CN108367164A - 热稳定的轮状病毒疫苗制剂及其使用方法 - Google Patents

热稳定的轮状病毒疫苗制剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含一种或多种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株、药学上可接受的钙盐、己二酸、蔗糖和磷酸钠的热稳定的口服轮状病毒疫苗制剂，其中所述一种或多种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株中的每一种在37℃下稳定7天，在25℃下稳定45天并且在2‑8℃下稳定2年或更久。本发明的含钙制剂可以进一步包含一种或多种赋形剂，其以有效地优化溶液中游离的钙离子以稳定轮状病毒颗粒的量存在。在本发明的实施方案中，所述制剂包含表面活性剂，诸如聚山梨醇酯80。本发明还涉及使用本发明的轮状病毒疫苗组合物以预防轮状病毒感染，或降低感染的可能性，或预防、改善或延迟其临床表现的发作或进展的方法。

Description

热稳定的轮状病毒疫苗制剂及其使用方法
发明领域
本发明涉及引发针对轮状病毒的免疫应答的热稳定的轮状病毒疫苗制剂，其可用于预防和/或治疗对象中的轮状病毒感染，和/或其临床表现。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月18日提交的美国临时申请号62/269,419的权益，该申请的内容以其整体通过引用并入本文。
发明背景
轮状病毒感染与幼儿中的腹泻和呕吐相关，其可以导致严重的脱水和电解质紊乱，并且在一些情况下导致休克和死亡。轮状病毒是<2岁儿童中的严重急性腹泻病的最常见的病原体。较大儿童以及成人也可以感染轮状病毒并发展相关的病状。由于其健康护理***不健全，轮状病毒相关发病率和死亡的发生率不成比例地影响发展中国家中的儿童。大约90％的轮状病毒相关的死亡发生在非洲和亚洲的较低收入国家；世界卫生组织 - 轮状病毒疫苗WHO立场文件，WHO Weekly Epidemiological Record 88:49-64 (2013))。
两种活减毒口服轮状病毒疫苗在世界各地的不同国家商业可得 - RotaTeq®(轮状病毒疫苗，活，口服，五价；Merck and Co., Inc., Whitehouse Station, NJ)和Rotarix® (轮状病毒疫苗，活，口服，GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart,Belgium)。这些疫苗的引入已导致高收入和中等收入国家的疾病负担大幅减少(Patel等人, PLoS Medicine, 9(10): e1001330, p1-10 (2012)；Giaquinto等人, Human Vaccines 7:734-748 (2012))。由于这个原因，WHO推荐针对轮状病毒接种疫苗和在所有国家免疫计划中包括轮状病毒疫苗。参见WHO Weekly Epidemiological Record, 同上在第62页 (2013)。然而，尽管可以获得降低轮状病毒感染或与之相关疾病的可能性的疫苗，轮状病毒仍然是每年大约450,000名5岁以下儿童死亡的原因，特别是在发展中国家中。同上在第50页。
对于轮状病毒疫苗的全世界分配，有必要配制疫苗，使得其在各种环境条件下是稳定的。由于发展中国家中频繁的冷链失败，存在对于改进的热稳定的疫苗制剂的需求。此外，在确实具有强大冷链的国家，热稳定疫苗的开发将提供承受无意暴露于高温的能力。
发明概述
本发明涉及适于口服施用的热稳定的液体轮状病毒疫苗制剂，其在37℃下稳定7天，在25℃下稳定45天并且在2-8℃下稳定2年或更久(即，符合VVM7要求，如下所讨论)。本发明的制剂包含药学有效量的至少一种轮状病毒重配体(reassortant)或减毒轮状病毒毒株，药学上可接受的钙盐，蔗糖，己二酸和磷酸钠，其中所述制剂的pH为约6.2至约6.7。在本发明的优选实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂包含约1.0mM至约3.5mM的药学上可接受的钙盐，约0.5M至约2.0M蔗糖，约260mM至约700mM己二酸和约10mM至约100mM磷酸钠。在具体实施方案中，所述制剂进一步包含非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯80。在另外的实施方案中，所述制剂包含组织培养基。本发明的制剂优选不含任何锌。
在本发明的具体实施方案中，所述制剂包含一种或多种选自以下的轮状病毒重配体：G1、G2、G3、G4和P1A。在进一步实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂包含G1、G2、G3、G4和P1A轮状病毒重配体。
本发明的一个优选实施方案涉及轮状病毒疫苗制剂，其包含：a) 一种或多种轮状病毒重配体，其选自：G1、G2、G3、G4和P1A；b) 约1.5M蔗糖；c) 约465mM己二酸；d) 约10mM磷酸钠；和e) 约3mM药学上可接受的钙盐；其中所述制剂的pH在25℃下为约6.4。在进一步实施方案中，所述制剂进一步包含约0.01％的聚山梨醇酯80。
本发明还涉及在儿童中降低轮状病毒感染的可能性或预防或降低轮状病毒肠胃炎的可能性或严重程度的方法，其包括将本发明的制剂施用于儿童。在本发明的该方面的具体实施方案中，将所述制剂口服施用于年纪在6至12周龄的婴儿。在本发明的一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：(a) 等待经过预定量的时间；(b) 将额外剂量的制剂施用于儿童，和(c) 任选地重复步骤(a)和(b)一次或多次。在一个优选实施方案中，所述方法包括以3-剂量系列将所述轮状病毒疫苗制剂施用于所述儿童，其中在所述系列完成时，所述儿童为32周龄或更年幼。
本发明还涉及本发明的轮状病毒疫苗制剂用于治疗或预防与轮状病毒感染相关的疾病(诸如用于预防轮状病毒肠胃炎)的用途。
如说明书通篇和所附权利要求中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的指代，除非上下文另有清楚指出。
除非上下文明确指明所示可能性之一，提及“或”表示任一或两种可能性。在一些情况下，“和/或”用于突出任一或两种可能性。
如说明书通篇和所附权利要求中所使用，适用以下定义和缩写：
术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防止措施。“需要”治疗的个体或患者包括已经具有轮状病毒感染的那些，无论是否表现任何临床症状，以及处于轮状病毒感染的风险中的那些。用本发明的轮状病毒疫苗制剂治疗患者包括以下的一种或多种：在患者中诱导/增加针对轮状病毒的免疫应答，诱导针对一种或多种轮状病毒的病毒中和抗体应答，在已经被轮状病毒感染的患者中预防、改善、消除或降低轮状病毒的临床表现的可能性，预防或降低发生轮状病毒感染相关的肠胃炎和/或与其他疾病或并发症的可能性，降低轮状病毒感染的临床症状(诸如腹泻、呕吐、发烧和腹部疼痛)的严重程度或持续时间，和预防或降低轮状病毒感染的可能性。
术语“药学有效量”或“有效量”意指将足够的疫苗组合物引入患者以产生期望效果的量，所述效果包括，但不限于：在患者中诱导/增加针对轮状病毒的免疫应答，在患者中诱导/增加针对轮状病毒的病毒中和抗体应答，预防或降低轮状病毒感染的可能性，在已经感染轮状病毒的患者中预防、改善或消除轮状病毒感染的临床表现，或降低与轮状病毒相关的疾病的严重程度或持续时间。本领域技术人员认识到对于预防与治疗，该水平可以变化，并且可以根据患者的特征诸如年龄、重量等而变化。
术语“免疫应答”是指细胞介导的(T-细胞)免疫应答和/或抗体(B细胞)应答。
术语“患者”是指待接受本文所述的轮状病毒疫苗制剂的，能够被轮状病毒感染的哺乳动物，例如人。在优选实施方案中，所述患者是儿科患者。在一个优选实施方案中，所述患者为6周龄至32周龄。如本文所定义，“患者”包括已经感染轮状病毒的那些和随后可以暴露(即处于暴露的风险)的那些。可以预防性或治疗性治疗患者。预防性治疗提供了足够的保护性免疫，以降低轮状病毒感染或其效果(例如，肠胃炎)的可能性或严重程度。可以进行治疗性治疗，以降低轮状病毒感染或其临床效果的严重程度。
术语“约”，当修饰物质或组合物的量(例如，mM或M)，制剂组分的百分比(v/v或w/v)，溶液/制剂的pH，或表征方法中的步骤的参数的值等时，是指可以例如通过在物质或组合物的制备、表征和/或使用中涉及的典型测量、处理和取样程序；通过这些程序中无意的错误；通过用于制备或使用组合物或实施程序的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等而发生的数值量的变化。在某些实施方案中，“约”可以意指±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0或5.0的合适单位的变化。在某些实施方案中，“约”可以意指±0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%或10%的变化。
“VVM7制剂”或者“VVM7RotaTeq™”是指本发明的轮状病毒疫苗制剂，其在37℃下稳定至少7天，在25℃下稳定45天并且在2-8℃下稳定2年或更久。为了被认为是稳定的，本发明的疫苗制剂必须将高于其临床确定的期满功效(end of expiration potency)的功效维持对于每个温度规定的时间长度，即如临床试验中定义的效力所需的最低功效。(参见下表1。还参见来自RotaTeq Package Insert, Initial U.S. Approval 2006, 2013年6月修订，Merck & Co., Inc. Whitehouse Station, NJ, USA的表7)。
表1：RotaTeq™重配体的最低剂量水平
重配体的名称 最低剂量水平(106感染单位)
G1 2.2
G2 2.8
G3 2.2
G4 2.0
P1A 2.3
“RotaTeq™商业制剂”是指由Merck & Co., Inc. (Whitehouse Station, NJ)制造并且在2006年首次批准用于预防6至32周龄的婴儿中的由G1、G2、G3和G4轮状病毒血清型引起的轮状病毒肠胃炎的疫苗RotaTeq™ (轮状病毒疫苗，活，口服，五价)。
以下缩写在本文中使用，且具有以下含义：ANC =酸中和能力，CI =置信区间，GMT=几何平均滴度，PS80 =聚山梨醇酯80，SNA =血清中和抗体；v/v= 体积/体积，VVM =疫苗瓶监视标签(vaccine vial monitor)，VVMC= 疫苗瓶监视标签相容的，VVM7 =疫苗瓶监视标签类别7 (如下所述)，WFI =注射用水；w/v = 重量/体积。
附图简述
图1显示在37℃下的钙沉淀。在37℃下孵育3、7、10、14、18和39天后，目视观察到具有不同水平的钙的轮状病毒制剂的沉淀迹象(PPT)。结果显示含有4mM Ca (pH 6.2、6.4和6.7)的制剂中以及含有3.75 mM Ca (pH 6.7)的制剂中的钙沉淀问题。
图2显示对于实施例8中描述的研究，针对重配体轮状病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1A的血清中和抗体应答的GMT的非劣效性的统计学分析(符合方案群体)。该研究的主要目的是确定在剂量3后42天，疫苗诱导的抗体应答在接受VVM7RotaTeq™ (RotaTeq™新制剂)的对象与接受RotaTeq™的商业制剂(RotaTeq™目前制剂)的对象中是否相似(非劣效的)。结果显示，VVM7 RotaTeq™制剂在所有5种血清型的免疫原性方面均不劣于RotaTeq™的商业制剂。
图3提供了用于实施例8中描述的研究的血清抗轮状病毒IgA的免疫原性概述。
发明详述
本发明涉及热稳定的轮状病毒疫苗制剂，相对于先前轮状病毒疫苗制剂，其具有提高的热稳定性。具体而言，本发明涉及包含一种或多种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株的轮状病毒疫苗制剂，其中所述一种或多种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株中的每一种在37℃下稳定7天，在25℃下稳定45天并且在2-8℃下稳定2年或更久。
疫苗瓶监视标签(VVM)允许本领域的健康护理人员能够作出关于是否使用疫苗小瓶的知情决定(WHO, 2002, Technical Review of Vaccine Vial Monitor Implementation 27Mar2002, 1-47)。VVM是贴在每个疫苗单元上的标记，并且含有温度敏感材料以监测随时间的累积热暴露。这种累积热暴露引起标记的内部部分随时间变深，提供疫苗经历的热应激的视觉指示。颜色变化率随温度增加。当标记的内部部分的颜色与标记的外部部分匹配或比其更深时，所述疫苗已经超过其允许的累积热暴露，并且应该丢弃。在可能发生冷链失败的地区，容易地鉴定由于过度热暴露而应当被丢弃的疫苗的能力尤其重要，因为VVM是从疫苗的分配至储存至施用中存在的唯一温度监测器。由于VVM的效用，UNICEF和WHO在1999年发布了政策声明，推荐购买疫苗的国家要求制造商包括符合WHO的规范的VVM。参见Quality of the cold chain: WHO/UNICEF policy statement on the use of vaccine vial monitors in immunization services (WHO/V&B/99.18)。
目前，有四个WHO规定的疫苗瓶监视标签类别，其基于其在37℃下到达终点所需的天数来分类(表2)。由于商业VVM的可用性有限，必须配制疫苗来匹配VVM指定的稳定性概况。为了使疫苗符合VVM稳定性标准，其必须将高于其临床确定的期满功效的功效维持对于2-8℃、25℃和37℃规定的时间长度。对于RotaTeq™的期满功效，参见上文表1。
表2：疫苗瓶监视标签稳定性要求
VVM 37℃ 2-8℃ 25℃
2 2天 225天 N/A
7 7天 >2年 45天
14 14天 >3年 90天
30 30天 >4年 193天
本发明涉及具有与疫苗瓶监视标签类别VVM7相容的稳定性概况(在37℃下7天，在25℃下45天和在2-8℃下2年)的热稳定的口服轮状病毒疫苗制剂。我们开发符合VVM7稳定性要求的新的轮状病毒疫苗制剂的策略涉及增加游离钙浓度以增加疫苗的热稳定性。我们通过选择钙结合常数低于目前商业RotaTeq™制剂中的那些的赋形剂和添加钙来实现这一点。本发明的制剂包含钙和额外赋形剂，其中额外赋形剂以使溶液中游离的钙最大化以稳定轮状病毒颗粒的量存在。本文显示制剂中使用的赋形剂的钙结合亲和力对稳定性具有直接影响。本发明的制剂提供了钙溶解度和轮状病毒稳定性的平衡。在本发明的优选实施方案中，所述轮状病毒制剂不包含锌。
在本发明的具体实施方案中，口服轮状病毒制剂包含(除了轮状病毒组分以外)：己二酸钠、磷酸钠、氯化钙和聚山梨醇酯80。在本发明的该方面的一个优选实施方案中，所述口服轮状病毒疫苗制剂包含0.465M己二酸二钠(通过用氢氧化钠中和己二酸而在溶液中生成)，10mM磷酸钠，3mM氯化钙和0.01% (w/v) PS-80，pH 6.4。本发明的口服轮状病毒疫苗制剂可以使用活的轮状病毒单价疫苗原液(vaccine bulks)的无细胞制备物来制备，所述活的轮状病毒单价疫苗原液的无细胞制备物通过收获和冻融裂解轮状病毒感染的Vero细胞培养物、随后过滤并浓缩裂解物来产生。可以通过与制剂缓冲液混合，来组合用于期望活性成分(即轮状病毒重配体和/或减毒轮状病毒毒株)的单个轮状病毒单价疫苗原液，以制造最终药物产品。
已经描述了各种轮状病毒疫苗制剂。然而，存在对轮状病毒疫苗制剂的需求，其符合VVM7要求，这与世界卫生组织的政策一致。通过提供在全世界安全分配轮状病毒疫苗的能力，这种制剂将对世界健康具有积极影响，所述轮状病毒疫苗在各种环境条件下稳定，并且不太受由于发展中国家中的频繁的冷链失败而导致的功效和/或安全性降低的影响。
我们假设添加钙可以对轮状病毒疫苗制剂的热稳定性具有有益的影响。然而，先前的公开已经指出，钙可能对特定轮状病毒制剂的稳定性没有任何影响，或者仅可以在某些条件下影响稳定性。Burke等人(美国专利号6,616,931和5,932,223)公开了当添加至不含组织培养基的制剂时，添加10mM钙改善了轮状病毒重配体P1和G1的稳定性。在氯化钙存在和不存在的情况下评估G1和P1轮状病毒重配体的功效损失。当将轮状病毒重配体透析至10mM Tris和100mM氯化钠中时，通过添加10mM氯化钙观察到在37℃下的稳定性的改善。在37℃下3天后的功效对数损失，对于P1降低超过4倍(2.2 vs. 0.5)，且对于G1降低超过12倍(2.5至0.2)。相反，当G1和P1轮状病毒重配体在William氏培养基E背景中时，通过添加10mM氯化钙没有观察到稳定性的改善。此外，WO2006/087205公开了轮状病毒疫苗制剂，其中钙对稳定性没有有益的影响。
根据本发明，本文显示特定量的钙增加轮状病毒病毒颗粒的稳定性而不诱导沉淀，因此允许制备符合VVM7要求的热稳定的制剂。在本文的制剂中，钙作为药学上可接受的钙盐存在。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指整个说明书中描述的物质，其与适合于施用于人的本发明的活性成分(例如轮状病毒重配体)混合。药学上可接受的钙盐对于期望目的(即增加稳定性)是安全和有效的。可用于本发明的制剂中的药学上可接受的钙盐的实例包括但不限于：氯化钙、乙酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙和硫酸钙。优选的是，在本发明的制剂中，钙盐不是磷酸钙，这是由于其溶解性差，特别是为了增加酸中和能力而在本发明中含有的磷酸钠存在的情况下。在优选实施方案中，药学上可接受的钙盐呈氯化钙的形式。
WO 2013/02933 (“'933申请”)公开了轮状病毒疫苗制剂中的过量钙离子确保了在升高温度下的疫苗活力。'933申请指出轮状病毒制剂中确保病毒稳定性的钙的优选量为至少4mM。根据本发明，已经显示，少于4 mM的钙，即约1.0mM至约3.8mM钙的量可以稳定轮状病毒疫苗而不诱导沉淀。本文进一步显示，4mM或更高的钙的量不是优选的，因为钙从溶液中沉淀出来。参见实施例1和4。
为此，本发明提供了疫苗制剂，例如，轮状病毒疫苗制剂，其包含一种或多种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株，其中所述制剂组分如任何前述实施方案中所定义，且钙以任何以下量存在：约1.0至约3.8 mM，约1.25 至约3.8 mM，约1.75至约3.8 mM，约2.0至约3.8 mM，约2.25至约3.8 mM，约2.5至约3.8 mM，约2.75至约3.8 mM，约3.0至约3.8 mM，约1至约3.5 mM，约1.25至约3.5 mM，约1.75 至约3.5 mM，约2.0至约3.5 mM，约2.25至约3.5mM，约2.5至约3.5 mM，约2.75至约3.5 mM，约3.0至约3.5 mM，约1至约3.0 mM，约1.25至约3.0 mM，约1.75 至约3.0 mM，约2.0至约3.0 mM，约2.25至约3.0 mM，约2.5至约3.0 mM，和约2.75至约3 mM。在本发明的替代实施方案中，所述疫苗制剂组分如任何前述实施方案中所述，且钙的量为约1mM、约2mM、约2.5mM、约2.75mM、约3.0mM、约3.5mM或约3.75mM。在优选实施方案中，所述组合物包含3.0mM钙。
本文显示，甚至当制剂包含组织培养基作为稀释剂时，本发明的轮状病毒疫苗制剂(其包含上述指定量(例如约1.0至约3.8mM)的药学上可接受的钙盐)也是稳定的。因此，本发明的制剂任选地包含约2至约30% v/v的量的组织培养基。适合于在药物制剂中使用的任何组织培养基可以用于本发明的制剂中，例如，William氏培养基E，Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基，美国专利号6,656,719中描述的培养基。现有技术公开内容(美国专利号6,616,931和5,932,223)已经相反地显示，当将钙添加至不含组织培养基的制剂中时，钙改善了特定轮状病毒重配体P1和G1的稳定性，但是当所述制剂包含William氏培养基E时，没有使G1和P1轮状病毒重配体稳定。
本发明的疫苗制剂包含药学有效量的至少一种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株(本文称为“轮状病毒活性成分”)作为活性成分。在本发明的实施方案(包括任何上述实施方案)中，所述轮状病毒疫苗制剂包含一种或多种轮状病毒重配体。在替代实施方案中，所述轮状病毒制剂包含至少一种减毒轮状病毒毒株。
重配体的轮状病毒亲本毒株可以从适当的人和牛宿主中分离。例如，人轮状病毒亲本毒株可以是WI78、WI79、BrB或SC2。牛轮状病毒亲本毒株可以是例如毒株WC3。轮状病毒重配体可以是表达来自人轮状病毒亲本毒株的外部衣壳蛋白和来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白的重配体轮状病毒。
在本发明的一个实施方案中，所述制剂包含表达来自人轮状病毒亲本毒株的外部衣壳蛋白G1和来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白的重配体轮状病毒。在具体实施方案中，来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白来自血清型P7。如本文所用，术语“G1”或“G1重配体”是指包含来自人轮状病毒毒株的G1外部表面蛋白和来自牛亲本毒株的血清型P7的附着蛋白的重配体。
在本发明的另一个实施方案中，所述制剂包含表达来自人轮状病毒亲本毒株的外部衣壳蛋白G2和来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白的重配体轮状病毒。在具体实施方案中，来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白来自血清型P7。如本文所用，术语“G2重配体”是指包含来自人轮状病毒毒株的G2外部表面蛋白和来自牛亲本毒株的血清型P7的附着蛋白的重配体。
在进一步的实施方案中，所述制剂包含表达来自人轮状病毒亲本毒株的外部衣壳蛋白G3和来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白的重配体轮状病毒。在具体实施方案中，来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白来自血清型P7。如本文所用，术语“G3重配体”是指包含来自人轮状病毒毒株的G3外部表面蛋白和来自牛亲本毒株的血清型P7的附着蛋白的重配体。
在又另一个实施方案中，所述制剂包含表达来自人轮状病毒亲本毒株的外部衣壳蛋白G4和来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白的重配体轮状病毒。在具体实施方案中，来自牛轮状病毒亲本毒株的附着蛋白来自血清型P7。如本文所用，术语“G4重配体”是指包含来自人轮状病毒毒株的G4外部表面蛋白和来自牛亲本毒株的血清型P7的附着蛋白的重配体。
在又进一步的实施方案中，所述制剂包含表达来自人轮状病毒亲本毒株的附着蛋白P1A (基因型P[8]，本文称为血清型P1A[8])和来自牛轮状病毒亲本毒株的血清型G6的外部衣壳蛋白的重配体病毒。如本文所用，术语“P1A[8]重配体”是指包含来自牛轮状病毒毒株的外部表面蛋白和来自人亲本毒株的附着蛋白P1A (基因型P[8])的重配体。
在本发明的制剂中，每种轮状病毒活性成分以药学有效量单独存在。在优选实施方案中，所有轮状病毒活性成分的总量为约1 x 106感染单位/mL至约50 x 106感染单位/mL。在优选实施方案中，疫苗制剂中的每种重配体的单独量为约2 x 106至约20 x 106，使得有效期限结束时每种重配体的量为至少2 x 106感染单位/mL。在一些实施方案中，所述制剂包含最少2.0-2.8 x 106感染单位/单个重配体剂量。
在所选实施方案中，所述制剂包含至少一种选自以下的轮状病毒重配体：G1、G2、G3、G4和P1A。在一些实施方案中，所述制剂包含两种或更多种选自以下的轮状病毒重配体：G1、G2、G3、G4和P1A。在其他实施方案中，所述制剂包含三种或更多种选自以下的轮状病毒重配体：G1、G2、G3、G4和P1A。在进一步实施方案中，所述制剂包含四种或更多种选自以下的轮状病毒重配体：G1、G2、G3、G4和P1A。在又进一步实施方案中，所述制剂包含G1、G2、G3、G4和P1A轮状病毒重配体。
可以在抗真菌剂不存在的情况下，使用标准细胞培养技术繁殖轮状病毒重配体，例如在Vero细胞中繁殖。
如上所述，开发符合VVM7稳定性要求的轮状病毒疫苗制剂的一个目标是增加游离钙浓度以增加疫苗的热稳定性。第二个目标是开发具有足够酸中和能力(ANC)以确保活性药物成分(即病毒重配体)完好地到达小肠的制剂。由于预期的轮状病毒疫苗制剂用于口服施用，每种活性重配体必须在胃的苛刻环境中存活以进入小肠。先前的研究表明，几种牛轮状病毒毒株，包括WC3 (目前RotaTeq™制剂中人-牛重配体的骨架)，在酸性条件下(低于pH4.0)迅速失活。Weiss, S., Clark, H.F.“Rapid Inactivation of Rotaviruses byExposure to Acid Buffer or Acidic Gastric Juice”Journal of General Virology 66: 2725-2730 (1985)。
由于如上所述需要足够的ANC，RotaTeq™的商业制剂包括柠檬酸钠和磷酸钠两者以中和婴儿胃酸，使得病毒在到达小肠之前不降解；因此允许产生保护性免疫应答。在本文的VVM7制剂的开发中，我们决定，包括柠檬酸钠不是最佳的，因为它与其他羧酸相比具有相对高的钙结合常数。我们决定用钙亲和力较低的羧酸替代柠檬酸盐，以提供所需的酸中和，但通过在溶液中留下更多钙来改善病毒稳定性。
为此，在本发明的实施方案中，轮状病毒疫苗制剂包含二羧酸己二酸，而不是RotaTeq™制剂中的三羧酸盐柠檬酸钠，因为己二酸与柠檬酸钠相比具有较低的钙结合常数并且具有可接受的安全性概况。在本发明的具体实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂包含任何前述实施方案或任何下述实施方案中所定义的组分(及其组合)，并且进一步包含约260mM至约700mM己二酸。
在一些实施方案中，所述制剂包含以下量的己二酸：约275 mM至约700 mM，约300mM至约700 mM，约325 mM至约700 mM，约350 mM至约700 mM，约400 mM至约700 mM，约425mM至约700 mM，约450 mM至约700 mM，约275 mM至约650 mM，约300 mM至约650 mM，约325mM至约650 mM，约350 mM至约650 mM，约400 mM至约650 mM，约425 mM至约650 mM，约275mM至约600 mM，约300 mM至约600 mM，约325 mM至约600 mM，约350 mM至约600 mM，约400mM至约600 mM，约425 mM至约600 mM，约450 mM至约600 mM，约275 mM至约550 mM，约300mM至约550 mM，约325 mM至约550 mM，约350 mM至约550 mM，约400 mM至约550 mM，约425mM至约550 mM，约450 mM至约550 mM，约275 mM至约500 mM，约300 mM至约500 mM，约325mM至约500 mM，约350 mM至约500 mM，约400 mM至约500 mM，约425 mM至约500 mM，或约450mM至约500 mM。在一个具体的优选实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂包含约465mM己二酸。
在本发明的具体实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂包含任何前述实施方案或任何下述实施方案中所定义的组分(及其组合)，并且进一步包含约0.5M至约2.0M蔗糖。将蔗糖添加至制剂中以增加总体病毒稳定性。在额外的实施方案中，所述组合物中的蔗糖的浓度为约0.5 M至约1.9 M，约0.5 mM至约1.8M，约0.5 mM至约1.75M，约0.5 M至约1.6M，约0.5M至约1.5M；0.75 M至约1.9 M，约0.75 mM至约1.8M，约0.75 mM至约1.75M，约0.75 M至约0.75，约0.75至约1.5M，1.0 M至约1.9 M，约1.0 mM至约1.8M，约1.0 mM至约1.75M，约1.0 M至约1.6M，约1.0 M至约1.5M；1.25 mM至约1.75M，约1.25 M至约1.6M，或约1.25 M至约1.5M。
在替代实施方案中，所述疫苗组合物包含约0.5M、约1.0M、约1.25M、约1.5M、约1.75M或约2M蔗糖。在一个优选实施方案中，所述疫苗制剂包含约1.5M蔗糖。
本发明的制剂还可以包含磷酸钠，其有助于溶液的ANC。磷酸钠可以呈磷酸二氢钠一水合物的形式。因此，在本发明的进一步实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂包含任何前述实施方案或任何下述实施方案中所定义的赋形剂(及其组合)，并且进一步包含约10mM至约100mM磷酸钠。使用约10mM至约100mM磷酸钠与约1.0至约3.8mM钙盐和约275mM至约700mM己二酸的组合，使可溶性钙浓度最大化而不诱导沉淀，允许制剂符合VVM7要求。在本发明的优选实施方案中，所述制剂包含约10mM磷酸钠。在进一步实施方案中，所述制剂包含约5mM磷酸钠、约15mM磷酸钠、约20mM磷酸钠、约25mM磷酸钠、约50mM磷酸钠、约75mM磷酸钠或约100mM磷酸钠。
本文所述的任何疫苗制剂可以任选地包含表面活性剂。表面活性剂可以添加至疫苗制剂中以便在加工条件诸如纯化、过滤、冷冻干燥、运输、储存和递送期间提供稳定性，减少和/或防止聚集或防止和/或抑制蛋白损伤。在本发明中，表面活性剂可用于为轮状病毒活性成分提供额外的稳定性。
可用于本发明的制剂中的表面活性剂包括，但不限于：非离子表面活性剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯类，以商品名Tween® (Uniquema AmericasLLC, Wilmington, DE)销售)，包括聚山梨醇酯-20 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)，聚山梨醇酯-40 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)，聚山梨醇酯-60 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)和聚山梨醇酯-80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)；聚氧乙烯烷基醚类诸如Brij® 58 (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE)和Brij® 35；泊洛沙姆类(例如泊洛沙姆188)；Triton® X-100 (Union Carbide Corp., Houston, TX)和Triton® X-114；NP40；Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80和Span 85；乙烯和丙二醇的共聚物(例如pluronic®系列的非离子表面活性剂，诸如pluronic® F68、pluronic®10R5、pluronic® F108、pluronic® F127、pluronic® F38、pluronic® L44、pluronic®L62 (BASF Corp., Ludwigshafen, Germany)；和十二烷基硫酸钠(SDS)。
本发明的制剂中包含的表面活性剂的量是足以行使期望功能的量，即稳定制剂中的轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株所需的最小量。典型地，表面活性剂以约0.008%至0.04% w/v (wt/vol)的浓度存在。在本发明的该方面的一些实施方案中，所述表面活性剂以约0.01％至约0.04％；约0.01％至约0.03％或约0.01％至约0.02％的量存在于制剂中。在具体实施方案中，所述表面活性剂以约0.01％的量存在。在替代实施方案中，所述表面活性剂以0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%或0.04%的量存在。
在本发明的示例性实施方案中，所述表面活性剂是选自以下的非离子表面活性剂：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Brij®35、pluronic® F-68和Triton®。在一些实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在具体实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂包含约0.01% PS80。
如任何前述实施方案或任何下述实施方案中所述，本发明的疫苗组合物在25℃下的pH优选在约6.2至约6.7的范围内。本文描述的稳定性研究(参见实施例2)证实，在低至6.0或高达7.0的pH时，对于特定轮状病毒重配体观察到更高的功效损失率。具体地，G1、G4和P1重配体在pH 6.0和pH 7.0显示更大的损失。因此，将本发明的制剂保持在高于6.0且低于7.0的pH，以便为所有轮状病毒活性成分提供较低的功效损失率。在本发明的具体实施方案中，所述组合物的pH为约6.2至约6.6，约6.2至约6.5，约6.2至约6.4，约6.2至约6.3，约6.3至约6.7，约6.3至约6.6或约6.3到约6.5。在额外的实施方案中，pH为约6.2，约6.3，约6.4，约6.5，约6.6或约6.7。在具体实施方案中，所述制剂在25℃下的pH为约6.4。
通过添加各种可用作酸化剂和碱化剂(其分别降低或增加制剂的pH)的药学上可接受的赋形剂，可以将本发明的制剂的pH调节至最佳水平。可用于增加制剂的pH的碱化剂包括：氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠和三乙醇胺。在本发明的实施方案中，通过添加氢氧化钠来调节pH。在本发明的实施方案中，氢氧化钠的量为约750mM至约1.25M。在具体实施方案中，氢氧化钠的量为约900mM至约950mM。在额外的实施方案中，氢氧化钠的量为约924mM。
WO2006/042202报道了锌是对其中所述的轮状病毒疫苗制剂赋予稳定性的关键赋形剂。类似地，WO2013/029033指出在轮状病毒疫苗制剂中优选具有锌。我们令人惊讶地发现，锌实际上对本文的轮状病毒制剂的稳定性有害(参见实施例5)。在1mM氯化锌存在和不存在的情况下，评估含有465mM己二酸、100mM磷酸钠、1.5M蔗糖、0.01％ PS80和2mM氯化钙(pH 6.7)的示例性五价轮状病毒疫苗制剂的稳定性。使用轮状病毒功效数据来计算测试制剂中每种重配体的功效损失率。数据显示，当制剂中包括1mM锌时，所有5种重配体在37℃下7天后都具有更大的功效损失。因此，优选本发明的制剂不包括锌。
使用方法
本发明还提供了预防或降低轮状病毒感染人患者的可能性的方法，其包括施用本文公开的疫苗制剂。本发明还提供了预防或降低轮状病毒肠胃炎的可能性或降低其持续时间或严重程度的方法，其包括施用如本文公开的疫苗制剂。在本文提供的方法的具体实施方案中，施用于患者的药物组合物包含一种或多种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株。在一个实施方案中，所述疫苗制剂包含至少一种轮状病毒重配体。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂包含G1、G2、G3、G4和P1A轮状病毒重配体。
在本发明的一些实施方案中，本文公开的轮状病毒药物制剂以各种引发/加强组合口服施用于患者以诱导增强的持久的免疫应答。在这种情况下，将两种或更多种药物组合物或制剂以“引发和加强”方案施用。例如，将第一组合物施用一次或多次，然后在预定量的时间，例如2周、1个月、2个月、6个月或其他适当的时间间隔之后，将第二组合物施用一次或多次。优选地，用于临床方案中的两种或更多种轮状病毒药物组合物以4至10周时间间隔施用，其中第一剂量在6至12周龄时施用。在本发明的具体实施方案中，将疫苗组合物施用三次，其中第三剂量在32周龄或更小的年纪施用。
因此，本发明涉及在儿童中降低轮状病毒感染的可能性或预防或降低轮状病毒肠胃炎的可能性或其严重程度或持续时间的方法，其包括将本发明的任何轮状病毒疫苗制剂口服施用于儿童。在本发明的该方面的具体实施方案中，所述儿童是6至32周龄的年纪的婴儿。在其他实施方案中，所述儿童是6至12周龄的年纪的婴儿。
在本发明的另一个实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：(a) 等待经过预定量的时间；(b) 将额外剂量的制剂施用于儿童，和(c) 任选地重复步骤(a)和(b)。本发明的轮状病毒疫苗组合物的第一剂量和本发明的轮状病毒疫苗组合物的第二剂量或其后的任何剂量之间的时间量可以变化。在具体实施方案中，第一次施用给予约6至约12周龄的儿童。在进一步实施方案中，所述方法包括以3-剂量系列将所述轮状病毒疫苗制剂施用于所述儿童，其中在所述系列完成时，所述儿童为32周龄或更年幼。
在本发明的方法的任何实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂任选地与一种或多种额外的疫苗同时施用于儿童，所述额外疫苗包含以下的一种或多种：白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳(DTaP)、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)、b型流感嗜血杆菌缀合物(Hib)，乙型肝炎疫苗，肺炎球菌缀合物疫苗。
本发明还涉及说明书中描述的任何实施方案的轮状病毒疫苗制剂用于治疗或预防与轮状病毒感染相关的疾病的用途。本发明还涉及本发明的轮状病毒疫苗制剂用于预防轮状病毒肠胃炎的用途。
本发明的实施方案还包括一种或多种本文所述的轮状病毒疫苗制剂，其(i) 用于以下，(ii) 用作用于以下的药物或组合物，或(iii) 用于制备用于以下的药物：(a) 治疗(例如，人体)；(b) 药物；(c) 抑制轮状病毒复制；(d) 诱导针对轮状病毒的免疫应答或保护性免疫应答；(e) 诱导针对轮状病毒的病毒中和抗体应答；(f) 治疗或预防轮状病毒的感染；(g) 降低与轮状病毒感染相关的病理症状的进展、发作或严重程度和/或降低轮状病毒感染的可能性或，(h) 治疗、预防或延迟轮状病毒相关疾病(包括但不限于：肠胃炎)的发作、严重程度或进展。
因此，本发明提供了用于预防和/或治疗性治疗轮状病毒感染或轮状病毒相关疾病的方法，其包括向需要治疗的患者施用一种或多种本发明的制剂。
预防性治疗可以使用本发明的轮状病毒疫苗制剂来进行，如本文所述。本发明的制剂可以施用于一般群体或处于增加的轮状病毒感染风险的那些人。
因此，本发明提供了用于在患者中诱导针对轮状病毒感染的保护性免疫应答的方法，其包括向患者施用药学有效量的本文所述的任何轮状病毒疫苗制剂的步骤。
本文提及的所有出版物都通过引用并入，用于描述且公开可以与本发明结合使用的方法和材料的目的。
已经参考附图描述了本发明的不同实施方案，应当理解的是，本发明不限于那些精确实施方案，并且在不背离如随附权利要求定义的本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中实现各种变化和修改。
实施例1：VVMC轮状病毒制剂赋形剂选择
我们评估了商业疫苗制剂(Rotateq™)从最小释放功效开始达到到期功效的时间量。经确定，尽管在5℃下储存时，疫苗中的每种重配体在符合VVM7所需的时间段是稳定的，但所有五种重配体在25℃和37℃下都不能符合最低VVM7要求。因此，进行研究以重新配制商业轮状病毒疫苗以增加产品的热稳定性概况以匹配VVM7要求，其要求在37℃下储存7天、在25℃下储存45天或在2-8℃下储存2年后，所有五种重配体的疫苗功效都保持高于期满功效。
由于口服施用RotaTeq™，每种活性重配体必须在胃的苛刻环境中存活以进入小肠。先前证实几种牛轮状病毒毒株，包括WC3 (RotaTeq™中使用的人-牛重配体的骨架)，在酸性条件下(低于pH4.0)迅速失活。Weiss, S., Clark, H.F. “Rapid Inactivation ofRotaviruses by Exposure to Acid Buffer or Acidic Gastric Juice” Journal of General Virology 66: 2725-2730 (1985)。因此，RotaTeq™的商业制剂包括柠檬酸钠和磷酸钠两者以中和婴儿胃酸，使得病毒在到达小肠之前不被降解；因此允许产生保护性免疫应答。开发VVM7制剂的一个目标是符合或超过商业RotaTeq™制剂的酸中和能力(ANC)，其为0.86 mEQ/剂量，以确保活性药物成分(即病毒重配体)完好地到达小肠。
我们开发符合VVM7稳定性要求的新的RotaTeq™制剂的策略涉及增加游离钙浓度以增加疫苗的热稳定性。我们通过选择钙结合常数低于商业RotaTeq™制剂中的那些的赋形剂和添加氯化钙来实现这一点。在商业RotaTeq™制剂中用于酸中和的柠檬酸钠与其他羧酸相比具有相对高的钙结合常数。我们决定用钙亲和力较低的羧酸替代柠檬酸钠，以提供所需的酸中和，但通过在溶液中留下更多钙来改善病毒稳定性。选择二羧酸己二酸来替代RotaTeq™制剂中的三羧酸盐柠檬酸盐，因为其较低的钙结合常数和其安全性概况。己二酸的钙结合常数(log(K)为2.19且K为~155)是柠檬酸的钙结合常数(log(K)为3.5且K为3162)的约1/20。
用于使制剂中可用于稳定传染性轮状病毒颗粒的游离钙最大化的第二种方法是向制剂中添加氯化钙。然而，因为在也含有磷酸盐的制剂中提高钙的浓度可以导致磷酸钙沉淀，我们开展了一系列沉淀筛选研究以确定钙、磷酸盐和己二酸浓度的何种组合将使可溶性钙最大化而没有沉淀的风险。
在制剂开发期间，最初测试两种浓度的己二酸：465mM和250mM。相对于商业制剂，使用465mM己二酸导致具有显著更高的ANC的制剂。还测试了250mM的己二酸浓度，其将使制剂的ANC降低至与商业RotaTeq™制剂的水平类似的水平。用包含250mM己二酸的测试制剂观察到钙溶解度的显著降低(从3.0mM至1.5mM)；因此选择465mM己二酸作为靶浓度。
使用匹配商业RotaTeq™制剂中的磷酸钠浓度，实施第一研究以使含磷酸盐制剂中的可溶性钙浓度最大化。这些研究使用了465mM己二酸、100mM磷酸钠、1.5M蔗糖和0.01%(w/v)聚山梨醇酯80的基础制剂。制备测试制剂，其中pH从6.0至6.7变化，并且钙浓度是1.0、2.0或3.0mM。在25和37℃下孵育后，观察制剂的沉淀物形成。含有2mM和3mM钙的pH6.5和6.7的制剂通常在两种孵育温度下都显示沉淀。这些观察表明，1mM钙是可以添加至含有100mM磷酸盐的制剂中的钙的最大浓度。首先在已经在37℃下孵育的pH 6.7的样品中观察到沉淀。因此，将随后的筛选聚焦于评估在37℃下孵育时在pH 6.7下的沉淀物形成。
在第二组实验中，制剂中磷酸盐的浓度随着钙浓度而变化，其目的是鉴定使可溶性钙最大化的组合。在这些研究中使用的基础制剂含有465mM己二酸、1.5M蔗糖和0.01%(w/v)聚山梨醇酯80，pH值为6.5和6.7。检测的磷酸钠浓度包括100mM、50mM和10mM。在该筛选中测试的钙浓度从1mM至4mM变化。再一次，当钙浓度超过1mM时，在100mM磷酸盐浓度制剂中观察到沉淀。当磷酸盐浓度降低至50mM时，由于在含有超过1mM钙的制剂中观察到沉淀，所以没有实现钙溶解度的显著改善。相反，在仅含有10mM磷酸盐的制剂中观察到钙溶解度的显著改善，其中直到添加4.0mM钙才观察到沉淀。这些研究表明，当磷酸盐浓度降低至10mM时，可以实现显著更高的可溶性钙浓度。
实施例2：pH对稳定性的影响
进行稳定性研究以对于465mM己二酸、100mM磷酸盐、1.5M蔗糖、0.01％ PS-80和1mM钙制剂生成跨越pH范围(6.0至7.0)的稳定性数据。简而言之，制备在pH 6.0、6.2、6.5、6.7和7.0的五价轮状病毒制剂并将其填充至口服给药管中。在37℃下孵育0、1、2、3、6、7、8和10天后，评估所有5种重配体的稳定性。使用轮状病毒功效数据，通过以时间(天)计对自然对数转化的功效进行线性回归，来计算在测试的五个pH值下每种重配体的功效损失率。以下报道了在37℃下储存7天后平均功效损失的自然对数值(表3)。在测试的pH范围的两端，G1、G4和P1重配体显示更大的损失。
表3：pH对稳定性的影响
实施例3：己二酸浓度
在10mM磷酸盐、1.5M蔗糖、0.01％ PS80和3mM钙(pH 6.4)的存在下，在250mM、350mM、465mM和700mM己二酸，评估己二酸浓度对轮状病毒重配体的稳定性的影响。简而言之，制备五价轮状病毒制剂并将其填充至口服给药管中。在37℃下孵育0、3、7和10天后，评估所有5种重配体的稳定性。使用轮状病毒功效数据，通过以时间(天)计对自然对数转化的功效进行线性回归，来计算在测试的四种己二酸浓度下每种重配体的功效损失率。以下报道了对于每种重配体，在37℃下储存7天后平均功效损失的自然对数值(表4)。对于G1、G2和G3重配体，在37℃下7天后的功效损失在测试的己二酸浓度范围内是一致的。该观察是预想不到的，因为较高浓度的己二酸会螯合较高量的钙并可以导致稳定性下降。尽管不希望受到理论的束缚，但对该结果的一种解释是，甚至在700mM己二酸下，足够的钙保留在溶液中或与病毒颗粒结合，以使对稳定性没有影响。对于G4重配体，在较高浓度的己二酸下，功效损失略高。
表4：己二酸浓度对稳定性的影响
实施例4：磷酸钙沉淀的细化
我们进行了另一组实验，其主要目的是确定在何种浓度(3至4 mM)首先观察到钙沉淀。在该组实验中，使用465mM己二酸、10mM磷酸钠、1.5M蔗糖和0.01% (w/v)聚山梨醇酯80的基础制剂。在37℃下孵育3、7、10、14、18和39天后，目视观察具有不同水平的钙的轮状病毒制剂的沉淀迹象(PPT)。在这些研究中测试的氯化钙浓度范围为1至4mM，并且特别关注于3至4mM的浓度。为了完整性，制剂的pH从6.2至6.7变化，并且在37℃下孵育的情况下监测沉淀的发生。结果表明，当样品含有3.5mM或更少的钙时，甚至在孵育39天后，在任何测试的pH值都没有观察到沉淀(参见图1)。我们在含有4mM Ca的制剂(pH 6.2或6.4)中观察到沉淀问题，如下表中所示。在pH 6.7时，我们观察到含有3.75和4mM的制剂中的沉淀。因此，基于沉淀的风险和稳定性，对于稳定性的最佳钙浓度被选择为3mM。
实施例5：锌对稳定性的影响
进行稳定性研究以评价在轮状病毒疫苗制剂中包括锌是否有益。在1mM氯化锌存在和不存在的情况下，评估含有465mM己二酸、100mM磷酸盐、1.5M蔗糖、0.01％ PS80和2mM氯化钙(pH 6.7)的五价轮状病毒疫苗制剂的稳定性。在37℃下孵育0、3、7和8天后，评估所有5种重配体的稳定性。使用轮状病毒功效数据，通过以时间(天)计对自然对数转化的功效进行线性回归，来计算在测试的2种制剂中的每种重配体的功效损失率。以下报道了在37℃下储存7天后平均功效损失的自然对数(表5)。当制剂中包括1mM锌时，所有5种重配体在37℃下7天后具有更大的功效损失。
表5：锌对稳定性的影响
实施例6：制剂与VVM7要求的相容性的确定
进行正式的稳定性研究，以评估在必要的VVM温度(37℃、25℃和2至8℃)下的功效损失率。对于所评估的每个温度，将样品孵育不同的时间量，并测量剩余的功效。使用测量的功效值确定95％ CI的损失率。表6和表7中呈现的数据分别概述了商业RotaTeq™制剂(其具有高钙结合亲和力)和VVMC制剂(低钙结合亲和力)在37℃和25℃下的功效损失率。在37℃下观察到稳定性的大幅改善，其中在G3重配体中观察到最大的改善(362倍增强)。在25℃下观察到更适度的稳定性增强，其中所有重配体都显示范围为1.7至51.1倍的损失率改善。总之，通过使溶液中可用于稳定病毒颗粒的游离钙最大化，RotaTeq™中存在的所有五种轮状病毒重配体在升高温度下的稳定性得到改善，并且产生VVM7相容的制剂。
表6 - 在37℃，每天的感染性损失(LN IU/天) w/ 95%置信区间
制剂 G1 G2 G3 G4 P1
目前 0.268 0.086 15.293 0.608 1.880
VVMC 0.072 0.065 0.042 0.061 0.069
稳定性改善 3.7x 1.3x 362x 9.9x 27.4x
表7 - 在25℃，每天的感染性损失(LN IU/天) w/ 95%置信区间
制剂 G1 G2 G3 G4 P1
目前 0.0243 0.0162 0.2890 0.0293 0.0329
VVMC 0.0074 0.0098 0.0057 0.0104 0.0135
稳定性改善 3.3x 1.7x 51.0x 2.8x 2.4x
实施例7：聚山梨酸酯80浓度范围的测定
RotaTeq™的商业制剂包含PS80。进行稳定性研究以评估PS80浓度对RotaTeq™ VVM7制剂在37℃下的稳定性的影响。在成品制剂中，存在来自于病毒原液和制剂缓冲液二者的PS80。制备具有不同浓度的PS80的制剂缓冲液，使得在添加病毒批次的情况下，最终容器中的PS80浓度可跨越目前商业制剂的范围(0.008至0.04% (w/v))。用每种制剂缓冲液制备三批具有独特原液批次的填充容器，并将所有12批次提交用于PS80测试。表8概述了每种稳定剂的理论PS80浓度和最终容器批次中实验测定的浓度。
表8. 制剂缓冲液和最终容器中的PS80浓度
制剂 理论制剂缓冲液浓度 最终容器浓度(实验测定；批次1、批次2、批次3)
1 0.000% (w/v) 0.0047、0.0052、0.0057 (w/v)
2 0.004% (w/v) 0.0089、0.0084、0.0094% (w/v)
3 0.010% (w/v) 0.0136、0.0139、0.0142% (w/v)
4 0.040% (w/v) 0.0451、0.0426、0.0437% (w/v)
将12个最终容器批次中的每一个置于在37℃下0或9天的稳定性，其后测定所有五种重配体的功效。分析PS80浓度和功效结果以确定稳定性是否受所研究范围内的PS80浓度影响。简而言之，将功效数据拟合至混合效应回归模型以检验相互作用项时间制剂的统计学显著性。该项的显著性表明各制剂间的损失率的潜在差异。结果表明，重配体G1、G2、G3和G4具有大于0.05的相互作用项p值，表明没有发现显著性。重配体P1具有0.049的相互作用项p值，表明边界显著性；因此，针对每种批次和制剂计算单独的斜率值。该进一步分析显示，制剂#4在三种批次间具有一致较大的斜率值。使用归因于在高PS80浓度下稳定性的改善的边缘显著性差异，得出结论，所有重配体在测试的PS80浓度间是稳定的。
实施例8：评估VVM7-RotaTeq™的安全性、耐受性和免疫原性的双盲、随机、对照的研究
该研究的主要目的是证实VVM7RotaTeq™当与RotaTeq™的商业制剂相比时，基于免疫原性的非劣性。该研究的主要目的是确定在剂量3后42天的疫苗诱导的抗体应答在接受VVM7RotaTeq™的对象与接受RotaTeq™的商业制剂的对象中是否相似(非劣效的)。
将6至12周龄的合格对象以1:1比率随机分配至2个疫苗接种组：组1接受3个口服剂量的VVM7 RotaTeq™且组2接受3个口服剂量的RotaTeq™的商业制剂。以2个时间间隔(在剂量1前和剂量3后42天)收集血清，并通过针对人轮状病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1A[8]的血清中和抗体(SNA)以及血清抗轮状病毒IgA进行测试。还评估新制剂的安全性和耐受性。对于在疫苗接种的14天内经历中度至重度腹泻和/或呕吐的对象，收集粪便样品并测试轮状病毒。
总共1020个对象被随机化，并且1014个对象接种疫苗。他们之中，510个接受新制剂，而504个接受目前的RotaTeq™制剂。两组具有基本相当的基本特征。
主要免疫原性假设是证实在各组之间，在接受3个剂量的研究疫苗的对象中，就疫苗诱导的针对人轮状病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1A[8]的SNA应答的GMT而言的非劣效性。成功标准要求GMT比率的95% CI的下限值为>0.67 (对应于新制剂的GMT与目前制剂相比下降不超过1.5倍)。VVM7 RotaTeq™制剂在所有5种血清型的免疫原性方面均不劣于RotaTeq™的商业制剂(参见图2)。与目前的制剂组相比，新制剂组中的G3的GMT更高。此外，新制剂组和目前制剂组中的血清抗轮状病毒IgA的免疫原性是相似的(参见图3)。
对于两组中的对象，收集关于安全性的数据。任何剂量后的肠套叠、腹泻、呕吐、体温升高(直肠温度38.1℃ [100.5℉]或等效温度)和过敏被预先指定为目标事件。结果表明，VVM7制剂被良好耐受，并且关于这些事件，VVM7制剂具有与商业RotaTeq™制剂相当的的安全性概况。研究中没有疫苗相关的严重不良事件且无死亡。只有2个对象由于不良事件中止研究。

Claims (21)

1.液体轮状病毒疫苗制剂，其包含药学有效量的至少一种轮状病毒重配体或减毒轮状病毒毒株，约1.0mM至约3.5mM药学上可接受的钙盐，约0.5M至约2.0M蔗糖，约260mM至约700mM己二酸和约10mM至约100mM磷酸钠；其中所述制剂的pH为约6.2至约6.7。
2.权利要求1的轮状病毒疫苗制剂，其中所述钙来自氯化钙。
3.权利要求1或权利要求2的轮状病毒疫苗制剂，其进一步包含非离子表面活性剂。
4.权利要求3的轮状病毒疫苗制剂，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯80，其以0.008%至0.04% w/v的浓度存在。
5.权利要求1-4中任一项的轮状病毒疫苗制剂，其中所述制剂包含一种或多种选自以下的轮状病毒重配体：G1、G2、G3、G4和P1A。
6.权利要求5的轮状病毒疫苗制剂，其中所述制剂包含G1、G2、G3、G4和P1A轮状病毒重配体。
7.权利要求5或权利要求6的轮状病毒疫苗制剂，其中轮状病毒重配体的总量为约1.0x 106至约50 x 106感染单位/mL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的轮状病毒疫苗制剂，其进一步包含组织培养基。
9.根据权利要求8所述的轮状病毒疫苗制剂，其中所述组织培养基以约2至约30% v/v的量存在。
10.根据任一前述权利要求所述的轮状病毒疫苗制剂，其中钙的量为约3.0 mM。
11.权利要求1的轮状病毒疫苗制剂，其中所述制剂包含：
a) 一种或多种轮状病毒重配体，其选自：G1、G2、G3、G4和P1A；
b) 约1.5M蔗糖；
c) 约465mM己二酸；
d) 约10mM磷酸钠；和
e) 约3mM药学上可接受的钙盐；
其中所述制剂的pH在25℃下为约6.4。
12.权利要求11的轮状病毒疫苗制剂，其进一步包含约0.01％聚山梨醇酯80。
13.权利要求1-12中任一项的轮状病毒疫苗制剂，其中所述制剂在37℃下热稳定至少7天、在25℃下热稳定至少45天，且在2-8℃下热稳定至少2年。
14.在儿童中降低轮状病毒感染的可能性或预防或减少轮状病毒肠胃炎的可能性或严重性的方法，其包括将权利要求1-13中任一项的制剂口服施用于所述儿童。
15.权利要求14的方法，其中所述儿童是6至12周龄的年纪的婴儿。
16.权利要求14或15的方法，其进一步包括以下步骤：(a)等待经过预定量的时间；(b)将额外剂量的所述制剂施用于所述儿童，和(c)任选地重复步骤(a)和(b)一次或多次。
17.权利要求16的方法，其中所述方法包括以3-剂量系列将所述轮状病毒疫苗制剂施用于所述儿童，其中在所述系列完成时，所述儿童为32周龄或更年幼。
18.权利要求14或15的方法，其中所述轮状病毒疫苗制剂与选自以下的第二疫苗同时施用于所述儿童：白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳(DTaP)、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)、b型流感嗜血杆菌缀合物(Hib)，乙型肝炎疫苗和肺炎球菌缀合物疫苗及其组合。
19.权利要求1-13中任一项的轮状病毒疫苗制剂用于治疗或预防与轮状病毒感染相关的疾病的用途。
20.权利要求1-13中任一项的轮状病毒疫苗制剂用于预防轮状病毒肠胃炎的用途。
21.根据权利要求1-13中任一项所述的轮状病毒疫苗制剂，其用于降低轮状病毒感染的可能性或降低轮状病毒肠胃炎的可能性或严重程度。
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