CN1353191A - 一种从可更新的原料制备发酵培养基的方法 - Google Patents

一种从可更新的原料制备发酵培养基的方法 Download PDF

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J－J·卡博彻
P·杜福勒特
C·福阿克
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Abstract

本发明涉及一种从可更新的原料制备用于生产高纯度代谢物的发酵培养基的方法,其特征在于该方法包括:任选地处理所述的可更新的原料,以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源,并清除不溶性杂质;独立地或组合使用选自纳米级过滤和电渗析的技术,以从所述可更新的原料除去低分子量杂质,而不降低能被直接同化的碳源的浓度;对通过上述方式已除去低分子量杂质的原料进行处理,以补充能被微生物直接同化的碳源或氮源;和回收所得的发酵培养基。

Description

一种从可更新的原料制备发酵培养基的方法
                      发明领域
本发明涉及一种从可更新的原料制备发酵培养基的特定方法。
更具体地说，本发明涉及一种加工可更新的原料的特定方法，使得该原料可以直接在发酵中用于生产高纯度的代谢物，而不必要进行多个费时且昂贵的提纯步骤来分离代谢物。
                        发明背景
在本发明的公开中，术语“可更新的原料”指来自食品工业的废料，它是廉价的、未精制的且通常是无毒的，并富含氮和碳源。
在本发明的公开中，术语“代谢物”指通过能直接被微生物同化的碳源发酵而转变得到的产物。它们是有利的代谢物，选自有机酸、维生素、氨基酸和抗生素，优选有机酸，例如L-乳酸。
通常认为，所述可更新的原料的选择是基于其可行性、成本和达到高产率的潜力。
还认为，发酵培养基必须含有碳源和氮源，并向其中加入矿物质和有机盐。
“碳源”可以从可更新的原料获得，例如糖浆，来自小麦、玉米、大米、木薯或马铃薯的淀粉水解物，但“能直接被同化的碳源”是从所述碳源精制或纯化得到的糖，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和糊精。
“氮源”或蛋白质类营养素的例子是酵母抽提物、玉米浆、非变性乳品、糖浆蛋白、肉羹或豆粉。但是，通常优选使用酵母抽提物作为氮源，并提供额外的维生素和矿物质。
包括“能直接被同化的碳源”即葡萄糖或蔗糖的或包括酵母抽提物的发酵培养基可以基本上用于多种发酵方法，例如用于生产有机酸的发酵方法，有机酸例如乳酸、丙酸、葡糖酸、柠檬酸等酸类，基础氨基酸，例如赖氨酸，抗生素或任何其它有工业价值的代谢物。
这些培养基还适用于生产生物量(例如，用于制备乳酸酵素(lactic ferments))。
但是，认为这些培养基的缺点是不能从它们外推以工业规模生产相同的经济可行的代谢物(因为难以提供具有标准组成的培养基，和因为从随后纯化步骤产生的额外费用)。
为了降低成本，所以必须选择使用这样的发酵培养基，其中氮源或烃源的一种通过价廉的原料提供，并对发酵培养基的其它组分进行精制或纯化。
为了制备有机酸例如乳酸，例如：
-美国专利5416020描述了一种从乳清和乳清的渗透物制备L-乳酸的方法，但酵母抽提物也在二价锰的存在下加入，其含有戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC 55163(Lactobacillus delbrueckiisub.bulgarious)的突变菌株，其基本上制得L-乳酸。
乳清的渗透物确实含有75-80重量％的乳糖，但不含有任何大量的蛋白质。所以其缺乏对于微生物的生长所必要的氮源。因此需要加入酵母抽提物。所加入的乳清基本上含有约65-70重量％的乳糖。
然后酵母抽提物提供了含有营养素的发酵培养基，其不能通过乳清的渗透物或乳清本身来充足地供应。
美国专利4467034显示可能从作为原料的乳清制备乳酸，使用新菌株保加利亚乳杆菌DSM 2129。
但是，乳清必须仍然具有额外的氮源，即肉羹、玉米浆或豆粉，并含有维生素和无机盐。
尽管在以上条件下使用这些发酵培养基会略微降低所用原料的成本，但需要慎重地选择氮/碳比例的组合，以及为达到有效产率所必需的添加剂。
此外，这些“重组”的培养基不适合生产高纯度的代谢物，例如乳酸，其必须然后通过许多标准方法来分离和提纯，例如膜分离、离子交换、溶剂萃取、电渗析和乳酸盐的沉淀。
在用乳杆菌(Lactobacillus)制备光学纯的乳酸方面，美国专利4769329解释了为了促进微生物的生长，必要的是加入许多不能自己生产的物质，例如生物素、维生素B1、烟酸、吡哆胺、对氨基苯甲酸、泛酸和维生素B12。
以上组分必须以复合培养基的形式加入，例如由MAN、ROGOSA和SHARPE开发的MRS培养基，尽管该方法不能用于工业生产乳酸(因为成本过高，且难以获得标准组成的培养基)。
复合培养基例如制糖甜菜、或蔗糖蜜或玉米浆，它们尽管能促进细菌的生长，但是不能用于制备光学纯的乳酸，因为它们本身含有显著量的外消旋乳酸。
光学纯的酸可以从所述的外消旋混合物仅仅通过沉淀和重结晶D-乳酸和L-乳酸的盐来获得，该方法是复杂且昂贵的。
为了得到光学纯的乳酸，美国专利4769329建议使用baker酵母作为维生素、氮、糖和痕量矿物元素的来源。该培养基还含有葡萄糖、蔗糖或乳糖作为碳源，它们能直接被同化，并能转化成乳酸。
所以必要的是恢复使用精制的且昂贵的培养基来生产高纯度代谢物，在这种情况下是光学纯的高纯度乳酸。
已提出许多解决方案来尝试解决上述现有技术的问题。
第一个解决方案是使用对特定发酵条件有特殊抵抗力的微生物，或使用微生物的混合物。第二个解决方案是对可更新的原料进行预处理。这两个解决方案也可以组合。
在美国专利4963486中，例如使用玉米作为可更新的原料，这受限于其与Rhizopus oryzae的组合，它具有贡献用于糖化原料的酶以及用于将其发酵制成L-乳酸的独特能力。
发酵在20-40℃温度下进行，优选30℃。必须加入中和剂以稳定pH值。碳酸钙是优选的，因为它具有形成乳酸钙的特定特征，乳酸钙在4℃下沉淀，并能选择性地回收高纯度乳酸。
但是纯化乳酸的方法不是最优化的，因为该方法产生大量对环境有害的石膏。
美国专利5464760指出通常是无毒的并能直接发酵的食品废产品的充足供应，提供了大量和浓缩的用于各种需氧和厌氧细菌的碳和氮源。乳酸然后可以直接从乳清、糖甘蔗或制糖甜菜通过各种乳杆菌类型的乳酸菌，通过从玉米、马铃薯或大米中水解淀粉，然后用所述微生物进行生物转化而以高产率制得。
但是，必要的是使用乳酸菌的五种菌株的混合培养基并进行糖化和发酵。
淀粉被部分液化，然后经受特定的pH和温度条件，该条件能使葡糖淀粉酶同时作为乳酸菌而被引入。
但是不建议使用该解决方案，因为认为水解的淀粉，例如从马铃薯废料制得的马铃薯的水解产物，或从任何淀粉生产者得到的葡糖浆，通常含有最高5％的“糖杂质”，即戊糖、麦芽糖和寡糖，其在发酵结束时保持未使用，或被转化成其它副产物例如乙酸，这引起在随后纯化步骤中的问题。
仍然必要的是加入另一种基于有机和无机盐和酵母抽提物的营养素。
根据MOTOYOSHI等人在Appl.Environ.Microbiol，1986，52(2)，314-319中所述，甚至必要的是当在发酵培养基中形成乳酸时，通过连续电渗析除去乳酸，以避免所引入的微生物群体不平衡。
相似地，TIWARI等在Zbl.Bakt.II.Abt.Bd.，134，544-546(1970)中描述了使用含有保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、含有或不含戴尔布吕克氏乳杆菌的、以及含有稀释糖浆的混合培养基来生产乳酸。
该技术用于试图提高从糖浆制备乳酸的产率。
但是，该产率至多不超过57.9％，且菌株通常在其相应的生产容量方面互相干扰。
至于第二个解决方案，其包括对可更新的原料的特殊处理，美国专利3429777发明的一个目的是利用乳酸镁的突出特性，即从含有足够纯度的糖浆的发酵培养基中自发结晶，从而由所述乳酸镁生产高纯度的乳酸。
所以，与文献中所述的常用方法例如使用钙的方法相比，看来使用镁的方法较简单和较经济。但是，乳酸镁在“加糖的原液”中的纯度确实随着所用可更新的原料的性质和质量而变化，即使其质量比乳酸钙的质量好。
最后，第三个解决方案包括允许使用微生物和对引入发酵培养基的可更新原料进行处理。
例如，通常推荐淀粉作为便宜的碳源，但不是所有微生物能都对其起代谢作用，而大多数微生物能代谢葡萄糖。
所以，在FR2635534中所述的方法在至少一种糖化淀粉酶的存在下进行乳酸发酵，但其中没有公开任何从以这种方式处理的发酵培养基清除杂质的方法。
MANHEIM和CHERYAN在JAOCSS，69，12，1992中描述了可控地使用水解酶和用于分离特定的麦谷蛋白级分的膜技术。这些技术还可以推广到大豆。
为了促进从麦谷蛋白粉得到的蛋白质食品的更广泛应用，研究小组开发了使用蛋白酶来改进其部分功能性能。
但是，没有描述或暗示在发酵工业中使用这些蛋白质，或从所述发酵培养基制备容易纯化的代谢物。
其它策略没有显著改进发酵培养基，而是保证生产菌株的生长以加快微生物产生的速率和对乳酸高浓度的抵抗性。
为此目的的传统途径是生物量循环和固定细胞。
在这种情况下，乳酸必须在生成时被回收，以防止其抑制细菌的生长和产生。
各种与发酵组合的技术已用于从发酵培养基中连续地除去乳酸，即渗析、电渗析、离子交换树脂、两种颗粒的流化床生物反应器、反向渗透和液液萃取。
但是，培养基的成本则占总生产成本的30％以上。所以，价廉的营养素是必要的。
所以显然的是，已进行许多尝试来降低生产高纯度代谢物例如乳酸的成本。
但是，从上述讨论可见，仍然需要简单有效的通过发酵来生产易于提纯的代谢物的方法，且不需要使用许多复杂和昂贵的工艺步骤来制备发酵培养基或从发酵培养基回收所述代谢物。
所以，必要的是开发能清除所有杂质的发酵条件，这些杂质通常伴随着经济可行的代谢物的生产而产生且最重要的是使其纯化复杂化。
在乳酸的情况下，这些杂质意味着已经存在于可更新的原料中的D-乳酸和L-乳酸的外消旋混合物，以及所有上述在发酵结束时堵塞培养基的“糖杂质”。
                       发明概述
对于开发比现有方法对实际限制有更好的解决途径的方法，申请人已发现该目的可以通过这样的方法来实现，该方法包括通过酶催步骤和特定的分离步骤的组合来处理可更新的原料，其中酶催步骤用于从其中释放出能直接被微生物同化的碳源和氮源，特定的分离步骤通过微量过滤和纳米级过滤或电渗析来进行，以从培养基中除去可能改变要分离的代谢物的质量和能阻碍和/或使随后的纯化步骤复杂化的所有组分。
那么，申请人开发的方法可以有利地用于生产任何经济可行的代谢物，优选生产选自有机酸、维生素、氨基酸和抗生素的代谢物。
根据本发明的方法特别适用于制备选自有机酸的代谢物，优选L-乳酸。
如下所述，申请人开发的方法可以同样地用于生产经济可行的微生物群体，因为其提供没有可能污染所述群体的杂质或没有特定的生长抑制剂的发酵培养基。
本发明的从可更新的原料制备用于生产高纯度代谢物的发酵培养基的方法的特征在于其包括：
a)任选地处理所述的可更新的原料，以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源，并清除不溶性杂质，
b)独立地或组合使用选自纳米级过滤和电渗析的技术，以从所述可更新的原料除去低分子量杂质，而不改变能被直接同化的碳源的浓度，
c)对已通过上述方式除去低分子量杂质的原料进行处理，以便补充能被微生物直接同化的碳源或氮源，和
d)回收所得的发酵培养基。
                 具体实施方案的描述
本发明的第一步任选地包括处理可更新的原料，以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源，并从其中清除不溶性杂质。
上述处理可以根据可更新的原料的性质而变化。
在本发明方法的第一个实施方案中，可更新的原料选自生产淀粉例如从来自麦、玉米、木薯、马铃薯的淀粉所得到的副产物，或者加工大麦和豆等得到的副产物。
例如生产麦淀粉的副产物有利地用于生产L-乳酸，更特别是麦的溶解物(wheat solubles)，或玉米淀粉生产得到的副产物，更特别是玉米浆。
此处，可更新的原料含有淀粉作为剩余葡萄糖或碳的来源，和高分子量蛋白质、以及游离氨基酸和肽作为氮源。
但是，尽管认为一些微生物能直接同化淀粉或高分子量的蛋白质，以便其自身生长和生产经济可行的代谢物，因为它们具有必要的酶催设备来降解它们，但是其它微生物要求这样的条件，其中对碳和氢源进行处理，以使它们能被直接同化。
麦溶解物例如来自从在湿麦淀粉生产工艺中从淀粉分离得到的B麦淀粉的分离流。B淀粉也称作第二淀粉，基本上包括绝大部分比例的淀粉的小颗粒或受损颗粒，并含有杂质例如戊糖、蛋白质和类脂。
在这些淀粉的水解产物中发现这些杂质，其中一部分未被传统提纯和软化工艺所除去，所以使得B淀粉不适合生产例如食品级右旋糖。这些种类的B淀粉所以难以在工业上应用。
申请人建议将B淀粉加热到至少60℃的温度，并用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理B淀粉以便从其中释放出能发酵的糖，并任选地用能降解植物纤维的酶处理，选自半纤维素、果胶酶和木聚糖酶，如下所述。
对于直接从干物质含量为约9-10％的玉米秣得到的玉米浆，作为玉米浆基本组分的35-40重量％的蛋白质的缺点是难以被同化。
申请人已显示这些蛋白质可以用选自碱性蛋白酶的解蛋白酶在使得这些蛋白质易于在随后的发酵步骤中进行代谢的pH和温度条件下处理。可以有利地使用在pH为7、温度60℃下，以1％/干物质的速率处理约6小时的条件进行处理。
在本发明方法的第二个实施方案中，可更新的原料选自加工乳品、大麦、豆、糖甘蔗、制糖甜菜所得的副产品，独立地或组合使用。
例如，为了生产L-乳酸，有利的是选择从加工乳品得到的副产物，更特别是乳清，以及从加工制糖甜菜得到的副产物，更特别是糖浆。
在这里，所用的可更新的原料含有能更容易地被大多数微生物直接同化的碳源。
因此，制糖甜菜糖浆例如基本上含有蔗糖作为能被微生物直接同化的碳源来生产乳酸。
以相同的方式，乳糖作为乳清的基本糖化组分容易地被同化。
但是，这些蛋白质难以被一些微生物同化。
在使用加工乳品的副产物制备乳酸的情况下，例如，所以可以有利地在用微生物处理之前对从含有乳糖的乳品得到的初始副产物进行蛋白分解作用。
蛋白分解步骤形成对微生物生产乳酸有活化作用的肽。
从含有乳糖的乳品得到的原料可以是例如中性或酸性乳清，乳清的超过滤渗透物，乳糖、乳糖结晶源液，这些原料还可以含有丝胶蛋白或酪蛋白。
可用于蛋白水解的蛋白酶选自胰酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
根据所选择的可更新的原料，则必要的是从所述富含能被直接同化的碳或氮源的原料除去高分子量的不溶性杂质。
不溶性杂质大多数是纤维。
例如，不溶物有利地从麦溶解物中分离出来，该麦溶解物已通过本领域熟练技术人员公知的技术被用于液化或糖化的酶处理，例如离心和微量过滤，单独或组合使用，如下所述。
本发明方法的作为其基本特征之一的第二个步骤，包括处理原料，以便从中除去大多数低分子量杂质，而不改变能被直接同化的碳源的浓度，其中使用选自纳米级过滤和电渗析的技术，单独或组合使用。
申请人所以已克服了这样的技术偏见，即必须在发酵结束时对乳酸生产培养基进行纳米级过滤和/或电渗析，而不是对发酵培养基本身在用微生物培植之前进行。
基于可更新的原料的发酵培养基含有许多“低分子量杂质”，即，在本发明的公开内容中指妨碍由所述发酵培养基生产的代谢物的随后纯化步骤的小分子。
小分子可以是例如不能被微生物同化的糖的残余物，例如C5糖，这些残余物污染了发酵培养基。
它们还可以是有机酸，例如外消旋D-乳酸和L-乳酸，其在生产作为经济可行的代谢物的乳酸情况下，阻碍顺利地回收光学纯的乳酸。
常规用于除去这些小分子的技术是本领域技术人员公知的，包括例如膜过滤技术，或传统的电渗析，适用于所述低分子量杂质的尺寸范围。
但是，熟练技术人员通常不采用以上技术方案来处理发酵培养基，因为分离界限还导致除去能被微生物直接同化的、尺寸在杂质尺寸范围内的碳源。
如上所述，所有以上技术实际上已用于发酵培养基，不仅仅是在发酵结束时。
申请人所以已显示，与文献中的常规方法相比，这些膜过滤技术和更特别的是纳米级过滤，或传统的渗析技术能清除低分子量杂质，并惊奇地和未预料到的是，能在不改变能直接被微生物同化的碳源的含量的情况下进行过滤
由申请人进行的研究已确定了用于达到预期效果的上述技术的应用条件。
例如，为了从麦溶解物生产乳酸，申请人已显示通过使由本发明方法的前两个步骤制备的微量过滤液的干物质含量，对于纳米级过滤分离达到2-10％，优选约4％，如下所述，或对于电渗析处理达到5-30％的值，优选约20％，这样可以保持所有碳源不受影响，并除去基本上全部D-乳酸和L-乳酸的外消旋混合物。
例如，为了从经碱性蛋白酶处理的玉米浆生产乳酸，如在本发明方法的第一步所述，进行处理以达到1-16％的干物质，优选约2％，以及传统的电渗析处理，如在下面所述，也除去基本上所有D-乳酸和L-乳酸的外消旋混合物，而不会改变被直接同化的碳源的浓度。
本发明方法的第三步包括处理已除去低分子量杂质的原料，以补充能被微生物直接同化的碳或氮源。
已从中除去杂质的可更新原料的氮源例如可以在纳米级过滤步骤之后补充。
在麦溶解物的情况下，从纳米级过滤得到的保留物用ALCALASE碱性蛋白酶(来自NOVO)处理，以释放出肽。
在玉米浆的情况下，额外的碳源可以通过葡萄糖或通过根据本发明方法处理的可更新的原料来提供。
本发明的最后步骤包括将所转化的可更新的原料回收，并直接用作发酵培养基。
能被直接同化的碳和氮源的富集以及通过纳米级过滤膜或传统电渗析的便利分离技术进行不溶性杂质和低分子量杂质的清除，得到了完全适用于生产经济可行的代谢物的培养基，甚至用于生产已除去杂质的微生物群体。
在生产有机酸的特定情况下，更特别地是生产L-乳酸，得到能满足药物纯度标准(“United States Pharmacopeia”的热稳定性测试)并符合“Food Chemicals Codex”标准的光学纯的乳酸，只需要不超过有限数目的纯化步骤。
本发明的其它特征和优势将通过以下说明性和非限定性实施例表现出来。
实施例1
将从“B”麦淀粉的分离流中得到的并具有4％干物质的麦溶解物加热到60℃ 15小时，用NOVO的TERMAMYL LC α-淀粉酶以0.05％/干物质的速率和GENENCOR的OPTIDEX L 300 A糖化酶以1％/干物质的速率处理，以释放出可发酵的糖。通过微量过滤法在0.14微米膜上除去不溶物。
所得的具有3.3％干物质的滤液具有下表I所列的组成。
                   表I
    组分     重量％/干物质
    葡萄糖     40
    果糖     10
    半纤维素     17
    蛋白质     15
    D-乳酸和L-乳酸     10
    盐和脂肪     8
然后将微量过滤的滤液在配备有DL 2540纳米级过滤膜的2.5米2EURODIA实验组件上在约20巴压力下进行纳米级过滤；通过外部冷却将温度调节到30℃。渗透物含有0.3％干物质，并主要由1克/升的D-乳酸和L-乳酸以及约1克/升的C5糖(木糖和阿糖)组成。
保留物，在通过纳米级过滤浓缩4.5倍之后，含有16％干物质，并具有下表II所列的组成。
                   表II
    组分     重量％/干物质
    葡萄糖     43
    果糖     10
    半纤维素     20
    蛋白质     18
    D-乳酸和L-乳酸     2
    盐和脂肪     6
该步骤还从麦溶解物中显著清除了外消旋D-乳酸和L-乳酸。
半纤维素将在发酵结束时以生物量被除去，但其可有利地在纳米级过滤步骤之前用本领域熟练技术人员公知的内-和外-木聚糖酶进行水解。
纳米级过滤步骤之后，可以在以下条件下用蛋白酶处理，以释放出形成发酵培养基的能直接同化的碳源所必要的肽。所以在这种情况下，不加入来自外源的肽是必要的。
将pH调节至7，温度调节到60℃。来自NOVO的ALCALASE蛋白酶以1％/干物质的速率加入，并在60℃下培养4小时。
在用蛋白酶水解的步骤之后，该培养基通过加热到120℃ 10分钟来消毒，之后可以直接用作发酵培养基。
下表III列出了在可用容积为15升(其中含有13升具有16％干物质的麦溶解物，处理的和未处理的)的发酵桶中得到的D-乳酸和L-乳酸的组成。
包括7小时预培植的乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)菌株的1.5升培养基用于接种这些发酵桶。
pH值设定为6.5，并用12N的NH4OH调节。温度为40℃。
                      表III
纳米级过滤 ALCALASE处理 发酵时间(小时)至Glc＝0   L-乳酸(克/升)    D-乳酸(克/升)
    无     有     12     59     2.8
    有     无     50     59     0.5
    有     有     12     60     0.5
因此，对于通过纳米级过滤预处理的培养基，发酵培养基的最终组成只显示痕量的D-乳酸。
所以，如上处理的麦溶解物能确保有效地发酵成L-乳酸，且没有显著量的能妨碍随后纯化的杂质。
当用2.4升ALCALASE预处理培养基时，得到较高的产率。
实施例2
将从“B”麦淀粉的分离流中得到的并具有20％干物质的麦溶解物加热到60℃ 12小时，用NOVO的TERMAMYL LC α-淀粉酶以0.05％/干物质的速率，GENENCOR的OPTIDEX L 300 A糖化酶以1％/干物质的速率和GENENCOR的SPEZYME CP半纤维素以0.5％/干物质的速率处理，以释放出可发酵的糖。通过微量过滤法在0.14微米膜上除去不溶物。
所得的具有16％干物质的滤液具有下表IV所列的组成。
                   表IV
    组分     重量％/干物质
    葡萄糖     55.4
    果糖     8.5
    半纤维素     11
    蛋白质     6.4
    D-乳酸和L-乳酸     3.8
    盐和脂肪     6.3
然后将微量过滤液在配备有CMX-S阳离子或AMX SB阴离子交换膜的活性表面积为5.6米2的EUR6B EURODIA电渗析组件(NEOSEPTA-TOKUYAMA SODA)上按照产品说明书进行传统的电渗析处理，生成被稀释到13.6％干物质并具有下表V组成的级分。
                   表V
    组分     重量％/干物质
    总糖     90.5
    水解的蛋白质     7.5
    D-乳酸和L-乳酸     1.5
    盐和其它组分     0.5
该步骤还显著除去了被麦溶解物引入的外消旋D-乳酸和L-乳酸。
在该电渗析步骤之后，可以在以下条件下进行蛋白酶处理，以释放出形成发酵培养基的能直接同化的碳源所必要的肽。
所以在这种情况下，不加入来自外源的肽是必要的。将pH调节至7，温度调节到60℃。加入2.4升NOVO的1％/干物质的ALCALASE，并在60℃下培养4小时。
在用蛋白酶水解的步骤之后，该培养基通过加热到120℃ 10分钟来消毒，之后可以直接用作发酵培养基。
下表VI列出了在可用容积为15升(其中含有13升具有15％干物质的麦溶解物，处理的和未处理的)的发酵桶中得到的D-乳酸和L-乳酸的组成。包括7小时预培植的乳酸乳球菌菌株的1.5升培养基用于接种这些发酵桶。pH值设定为6.5，并用12N的NH4OH调节。温度为40℃。
                                表VI
  电渗析 ALCALASE处理 发酵时间(小时)至Glc＝0     L-乳酸(克/升)     D-乳酸(克/升)
    无     有     18     80     2.2
    有     有     22     80     0.8
因此，对于通过电渗析处理的培养基，发酵培养基的最终组成只显示痕量的D-乳酸。
所以，如上处理的麦溶解物能确保有效地发酵成L-乳酸，且没有显著量的能妨碍随后纯化步骤的杂质。
实施例3
从中间体玉米秣中得到的并具有3.3％干物质的玉米浆具有下表VII所列的组成。
                  表VII
    组分     重量％/干物质
    总糖     3
    蛋白质     38
    D-乳酸和L-乳酸     32
    盐和其它组分     27
因为玉米蛋白质难以同化，所以在pH为7和60℃下用1％/干物质的NOVO公司的ALCALASE预处理6小时。
然后将由此得到的水解产物在配备有CMX-S阳离子或AMX SB阴离子交换膜的活性表面积为5.6米2的EURODIA EUR6B电渗析组件(NEOSEPTA-TOKUYAMA SODA)上按照产品说明书进行传统的电渗析处理，生成被稀释到2％干物质并具有下表VIII组成的级分。
                 表VIII
    组分     重量％/干物质
    总糖     4
    水解的蛋白质     51
    D-乳酸和L-乳酸     3
    盐和其它组分     42
用ALCALASE进行预处理，并通过传统电渗析除去氨基酸，提供了在开始发酵时水解度为44的玉米蛋白水解产物，这由胺化氮与总氮量的比例确定，而未处理液体的水解度为36。
下表IX列出了在可用容积为15升(其中含有8.8升具有2％干物质的麦溶解物，处理的和未处理的)的发酵桶中得到的D-乳酸和L-乳酸的组成，向其中加入60克/升葡萄糖作为能被直接同化的碳源。
包括7小时预培植的乳酸乳球菌菌株的1.5升培养基用于接种这些发酵桶。
pH值设定为6.5，并用12N的NH4OH调节。温度为40℃。
                             表IX
  电渗析 ALCALASE处理 发酵时间(小时)至Glc＝0     L-乳酸(克/升)     D-乳酸(克/升)
    无     无     18     62     3.3
    有     无     18     59     0.2
    有     有     15     59     0.2
所以，通过电渗析预处理的玉米浆能确保有效地发酵成乳酸，且没有显著量的能妨碍随后纯化步骤的杂质。通过用ALCALASE预处理发酵培养基再次提高了产率。
实施例4
浓缩的制糖甜菜糖浆，再次稀释到10％干物质，通过传统的电渗析在与实施例2相同的条件下处理。
在电渗析之前，产品的干物质的组成列于下表X中。
                      表X
    组分     重量％/干物质
    糖(蔗糖)     66(95)
    蛋白质     14
    灰分     12
    有机酸     4
  其它组分(包括甜菜碱)     4
电渗析步骤制得具有5.3％干物质的溶液，其中糖的含量大于70％，蛋白质含量为约16％。
由此从发酵培养基中除去了大于90％的不需要的有机酸。
实施例5
在与实施例4相同的条件下，浓缩的制糖甜菜糖浆，再次稀释到20％干物质，在微量过滤之后通过传统的电渗析在与实施例2相同的条件下进行处理。
在电渗析之前，产品的干物质的组成列于下表XI中。
                      表XI
    组分     重量％/干物质
    糖(蔗糖)     65.4(95)
    蛋白质     11.7
    灰分     12.3
    有机酸     4.4
  其它组分(包括甜菜碱)     6.2
在这种情况下，电渗析步骤制得具有16.5％干物质的溶液，其中糖的含量大于70％，蛋白质含量为约11％。
由此从发酵培养基中除去了大于90％的不需要的有机酸。
制备了发酵培养基，其含有80克/升的糖浆、5克/升的(NH4)2SO4、2克/升的KH2PO4和0.5克/升的MgSO4，其中糖浆通过上述方式进行电渗析(培养基B)，或不经过电渗析(培养基A)。
这些生产培养基用10％ baker酵母(酿酒酵母，S.Cerevisiae)接种，得自在含有50克/升葡萄糖和5克/升酵母抽提物的培养基中预培植24小时。
用1N NaOH将pH调节到5，温度是30℃，生物量的生成在可用容积为15升的反应器中在600rpm搅拌下和1vvm通风下进行17小时。
下表XII和XIII列出了在制备培养基A和B中分别生产酿酒酵母的结果。
                    表XII
                                    培养基A
    时间 生物量   蔗糖   葡萄糖+果糖   EtOH     K     NH4     PO4
  (小时) (克/升) (克/升) (克/升)  (克/升)  (克/升)  (克/升)  (克/升)
    0     0.3     59     3.5     1.8     4.9     1.4     2.2
    2     0.6     54.4     3     2.3     Nd*     Nd     Nd
    4     1     52.1     4     3     Nd     Nd     Nd
    6     1.5     38.5     9.9     4.8     Nd     Nd     Nd
    8     2.4     24     15     6.9     Nd     Nd     Nd
    14     6.8     0     0     18.5     6.4     0.9     2
    17     7.4     0     0     16     Nd     Nd     Nd
*Nd＝未测
                                   表XIII
                                     培养基B
    时间   生物量   蔗糖   葡萄糖+果糖   EtOH     K     NH4     PO4
  (小时)  (克/升)  (克/升)  (克/升)  (克/升)     (克/升)   (克/升)   (克/升)
    0     0.3     63.2     0     1.8      1.2     1.3     1.3
    2     0.6     60.5     0     2       Nd     Nd     Nd
    4     1     57.9     0     2.8       Nd     Nd     Nd
    6     1.8     46.5     4     4.4       Nd     Nd     Nd
    8     3.1     33.7     9.9     7.1       Nd     Nd     Nd
    14     9.6     0     0     18.5       4     0.5     0.8
    17     11     0     0     17.5       Nd     Nd     Nd
从这些结果可见，在糖浆经过电渗析的培养基中，生长的初始速率是0.29小时-1，生物量产率是24％，而如果使用未电渗析的糖浆，生长的初始速率仅仅是0.26小时-1，生物量产率是17％。
所以可见，根据本发明方法对糖浆的处理非常适用于有效地生产酵母。
实施例6
乳清通过传统的电渗析在与实施例2相同的条件下进行处理。
具有6.6％干物质的乳清的初始组成列于下表XIV中。
        表XIV
    组分     重量％
    糖     71
    蛋白质     12
    有机酸     4
    盐     9
    脂肪     4
传统电渗析步骤制得具有4.3％干物质的溶液。糖的含量大于80％，蛋白质含量为约14％。所有污染性的有机酸被从培养基中除去。
实施例7乳清通过传统的电渗析在与实施例6相同的条件下进行处理。在这种情况下，初始乳清组成是16.2％干物质，列于下表XV中。
         表XV
    组分     重量％/干物质
    糖     69.2
    蛋白质     11
    有机酸     3.6
    盐     14.6
    脂肪     1.6
传统电渗析步骤制得具有14.6％干物质的溶液。糖的含量大于80％，蛋白质含量为约9％。所有污染性的有机酸被从培养基中除去。
以上述方式电渗析的乳清在以下条件下引入生物量生产培养基中，即乳酸酵素(乳链球菌streptococcus lactis)和酵母酵素(酿酒酵母)。
从在陪替氏培养皿中培养的群体中取出等“ose”当量的细胞，加入2升Erlenmeyer烧瓶中，其中含有500毫升生产培养基，由80克/升在150rpm搅拌下电渗析或未电渗析(对比)的乳清组成，对于酿酒酵母在需氧条件下温度为30℃，对于乳链球菌在厌氧条件下温度为40℃。
生物量的富集通过监测细胞数目来确定。
表XVI显示在培养24小时后得到的结果。
                    表XVI
    乳链球菌     酿酒酵母
经微量过滤的乳清     0     1.7×108
经微量过滤和电渗析的乳清     1.7×108     2.7×108
所以，根据本发明通过电渗析进行处理对于所测试的两种菌株的培养十分有效。在传统酵母的情况下，经电渗析的培养培养基制得基本上两倍的生物量，而在乳酸酵素的情况下，经微量过滤的乳清甚至含有能被电渗析清除的生长抑制剂。

Claims (10)

1.一种从可更新的原料制备用于生产高纯度代谢物的发酵培养基的方法，其特征在于该方法包括：
a)任选地，处理所述的可更新的原料，以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源，并清除不溶性杂质，
b)独立地或组合使用选自纳米级过滤和电渗析的技术，以从所述可更新的原料除去低分子量杂质，而不改变能被直接同化的碳源的浓度，
c)对通过上述方式已除去低分子量杂质的原料进行处理，以补充能被微生物直接同化的碳源或氮源，和
d)回收所得的发酵培养基。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于由发酵生成的代谢物选自有机酸、维生素、氨基酸和抗生素，优选有机酸。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述有机酸是L-乳酸。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于可更新的原料选自淀粉生产所得的副产物，优选来自麦、玉米、木薯、马铃薯的淀粉生产所得的副产物，或者加工大麦和豆所得的副产物，优选包括麦溶解物或玉米浆。
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于可更新的原料选自乳品、豆、糖甘蔗、制糖甜菜的加工所得的副产物，优选包括乳清或糖浆。
6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于可更新的原料富含碳源，该碳源能通过使用用于液化和糖化淀粉的酶和任选地用能降解植物纤维的酶而被微生物同化，选自半纤维素、果胶酶和木聚糖酶。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于选自碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的解蛋白酶用于使可更新的原料富含或补充能被同化的氮源。
8.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于加入葡萄糖以向可更新的原料补充能被同化的碳源。
9.通过根据权利要求1-8中任一项的方法得到的发酵培养基。
10.根据权利要求9的发酵培养基在生产微生物群体中的用途。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108841753A (zh) * 2018-07-09 2018-11-20 广州珍健生物科技有限公司 一种乳酸菌高密度发酵培养基、制备方法及其应用
CN109943603A (zh) * 2019-03-11 2019-06-28 内蒙古阜丰生物科技有限公司 一种氨基酸发酵生产方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2831552B1 (fr) * 2001-10-30 2004-08-27 Roquette Freres Procede de preparation d'un milieu de fermentation autosuffisant
WO2005010052A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-03 Cargill, Incorporated Enhanced steep-water
DE102004026152A1 (de) * 2004-05-28 2005-12-15 Basf Ag Fermentative Herstellung von Feinchemikalien
DE102005042541A1 (de) * 2005-09-07 2007-03-08 Basf Ag Fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte in fester Form
FI120590B (fi) * 2005-10-28 2009-12-15 Danisco Sweeteners Oy Erotusmenetelmä
DE102005056667A1 (de) * 2005-11-28 2007-05-31 Basf Ag Fermentative Herstellung organischer Verbindungen
DE102005056669A1 (de) * 2005-11-28 2007-05-31 Basf Ag Fermentative Herstellung organischer Verbindungen unter Einsatz Dextrin-haltiger Medien
DE102005056668A1 (de) * 2005-11-28 2007-05-31 Basf Ag Fermentative Herstellung organischer Verbindungen
DE102007017184A1 (de) 2007-04-12 2008-10-16 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur integrierten Verwertung der Energie- und Stoffinhalte von Hydrolysaten
CN102791872A (zh) * 2010-03-10 2012-11-21 东丽株式会社 精制糖水溶液的制造方法及化学品的制造方法
WO2012064868A2 (en) * 2010-11-09 2012-05-18 Suganit Systems, Inc. Ionic liquid recovery and purification in biomass treatment processes
CN102356899B (zh) * 2011-09-07 2012-11-28 中国食品发酵工业研究院 一种天然果蔬酵素饮料及其制备方法
CN102826649B (zh) * 2012-07-24 2015-04-15 同济大学 一种利用缓释固体碳源进行生物脱氮的方法
FR3027821B1 (fr) * 2014-10-31 2018-11-16 Centralesupelec Procede de purification d'oses.
FR3033332A1 (fr) 2015-03-02 2016-09-09 Etablissements J Soufflet Utilisation d'un complement nutritionnel dans la fabrication d'acide lactique
AU2016244742B2 (en) * 2015-04-10 2020-07-16 Comet Biorefining Inc. Methods and compositions for the treatment of cellulosic biomass and products produced thereby
JP6626869B2 (ja) * 2016-10-03 2019-12-25 株式会社バイオジェノミクス 善玉菌生産物質の製造方法及び食品
JP7341574B1 (ja) * 2023-03-23 2023-09-11 加藤化学株式会社 乳酸マグネシウムの製造方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4698303A (en) * 1985-02-15 1987-10-06 Engenics, Inc. Production of lactic acid by continuous fermentation using an inexpensive raw material and a simplified method of lactic acid purification
FR2635334B1 (fr) * 1988-08-10 1990-11-09 Rhone Poulenc Chimie Procede de production d'acide lactique par fermentation
WO1994013826A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 University Of Chicago Improved pre-treatment process for lactic acid production
US5681728A (en) * 1995-06-07 1997-10-28 Chronopol, Inc. Method and apparatus for the recovery and purification of organic acids
CN1097635C (zh) * 1996-12-23 2003-01-01 拉克塔斯坎有限公司 乳酸的发酵生产和分离
FR2791700B1 (fr) * 1999-04-02 2003-07-04 Roquette Freres Procede de fabrication d'un hydrolysat d'amidon a haute teneur en dextrose

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108841753A (zh) * 2018-07-09 2018-11-20 广州珍健生物科技有限公司 一种乳酸菌高密度发酵培养基、制备方法及其应用
CN109943603A (zh) * 2019-03-11 2019-06-28 内蒙古阜丰生物科技有限公司 一种氨基酸发酵生产方法

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