剂105-106ffu。且可以在一个时期内，以几剂给予；例如，以两个月的间隔将其分两剂给予。然而，通过应用不止2剂后，例如3或4剂方案，则可以得到好处，尤其是在发展中国家里。一剂与一剂之间的间隔可以多于或少于两个月。通过涉及观测抗体效价和受接种者之其它反应的标准研究，可确定一剂方案或多剂方案的活病毒的最适量以及各剂的最适给药时间。
本发明的疫苗也可包含其它合适的活病毒，以提供针对其它疾病的保护作用，例如包含脊髓灰质炎病毒。另一方面，可以以独立一剂但在给予根据本发明的轮状病毒疫苗组合物的同一时刻，给予其它合适的口服给予的病毒活疫苗。图3的图面说明
检验了来自用Vaccine(1998)论文中描述的P33材料接种的12位4-6个月大婴儿的血清针对P33、P38、P43和89-12C2的中和作用。
对于P33、P38和P43，检验过的所有血清的中和效价的范围是类似的。统计学分析显示：针对全部三种病毒的整体中和效价没有显著的差异。这暗示P33、P38和P43的构象和非构象中和表位都同等良好地被接种了P33的婴儿之抗P33血清识别。这一观测间接地暗示：在P33、P38和P43之间，在这种体外分析中显露的中和表位没被改变的。
然而，P89-12C2的中和效价的范围显著不同于P33、P38和P43。这一观测暗示：P33、P38和P43的构象和非构象中和表位不是同样良好地被接种了P33的婴儿之抗P33血清识别。这一观测间接地暗示：在89-12C2与P33、P38及P43之间，在这种体外分析中所显露的中和表位是改变了的。
下面的实施例阐明本发明。
                              实施例实施例1：传代26次的89-12病毒株(P26)为变异体混合物的证明来自不同传代次数之病毒的VP4基因和VP7基因的序列测定
对来自传代物P26(原代AGMK细胞)、传代物P33(建立的(与原代相对)AGMK细胞系)、传代物P41以及传代物P43的VP4基因和VP7基因进行序列测定。将总RNA提取物逆转录，并在一支管/一个步骤中通过PCR，将其扩增。
引物Rota 5bis和引物Rota 29bis扩增完整的VP4基因，引物Rota 1和引物Rota 2bis扩增完整的VP7基因。已用不同的引物测定了所述PCR材料的序列(参见表1)。
传代物P26之序列传代物P33之序列在VP4中相差三个碱基(位于从起始密码子起的501、788及802bp处)且在VP7中相差三个碱基(从起始密码子起的108、605及897bp)。
对传代物P26之VP4和VP7的序列扫描表明：在突变的位置，存在作为本底的传代物P33之序列。因此，可看出传代物P26是至少2种变异体的混合物。
对传代物P33的序列扫描似乎就VP4而言是均一的，而就VP7而言则是不均一的(参见表2)。
在Vero细胞中使传代物P38(来源于传代物P33)传代5次；显示出与传代物P33(AGMK细胞系)相同的一组的VP4和VP7序列。因此，在P33和P38之间的种群中，没有较大的变化。表1：用于RT-PCR和序列测定的寡核苷酸
 名称  序列  位置
VP7  Rota 1Rota 1bisRota 2bisRota 7Rota 12Rota 46Rota 18  GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG GGGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT AGGT CAC ATC GAA CAA TTC TAA TCT AAGCAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG GTGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC ACGGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TATAGT GGCCA CTA TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAGCAA CC  -49 to-22-16 to 101014-988266-287372-394651-682682-651
 VP4  Rota 5Rota 6Rota 5bisRota 6bisRota 25Rota 26Rota27bisRota 28Rota 31Rota 32Rota 45Rota 53Rota 54Rota 55Rota 40Rota 39Rota 33Rota 34Rota29bis  TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC AATT TCG GAC CAT TTA TAA CCTGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC AATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AGGGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AATAGCTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CCTCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA GTTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTGGTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT GCAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA CTGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CGCGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CAGTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CATGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT ACCTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT GCAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA GCGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT GCAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC GAGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G  2-23878-8592-23878-856268-296296-268721-745753-7271048-10701070-10481205-12271227-12051465-14871487-14651703-17271727-17032008-20322032-20082335-2311
表2：用于杂交的寡核苷酸
 名称  序列  位置
 VP7  Rota 41Rota 42  AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT TAATCAGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT TAATC  882-913882-913
 VP4  Rota 15Rota 16Rota 35Rota 36  ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT CATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC TTT CATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT CATC CCT ATT ATA CTG CAT TCC TTT C  807-783807-783807-783807-783
在表2中以粗体显示的碱基是VP4和VP7中的具体序列变异的位点。表3：VP4基因和VP7基因的序列变异3.1
                        VP4                VP7
  501bp167aa    788bp263aa    802bp268aa   108bp36aa    605bp202aa   897bp299aa
    P26(AGMK)     A     G/A     G/A     A     C/T     A
    P33(AGMK)     T     A     A     G/A     T/C     A/G
    P38(VERO)     T     A     A     A/G     T     G/A
    P43(VERO)     T     A     A     A     T     A
注意：在来自发展到生产批量水平之3个克隆的第二个克隆中，VP7的897bp位置的核苷酸为G，而不是所选定的P43克隆中的A。这导致在氨基酸序列中一个甲硫氨酸取代一个异亮氨酸。在用P33材料接种的婴儿的粪便中，既***出对应于所选定的P43克隆的变异体，又***出与VP7中从起始密码子起的897bp位置上有一个G的克隆对应的变异体。
在表3.1中，在一个特定位置上有两种可变碱基的情况下，两者中的第一种代表在较多的群体中出现的碱基，而第二种是在较少的群体中出现的碱基。根据序列分析中的信号强度来断定较多的变异体群体和较少的变异体群体。3.2
                        VP4                    VP7
    501bp167aa     788bp263aa     802bp268aa     108bp36aa   605bp202aa     897bp299aa
    P26(AGMK)     Leu     Gly/Glu     Gly/Arg     Arg   Thr/Met     Ile
    P33(AGMK)     Phe     Glu     Arg     Arg/Arg   Met/Thr     Ile/Met
    P38(EVRO)     Phe     Glu     Arg     Arg/Arg   Met     Met/Ile
    P43(EVRO)     Phe     Glu     Arg     Arg   Met     Ile
表3.2显示了由变异体之间的核苷酸差异而引起的氨基酸变化。表4
              VP4(788-802位)     VP7(897位)
G-G A-A A-G G-A A G
探针 Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 Rota 41 Rota 42
传代物
P26 - + + + nd nd
P33 - + - - ++ +
P38 - + - - + ++
P43 - + - - + -
狭线印迹杂交
通过狭线印迹杂交，进一步证实了AGMK细胞上的传代物P26至P33之间的种群变化。使通过RT/PCR产生的VP4基因片段和VP7基因片段与各变异体特异性的寡核苷酸探针杂交(参见表3.1和表3.2)。跟与Rota 16、Rota 35和Rota 36杂交而不与Rota 15杂交的P26比较起来，P33材料之VP4的PCR片段在788和802位仅与Rota 16杂交，而不与或Rota 15或Rota 35或Rota 36杂交。这些结果证实了在P26中至少存在3种变异体(参见表4)。
至于P33材料之VP7的PCR片段，所述897位与Rota 41和Rota 42杂交。这些结果证实了在P33材料中至少存在2种变异体。实施例2：P43克隆的分离和特性鉴定
为了分离作为均一病毒种群的P33组分，在Vero细胞上进行P33/AGMK的三次终点稀释；并用所得到的病毒感染Vero细胞。
运用两种标准来挑选阳性孔：由在孔中检测出的最大转化灶数表明的生长，以及在板上分离出最多的阳性孔，正如常规所作的。在用96孔微量滴定板进行3次终点稀释传代后，在Vero细胞中相继扩增了10个阳性孔，并评价了其产量。
基于产量，将三个克隆发展到生产批量的传代水平。已显示：在所述三个克隆之间以及在所述克隆和P33之间，多克隆抗体的免疫识别都是类似的。根据狭线印迹杂交，评价了所述克隆的均一性。单一克隆的最终选择是基于产量和序列的。
通过在Vero细胞中连续传代来扩增所选定的克隆，从而产生原种(Master seed)、工作种(Working seed)，且最终产生生产批量。
通过测定VP4和VP7的序列(同一性)以及通过PCR扩增材料之VP4和VP7的特异性狭线印迹杂交(均一性)，从遗传学角度来鉴定所选定克隆在不同传代水平的特征。在图1和图2中分别给出了P43材料之VP4基因的序列和VP7基因的序列，且这些序列和P41的相应序列是一样的。
通过使用鉴别在P26/原代AGMK序列测定期间所鉴定的各变异体VP4和/或VP7区域中核苷酸变化的寡核苷酸探针(参见表4)进行选择性杂交，来评价所选定克隆的均一性。
该VP4片段与Rota 16杂交，而不与Rota 15、Rota 35或Rota 36杂交。
所述VP7片段与Rota 41杂交，而不与Rota 42杂交。
这些结果证实了P43是一个均一的种群。实施例3：除去可能意外产生的病毒
按20％的终浓度将***添加到P33(AGMK培养的)中达1小时。然后，用N2使***以气泡排出达35分钟。没有观测到对P33种子滴度的影响。实施例4：减毒活疫苗的配制
用下面的方法配制用于口服给予婴儿的上述生产批量。
1.冻干的病毒
运用制备病毒剂的标准技术。将纯化病毒的冷冻块解冻，并用合适的培养基组合物(在本实例中为Dulbecco改进的eagle培养基)将其稀释到所需的病毒标准浓度(在本实例中为106.2ffu/ml)。然后，用冻干稳定剂(蔗糖4％、葡聚糖8％、山梨醇6％、氨基酸4％)将该稀释过的病毒进一步稀释至目标病毒滴度，在本实例中为105.6ffu/剂。将稳定的病毒组合物的0.5ml等分试样无菌转移至3ml的小瓶中。然后，用橡胶塞将各小瓶部分封闭，在真空下冻干所述的样品；接着，完全密封所述小瓶，并在环绕小瓶的适当位置压上铝帽，以使所述瓶塞保持在适当的位置。
至于使用，用下面抗酸的重建剂中的一种将该病毒重建：(a)柠檬酸盐重建剂
将柠檬酸钠溶解于水中，通过过滤除菌；并按1.5ml的量、以544mg柠檬酸钠·2H2O/1.5ml之剂的浓度，将其无菌转移至重建剂容器中。所述重建剂容器可以例如是：3ml的小瓶、或4ml的小瓶、或2ml的注射器、或用于口服给药的可压缩的软塑料胶囊。作为在无菌条件下保存无菌组分的一种可供选择的方法，可以将最终的容器高压灭菌。
(b)Al(OH)3重建剂
在无菌水中无菌稀释无菌氢氧化铝悬浮液(Mylanta-商标)；并以每份2ml的量，将其无菌转移至各重建剂容器(例如2ml的注射器或可压缩的软塑料胶囊)中，每份2ml的量包含48mg Al(OH)3。在无菌条件下使用无菌组分的一种可采用的方法是用γ射线照射氢氧化铝悬浮液(最好处于经稀释的阶段)。
包含阻止该悬浮液澄清的标准成分。这样的标准成分包括：例如，硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素以及硅氧烷聚合物。也可包含用于食品的抑菌剂及调味剂，所述抑菌剂例如对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯或其它标准的抑菌剂。
2.在液体制剂中和Al(OH)3一起被冻干的病毒
运用制备病毒剂的标准技术。将纯化病毒的冷冻块解冻，并用合适的培养基组合物(在本实例中为Dulbecco改进的eagle培养基)将其稀释到所需的病毒标准浓度(在本实例中为106.2ffu/ml)。加入氢氧化铝悬浮液而达到48mg/剂的最终量，且用冻干稳定剂(蔗糖4％、葡聚糖8％、山梨醇6％、氨基酸4％)将该病毒组合物稀释至目标病毒滴度，在本实例中该目标滴度为105.6ffu/剂。将稳定的病毒组合物的0.5ml等分试样无菌转移至3ml的小瓶中。然后，如同在第1部分中描述的，进行所述小瓶的冻干和密封。
3.用于泡罩片规格的、和Al(OH)3一起被冻干的病毒
运用制备病毒剂的标准技术。将纯化病毒的冷冻块解冻，并用合适的培养基组合物(在本实例中为Dulbecco改进的eagle培养基)将其稀释到所需的病毒标准浓度(在本实例中为106.2ffu/ml)。加入氢氧化铝悬浮液而达到48mg/剂的最终量，且用冻干稳定剂将该病毒组合物稀释至105.6ffu/剂的目标病毒滴度；所述冻干稳定剂可以是蔗糖、葡聚糖或4％的氨基酸、或明胶、或营养蛋白胨、或黄原胶。用无菌装填操作将各份0.5ml或最好更少的剂量转移至各泡罩腔中。冻干该组合物，并通过热封而密封所述的泡罩腔。
可任意选择地包含阻止氢氧化铝悬浮液澄清的标准成分。这样的标准成分包括：例如，硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素以及硅氧烷聚合物。也可以包含调味剂。实施例5：用于不同制剂的轮状病毒之病毒滴度
5.1：基于制剂的乳糖和蔗糖之间的比较
批号 制剂的成分   冻干前的病毒滴度   在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
98G06/01 乳糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％   105.22   104.67
98G06/03 蔗糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％   105.28   104.92
正如在上表中显示的，或者用蔗糖、或者用乳糖配制P43轮状病毒。冻干前的病毒滴度是在完成配制的液体(包含蔗糖、葡聚糖、山梨醇、氨基酸)中的、且无冻干步骤的病毒滴度。
良好的结果是在冻干步骤时实现＜0.5log的减小、且在“37℃1周”(加速稳定性试验)期间实现＜0.5log的减小的那些结果。
所述病毒滴度的精密度大约是+或-0.2log。
所述结果表明，可以用蔗糖代替乳糖。
5.2：精氨酸的作用及用麦芽糖醇代替山梨醇：
  批号 制剂的成分  冻干后时间等于0时的病毒滴度 在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
  98L16/01 乳糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％  104.8 104.8
  98L16/02 蔗糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％精氨酸：3％  104.8 104.9
  98L16/04 乳糖：  2％葡聚糖：4％麦芽糖醇：3％氨基酸：2％精氨酸：3％  104.7 105
所述结果表明：添加精氨酸(已知精氨酸在冻干期间改善所述病毒的稳定性且还提供碱性介质以便平衡胃的酸性)保持该病毒的滴度。
山梨醇往往会将冻干块的玻璃化转变温度降低太多。如上所示，通过用麦芽糖醇代替山梨醇，可以克服这一点；且仍保持该病毒的滴度。
5.3：各种各样的制剂的成分
这个实验表明许多配方是可允许的。
批号 制剂的成分 冻干前的病毒滴度   在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
99C11/01 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：2％ 105.24   105.07
99C11/02 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％麦芽糖醇：3％氨基酸：  2％ 105.09   104.92
99C11/04 葡聚糖：  4％麦芽糖醇：3％氨基酸：  2％ 104.89   105.06
  批号 制剂的成分  冻干后时间等于0时的病毒滴度 在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
  99C17/01 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％  105.40 105.41
  99C17/02 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  1.5％氨基酸：  2％  105.30 104.93
  99C17/03 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％氨基酸：  2％  105.31 105.24
  99C17/04 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％麦芽糖醇：3％氨基酸：  2％  104.42 104.45
  99C17/05 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％麦芽糖醇：1.5％氨基酸：  2％  104.39 104.40
  99C17/06 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％  105.44 104.97
  99C17/07 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  1.5％  105.11 104.89
5.4：轮状病毒和Al(OH)3抗酸剂之间的结合
 轮状病毒 Al(OH)3     H2O  在室温下的接触时间   离心 上清液的病毒滴度ffu/ml  沉淀的病毒滴度ffu/ml
 105.6ffu/ml 48mg于0.240ml中     0.76ml  30分钟 8000rpm，10分钟 103.66
 105.6ffu/ml 48mg于0.240ml中     0.76ml  30分钟 8000rpm，10分钟 104.41
 105.6ffu/ml     1ml  30分钟 8000rpm，10分钟 105.68
 冻干块中的轮状病毒 12mg于0.120ml中     1.380ml  30分钟 8000rpm，10分钟 检测不到  104.7
将Al(OH)3用作抗酸剂。该表表明轮状病毒与不溶性无机盐(Al(OH)3)结合，因为轮状病毒与Al(OH)3一起离心(上清液中的病毒活性降低)。5.5：在病毒滴定前用柠檬酸钠溶解Al(OH)3抗酸剂
病毒样品 溶解 条件     病毒滴度ffu/ml
冻干前的99B10/06液体制剂，105.43 1.5ml柠檬酸钠 在室温下24小时     105.11
99B10/06：冻干的，105.43 1.5ml柠檬酸钠 在室温下24小时     104.53
当轮状病毒和Al(OH)3结合时，冻干有关的一切(包括Al(OH)3)是可能的。冻干后，通过在柠檬酸钠中溶解Al(OH)3而回收所述的轮状病毒是可能的。这个步骤不损害所述的轮状病毒，且在这个溶解步骤后保持其活性。
5.6：Al(OH)3-轮状病毒之结合解离后轮状病毒的感染性
病毒释放的机制(通过溶解该载体)可以很好地在体内发生。实际上，在pH6以下，氢氧化铝成为完全溶解的，因此在胃中将放出轮状病毒。
           
在胃中，Al+++离子不被吸收(J.J.Powell，R.Jugdaohsingh和R.P.H.Thompson，The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinaltrack，Proceedings of the Nutrition Society(1999)，58，147-153)。
在肠道中，由于pH升高，沉淀出铝的不溶形式(Al(OH)3或AlPO4)，且通过天然的方式将其排除。
不了解新形成的Al(OH)3(或AlPO4)沉淀是否能和游离的轮状病毒重新结合。这提出了Al(OH)3-轮状病毒结合物本身的感染性问题。
通过其它机制由Al(OH)3-轮状病毒结合物释放出轮状病毒也是可能的。例如，赖氨酸干扰在Al(OH)3上的病毒吸附。已知象硼酸根(borate)、硫酸根、碳酸根和磷酸根那样的其它阴离子被特异性地吸附到氢氧化铝上，因此在理论上，从Al(OH)3-轮状病毒结合物置换出(通过竞争吸附位点)轮状病毒应该是可能的。
Figure A0081434900281
因此，可以由轮状病毒-Al(OH)3结合物释放出轮状病毒，释放出的轮状病毒仍是活性的。
可以或者通过溶解Al(OH)3(在胃中用盐酸或在体外用柠檬酸钠)，或者通过用一种碱性氨基酸(赖氨酸)置换出轮状病毒，来完成这种释放。
5.7：Al(OH)3-轮状病毒结合物的感染性
一剂冻干的轮状病毒用水重建，并将其分成两部分。被认为是参照的第一部分得到了追加体积的水。第二部分得到悬浮于0.240ml水中的24mg Al(OH)3(临床前病毒滴定)。
Figure A0081434900291
当存在Al(OH)3时，该轮状病毒是有活性的，且与参照样品相比，病毒的滴定值较高。
不分割该冻干剂且通过添加12mg Al(OH)3或24mg Al(OH)3，来重做这个实验。
这里的参照样品是用一种柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液重建的样品。这样，在存在Al(OH)3情况下，病毒滴度又是较高的。
DRVC003A46           DRVC003A46           DRVC003A46
   +                    +                    +
1.5ml WL缓冲液       在0.120ml中的        在0.240ml中的
                     12mg Al(OH)3        24mg Al(OH)3
                        +                    +
                     1.380ml H2O         1.260ml H2O
5.34                 6.24                 6.05
5.32                 5.95                 6.26
同上面实施例中一样，轮状病毒与Al(OH)3微粒结合，因为可通过离心抛弃该病毒。DRVC003A46是一种冻干的经配制的轮状病毒(蔗糖：2％；葡聚糖：4％；山梨醇：3％；氨基酸：2％)。
Figure A0081434900301
SDSAA＝蔗糖2％、葡聚糖4％、山梨醇3％、氨基酸2％。
根据对上清液进行的病毒滴定，吸附该轮状病毒所需的Al(OH)3量似乎是少的(始于一剂冻干剂5.7log)。
    Al(OH)3   吸附时间   在上清液中的滴度
    12mg   室温1小时   2.7
    24mg   室温1小时   3.4
    48mg   室温1小时   3.4
    72mg   室温1小时   2.0
    96mg   室温1小时   检测不到
    12mg   过夜   2.7
    24mg   过夜   检测不到
    48mg   过夜   2.5
    12mg   立刻   检测不到
    24mg   立刻   2.0
    48mg   立刻   检测不到
轮状病毒吸附于Al(OH)3所需的时间似乎是短的。
在存在24mg Al(OH)3的情况下，重建一剂冻干的轮状病毒，并于0分钟、15分钟、60分钟和24小时后，将其离心。在病毒滴定前，把“离心下层块”(“culot”)重新悬浮于SDSAA中。
    时间  沉淀(Culot)     上清液
    0分钟     5.26     3.17
    15分钟     5.34     ＜1.44
    60分钟     5.96     ＜1.44
    24小时     6.13     ＜1.44
5.8：将CaCO3用作抗酸剂
为了在疫苗中避免铝，用另一种不溶性无机盐CaCO3(碳酸钙)来取代抗酸剂Al(OH)3。
用CaCO3观测到的现象类似于所描述的有关Al(OH)3的那些现象：
-轮状病毒与所述无机盐结合；
-当与该无机盐结合时，保持轮状病毒的活性；
-通过用一种酸溶解该无机碱有可能由该结合物释放出轮状病毒；
-有可能将所述抗酸剂与该轮状病毒的共冻干。
CaCO3与轮状病毒的结合
在最初的一个试验中，冻干的轮状病毒(病毒滴度为5.7)用CaCO3在水中的悬浮液(50mg在1.5ml中)来重建；然后，将其离心，并将上清液的病毒滴度与沉淀(Culot)的进行比较。这表明多于90％的轮状病毒与CaCO3结合。而且，当病毒被结合时，完成滴定和回收原始病毒量是可能的。同样，病毒滴度稍微高于无CaCO3时获得的病毒滴度。
Figure A0081434900331
CaCO3与轮状病毒结合的量
冻干的轮状病毒用CaCO3在水(1.5ml)中的悬浮液来重建；CaCO3的量为：
10mg
50mg
100mg然后，将其离心，并将上清液的病毒滴度与沉淀(Culot)的进行比较。
CaCO3     当场(extempo)+离心           1小时+离心
离心下层块(Culots)  上清液 离心下层块(Culots)  上清液
100mg     4.57   3.01     4.79   3.09
50mg     4.17   4.15     4.22   3.86
10mg     3.17   4.77     3.87   4.87
因此，显然更多的CaCO3和更多的病毒是结合的，而在上清液中发现较少的病毒。然而，没完全回收全部的剂量(预期总量至少为5.3或甚至如同较早获得的5.8-参见上文)。
CaCO3在Rossett-Rice抗酸剂滴定期间对轮状病毒的保护
用10剂冻干的轮状病毒(DRVC003A46)和50mg CaCO3，来进行两种类型的婴儿Rossett-Rice滴定：
在传统的Rossett-Rice滴定中，把该抗酸剂与轮状病毒混合，并将盐酸注入到这种介质中。
在“反向”婴儿的Rossett-Rice中，情况相反：将抗酸剂滴入到盐酸池中(如同体内发生的情况一样)。
                          传统的婴儿Rossett-Rice滴定
冻干的轮状病毒贮存在：   缓冲剂 病毒滴度理论值 病毒滴度实测值
    4℃ 60mg CaCO3     5.3     4.6
    -80℃ 60mg CaCO3     5.3     4.6
    4℃ 24mg Al(OH)3     5.4     ＜2.9
    -80℃ 24mg Al(OH)3     5.4     ＜2.9
                   反向婴儿Rossett-Rice滴定
冻干的轮状病毒贮存在：   缓冲剂 理论上的病毒滴度 测量的病毒滴度
    4℃ 60mg CaCO3     5.3     4.6
    -80℃ 60mg CaCO3     5.3     4.6
    4℃ 24mg Al(OH)3     5.4     ＜2.9
    -80℃ 24mg Al(OH)3     5.4     ＜2.9
因此，在这个体外实验中，碳酸钙能够保护大约20％的轮状病毒，使其不受盐酸存在的影响；而氢氧化铝则不能。5.9：在存在CaCO3抗酸剂情况下轮状病毒的冻干：
批号 成分 冻干后时间等于0时的病毒滴度 在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
99K08/01 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  50mg   105.28   105.10
99K08/02 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg   105.16   105.15
00C24/01 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg黄原胶    0.3％   105.07   104.69
00C24/03 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg黄原胶    0.3％   105.07   104.85
00E09/25 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg黄原胶    0.25％   105.03   104.91
00E09/30 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg黄原胶    0.30％   105.01   104.87
00F26/06 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg淀粉：    2％   104.50   104.70
这是“整体型(all in one)”的，即：轮状病毒和抗酸剂(CaCO3)在同一小瓶中一起冻干。为了防止在装填步骤期间CaCO3沉降，需要粘性剂。这样的粘性剂的实例包括黄原胶和淀粉。甚至在存在黄原胶和淀粉情况下，所述轮状病毒的活性也得以保持。
5.10：当放置于口中时快速崩解的冻干片剂：
下面的配方表明“冻干块(lyoc)”概念，即：冻干块在口中迅速溶解。
  批号 制剂的成分 在冻干前的病毒滴度  在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
  99B10/06 蔗糖     4％谷氨酸钠 3.7％Al(OH)3 48mg   105.11     104.53
  99C11/12 麦芽糖醇 3％Al(OH)3 48mg羟丙基甲基纤维素：1％   104.16     103.79
批号 制剂的成分 在冻干后时间等于0时的病毒滴度 在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
00C24/05 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg黄原胶    0.3％ 105.02 104.54
00C24/06 蔗糖：    2％葡聚糖：  4％山梨醇：  3％氨基酸：  2％CaCO3：  60mg黄原胶：  0.3％ 104.86 104.56
00F26/11 蔗糖：    1％葡聚糖：  2％山梨醇：  1.5％氨基酸：  1％CaCO3：  60mg淀粉：    2％ 104.70 104.40
在所述“冻干块概念”方面，既可以用黄原胶，又可以用淀粉(保持该冻干块的迅速溶解性质)。实施例6：应用碳酸钙作为轮状病毒疫苗组合物的抗酸剂
当把CaCO3在水中的悬浮液用作轮状病毒的抗酸剂时，有一个问题，即当将碳酸钙粉末放置于水中时，因为该粉末密度值接近2.6，且平均粒径为30μm，所以碳酸钙粒子迅速沉降。
可以通过以下方法减慢这种沉降：
(1)增加周围介质的密度，
(2)增加周围介质的粘度，
(3)减小所述粒子的大小，
(4)保持粒子相互远离。
6.1增加周围介质的密度：
如果把CaCO3-水悬浮液(当置于注射器中时)置于冻干块(包含蔗糖2％、葡聚糖4％、山梨醇3％、氨基酸2％)上，则增加周围介质的密度；但CaCO3沉降的速率与CaCO3-水悬浮液的并无很大差异。
6.2增加周围介质的粘度：
假塑性赋形剂
假塑性溶液的定义为：与在搅动期间的溶液粘度相比在静置时具有较高粘度的溶液。
常见的这种类型的赋形剂是：
天然的聚合物，例如：
***树胶
黄耆胶
琼脂
藻酸盐
果胶
半合成的聚合物，例如：
羧甲基纤维素(Tyloses C)、
甲基纤维素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)、
羟丙基纤维素(Klucels)、
羟丙基甲基纤维素(Methocels E和K、Viscontrans MPHC)。
通常，这些假塑性赋形剂与触变剂一起使用。
具有低流动能力的假塑性赋形剂
这些聚合物在足够浓度下引起产生在静置时具有低流动能力的高粘度溶液的结构流体排列。需要给予该***一定量的能量，以让其流动和转移。
为了获得一种流体溶液，需要外来能量(搅动)暂时破坏该结构流体排列。
这样的聚合物的实例是Carbopols和黄原胶。
触变赋形剂
用这些赋形剂在静置时得到一种凝胶结构；而在搅动时，则获得一种流体溶液。
触变赋形剂的实例是：Veegum(硅酸铝镁)和Avicel RC(大约89％的微晶纤维素和11％的羧甲基纤维素钠)。
6.3减小所述粒子的大小
CaCO3粒径的减小导致该化合物抗酸能力降低。
6.4保持粒子相互远离
这是在Veegum和Avicel RC中的情况；对于这种情况，不溶性粒子比CaCO3粒子小些(大约小1μm)，将所述不溶性粒子置于CaCO3粒子之间以便防止聚集。实施例7：产品设计
下面方案显示了可能的产品设计的实例。
7.1在注射器中的CaCO3
在得到多批临床用的冻干小瓶中的轮状病毒后，可以把所述抗酸剂置于注射器中所含有的重建液体之中。
Figure A0081434900391
在这种产品规格中，不仅在装填步骤期间，而且在该产品的整个贮藏期内(至少2年)，CaCO3的沉降都必须在控制之下。
7.2在冻干小瓶中的CaCO3
Figure A0081434900392
7.3在泡罩中冻干
在这种情况中，将轮状病毒、CaCO3和黄原胶在所述泡罩中一起直接冻干。
Figure A0081434900401
实施例8：不同轮状病毒株的冻干
批号  轮状病毒株 制剂的成分 冻干后时间等于0时的病毒滴度  在冻干且于37℃1周后的病毒滴度
00F26/01  G1SB purifn°61PRO/0232 蔗糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％ 104.6  104.7
00F26/02  G2(DS-1) 蔗糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％ 104.4  104.4
00F26/03  G3(P) 蔗糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％ 104.6  104.5
00F26/04  G4(VA-70) 蔗糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％ 104.8  104.8
00F26/05  G9(W161) 蔗糖：  2％葡聚糖：4％山梨醇：3％氨基酸：2％ 104.6  104.5
在“Fields”(Raven press，1990年，第二版)的第1361页上，将病毒株DS-1、P和VA70分别描述为血清型为G2、G3和G4的人轮状病毒参照株。
在这个实验中，冻干了不同的轮状病毒株。
对于所有这些病毒株而言，既在冻干期间保持了病毒滴度，又显示了加速稳定性(在37℃一周)。实施例9：在成人中口服给予一次轮状病毒疫苗的I期安全性研究
在年龄18至45岁的健康成人中，进行了一项I期研究，来评价口服一剂106.0ffu的P43疫苗的安全性和反应原性。
该临床试验是双盲和随机的。该试验是以安慰剂作对照并且是自给的。在比利时的一个中心里进行该研究。
研究人群
登记了总共33个被试者，其中11个在安慰剂组里，而22位在疫苗组中；且所有被试者都完成了所述的研究。所有的志愿者都是白种人(Caucasian)。在接种时，他们的平均年龄是35.3岁，年龄从18岁至44岁。该试验开始于一月且进行了稍多于一个月。
材料
疫苗
按照Good Manufacturing Practices来生产、纯化、配制及冻干多批临床用P43疫苗。按照Quality Control and Quality Assurance交付各批疫苗。每个小瓶的疫苗含有下面的组分：
活性成分：
P43病毒株                     最少105.8ffu
赋形剂、稳定剂：
蔗糖                          9mg
葡聚糖                        18mg
山梨醇                        13.5mg
氨基酸                        9mg
安慰剂
制备并交付安慰剂小瓶。每个小瓶的安慰剂包含下面的组分：
赋形剂、稳定剂：
蔗糖               9mg
葡聚糖             18mg
山梨醇             13.5mg
氨基酸             9mg
稀释剂
用注射用水作为稀释剂，来重建疫苗和安慰剂。
给予
在给予所述疫苗或安慰剂之前大约10至15分钟，口服给予两个组的被试者10ml Mylanta。Mylanta是一种已注册的抗酸剂。该抗酸剂增加胃的pH，并在轮状病毒通过胃期间防止轮状病毒失活。
为了制备所述疫苗，用1.5ml注射用稀释水来重建每小瓶含有105.8ffu的两小瓶冻干P43。这达到每剂106.1ffu的计算的病毒滴度。迅速地给予作为单独一剂口服的所述重建的疫苗。
为了制备所述安慰剂，用1.5ml注射用水来重建两小瓶冻干的安慰剂；并将其作为单独一剂口服给予。
安全性和反应原性
应用以下安全性和反应原性标准：
诱发的一般症状是发热、腹泻、呕吐、恶心、腹痛和食欲不振。在给予疫苗后的8天期间记录这些症状。
在给予疫苗后30天期间记录非诱发的症状。
在整个研究期间记录严重有害的事件。
应该在给予疫苗后的8天期间，收集腹泻样品。
结果是：
在各个观测期期间，没有报告诱发的症状、非诱发的症状及严重有害的事件。
没有报告腹泻的病例。
结论
当按双盲方式口服给予年龄18至44岁的成年健康志愿者作为单独一剂106.1ffu剂量的SB Biologicals P43疫苗时，该SB Biologicals P43疫苗相对于所述安慰剂是安全的。
                               序列表
<110>史密丝克莱恩比彻姆有限公司(SmithKline Beecham Biologicals S.A.)
<120>疫苗
<130>B45194
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>2350
<212>DNA
<213>人
<400>1atggcttcac tcatttatag acaacttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat      60gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact cagaatgtaa ctataaatcc gggtccattt     120gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg gatcatggag agataaatga ttcgactaca     180gtagaaccaa ttttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat     240tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac     300ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgtcaacc cagtagatag acaatatatg     360atatttggtg aaagcaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta     420gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat     480accagacttg taggaatatt taaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca     540ccgagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt     600cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caggaatcta aatgtaatga atatattaat     660aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga     720tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta     780tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt     840gtaaagatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat     900caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat     960ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg    1020tatgaagtta ttaaagagaa ttcttatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca    1080tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt taaattcagt gaaatgtaca    1140ggtggaagtt attatttcag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct    1200gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcatta    1260aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatactgaga    1320acacgtacag tgaatttgta tggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac    1380tacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tctttagttc caactaatga tgattatcag    1440actccaatta tgaattcagt gacggtaaga caagatttag agcgccaact tactgattta    1500cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca    1560ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact    1620aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt    1680tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt    1740agatcgaatt tatctgcgat ttcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta    1800actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acatctacaa ttagtaagaa acttagatta    1860aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta    1920aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga tatagttaca    1980gaagcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta    2040atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg    2100ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata    2160atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg    2220ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttacgtaatt tcattaatca aaataatcca    2280attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtgaga acgctattga    2340ggatgtgacc                                                           2350
       <210>2
       <211>1009
       <212>DNA
       <213>人
       <400>2atgtatggtc ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaattat tctactcaac      60tatatattaa aatcagtaac tcgaataatg gactacatta tatatagatc tttgttgatt     120tatgtagcat tatttgcctt gacaagagct cagaattatg ggcttaactt accaataaca     180ggatcaatgg acactgtata cgctaactct actcaagaag gaatatttct aacatccaca     240ttatgtttgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatta atgatggtga atggaaagac     300tcattgtcac aaatgtttct cacaaaaggt tggccaacag gatcagtcta ttttaaagag     360tattcaagta ttgttgattt ttctgtcgat ccacaattat attgtgatta taacttagta     420ctaatgaaat atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag agttagctga tttaatattg     480aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt attatcaaca atcgggagaa     540tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaatacg     600caaatgttag gaataggttg tcaaacaaca aatgtagact cgtttgaaat ggttgctgag     660aatgagaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttgaca     720actacgacat gtactattcg aaattgtaag aagttaggtc caagagagaa tgtagctgta     780atacaagttg gtggctctaa tgtattagac ataacagcag atccaacgac taatccacaa     840actgagagaa tgatgagagt gaattggaaa aaatggtggc aagtatttta tactatagta     900gattatatta accaaatcgt gcaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca     960gctttttatt atagagtata gatatatctt agattagatc gatgtgacc                1009

Claims (39)

1.一种减毒轮状病毒种群，其特征在于它由单一的变异体或大体上单一的变异体组成，所述变异体由编码名为VP4和VP7的主要病毒蛋白中至少一种的核苷酸序列限定。
2.一种权利要求1的轮状病毒种群，所述种群为一个克隆株。
3.一种权利要求1或权利要求2的轮状病毒种群，所述种群来源于人轮状病毒感染。
4.一种权利要求1-3中任一项的轮状病毒种群，所述种群在人体中复制且被人体***出。
5.一种权利要求1-4中任一项的轮状病毒种群，其中所述大体上单一的变异体是其中所述VP4基因包含一段包括以下碱基中至少一种的核苷酸序列的变异体：从起始密码子起，在788位的腺嘌呤碱基(A)、在802位的腺嘌呤碱基(A)以及在501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
6.一种权利要求5的轮状病毒种群，其中所述VP4基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：从起始密码子起，在788位和802位的腺嘌呤碱基(A)，以及在501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
7.一种权利要求1-6中任一项的轮状病毒种群，其中所述大体上单一的变异体是其中所述VP7基因包含一段包括以下碱基中至少一种的核苷酸序列的变异体：从起始密码子起，在605位的胸腺嘧啶(T)、在897位的腺嘌呤(A)和在897位的鸟嘌呤(G)。
8.一种权利要求7的轮状病毒种群，其中所述VP7基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：从起始密码子起，在605位的胸腺嘧啶(T)、以及在897位的腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。
9.一种权利要求5-8的轮状病毒种群，其中所述VP4基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：从起始密码子起，在788位和802位的腺嘌呤(A)及在501位的胸腺嘧啶(T)；且所述VP7基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：从起始密码子起，在605位的胸腺嘧啶(T)和在897位的腺嘌呤(A)。
10.一种轮状病毒，所述轮状病毒包含：一种编码VP4蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如图1中所示；和/或一种编码VP7蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如图2中所示。
11.一种权利要求1-10中任一项的轮状病毒种群，所述轮状病毒种群称为P43且以保藏号ECACC 99081301保藏。
12.一种轮状病毒变异体、其轮状病毒后代和其免疫学活性衍生物、以及由它而获得的材料，所述轮状病毒变异体称为P43且以保藏号ECACC 99081301保藏。
13.一种轮状病毒重配体，所述轮状病毒重配体包含权利要求11或权利要求12的轮状病毒变异体P43之至少一种抗原或至少一个节段。
14.一种产生由大体上单一的变异体组成的纯化轮状病毒种群的方法，所述方法包括：
在合适的细胞系中将一种轮状病毒制剂传代；
可任意选择地采用或者有限稀释步骤或者单个噬斑分离的步骤，来选择均一的培养物；以及
通过对所述VP4和/或所述VP7基因序列的适当区域进行序列测定而检验大体上单一的变异体的存在。
15.一种权利要求14的方法，其中在AGMK细胞中将所述轮状病毒制剂传代。
16.一种权利要求14或权利要求15的方法，其中所述轮状病毒制剂具有89-12病毒株或其衍生物的特征。
17.一种权利要求14-16中任一项的方法，所述方法包括附加的***处理步骤，以除去意外产生的***敏感性污染因子。
18.一种疫苗组合物，所述组合物包含与一种合适的药用载体或佐剂混合的一种权利要求1-13中任一项的活减毒病毒。
19.一种权利要求18的疫苗组合物，所述疫苗组合物适合于口服给予。
20.一种权利要求19的疫苗组合物，其中所述活减毒病毒是与一种抗酸剂组合物一起配制的。
21.一种权利要求20的疫苗组合物，其中所述抗酸剂组合物包括一种有机抗酸剂。
22.一种权利要求21的疫苗组合物，其中所述抗酸剂为柠檬酸钠。
23.一种权利要求20的疫苗组合物，其中所述抗酸剂组合物包括一种无机抗酸剂。
24.一种权利要求23的疫苗组合物，其中所述抗酸剂是氢氧化铝。
25.一种权利要求23的疫苗组合物，其中所述抗酸剂是碳酸钙。
26.一种权利要求25的疫苗组合物，所述组合物还包括一种粘性剂。
27.一种权利要求26的疫苗组合物，其中所述粘性剂为黄原胶。
28.一种权利要求25-27中任一项的疫苗组合物，其中所述活减毒病毒是与碳酸钙和黄原胶一起配制的，且用水溶液重建。
29.一种权利要求20-28中任一项的疫苗组合物，其中所述减毒活疫苗是与所述抗酸剂组合物一起配制的，且是在泡罩片中冻干的。
30.权利要求18-29中任一项的疫苗组合物，其中所述病毒为冻干形式。
31.一种权利要求30的疫苗组合物，其中所述活减毒病毒和所述抗酸剂组合物存在于独立的容器中，以供在给予之前配制为液体疫苗组合物。
32.一种权利要求30的疫苗组合物，其中所述活减毒病毒和所述抗酸剂组合物存在于同一容器中，以供配制为在给予之前用水溶液重建的冻干疫苗组合物。
33.一种包含活减毒轮状病毒的疫苗组合物，其中所述病毒为冻干形式。
34.一种权利要求33的疫苗组合物，其中所述组合物为当被置于舌上时立即溶解的速溶片剂形式。
35.一种权利要求33或权利要求34的疫苗组合物，所述组合物包含与一种例如碳酸钙的无机抗酸剂及一种例如黄原胶的粘性剂一起混合的一种冻干的减毒活轮状病毒。
36.一种权利要求35的疫苗组合物，其中所述减毒病毒和所述抗酸剂组合物存在于独立的容器中，以供在给予之前配制为液体疫苗组合物。
37.一种权利要求35的疫苗组合物，其中所述减毒病毒和所述抗酸剂组合物被配制到同一容器中，作为一种在给予之前用含水溶液重建的冻干疫苗组合物。
38.一种制造轮状病毒疫苗的方法，所述方法包括将一种冻干的、活减毒人轮状病毒与一种抗酸剂及一种粘性剂一起混合。
39.一种在人类中预防轮状病毒感染的方法，所述方法包括给予需要预防轮状病毒感染的人类对象有效量的一种权利要求18-27中任一项的疫苗。
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