ES2260046T3 - Procedimiento para separar variantes rotavirus y vacuna de rotavirus vivos atenuados. - Google Patents
Procedimiento para separar variantes rotavirus y vacuna de rotavirus vivos atenuados.Info
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Abstract
Una población de rotavirus atenuado humano, que se caracteriza porque comprende una única variante o sustancialmente una única variante, estando dicha variante definida por una secuencia nucleotídica que codifica al menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7.
Description
Procedimiento para preparar variantes rotavirus
y vacuna de rotavirus vivos atenuados.
Esta invención se refiere a nuevas formulaciones
de vacunas, a procedimientos para prepararlas y a su uso en
tratamiento. En particular, la presente invención se refiere a
nuevas formulaciones de vacunas con rotavirus.
La diarrea infecciosa aguda es una causa
principal de enfermedad y muerte en muchas zonas del mundo. En los
países en desarrollo, el impacto de la enfermedad diarreica es muy
importante. Se ha estimado que en Asia, África y Latinoamérica
existen entre 3-4 billones de casos de diarrea cada
año y, de estos casos, alrededor de 5-10 millones
tienen como resultado la muerte (Walsh, J.A. y col.: N. Engl. J.
Med., 301:967-974 (1979)).
Se ha reconocido que los rotavirus son una de
las causas más importantes de diarrea intensa en lactantes y niños
pequeños (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields
Virology, Third Edition, editado por Fields y col., Raven
Publishers, Filadelfia, 1996). Se ha estimado que la enfermedad por
rotavirus es responsable de alrededor de un millón de muertes
anuales. La enfermedad inducida por rotavirus afecta principalmente
a niños de edades comprendidas entre los 6 y los 24 meses, y la
prevalencia máxima de la enfermedad suele producirse durante los
meses más fríos en climas templados y durante todo el año en zonas
tropicales. Los rotavirus se transmiten típicamente de una persona a
otra por la vía oro-fecal, con un periodo de
incubación de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días. Al
contrario que la infección en el grupo de 6 meses-24
meses de edad, por lo general, los neonatos son asintomáticos o solo
presentan la enfermedad leve. En contraste con la enfermedad grave
que se suele encontrar en niños pequeños, la mayoría de los adultos
están protegidos como resultado de infecciones previas por
rotavirus, por lo que en la mayoría de los adultos las infecciones
son leves o asintomáticas (Offit, P.A. y col. Comp. Ther.,
8(8):21-26,
1982).
1982).
En general. los rotavirus son esféricos y su
nombre deriva de su característica estructura de cápside de cubierta
externa e interna o de doble cubierta. Normalmente, la estructura de
la cápside de doble cubierta de un rotavirus rodea una cubierta
proteica interna o núcleo que contiene el genoma. El genoma de un
rotavirus está compuesto por 11 segmentos de de ARN bicatenario que
codifica al menos 11 proteínas virales distintas. Dos de estas
proteínas virales, denominadas VP4 y VP7 (proteína G) están
dispuestas en el exterior de la estructura de cápside de doble
cubierta. La cápside interna del rotavirus presenta una proteína,
que es la proteína del rotavirus denominada VP6. La importancia
relativa de estas proteínas concretas de los rotavirus en provocar
la respuesta inmunitaria que sigue a la infección por rotavirus
todavía no está clara. No obstante, la proteína VP6 determina el
antígeno del grupo y subgrupo y las proteínas VP4 y VP7 son los
determinantes de la especificidad de serotipo.
La proteína VP7 es una glucoproteína de PM de
38.000 (PM de 4.000 cuando no está glicosilada) que es el producto
de la traducción del segmento genómico 7, 8 ó 9, dependiendo de la
cepa. Esta proteína estimula la formación del principal anticuerpo
neutralizante tras la infección por rotavirus. La proteína VP4 es
una proteína no glicosilada de aproximadamente 88.000 de PM, que es
el producto de la traducción del segmento genómico 4. Esta proteína
también estimula el anticuerpo neutralizante tras la infección por
rotavirus.
Dado que las proteínas VP4 y VP7 son la
proteínas víricas contra las que están dirigidos los anticuerpos
neutralizantes, se cree que son los candidatos primarios para el
desarrollo de vacunas de rotavirus, proporcionando protección contra
la enfermedad por rotavirus.
Se sabe que la infección natural por rotavirus
durante la primera etapa de la infancia produce inmunidad
protectora. Por tanto, es deseable una vacuna contra rotavirus con
microorganismos vivos, atenuados. Preferentemente, esta debería ser
una vacuna oral, ya que esta es la vía natural de adquirir la
infección del virus.
El primer desarrollo de vacunas para prevenir
las infecciones por rotavirus comenzó en la década de 1970 tras el
descubrimiento del virus. Inicialmente, se estudiaron las cepas
atenuadas de animales y seres humanos, con resultados mixtos o
decepcionantes. Los esfuerzos más recientes se han centrado en
reagrupados de seres humanos-animales que han tenido
más éxito.
Ward ha descrito una cepa de rotavirus conocida
como 89-12; véase la patente de EE.UU. nº 5.474.773
y Bernstein, D. L. y col., Vaccine, 16 (4), 381-387,
1998. La cepa 89-12 se aisló de una muestra de heces
recogida de un niño de 14 meses de edad con una enfermedad natural
por rotavirus en 1988. De acuerdo con la patente de EE.UU. nº
5.474.773, el rotavirus humano HRV 89-12 se adaptó
al cultivo mediante 2 pases en células de riñón de mono verde
africano (AGMK) y 4 pases en células MA-104 como
describe Ward en J. Clin. Microbiol., 19, 748-753,
1984. A continuación se purificó en placas 3 veces en células
MA-104 (hasta el pase 9) y se cultivó tras 2 pases
adicionales en estas células. Se realizó un pase adicional (pase 12)
para su depósito con el número de registro de la ATCC VR 2272. La
cepa depositada se conoce como 89-12C2.
A continuación se hace referencia al artículo de
1998 de Bernstein y col. sobre Vacunas, como el artículo Vacunas
(1998). El artículo describe la seguridad e inmunogenicidad de un
candidato a vacuna con rotavirus humanos vivos administrada por vía
oral. Esta vacuna se obtuvo de la cepa 89-12,
atenuada mediante pases sin purificación en placas 26 veces en
células AGMK primarias y después otras 7 veces en una línea celular
AGMK establecida (33 pases en total).
En lo sucesivo, el material mencionado
anteriormente que se ha sometido a 26 pases seriados se denominará
P26 y el material que se ha sometido a 33 pases seriados se
denominará P33. En general, los rotavirus derivados de n pases de la
cepa 89-12 se denominarán Pn.
En los ejemplos siguientes el material P33 se
pasó otras 5 veces en células Vero. Esta se denomina P38.
Los aislamientos P26 y P33 descritos en el
artículo Vacunas (1998) no se depositaron en una recolección de
cultivo, ni tampoco se sometieron a análisis para establecer su
caracterización genética.
En la actualidad se ha descubierto que la
población P26 descrita en la literatura comprende una mezcla de
variantes. Esta se ha establecido mediante caracterización genética
como se describe en la presente memoria descriptiva a continuación
(véanse los ejemplos). Por tanto, la P26 no es una población
fiablemente consistente para más pases, en particular para la
producción de lotes de vacunas. De igual forma, la P33 comprende una
mezcla de variantes y no es fiablemente consistente para la
producción de lotes de vacunas.
Se ha descubierto que el material P26 es una
mezcla de al menos tres variantes del gen VP4. P33 y P38 son, de
igual forma, una mezcla de dos variantes. Estas variantes parecen
ser antigénicamente diferentes en términos de epítopos
neutralizantes a la cepa 89-12C depositada en la
ATCC al evaluar los títulos de anticuerpos neutralizantes de sueros
de lactantes vacunados con P contra estas variantes. Esto se ilustra
en la Figura 3.
Además, se ha descubierto que cuando el material
P33 se administra a lactantes se replican y excretan dos variantes
identificadas. De 100 lactantes vacunados, Solo 2 mostraron signos
de gastroenteritis debida a la infección con rotavirus, mientras que
el 20% de un grupo tratado con placebo estaba infectado. Estos
hallazgos sugieren que las variantes identificadas están asociadas
con la protección de la enfermedad por rotavirus.
La presente invención proporciona un
procedimiento para separar variantes de rotavirus y una vacuna de
rotavirus atenuados vivos mejorada derivada de una cepa de rotavirus
humana clonada (homogénea).
En consecuencia, de acuerdo con un primer
aspecto la presente invención proporciona una población de rotavirus
atenuados (aislamiento), que se caracteriza porque comprende una
variante única o sustancialmente una variante única, definida dicha
variantes por la secuencia nucleotídica que codifica al menos una de
las principales proteínas víricas denominadas VP4 y VP7.
Preferentemente, la población de rotavirus según
la invención es una variante clonada.
Por población que comprende una única variante,
o sustancialmente una única variante, se quiere decir una población
de rotavirus que no contiene más del 10%, y preferentemente menores
del 5% y más preferentemente menos del 1% de una variante o
variantes diferentes. Las poblaciones de virus se pueden purificar
hasta homogeneidad u homogeneidad sustancial mediante pases en tipos
de células adecuados o realizando una seria de una o más etapas de
clonación.
Una ventaja de la invención es que una población
que comprende una única variante es más adecuada para la formulación
de un lote de vacuna consistente. Variantes concretas definidas por
secuencias nucleotídicas que codifican la principal proteína vírica
también pueden asociarse con eficacia potenciada en la prevención de
la infección por rotavirus.
En un aspecto preferido, la única variante o la
sustancialmente única variante en la población de rotavirus de la
invención es una variante en la que el gen de VP4 comprende una
secuencia nucleotídica que comprende al menos una de las siguientes:
una base adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la
posición 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón
de iniciación.
En otro aspecto preferido, la única variante o
la sustancialmente única variante en la población de rotavirus de la
invención es una variante en la que el gen de VP7 comprende una
secuencia nucleotídica que comprende al menos una de las siguientes:
una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición
897 o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de
iniciación. Preferentemente en la posición 897 hay una
adenina
(A).
(A).
En un aspecto preferido la única variante en la
población según la invención presenta una adenina (A) en las
posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 desde el
codón de iniciación en la secuencia del gen
de VP4.
de VP4.
En otro aspecto preferido la única variante en
la población según la invención presenta una timina (T) en la
posición 605 y una adenina/guanina (A/G) en la posición 897 desde el
codón de iniciación en la secuencia de VP7. Más preferentemente en
la secuencia de VP7 hay una adenina (A) en la posición 897.
En un aspecto especialmente preferido la única
variante en la población según la invención presenta una adenina (A)
en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501
desde el codón de iniciación en la secuencia génica VP4, y una
timina (T) en la posición 605 y una adenina/guanina (A/G) en la
posición 897 desde el codón de iniciación en la secuencia VP7. Más
preferiblemente, en la secuencia VP7 hay una adenina (A) en la
posición 897.
En otro aspecto la única variante comprende una
secuencia nucleotídica que codifica una proteína VP4, en la que la
secuencia nucleotídica es como se muestra en la Figura 1, y/o una
secuencia nucleotídica que codifica una proteína VP7, en la que la
secuencia nucleotídica es como se muestra en la Figura 2.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para producir una población de rotavirus que
comprenden una variante sustancialmente única, donde el
procedimiento comprende:
el pase de una preparación de rotavirus en una
tipo celular adecuado;
opcionalmente seleccionar un cultivo homogéneo
usando las etapas de:
a) dilución límite; o
b) aislamiento en placas individual; y
comprobar la presencia de una variante
sustancialmente única mediante una determinación de la secuencia de
una región adecuada de la secuencia génica de VP4 y/o VP7.
La determinación de la secuencia se puede llevar
a cabo de forma adecuada mediante una técnica de hibridación
cuantitativa o semicuantitativa tal como hibridación puntual o
hibridación en placas.
Preferentemente, la variante seleccionada es una
variante que se replica y excreta cuando la preparación de rotavirus
de partida se administra a un sujeto humano, en particular un
niño.
La población de virus clonado resultante como
resultado del procedimiento de acuerdo con la invención puede
amplificarse mediante más pases en una línea celular adecuada.
Entre los tipos celulares adecuados para pasar
la población de rotavirus en el procedimiento anterior se incluyen
células de riñón de mono verde africano (AGMK), que pueden ser
líneas celulares establecidas o células AGMK primarias. Entre las
líneas celulares AGMK adecuadas se incluyen, por ejemplo, Vero (ATCC
CCL-81), DBS-FRhL-2
(ATCC CL-160). BSC-1 (ECACC
85011422) y CV-1 (ATCC CCL-70).
También son adecuadas las líneas celulares MA-104
(mono rhesus) y MRC-5 (humana ATCC
CCL-171). Las células Vero son particularmente
preferidas con fines de amplificación. Los pases en células Vero
proporcionan un elevado rendimiento de virus.
En la técnica se conocen técnicas para comprobar
sin existe una única variante en una población de virus resultante
del procedimiento y para determinar la naturaleza de la única
variante que implican secuenciación convencional o procedimientos de
hibridación y se describen en la presente memoria descriptiva a
continuación.
En un aspecto preferido, el procedimiento de la
invención se realiza usando un rotavirus adecuados, en particular un
rotavirus que tiene las características de la cepa
89-12 o de un derivado de la misma sometido a
pases.
Un población de variante única particularmente
preferida es la P43, que se obtuvo de la P33 (un rotavirus humano
aislado 33 veces en cultivos en tipos celulares adecuados) mediante
una serie de etapas de clonación de dilución Terminal seguidas por
pases del material clonado en células Vero para su
amplificación.
Una población P43 se depositó en la Colección
Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC), Laboratorio de
Investigación y Producción de Vacunas, Servicio de Laboratorio de
Salud Pública, Centro para la Microbiología e Investigación
Aplicada, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido,
el 13 de agosto de 1999 con el número de registro 99081301, en los
términos del Tratado de Budapest.
Aunque esta disponibilidad pública indicada en
el procedimiento más sencillo de obtener P43 rotavirus humano, no es
del todo imposible o improbable que puedan producirse rotavirus
similares y sustancialmente idénticos funcionalmente mediante estos
u otros procedimientos a la luz de las enseñanzas de esta
invención.
Se considera que dichos rotavirus
sustancialmente idénticos funcionalmente son biológicamente
equivalentes al rotavirus humano P43 de esta invención y, por tanto,
se encuentran dentro del alcance general de la presente invención.
Por tanto, deberá entenderse que la invención abarca poblaciones de
rotavirus que tienen las características de la variante P43 como se
describe en la presente memoria descriptiva.
Bien deberá entenderse que la invención abarca
materiales derivados de la P43 depositada en la ECACC 99081301
sometiéndola a posterior procesamiento mediante su propagación a
través de posteriores pases, clonación u otros procedimientos
utilizando el virus vivo o mediante la modificación de P43 de
cualquier forma que incluya técnicas de ingeniería genética o
técnicas de reagrupación. Tales etapas y técnicas son bien conocidas
en la técnica.
Materiales derivados de la P43 depositada
abarcadas por la invención incluyen material proteico y genético. De
particular interés son los rotavirus reagrupados que comprenden al
menos un antígeno o al menos un segmento de P43, por ejemplo
reagrupados que comprenden una cepa virulenta de rotavirus en la que
uno o parte de uno de los 11 segmentos del genoma ha sido
reemplazado por el segmento genómico o parte del mismo de P43.
Específicamente, un reagrupado de rotavirus en el que el segmento o
segmento parcial que codifica la NSP4 es un segmento o segmento
parcial de P43, puede poseer propiedades útiles. Los rotavirus
reagrupados y técnicas para prepararlos son bien conocidos (Foster,
R. H. y Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review.
ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178,
1998).
Materiales de particular interés son la progenie
de P43 y los derivados inmunológicamente activos de P43. Derivados
inmunológicamente activos quiere decir materiales obtenidos de o con
el virus P43, en particular antígenos del virus, que son capaces de
provocar una respuesta inmunitaria que es reactiva contra el
rotavirus cuando se inyecta en un animal huésped.
Al adaptar el rotavirus a una línea célula
adecuada, por ejemplo células Vero, puede ser necesario tratar el
virus para eliminar cualquier posible contaminante tales como
agentes extraños que puedan estar presentes y que, de otro modo,
causarían contaminación. En el caso de virus extraños sensibles a
éter, esto se puede realizar mediante tratamiento con éter como se
describe más adelante en la presente memoria descriptiva. La
presente invención también se refiere a la inclusión de tal
tratamiento con éter como etapa opcional en el procedimiento global
para la obtención de un rotavirus vivo atenuado o una vacuna
formulada con el mismo.
Asimismo, dentro del alcance de la invención
están las mezclas de P43 con otras variantes de rotavirus, por
ejemplo otras variantes clonadas con otros virus, en particular
otros virus atenuados. Tales mezclas son útiles en las vacunas de la
invención que se describen más adelante en la presente memoria
descriptiva.
La presente invención también proporciona una
vacuna de rotavirus vivo atenuado que comprende una población de
variante sustancialmente única mezclada con un adyuvante o un
transportador farmacéutico adecuado.
Preferentemente, la vacuna de rotavirus según la
invención es una vacuna del rotavirus monovalente que contenga una
única cepa de rotavirus.
La presente invención es particularmente
ventajosa para proporcionar una vacuna de rotavirus vivo en la que
el rotavirus vivo atenuado es un rotavirus humano y no produce
intususpección.
Entre los transportadores farmacéuticos
adecuados para usar en la vacuna según la invención se incluyen los
conocidos en la técnica como adecuados para administración oral, en
especial a lactantes. Tales transportadores incluyen, sin estar
limitados a ellos, hidratos de carbono, polialcoholes, aminoácidos,
hidróxido de aluminio, hidróxido de magnesio, hidroxiapatita, talco,
óxido de titanio, hidróxido de hierro, estearato de magnesio,
carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa
microcristalina, gelatina, peptona vegetal, goma xantán,
carragenina, goma arábiga,
\beta-ciclodextrina.
La invención también proporciona un
procedimiento para preparar una vacuna de rotavirus, por ejemplo
liofilizando el virus en presencia de estabilizantes adecuados o
mezclando el virus según la invención con un adyuvante o
transportador farmacéutico adecuado.
También puede ser una ventaja formular el virus
de la invención en vehículos basados en lípidos, tal como virosomas
o liposomas, en emulsiones de aceite en agua o con partículas
transportadoras. Como alternativa o adicionalmente, se pueden
incluir en la formulación inmunoestimulantes tales como los
conocidos en la técnica para vacunas orales. Entre tales
inmunoestimulantes se incluyen toxinas bacterianas, en particular la
toxina del cólera (TC) en forma de la holotoxina (la molécula
entera) o la cadena B sólo (CTB) y la enterotoxina termolábil de
E. coli (LT). Las LT mutadas (LTm) que es menos probable que
se conviertan en su forma activa que la LT nativa se describen en
los documentos WO 96/06627, WO 93/13202 y US 5,182,109.
Otros inmunoestimulantes que pueden incluirse de
forma ventajosa son derivados de saponina tales como QS21 y
monofosforil lípido A, en particular el monofosforil lípido A
3-O-desacilado
(3D-MPL). Las saponinas purificadas como adyuvantes
orales se describen en el documento WO 98/56415. Las saponinas y el
monofosforil lípido A se pueden emplear por separado o en
combinación (p. ej., documento WO 94/00153) y se pueden formular en
sistemas adyuvantes junto con otros agentes. El
3D-MPL es un adyuvante bien conocido fabricado por
Ribi Immunochem, Montana, y su fabricación se describe en el
documento GB 2122204.
Una exposición general de vehículos y adyuvantes
para la inmunización oral se puede encontrar en Vaccine Design, The
Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell y Newman, Plenum
Press, Nueva York, 1995.
La invención también proporciona un
procedimiento para vacunar sujetos humanos, en especial lactantes,
mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una
cantidad eficaz de una composición vacunal según la invención.
Preferentemente, la vacuna viva atenuada se administra mediante
administración oral.
\newpage
En un aspecto preferido, la composición vacunal
de la invención se formula con un antiácido para minimizar la
inactivación de la vacuna por el ácido del estómago. Entre los
componentes antiácido adecuados se incluyen antiácidos inorgánicos,
por ejemplo hidróxido de aluminio Al(OH)_{3} e
hidróxido de magnesio Mg(OH)_{2}.
Entre los antiácidos comercialmente disponibles
que son adecuados para usar en la invención se incluyen
Mylanta(marca comercial), que contiene hidróxido de aluminio
e hidróxido de magnesio. Estos son insolubles en agua y se
proporcionan en suspensión.
El hidróxido de aluminio es un componente
particularmente preferido de una composición vacunal según la
invención, ya que puede proporcionar no solo un efecto antiácido
sino también un efecto adyuvante.
También adecuados para usar como antiácidos en
la vacuna de la invención son los antiácidos orgánicos, tales como
las sales carboxilato de ácido orgánico. Un antiácido preferido en
la composición de la vacuna de la invención contiene una sal
carboxilato de ácido orgánico, preferentemente una sal de ácido
cítrico tal como citrato sódico o citrato potásico.
Un antiácido particularmente preferido que puede
usarse en la composición de la vacuna de la presente invención es la
sal inorgánica insoluble, carbonato cálcico (CaCO_{3}). El
carbonato cálcico es capaz de asociarse con el rotavirus y la
capacidad del rotavirus se mantiene durante la asociación con el
carbonato cálcico.
Para prevenir la sedimentación del carbonato
cálcico durante la etapa de llenado, en la formulación
preferentemente hay agentes viscosos.
Entre los posibles agentes viscosos que se
pueden usar se incluyen excipientes pseudoplásticos. Una solución
pseudoplástica se define como una solución que posee una viscosidad
más elevada en reposo en comparación con su viscosidad en agitación.
Excipientes de este tipo son los polímeros naturales tales como goma
arábiga, goma adragant, agar-agar, alginatos,
pectinas o polímeros semisintéticos, por ejemplo:
carboximetilcelulosa (Tyloses C®), metilcelulosa (Methocels A®,
Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®), hidroxipropilmetilcelulosa
(Klucels®), hidroxipropilcelulosa (Methocels E® y K®, Vicotrans
MPHC®). En general, esos excipientes pseudoplásticos se usan junto
con agentes tixotrópicos. Agentes viscosos alternativos que se
pueden usar son los excipientes pseudoplásticos con baja capacidad
de flujo. Esos polímeros, a una concentración suficiente, dan lugar
a una disposición fluida estructural que tiene como resultado una
solución de viscosidad elevada con baja capacidad de flujo en
reposo. Se necesita proporcionar al sistema una cierta cantidad de
energía para permitir el flujo y la transferencia. Son necesarias
energías externas (agitación) para destruir temporalmente la
disposición fluida estructural con el fin de obtener una
solución
fluida.
fluida.
Ejemplos de tales polímeros son Carbopols® y
goma xantán.
Los excipientes tixotrópicos se convierten en
una estructura de gel en reposo, mientras que en agitación forman
una solución fluida. Ejemplos de excipientes tixotrópicos son:
Veegum® (silicato de aluminio-magnesio), Avicel RC®
(aproximadamente un 89% de celulosa microcristalina y un 11% de
carboximetilcelulosa Na).
La composición de la vacuna de la presente
invención comprende, preferentemente, un agente viscoso seleccionado
de goma xantán o almidón.
Por tanto, la composición de la vacuna de la
presente invención se formula, preferentemente, con una combinación
de carbonato de calcio y goma xantán.
Otros componentes de una composición usada en la
invención incluyen de forma adecuada azúcares, por ejemplo sacarosa
y/o lactosa.
La composición de la vacuna de acuerdo con la
invención puede contener componentes adicionales, incluidos, por
ejemplo, aromatizantes (en particular para una vacuna oral) y
agentes bacteriostáticos.
Se prevén preparaciones diferentes de la
composición de la vacuna de acuerdo con la invención.
En una forma de realización preferida, la vacuna
se administra en forma de una formulación líquida. Preferentemente,
formulación líquida se reconstituye antes de la administración a
partir de al menos los siguientes dos componentes:
i) componente vírico
ii) componente líquido.
En esta forma de realización, el componente
vírico y el componente líquido normalmente están presentes en
envases distintos, que pueden ser de forma conveniente
compartimentos separados de un único vaso, o vasos separados que se
pueden conectar de tal forma que la composición final de la vacuna
se reconstituye sin exponerse al aire.
Antes de la reconstitución, el virus puede estar
en forma seca o en forma líquida. Preferentemente el componente
vírico está liofilizado. El virus liofilizado es más estable que el
virus en una solución acuosa. El virus liofilizado puede
reconstituirse de forma adecuada usando una composición antiácida
líquida para producir una formulación de vacuna líquida. Como
alternativa, el virus liofilizado puede reconstituirse con agua o
con solución acuosa, en cuyo caso la composición de virus
liofilizado contiene, preferentemente un componente antiácido.
Preferentemente, la formulación de la vacuna
comprende un componente vírico formulado con carbonato de calcio y
goma xantán en un compartimento o vaso, y esto se reconstituye con
agua o solución acuosa presente en el segundo compartimento o
vaso.
En otra forma de realización preferida, la
composición de la vacuna es una formulación sólida, preferentemente
una torta liofilizada que es adecuada para la disolución inmediata
cuando se introduce en la boca, Las formulaciones liofilizadas se
pueden proporcionar convenientemente en forma de comprimidos en un
envase blíster farma-
céutico.
céutico.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna de rotavirus en forma de un comprimido de disolución rápida
para administración oral.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición que comprende una cepa de rotavirus atenuado vivo, en
particular una cepa de rotavirus humano, en la que la composición es
un sólido liofilizado capaz de la disolución inmediata cuando se
introduce en la boca.
Preferentemente, el comprimido de disolución
rápida según la invención se disuelve en la boca del sujeto lo
suficiente rápido como para impedir la deglución del comprimido no
disuelto. Este enfoque es particularmente ventajoso para las vacunas
de rotavirus pediátricas.
Preferentemente, el virus es un rotavirus vivo
atenuado humano que se formula con un antiácido inorgánico tal como
carbonato de calcio y un agente viscoso tal como goma xantán.
Otro aspecto de la presente invención es
proporcionar una formulación liofilizada en la que el componente
vírico es cualquier cepa de rotavirus que se formula con carbonato
de calcio y goma xantán.
Las vacunas de la invención se pueden formular y
administrar mediante técnicas conocidas, usando una cantidad
adecuada de virus vivo para proporcionar protección eficaz contra la
infección por rotavirus sin efectos secundarios adversos
significativos en vacunas típicas. Normalmente, una cantidad
adecuada de virus vivo estará entre 10^{4} y 10^{7} uff por
dosis. Una dosis típica de vacuna puede comprender
10^{5}-10^{6} uff por dosis y se puede
administrar en varias dosis en un periodo de tiempo, por ejemplo en
dos dosis administradas con un intervalo de dos meses. Sin embargo
se pueden obtener beneficios teniendo más de 2 dosis, por ejemplo un
régimen de 3 ó 4 dosis, particularmente en los países en desarrollo.
El intervalo entre dosis puede ser de una duración mayor o menor a
dos meses. Una cantidad óptima de virus vivos para una dosis única o
para un régimen de múltiples dosis, y el momento adecuado para las
dosis, se puede determinar mediante estudios estándar que implican
la observación de los títulos de anticuerpos y otras respuestas en
los sujetos.
La vacuna de la invención puede también
comprende otros virus vivos adecuados para la protección contra
otras enfermedades, por ejemplo poliovirus. Como alternativa, otras
vacunas con virus vivos adecuados para administración pueden
administrarse en una dosis aparte pero a la vez que la composición
de vacuna de rotavirus según la
invención.
invención.
Se analizaron sueros de doce lactantes de 4 a 6
meses de edad vacunados con el material P33 como se describe en el
artículo Vacunas (1998) para determinar la neutralización de P33,
P38, P43 y 89-12C2.
El intervalo de los títulos de neutralización de
todos los sueros analizados es similar para P33, P38 y P43. El
análisis estadístico no muestra diferencias significativas en los
títulos de neutralización global contra los tres virus. Esto sugiere
que los epítopos de neutralización conformacionales y no
conformacionales de P33, P38 y P43 son igualmente bien reconocidos
por los sueros anti-P33 de los lactantes vacunados
con P33. Esta observación sugiere de forma indirecta que los
epítopos de neutralización revelados en este ensayo in vitro
no se vieron alterados ente P33, P38
y P43.
y P43.
Sin embargo, el intervalo de los títulos de
neutralización de P89-12C2 difiere
significativamente de P33, P38 y P43. Esta observación sugiere que
los epítopos de neutralización conformacionales y no
conformacionales de P33, P38 y P43 no son igualmente bien
reconocidos por los sueros anti-P33 de los lactantes
vacunados con P33. Esta observación sugiere de forma indirecta que
los epítopos de neutralización revelados en este ensayo in
vitro no se vieron alterados ente 89-12C2 y P33,
P38 y P43.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Se llevó a cabo la secuenciación de los genes de
VP4 y VP7 del pase P26 (células AGMK primarias), pase P33 (línea
celular AGMK establecida (al contrario que primaria), pase P41 y
pase 43. La extracción del ARN tota se sometió a transcripción
inversa y se amplificó mediante PCR en un tubo/una etapa.
Los cebadores Rota 5bis y Rota 29bis
amplificaron la totalidad del gen VP4 y los cebadores Rota 1 y Rota
2bis amplificaron la totalidad del gen VP7. El material de la PCR se
ha secuenciado usando distintos cebadores (véase la Tabla 1).
La secuencia del pase P26 difería de la
secuencia del pase P33 en 3 bases (en las posiciones 501, 788 y 802
pb desde el codón de iniciación) en VP4 y en tres bases en VP7 (108,
605 y 897 pb desde el codón de iniciación).
Las radiografías de la secuencia del pase P26 de
VP4 y VP7 muestran en las posiciones mutadas la presencia de la
secuencia del pase P33 de fondo. Por tanto, se puede observar que el
pase P26 es una mezcla de al menos 2
variantes.
variantes.
Las radiografías de la secuencia del pase P33
parecen homogéneas en VP4 y heterogéneas para VP7 (véase la Tabla
2).
El pase P38 (derivado del pase 33) se pasó 5
veces en células Vero y exhibió el mismo conjunto de secuencias de
VP4 y VP7 que el pase P33 (línea celular AGMK). Por tanto, no se
produjeron cambios de importancia en las poblaciones entre P33 y
P38.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las bases en negrita en la Tabla 2 son los
sitios de variación de secuencia específica en VP4 y VP7.
\vskip1.000000\baselineskip
3.1 | ||||||
VP4 | VP7 | |||||
501 pb | 788 pb | 802 pb | 108 pb | 605 pb | 987 pb | |
167 aa | 263 aa | 268 aa | 36 aa | 202 aa | 299 aa | |
P26 (AGMK) | A | G/A | G/A | A | C/T | A |
P33 (AGMK) | T | A | A | G/A | T/C | A/G |
P38 (VERO) | T | A | A | A/G | T | G/A |
P43 (VERO) | T | A | A | A | T | A |
N.B. En un segundo clon de los 3 clones que se
desarrollaron al nivel del lote de producción, el nucleótido de la
posición 897 pb de VP7 es G, en lugar de A como ocurre en el clon
seleccionado P43. Esto tiene como resultado una metionina en lugar
de una isoleucina en la secuencia de aminoácidos. Las variantes
correspondientes al clon seleccionado P43 y al colon en el que hay
una G en VP7 en la posición 897 pb con respecto al codón de
iniciación se excretaron en las heces de lactantes que habían sido
vacunados con el material P33.
En la Tabla 3.1, donde hay dos bases
alternativas en una posición concreta, a primera de las dos
representa la base que aparece en una población mayoritaria y la
segunda es la base que aparece en una población minoritaria. Las
poblaciones de variantes mayoritarias y minoritarias se juzgan
mediante la fuerza de la señal en la secuenciación.
3.2 | ||||||
VP4 | VP7 | |||||
501 pb | 788 pb | 802 pb | 108 pb | 605 pb | 987 pb | |
167 aa | 263 aa | 268 aa | 36 aa | 202 aa | 299 aa | |
P26 (AGMK) | Leu | Gly/Glu | Gly/Arg | Arg | Thr/Met | Ile |
P33 (AGMK) | Phe | Glu | Arg | Arg/Arg | Met/Thr | Ile/Met |
P38 (VERO) | Phe | Glu | Arg | Arg/Arg | Met | Met/Ile |
P43 (VERO) | Phe | Glu | Arg | Arg | Met | Ile |
La tabla 3.2 muestra los cambios de aminoácidos
resultantes de las diferencias en los nucleótidos entre las
variantes.
VP4 (posiciones 788-802) | VP7 (posición 897) | |||||
G-G | A-A | A-G | G-A | A | G | |
Sondas | Rota 15 | Rota 16 | Rota 35 | Rota 36 | Rota 41 | Rota 42 |
Pases | ||||||
P26 | - | + | + | + | nd | Nd |
+P33 | - | + | - | - | ++ | + |
P38 | - | + | - | - | + | ++ |
P43 | - | + | - | - | + | - |
El cambio en las poblaciones entre los pases P26
a P33 en células AGMK se ha confirmado además mediante hibridación
puntual. Los fragmentos de los genes VP4 y VP7 generados mediante
RT-PCR se hibridaron con sondas oligonucleotídicas
específicas para cada variante (véanse las Tablas 3.1 y 3.2). En
contraste con P26, que hibridó con Rota 16, Rota 35 y Rota 36 y no
con Rota 15, el fragmento VP4 de PCR del material P33, en las
posiciones 788 y 802 hibridó únicamente con Rota 16 y no con Rota 15
ni con Rota 35 o Rota 36. Estos resultados establecieron la
presencia de al menos 3 variantes en P26 (véase la Tabla 4).
Para el fragmento de PCR de VP7 del material
P33, la posición 897 hibridó con Rota 41 y con Rota 42. Estos
resultados establecieron la presencia de al menos dos variantes en
el material P33.
Para aislar los componentes de P33 en forma de
una población de virus homogénea se realizaron tres diluciones
finales de P33/AGMK en células Vero y se usó el virus resultante
para infectar las células Vero.
Los pocillos positivos se seleccionaron usando
dos criterios: crecimiento demostrado por el mayor número de focos
detectados en los pocillos y la mayoría de pocillos positivos
aislados en las placas, como se ha realizado normalmente. Tras 3
pases de dilución final en placas de microtitulación de 96 pocillos,
10 pocillos positivos se amplificaron de forma sucesiva en células
Vero y se evaluaron para determinar su rendimiento.
Según el rendimiento se desarrollaron tres
clones hasta el nivel de pase del lote de producción.
Se mostró que el inmunoreconocimiento mediante
anticuerpos policlonales era similar entre los tres clones y entre
los clones y P33. La homogeneidad de los clones se valoró mediante
hibridación puntual. La selección final de un único clon se basó en
el rendimiento y la secuencia.
El clon seleccionado se amplificó mediante pases
sucesivos en células Vero para generar una siembra Primaria, una
siembra de Trabajo y, por último, lotes de producción.
El clon seleccionado se caracterizó
genéticamente a diferentes niveles de pases mediante la
secuenciación de VP4 y VP7 (identidad) y mediante hibridación
puntual específica de VP4 y VP7 (homogeneidad) de los materiales
amplificados mediante PCR. La secuencia de los genes VP4 y VP7 del
material P43 se proporcionan en las Figuras 1 y 2, respectivamente,
y son idénticas a las de P41.
La homogeneidad del clon seleccionado se valoró
mediante hibridación selectiva usando sondas oligonucleotídicas
discriminatorias de cambios nucleotídicos en regiones de VP4 y/o VP7
para cada variante identificada durante la secuenciación de P26/AGMK
primarias (véase la Tabla 4).
El fragmento de VP4 hibridó con Rota 16 y no con
Rota 15, Rota 35 o Rota 36.
El fragmento de VP7 hibridó con Rota 41 y no con
Rota 42.
Estos resultados confirmaron que P43 es una
población homogénea.
A P33 (cultivada en AGMK) se añadió éter hasta
una concentración final del 20% durante 1 h. A continuación se
burbujeó éter mediante con N_{2} durante 35 min. No se observó
impacto alguno sobre el título de la siembra de P33.
Los lotes de producción descritos anteriormente
se formulan para administración oral a lactantes a través del
siguiente procedimiento.
Para preparar las dosis de virus se usan
técnicas convencionales. El virus a granel purificado congelado se
descongela y se diluye con la composición de medio adecuada, en este
caso medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración
viral convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. A
continuación, el virus diluido se diluye más con estabilizante de
liofilización (sacarosa al 4%, dextrano al 8%, sorbitol al 6%,
aminoácido al 4%) hasta el título viral objetivo, en este caso
10^{5,6} uff/dosis. Alícuotas de 0,5 ml de composición vírica
estabilizada se transfieren asépticamente a viales de 3 ml. A
continuación, cada vial se cierra parcialmente con un tapón de
goma, la muestra se liofiliza al vacío, después el vial se cierra
del todo y se enrosca en su lugar una tapa de aluminio alrededor del
vial para mantener el tapón en su sitio.
Para usar, el virus se reconstituye usando uno
de los siguientes reconstituyentes antiácidos:
El citrato sódico se disuelve en agua, se
esteriliza mediante filtración y se transfiere asépticamente a
envases de reconstitución en cantidades de 1,5 ml a una
concentración de 544 mg de CitratoNa_{3}-2H_{2}O
por dosis de 1,5 ml. Los envases de reconstitución pueden ser, por
ejemplo, viales de 3 ml o viales de 4 ml o jeringas de 2 ml, o
cápsulas blandas comprimibles de plástico para administración oral.
Como alternativa al mantenimiento de los componentes estériles en
condiciones estériles, el envase final se puede someter a
esterilización en autoclave.
Una suspensión aséptica de hidróxido de aluminio
(Mylanta, marca comercial) se diluye asépticamente en agua estéril,
se transfiere asépticamente a envases de reconstitución (por ejemplo
jeringas de 2 ml o blandas comprimibles de plástico) en cantidades
de 2 ml que contienen 48 mg de Al(OH)_{3.} Una
alternativa a usar los componentes estériles en condiciones
estériles consiste en irradiar con rayos \gamma la suspensión de
hidróxido de aluminio (preferentemente en una etapa diluida).
Se incluyen ingredientes convencionales para
impedir que la suspensión sedimente. Entre tales ingredientes
convencionales se incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio,
carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa
microcristalina y polímeros de silicona. También se pueden incluir
agentes bacteriostáticos, por ejemplo butilparabén, propilparabén u
otros agentes bacteriostáticos usados en los alimentos, y
aromatizantes.
Para preparar las dosis de virus se usan
técnicas convencionales. El virus a granel purificado congelado se
descongela y se diluye con la composición de medio adecuada, en este
caso medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración
viral convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. Se añade
suspensión de aluminio de hidróxido hasta alcanzar una cantidad
final de 48 mg/dosis y la composición del virus se diluye más con
estabilizante de liofilización (sacarosa al 4%, dextrano al 8%,
sorbitol al 6%, aminoácido al 4%) hasta el título viral objetivo, en
este caso 10^{5,6} uff/dosis. Alícuotas de 0,5 ml de composición
vírica estabilizada se transfieren asépticamente a viales de 3 ml. A
continuación se lleva a cabo la liofilización y el cierre de los
viales como se ha descrito en la parte 1.
Para preparar las dosis de virus se usan
técnicas convencionales. El virus a granel purificado congelado se
descongela y se diluye con la composición de medio adecuada, en este
caso medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración
viral convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. Se añade
suspensión de aluminio de hidróxido hasta alcanzar una cantidad
final de 48 mg/dosis y la composición del virus se diluye más con
estabilizante de liofilización, que puede ser sacarosa, dextrano o
aminoácido al 4%, o gelatina, o peptona vegetal, o xantán hasta el
título viral objetivo de 10^{5,6} uff/dosis. Para transferir dosis
de 0,5 ml, o preferentemente menos, a los huecos del blíster, se
emplea una operación de llenado aséptica. La composición se
liofiliza y los huecos del blíster se sellan mediante sellado
térmico.
Opcionalmente se incluyen ingredientes estándar
para impedir que la suspensión de hidróxido de aluminio sedimente.
Tales ingredientes estándar incluyen, por ejemplo, estearato de
magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa
microcristalina y polímeros de silicona. También se pueden incluir
aromatizantes.
Nº de lote | Composición de la | Título viral antes de | Título viral tras la liofilización |
formulación | la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
98G06/01 | Lactosa: 2% | 10^{5.22} | 10^{4,67} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
98G06/03 | Sacarosa: 2% | 10^{5.28} | 10^{4,92} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% |
El rotavirus P43 se formuló con sacarosa o con
lactosa como se muestra en la tabla anterior.
La titulación viral antes de la liofilización es
el título viral en el líquido formulado completado (que contiene
sacarosa dextrano sorbitol aminoácidos) y sin la etapa de
liofilización.
Los resultados buenos son aquéllos en los que se
alcanzan una disminución < 0,5 log en la etapa de liofilización y
una disminución < 0,5 log durante la "1 semana a 37ºC"
(ensayo de estabilidad acelerada).
La precisión de la titulación viral es de
alrededor de + o - 0,2 log.
Los resultados indican que se puede usar
sacarosa en lugar de lactosa.
Nº de lote | Composición de la | Título viral en el momento= | Título viral tras la liofilización |
formulación | cero tras la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
98L16/01 | Lactosa: 2% | 10^{4,8} | 10^{4,8} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
98L16/02 | Lactosa: 2% | 10^{4,7} | 10^{5} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% |
Los resultados demuestran que la adición de
arginina (de la que se sabe que mejora la estabilidad del virus
durante la liofilización y también proporciona un medio básico con
el fin de compensar la acidez del estómago) mantiene el título
viral.
El sorbitol tiende a disminuir la temperatura de
transición vírica de la torta liofilizada en más de un grado. Esto
se puede superar usando maltitol en lugar de sorbitol como se ha
mostrado anteriormente y el título viral se sigue manteniendo.
Este experimento demuestra que son posibles
numerosas formulaciones.
Nº de lote | Composición de la | Título viral antes de | Título viral tras la liofilización |
formulación | la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
99C11/01 | Sacarosa: 2% | 10^{5,24} | 10^{5.07} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
99C11/02 | Sacarosa: 2% | 10^{5,09} | 10^{4,92} |
Dextrano: 4% | |||
Maltitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
99C11/04 | Dextrano: 4% | 10^{4,89} | 10^{5,06} |
Maltitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% |
\vskip1.000000\baselineskip
Nº de lote | Composición de la | Título viral en el momento= | Título viral tras la liofilización |
formulación | cero tras la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
99C17/01 | Sacarosa: 2% | 10^{5,40} | 10^{5,41} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
99C17/02 | Sacarosa: 2% | 10^{5,30} | 10^{4,93} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 1,5% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
99C17/03 | Sacarosa: 2% | 10^{5,31} | 10^{5,24} |
Dextrano: 4% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
99C17/04 | Sacarosa: 2% | 10^{4,42} | 10^{4,45} |
Dextrano: 4% | |||
Maltitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
99C17/05 | Sacarosa: 2% | 10^{4,39} | 10^{4,40} |
Dextrano: 4% | |||
Maltitol: 1,5% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
99C17/06 | Sacarosa: 2% | 10^{5,44} | 10^{4,97} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
99C17/07 | Sacarosa: 2% | 10^{5,11} | 10^{4,89} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 1,5% |
Rotavirus | Al(OH)_{3} | H_{2}O | Tiempo de | Centrifugación | Título viral | Título |
contacto a | en el | viral en el | ||||
temperatura | sobrenadante | precipitado | ||||
ambiente | en uff/ml | en uff/ml | ||||
10^{5,6} | 48 mg en | 0,76 ml | 30 min | 8000 rpm | 10^{3,65} | |
uff/ml | 0,240 ml | 10 min | ||||
10^{5,6} | 48 mg en | 0,76 ml | 30 min | 8000 rpm | 10^{4,41} | |
uff/ml | 0,240 ml | 10 min | ||||
10^{5,6} | 1 ml | 30 min | 8000 rpm | 10^{5,68} | ||
uff/ml | 10 min | |||||
Rotavirus | 12 mg | 1,380 ml | 30 min | 8000 rpm | Por debajo de | 10^{4,7} |
en torta | 0,120 ml | 10 min | los límites | |||
liofilizada | de detección |
El Al(OH)_{3} se usa como
antiácido. Esto muestra que el rotavirus se asocia con la sal
inorgánica insoluble (Al
(OH)_{3}). Ya que se centrifugó junto con el Al(OH)_{3} (disminución de actividad viral en el sobrenadante).
(OH)_{3}). Ya que se centrifugó junto con el Al(OH)_{3} (disminución de actividad viral en el sobrenadante).
Muestras virales | Disolución | Condiciones | Títulos virales uff/ml |
99B10/06 | 1,5 ml de CitratoNa_{3} | 24 h a temperatura | 10^{5,11} |
formulación líquida | ambiente | ||
antes de la liofilización; | |||
10^{5,43} | |||
99B10/06 | 1,5 ml de CitratoNa_{3} | 24 h a temperatura | 10^{4,53} |
liofilizado; | ambiente | ||
10^{5,43} |
Cuando el rotavirus se asocia con el
Al(OH)_{3} es posible liofilizar todo (incluido el
Al(OH)_{3}). Tras la liofilización es posible
recuperar el rotavirus mediante la disolución de
Al(OH)_{3} en citrato sódico. Esta etapa no daña al
rotavirus y conserva su actividad tras esta etapa de disolución.
El mecanismo de liberación de virus (mediante
disolución del transportador) puede muy bien producirse in
vivo. De hecho, a un pH inferior a 6, el hidróxido de aluminio
se convierte en completamente soluble y, por tanto, el rotavirus se
liberará en el estómago.
Al(OH)_{3} + 3H+
\longrightarrow Al^{+++} (hidrosoluble) +
3H_{2}O
En el estómago, los iones de Al^{+++} no se
absorben (J. J. Powell, R. Jugdaohsingh y R.P.H. Thompson. The
regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track,
Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58,
147-153).
En el intestino, debido al incremento del pH,
las formas insolubles de aluminio precipitan
(Al(OH)_{3} o AlPO_{4}) y se eliminan de la forma
natural.
Se desconoce si el precipitado recién formado
(Al(OH)_{3} o AlPO_{4}) podrá volver a asociarse
con el rotavirus libre. Esto eleva la cuestión de la infectividad de
la propia asociación
Al(OH)_{3}-Rotavirus.
También es posible la liberación del rotavirus
de la asociación
Al(OH)_{3}-Rotavirus por otros
mecanismos. La lisina, por ejemplo, interfiere en la adsorción viral
del Al(OH)_{3}.
Se sabe que otros aniones, como borato, sulfato,
carbonato y fosfato, se adsorben específicamente en hidróxido de
aluminio, por tanto, en teoría, debería ser posible desplazar
(mediante competición por el sitio de adsorción) el rotavirus de la
asociación Al(OH)_{3}-Rotavirus.
Por tanto, el rotavirus se puede liberar de la
asociación Al(OH)_{3}-Rotavirus y el
rotavirus liberado permanece activo.
Esta liberación se puede realizar mediante la
disolución de Al(OH)_{3} (por HCl en el estómago o
por Na_{3}Citrato in vitro) o desplazando el rotavirus con
un aminoácido básico (lisina).
Una única dosis de rotavirus liofilizado se
reconstituyó con agua y se dividió en dos partes. La primera parte,
considerada como la referencia, recibió un volumen adicional de
agua. La segunda parte recibió 24 mg de Al(OH)_{3}
suspendido en 0,240 ml de agua (titulaciones virales
preclínicas).
Cuando está presente Al(OH)_{3,}
el rotavirus es activo y el valor de la titulación viral es más
elevado en comparación con la muestra de referencia.
Este experimento se repitió sin dividir la dosis
liofilizada y mediante la adición de 12 mg de
Al(OH)_{3} o 24 mg de
Al(OH)_{3}.
Aquí, la muestra de referencia fue la
reconstituida con un tampón de citrato-bicarbonato.
Por tanto, el título viral es, de nuevo, mayor en presencia de
Al(OH)_{3}.
Como en el ejemplo anterior, el rotavirus se
asocia con las partículas de Al(OH)_{3}, ya que el
virus se puede descartar mediante centrifugación. DRVC003A46 es un
rotavirus liofilizado formulado (Sacarosa: 2%, Dextrano: 4%,
Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2%).
SDSAA= Sacarosa 2%, Dextrano 4%, Sorbitol 3%,
aminoácido 2%.
\newpage
Según la titulación viral lleva a cabo sobre el
sobrenadante, la cantidad de Al(OH)_{3} necesaria
para adsorber Rotavirus parece ser baja (comenzando con una dosis
liofilizada 5,7 log) aumentando la titulación viral):
Al(OH)_{3}, | Tiempo de adsorción | Título en el sobrenadante |
12 g | 1 h TA | 2,7 |
24 mg | 1 h TA | 3,4 |
48 gm | 1 h TA | 3,4 |
72 mg | 1 h TA | 2,0 |
96 mg | 1 h TA | Por debajo de los límites de |
detección | ||
12 mg | Durante la noche | 2,7 |
24 mg | Durante la noche | Por debajo de los límites de |
detección | ||
48 mg | Durante la noche | 2,5 |
12 g | Inmediata | Por debajo de los límites de |
detección | ||
24 mg | Inmediata | 2,0 |
48 mg | Inmediata | Por debajo de los límites de |
detección |
El tiempo necesario para adsorber el rotavirus
en Al(OH)_{3} parece ser corto:
Una dosis de rotavirus liofilizado se
reconstituyó en presencia de 24 mg de Al(OH)_{3} y
se centrifugó tras 0, 15, 60 min y 24 horas. El "Culot" se
resuspendió e SDSAA antes de la titulación viral:
Tiempo | Culot | Sobrenadante |
0 min | 5,26 | 3,17 |
15 min | 5,34 | < 1,44 |
60 min | 5,96 | < 1,44 |
24 horas | 6,13 | < 1,44 |
Con el fin de evitar el aluminio en la vacuna el
antiácido Al(OH)_{3} se sustituyó con otra sal
inorgánica insoluble: CaCO_{3} (carbonato cálcico).
Los fenómenos observados con CaCO_{3} son
paralelos a los descritos para Al(OH)_{3}:
- -
- Asociación de rotavirus con la sal inorgánica;
- -
- Mantenimiento de la actividad del rotavirus cuando se asocia con la sal inorgánica:
- -
- Posibilidad de liberación del rotavirus de la asociación mediante disolución de la base inorgánica por un ácida;
- -
- Posibilidad de co-liofilización del antiácido y el rotavirus.
En un primer ensayo, el rotavirus liofilizado
(título viral 5,7) se reconstituyó con una suspensión de CaCO_{3}
en agua (50 mg en 1,5 ml); y después se centrifugó, y el título
viral del sobrenadante se comparó con el culot.
Esto indica que más del 90% del rotavirus está
asociado con CaCO_{3}.
Asimismo, cuando el virus estaba asociado, era
posible realizar la titulación y recuperar las cantidades virales
originales.
También, los títulos virales son ligeramente
superiores a los obtenidos con CaCO_{3}.
El rotavirus liofilizado se reconstituyó con
suspensión de CaCO_{3} en agua (1,5 ml)
10 mg
50 mg
100 mg
y se centrifugó, y el título viral
del sobrenadante se comparó con el
culot.
CaCO_{3} | Extemp.+ Centrif. | 1 Hora +Centrif. | ||
Culots | Sobrenadante | Culots | Sobrenadante | |
100 mg | 4,57 | 3,01 | 4,79 | 3,09 |
50 mg | 4,17 | 4,15 | 4,22 | 3,86 |
10 mg | 3,17 | 4,77 | 3,87 | 4,87 |
Por tanto, claramente, más CaCO_{3} y más
virus se asocian, y menos se encuentra en el sobrenadante.
No obstante, la dosis total no se recupera por
completo (cabe esperar un total de al menos 5,3 o incluso 5,8 como
se ha obtenido anteriormente, véase antes).
Usando 10 dosis de rotavirus liofilizado
(DRVC003A46) y 50 mg de CaCO_{3} se llevaron a cabo dos tipos de
titulación de Rossett-Rice para bebés:
En una titulación de
Rossett-Rice para bebés típica, el antiácido se
mezcla con rotavirus y se vierte HCl en este medio.
En el análisis de Rossett-Rice
para bebés "inverso", la situación es la inversa: el antiácido
se vierte en el HCl (como ocurre in vivo).
\newpage
Titulación de Rossett-Rice para bebés típica | |||
Rota. liof. Almacenado a | Tampón | Título viral teórico | Título viral medido |
4ºC | 60 mg CaCO_{3} | 5,3 | 4,6 |
-80ºC | 60 mg CaCO_{3} | 5,3 | 4,6 |
4ºC | 24 mg Al(OH)_{3} | 5,4 | <2,9 |
-80ºC | 24 mg Al(OH)_{3} | 5,4 | <2,9 |
\vskip1.000000\baselineskip
Titulación de Rossett-Rice para bebés inversa | |||
Rota. liof. Almacenado a | Tampón | Título viral teórico | Título viral medido |
4ºC | 60 mg CaCO_{3} | 5,3 | 4,6 |
-80ºC | 60 mg CaCO_{3} | 5,3 | 4,6 |
4ºC | 24 mg Al(OH)_{3} | 5,4 | <2,9 |
-80ºC | 24 mg Al(OH)_{3} | 5,4 | <2,9 |
Por tanto, en este experimento in vitro,
el carbonato de calcio es capaz de proteger alrededor del 20% del
rotavirus de la presencia de HCl, mientras que el hidróxido de
aluminio no puede.
Nº de lote | Composición de | Título viral en el momento= | Título viral tras la liofilización |
la formulación | cero tras la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
99PK08/01 | Sacarosa: 2% | 10^{5,28} | 10^{5,10} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 50 mg | |||
99PK08/02 | Sacarosa: 2% | 10^{5,16} | 10^{5,15} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
00C24/01 | Sacarosa: 2% | 10^{5,07} | 10^{4,69} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Xantán: 0,3% | |||
00C24/03 | Sacarosa: 2% | 10^{5,07} | 10^{4,85} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Xantán: 0,3% |
(Continuación)
Nº de lote | Composición de | Título viral en el momento= | Título viral tras la liofilización |
la formulación | cero tras la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
00E09/25 | Sacarosa: 2% | 10^{5,03} | 10^{4,91} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Xantán: 0,25% | |||
00E09/30 | Sacarosa: 2% | 10^{5,01} | 10^{4,87} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Xantán: 0,30% | |||
00F26/06 | Sacarosa: 2% | 10^{4,50} | 10^{4,70} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Almidón: 2% |
\vskip1.000000\baselineskip
Esta es una liofilización de "todo en uno"
del rotavirus y el antiácido (CaCO_{3}) juntos en el mismo vial.
Para prevenir la sedimentación de CaCO_{3} durante la etapa de
llenado, son necesarios hay agentes viscosos. Ejemplos tales agentes
viscosos incluyen goma xantán y almidón. La actividad de rotavirus
se mantiene incluso en presencia de goma xantán y almidón.
Las siguientes formulaciones demuestran el
concepto "liof". Es decir, la rápida disolución de la torta
liofilizada en la boca.
\vskip1.000000\baselineskip
Nº de lote | Composición de | Título viral antes | Título viral tras la liofilización |
la formulación | de la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
99B10/06 | Sacarosa: 4% | 10^{5,11} | 10^{4,53} |
Glutamato sódico: 3,7% | |||
Al(OH)3 48 mg | |||
99C11/12 | Maltitol:3% | 10^{4,16} | 10^{3,79} |
Al(OH)3 48 mg | |||
Hidroxipropilmetilcelulosa: 1% |
Nº de lote | Composición de | Título viral en el momento= | Título viral tras la liofilización |
la formulación | cero tras la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
00C24/05 | Sacarosa: 2% | 10^{5,02} | 10^{4,54} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Xantán 0,3% | |||
00C24/06 | Sacarosa: 2% | 10^{4,86} | 10^{4,56} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | |||
Aminoácidos: 2% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Xantán 0,3% | |||
00F26/11 | Sacarosa: 2% | 10^{4,70} | 10^{4,40} |
Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 1,5% | |||
Aminoácidos: 1% | |||
CaCO_{3}: 60 mg | |||
Almidón 2% |
\vskip1.000000\baselineskip
En el concepto "liof", se puede usar tanto
xantán como almidón (manteniendo las propiedades de disolución
rápida de la torta liofilizada).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usa una suspensión de CaCO_{3} como
antiácido para el rotavirus existe el problema de que las partículas
de carbonato de calcio sedimentan con rapidez cuando se introducen
en agua, dado que el valor de densidad del polvo se acerca a 2,6 y
el tamaño de la partícula media es de 30 \mum.
Esta sedimentación se puede retrasar
mediante:
- 1
- aumentando la densidad del medio circundante
- 2
- aumentando la viscosidad del medio circundante
- 3
- reduciendo el tamaño de las partículas
- 4
- manteniendo las partículas lejos unas de otras
Cuando la suspensión de
CaCO_{3}-agua (colocada en la jeringa) se coloca
sobre la tora liofilizada (que contiene sacarosa 2%, dextrano 4%,
sorbitol 3%, aminoácidos 2%), la densidad del medio circundante
aumenta, pero la velocidad de sedimentación del CaCO_{3} no es muy
diferente de la de la suspensión
CaCO_{3}-agua.
Una solución pseudoplástica se define como una
solución que tiene una viscosidad superior en reposo en comparación
con su viscosidad en agitación.
\newpage
Excipientes frecuentes de este tipo son:
Polímeros naturales por ejemplo:
- Goma arábiga
- Goma adragante
- Agar-agar
- Alginatos
- Pectinas
\vskip1.000000\baselineskip
Polímeros naturales por ejemplo:
- carboximetilcelulosa (Tyloses C®)
- Metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®)
- Hidroxipropilmetilcelulosa (Klucels®)
- Hidroxipropilcelulosa (Methocels E® y K®, Vicotrans MPHC®).
En general, esos excipientes pseudoplásticos se
usan junto con agentes tixotrópicos.
Esos polímeros, a una concentración
suficiente, dan lugar a una disposición fluida estructural que
tiene como resultado una solución de viscosidad elevada con baja
capacidad de flujo en reposo. Se necesita proporcionar al sistema
una cierta cantidad de energía para permitir el flujo y la
transferencia.
Son necesarias energías externas (agitación)
para destruir temporalmente la disposición fluida estructural con el
fin de obtener una solución fluida.
Ejemplos de tales polímeros son Carbopol® y goma
xantán.
Con estos excipientes, en reposo, se obtiene una
estructura de gel; mientras que en agitación forman una solución
fluida.
Ejemplos de excipientes tixotrópicos son:
Veegum® (silicato de aluminio-magnesio), Avicel®
(aproximadamente un 89% de celulosa microcristalina y un 11% de
carboximetilcelulosa Na).
Una reducción del tamaño de la partícula de
CaCO_{3} tuvo como resultado una disminución de la capacidad
antiácida del compuesto.
Este es el caso en Veegum® y Avicel® para los
que partículas insolubles más pequeñas (de aproximadamente 1 \mum)
que las partículas de CaCO_{3} se colocan entre las partículas de
CaCO_{3} con el fin de impedir la agregación.
Los siguientes esquemas demuestran ejemplos de
posibles diseños de producto.
Teniendo ya lotes clínicos de rotavirus en
viales liofilizados, el antiácido se puede colocar en el líquido
reconstituyente contenido en la jeringa.
En esta presentación del producto, la
sedimentación del CaCO_{3} debe controlarse no sólo durante las
etapas de llenado sino también durante todo el periodo de caducidad
del producto (al menos 2 años).
En este caso el rotavirus, el CaCO_{3} y la
goma xantán se liofilizan juntos directamente en el blíster.
Nº de lote | Cepa de | Composición de | Título viral a t= cero | Título viral tras la liofilización |
rotavirus | la formulación | tras la liofilización | y 1 semana a 37ºC | |
00F26/01 | G1 | Sacarosa: 2% | 10^{4,6} | 10^{4,7} |
SB purif. | Dextrano: 4% | |||
Nº 61 | Sorbitol: 3% | |||
PRO/0232 | Aminoácidos: 2% | |||
00F26/02 | G2 | Sacarosa: 2% | 10^{4,5} | 10^{4,5} |
(DS-1) | Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | ||||
Aminoácidos: 2% | ||||
00F26/03 | G3 | Sacarosa: 2% | 10^{4,5} | 10^{4,5} |
(P) | Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | ||||
Aminoácidos: 2% | ||||
00F26/04 | G4 | Sacarosa: 2% | 10^{4,8} | 10^{4,8} |
(VA-70) | Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | ||||
Aminoácidos: 2% | ||||
00F26/05 | G9 | Sacarosa: 2% | 10^{4,6} | 10^{4,5} |
(W161) | Dextrano: 4% | |||
Sorbitol: 3% | ||||
Aminoácidos: 2% |
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas DS-1, P y VA70 se
describen como cepas de referencia de rotavirus humano para los
serotipos G2, G3 y G4 respectivamente en la página 1361 de
"Fields" Raven PRess 1990, segunda edición.
En este experimento de han liofilizado
diferentes cepas de rotavirus.
Para todas el título viral se ha mantenido
durante la liofilización y se ha mostrado una estabilidad acelerada
(una semana a 37ºC).
Se llevó a cabo un estudio en fase I para
evaluar la seguridad y la reactogenicidad de una única dosis oral de
10^{6,0} uff de la vacuna con P33 en adultos sanos de 18 a 45 años
de edad.
El estudio clínica era aleatorizado, doble
ciego. Era controlado con placebo y autónomo. El estudio se realizó
en un único centro en Bélgica.
Se incluyó un total de 33 sujetos, 11 en el
grupo de placebo y 22 en el grupo de la vacuna y todos completaron
el estudio. Todos los voluntarios eran caucasianos. Su media de edad
en el momento de la vacunación fue de 35,5 años de edad, con un
intervalo de 18-44-años. El estudio
comenzó en enero y duró justo un mes.
\newpage
Se produjeron lotes clínicos de vacuna P43, se
purificaron, se formularon y se liofilizaron de acuerdo con las
Buenas Prácticas de Fabricación. Los lotes se emitieron mediante
Control de Calidad y la Garantía de Calidad. Cada vial de vacuna
contenía componentes siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Ingrediente activo:
Cepa P43 | Min 10^{5,8} uff |
\vskip1.000000\baselineskip
Excipientes, estabilizantes:
Sacarosa | 9 mg | |
Dextrano | 18 mg | |
Sorbitol | 13,5 mg | |
Aminoácidos | 9 mg |
Se prepararon y liberaron viales de placebo.
Cada vial de placebo contenía componentes siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Excipientes, estabilizantes:
Sacarosa | 9 mg | |
Dextrano | 18 mg | |
Sorbitol | 13,5 mg | |
Aminoácidos | 9 mg |
Se usó agua para inyectables como diluyente para
reconstituir la vacuna y el placebo.
Aproximadamente de 10 a 15 minutos antes de la
administración de la vacuna o del placebo, los sujetos de ambos
grupos recibieron 10 ml de Mylanta® por vía oral. Mylanta® es un
antiácido registrado. El antiácido incrementa el pH del estómago e
impide la inactivación del rotavirus durante su paso a través del
estómago.
Para preparar la vacuna se reconstituyeron dos
viales de P43 liofilizada que contenían 10^{5,8} uff por vial con
1,5 ml de agua para inyectables como diluyente. Esto alcanzó un
título viral calculado de 10^{6,1} uff por dosis. La vacuna
reconstituida se administró rápidamente como una única dosis
oral.
Para preparar placebo se reconstituyeron dos
viales de placebo liofilizado con 1,5 ml de agua para inyectables y
se administró por vía oral como una única dosis.
Se aplicaron los siguientes criterios de
seguridad y reactogenicidad:
Los síntomas generales notificados fueron
fiebre, diarrea, vómitos, náuseas, dolor abdominal y pérdida de
apetito. Se registraron durante ocho días después de la
administración.
Los síntomas no comunicados se registraron
durante 30 días después de la administración.
Los acontecimientos adversos graves se
registraron durante todo el periodo de estudio.
Se debían obtener muestras de diarrea durante
ocho días después de la administración.
\newpage
Los resultados fueron:
No se registraron síntomas comunicados, ni
acontecimientos adversos no comunicados ni graves durante los
respectivos periodos de observación.
No se registraron casos de diarrea.
La vacuna P43 de productos biológicos SB era
segura con respecto al placebo cuando se administró por vía oral
siguiendo un patrón doble ciego en forma de una dosis única a la
dosis de 10^{6,1} uff a voluntarios adultos sanos de 18 a 44 años
de edad.
<110> Smithkline Beecham Bioligicals
S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vaccine
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B45194
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1009
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (35)
1. Una población de rotavirus atenuado
humano, que se caracteriza porque comprende una única
variante o sustancialmente una única variante, estando dicha
variante definida por una secuencia nucleotídica que codifica al
menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y
VP7.
2. Una población de rotavirus según la
reivindicación 1, que es una cepa clonada.
3. Una población de rotavirus según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, que deriva de una infección
humana por rotavirus.
4. Una población de rotavirus según una
cualquiera de las reivindicación 1 a 3, que se replica y excreta en
seres humanos.
5. Una población de rotavirus según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la
sustancialmente única variante es una variante en la que el gen VP4
comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una de
las siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base
adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición
501 desde el codón de iniciación.
6. Una población de rotavirus según la
reivindicación 5, en la que el gen VP4 comprende una secuencia de
nucleótidos que comprende una base adenina (A) en las posiciones 788
y 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de
iniciación.
7. Una población de rotavirus según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la
sustancialmente única variante es una variante en la que el gen VP7
comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos una de
las siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A)
en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 desde el
codón de iniciación.
8. Una población de rotavirus según la
reivindicación 7, en la que el gen VP7 comprende una secuencia
nucleotídica que comprende una timina (T) en la posición 605 y una
adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de
iniciación.
9. Una población de rotavirus según las
reivindicaciones 5 a 8, en la el gen VP4 comprende una secuencia de
nucleótidos que una adenina (A) en las posiciones 788 y 802, y una
timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación; y el gen
VP7 comprende una secuencia nucleotídica que comprende una timina
(T) en la posición 605 y una adenina (A) 897 desde el codón de
iniciación.
10. Un rotavirus que comprende una secuencia
nucleotídica que codifica una proteína VP4, en la que la secuencia
nucleotídica es como se muestra en la Figura 1 y/o una secuencia
nucleotídica que codifica una proteína VP7, en la que la secuencia
nucleotídica es como se muestra en la Figura 2.
11. Una población de rotavirus según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, denominada P43 y
depositada con el número de registro ECACC 99081301.
12. Una variante de rotavirus denominada P43 y
depositada con el número de registro ECACC 99081301, la progenie del
rotavirus y derivados inmunológicamente activos del mismo y
materiales obtenidos del mismo.
13. Un rotavirus reagrupado humano que comprende
al menos un antígeno o al menos un segmento de la variante P43 del
rotavirus según la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
14. Un procedimiento para producir una población
de rotavirus humano purificado, que comprende una sustancialmente
única variante, donde el procedimiento comprende:
pasar una preparación de rotavirus en una línea
celular adecuada;
opcionalmente seleccionar un cultivo homogéneo
usando las etapas de:
dilución límite; o
aislamiento en placas individual; y
comprobar la presencia de una variante
sustancialmente única mediante secuenciación de una región adecuada
de la secuencia génica de VP4 y/o VP7.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14,
en el que la preparación de rotavirus se somete a pases en células
AGMK.
16. Un procedimiento según la reivindicación 14
ó 15, en el que la preparación de rotavirus posee las
características de una cepa 89-12 o derivado de la
misma.
17. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, que comprende la etapa adicional de
tratamiento con éter para eliminar los agentes contaminantes
adquiridos sensibles a éter.
18. Una composición de vacuna que comprende un
virus atenuado vivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
13 mezclado con un transportador o adyuvante farmacéutico
adecuado.
19. Una composición de vacuna según la
reivindicación 18 adaptada para administración oral.
20. Una composición de vacuna según la
reivindicación 19, en la que el virus atenuado vivo se formula con
una composición antiácida.
21. Una composición de vacuna según la
reivindicación 20, en la que la composición antiácida comprende un
antiácido orgánico.
22. Una composición de vacuna según la
reivindicación 21, en la que el antiácido es citrato sódico.
23. Una composición de vacuna según la
reivindicación 20, en la en la que la composición antiácida
comprende un antiácido inorgánico.
24. Una composición de vacuna según la
reivindicación 23, en la que el antiácido es hidróxido de
aluminio.
25. Una composición de vacuna según la
reivindicación 23, en la que el antiácido es carbonato cálcico.
26. Una composición de vacuna según la
reivindicación 25, que además comprende un agente viscoso.
27. Una composición de vacuna según la
reivindicación 26, en la que el agente viscoso es goma de
xantano.
28. Una composición de vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en la que
el virus atenuado vivo se formula con carbonato cálcico y goma de
xantano y se reconstituye con solución acuosa.
29. Una composición de vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, en la que el virus
atenuado vivo se formula con la composición antiácida y se liofiliza
en un envase blíster.
30. Una composición de vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, en la que el virus
está en forma liofilizada.
31. Una composición de vacuna según la
reivindicación 30, en la que el virus atenuado vivo y la composición
antiácida se encuentran presentes en envases distintos para su
formulación como composición de vacuna líquida antes de la
administración.
32. Una composición de vacuna según la
reivindicación 30, en la que el virus atenuado vivo y la composición
antiácida se encuentran presentes en el mismo envase para su
formulación como composición de vacuna liofilizada para
reconstituirse con solución acuosa antes de la administración.
33. Un procedimiento de fabricación de una
vacuna de rotavirus según se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 32, que comprende la mezcla de un rotavirus
atenuado humano con un transportador o adyuvante adecuado.
34. Uso de un rotavirus atenuado humano en la
preparación de una vacuna según se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 32 para la prevención de la infección por
rotavirus en un sujeto humano.
35. Una formulación de vacuna según se
reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 32 para usar
en medicina.
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