KR100586105B1

KR100586105B1 - 저ｐＨ 락트산 발효법

Info

Publication number: KR100586105B1
Application number: KR1020007003568A
Authority: KR
Inventors: 팅류 칼슨; 유진막스주니어 피터스
Original assignee: 카르길,인코포레이티드
Priority date: 1997-10-14
Filing date: 1998-10-13
Publication date: 2006-06-02
Also published as: NO20001764D0; CN1276016A; ES2313754T3; CN100467608C; NO320889B1; EP1930408A2; ID25625A; NZ504345A; EP1025254A1; EP1025254B1; JP2001520018A; AU754069B2; BR9814072A; WO1999019503A1; KR20010030876A; US20060094093A1; EP1930408A3; AU9800698A; NO20001764L; ATE399874T1

Abstract

내산성 호모락트산세균 같은 내산성락트산염 생성미생물을 영양배지내에서 배양하여 유리락트산 농도가 큰 발효액을 생성하는 것을 포함하는 락트산제조방법을 제공한다. 또한 고농도 유리락트산을 생성할 수 있는 내산성 호모락트산세균도 분리제공한다.

Description

저ｐＨ 락트산 발효법{LOW PH LACTIC ACID FERMENTATION}

락트산과 그 염은 오랫동안 화학공업, 화장품 및 제약분야에서 광범위하게 활용되어왔다. 근래에는, 생분해성 락티드고분자 같은 락트산염에 기초한 생명공학 신물질이 대두되면서 락트산염 특히 유리산형태의 L- 이나 D-락트산염에 대한 수요가 폭발적으로 증가하였다. 다양한 공업적 고분자의 제조에서의 락트산 이용은 미국특허 5,142,023; 5,247,058; 5,258,488; 5,357,035; 5,338,822; 5,446,123; 5,539,081; 5,525,706; 5,475,080; 5,359,026; 5,484,881; 5,585,191; 5,536,807; 5,247,059; 5,274,073; 5,510,526; 또한 5,594,095 등에서 공지되었다.

화학공정에 따라 락트산을 제조할 수 있으나, 석유화학 공급원료의 원가상승 및 종래의 화학방법에 의해 제조된 라세미체 락트산염의 용해필요성 때문에 광학이성체 중 하나가 풍부한 락트산염의 제조에 있어서 발효방법이 적합한 대안으로 제시되고 있다. 생분해성 락티드고분자를 제조하는데 이용되는 방법은 일반적으로 출발물질로서 유리산형태의 L- 또는 D-락트산염을 써야한다.

유감스럽게도, 대부분 유기산발효법을 이용할 경우, 유기산(이경우는 락트산)에 의한 최종생성물 억제현상이 효과적인 발효에 큰 장애물이 된다. 락트산염 발효에 통상 이용되는 박테리아균주는 일반적으로 락트산염농도 이외에도 저pH값에 의해서도 저해되기 쉽다. 이문제를 해결하기위해, 공업적 락트산염 발효공정은 통상 적어도 약 5.0이상 또한 대개는 6.0이나 그이상의 pH값에서 실행된다. 이결과 원칙적으로 모두 염형태로 존재하는 락트산염 생성물을 제조하게된다. 보통은 양이온형 카운터이온(counterion)을 제거하고 원하는 유리락트산을 분리하는데 또다른 처리단계가 필요하다. 또한 고농도의 염 즉, 나트륨양이온 등이 발효를 억제하는 영향을 미치기도 하므로 염의 종류 및/또는 양 역시 발효반응효과에 영향을 미칠 수 있다.

락토바실러스 아밀로보루스(lactobacillus amylovorus)균을 이용하여 효소-희박성 콘스타치에서 라세미화 락트산염을 제조하는 것은 발표된 바 있다(Cheng et al., J. Ind Microbiol., 7:27-34(1991)). pH4.2 정도의 낮은 pH값에서 비교적 다량 생산되는 것으로 알려졌으나 이 발효방법으로 얻은 락트산염에는 어느쪽 광학이성체도 풍부하지 않다.

락트산염 발효효율을 개선하기 위한 접근은 다수 있었다. 이러한 접근중에는 연속적으로 발효액(broth)으로부터 유리락트산을 제거하는 것도 포함된다. 예를들어, 전기투석법은 발효액으로부터 락트산염을 제거하여 최종생성물 억제현상을축소시키는데 이용되었다. 저락트산염 농도구배와 고가의 투석막을 이용해야하므로 이 접근에 대한 관심은 줄어들었다. 이온교환 및 폴리비닐피리딘을 이용하여 발효매질에서 락트산염을 제거하는 것도 발표된 바 있다. 최근에 발표된 또다른 방법으로서 다단계 추출방법도 있다. 이 방법은 3차아민을 이용하여 발효액으로부터 락트산염을 추출하는 것으로서 이는 발효액의 pH가 추후의 락트산염 생산과정을 저해할 정도의 값으로 떨어지지않도록 방지하기 위한 시도이다. 이 방법을 통해 달성된 락트산염 생산수준은 그러나 아직까지 상당히 낮다. 또한 이 방법을 활용하려면 추출된 발효액을 발효반응에 귀환시키기에 앞서서 3차아민 추출제의 잔류농도를 낮추기 위해 추출된 발효액은 적어도 제2의 추출과정을 거쳐야 한다.
미국특허 4,769,329(Cooper et al.)는 pH4 내지 6에서 락토바실러스를 이용하여 발효시켜 광학적으로 순수한 D- 또는 L- 락트산을 제조하는 방법을 개시한다. 그러나 Cooper et al.은 낮은 pH에서 고수율을 얻는 것에 관해서는 제시하지 않았다.
일본특허 87 44 188은 pH4.5 내지 7.0의 낮은 pH값에서 101g/L의 농도로 광학적으로 활성인 락트산을 제조하는 방법을 개시한다.
일본특허 92 271 787은 pH8.0에서 I-생성 슈도모나스를 1,2-프로판디올 함유 배지에서 배양하여 D-락트산을 제조하는 방법을 발표한다. 발효가 끝난 뒤 배양물을 황산으로 pH 2.0까지 산성화시켜 21g/L의 D-락트산을 수득한다.
유럽특허 0 308 064는 락토바실러스로 토마토 음료수를 발효시켜 제조한 개선된 토마토 음료수를 개시한다. 그러나 상기의 발효방법으로 수득된 락트산의 수율이나 광학순도에 대해 논의된 부분은 없다.
영국특허 2 251 864는 pH3.4 내지 4.2에서 우유를 함유한 배지에 락토바실러스 혼합물을 배양하여 수득한 저온안정성 락토바실러스 내산성균주를 개시한다. 그러나 여기에는 저온안정성 락토바실러스에서 수득한 락트산의 수율이나 광학순도에 대한 내용이 없다.
독일특허 27 00 644 (영국특허 1547063과 동일함)는 pH4 내지 4.7의 배지에서 락트산형성을 위한 내산성 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis)세균 혹은 류코노스톡 세균을 이용하여 식물 및/또는 동물 유래의 물질을 발효처리하여 가축이나 농장의 동물을 위한 사료를 제조하는 방법을 발표하였다. 역시 특정한 pH값에서의 락트산의 수율은 설명하지 않았다.

락토바실러스의 발효에 기초하여 락트산을 유리산형태로써 생성하기 위한 상기의 접근은 모두 하나이상의 단점을 가지고 있다. 산에 대한 내성이 더 큰 미생물의 발효에 기초한 또다른 접근방법도 발표되었다. 사카로마이세스 세레비시에(Saccaromyces cerevisiae) 같은 이스트류는 락토바실러스보다 훨씬 낮은 pH값에서도 성장할 수 있다. 재조합이스트균주는 박테리아(락토바실러스) 혹은 포유동물(소) 기원의 탈수소효소 유전자를 사카로마이세스 세레비시에속에 삽입하여 생성했다. 재조합 이스트균주는 락트산의 pK_a (약 3.8)이거나 이보다 낮은 락트산염을 제조할 수 있는 것으로 보고되었다. 그러나 이 재조합 이스트균주에 의해 발생된 주요 발효생성물은 에탄올이다. 이것은 락트산염 생산효율을 낮추고 또한 유리락트산의 분리 및 정제에 관한 또다른 잠재적인 문제를 일으킨다. 펠릿형 진균류인 리조푸스 오르지자에(Rhizopus orgyzae)에 의한 락트산제조도 발표되었다. 이 진균발효는 또한 전형적으로 주요부산물인 글리세롤 및/또는 에탄올을 생성한다. 유리락트산은 폴리비닐피리딘("PVP")컬럼을 이용하여 발효액으로부터 연속제거함으로써 최적의 수율을 달성하였다. 리조푸스/PVP방법을 이용할 때 저발효pH에서 약 25g/L 보다 큰 락트산염 농도는 나타나지 않았다.

본 발명은 발효를 통한 락트산염 제조에 관계한다. 특히 내산성 락트산염 제조를 위한 미생물 즉 내산성세균을 이용하여 고유리산농도의 발효액을 제조할 수 있는 발효방법에 관계한다. 고유리산농도는 유리산형태의 락트산염을 발효액으로부터 분리하는데 필요한 하행류처리를 촉진할 수 있다.

일반적으로 발효액(혹은 기타의 락트산/락트산염 혼합물)이 약 4.8 이하의 pH값(바람직하게는 4.5 더 바람직하게는 pH4.3 이하, 통상 pH3.5 내지 4.2)를 갖도로 처리하면 전체효율이 우수한 공정을 개발할 수 있으며 여기서 생성된 락트산은 고분자제조에 이용할 수 있고 필요시 회수된 락트산염을 완충제로써 발효장치에 재순환시키거나 혹은 별도로 pH제어를 위해 이용한다.

락트산을 제조하기위해 여기서 도입한 방법은 내산성 락트산염 생성을 위한 미생물 즉, 내산성 호모락트산형 락토바실러스를 락트산염 생성물 대부분을 유리산형태로서 제공할 pH값 조건하에 영양배지속에서 증식배양하는 것을 포함한다. 여기서, "내산성"이란 박테리아에 관련하여 사용될 때 락트산염 생성물 대부분을 유리산형태로 제공하기에 충분한 pH값에서 락트산염을 제조할 수 있는 박테리아를 말한다. 내산성 박테리아는 또한 "평균배양pH"가 4.2를 넘지않는 조건하에 영양배지속에서 적어도 약 50g/L의 락트산염 (즉, 총 50g/L의 락트산염)을 생성할 수 있다.

만일 발효처리를 락트산염 한계농도에 도달하는 값에서 실행하지 않을 경우, "평균배양pH"는 전체 발효기간에 걸쳐 10등분이상의 시간간격으로 측정한 pH값의 평균치에 근거하여 결정한다. 본 발명의 발효처리법은 연속식으로 진행된다. 이 러한 조건에서, 정상상태 조건(pH, 락트산염 농도 및 영양물농도에 대한)은 최초개시단계를 결정한 후 달성 및 유지된다. 이 방식대로 발효할 때 평균배양pH는 최초개시단계가 종료된 후의 발효액 평균pH이며 즉, 평균배양pH를 결정함에 있어서 개시단계의 pH를 무시한다.

pH 및/또는 락트산농도가 락트산염 생산을 저해하는 값에서 발효처리할 경우 "평균배양pH"는 90%의 락트산염제한농도를 생성하는데 필요한 기간동안 10등분이상의 시간간격으로 측정한 pH값의 평균치에 기초하여 결정한다. 여기서, "락트산염제한농도"란 발효에 의해 형성된 pH값 및/또는 락트산농도가 추후의 락트산염 생성을 저해할 특정한 배양조건(영양배지, 온도, 폭기도 등)하에서의 락트산염농도를 뜻한다. 또한 "배양제한pH"는 pH값 및/또는 락트산농도가 추후의 락트산염 생성을 저해할 특정한 배양조건에 적합한 발효액의 pH를 의미한다. 락트산염 생성의 저해는 제조된 락트산염의 양이 동일조건하에서 최고 약 12시간까지의 기간동안 추후배양시 3%를 초과하여 증가하지 않을 때 발생하는 것으로 생각된다. 이 정의는 락트산염 생성에 충분한 영양물이 아직 발효액속에 남아있다고 가정한 것이다.

"영양배지"와 "발효액"은 서로 중복하여 사용되는 용어다. 이것은 (i) 영양공급원으로서 내산성세균에 초기제공되는 형태의 배지 및 (ii) 초기제공된 영양물 전체 혹은 일부가 소모되고 또한 락트산염을 포함한 발효생성물이 세균에 의해 배지속으로 분비된 후 생성된 배지이다.

본 발명의 방법에서, 내산성세균을 배양하여 락트산염을 생성한 후의 발효액의 pH는 전형적으로 약 4.2를 넘지않는다 ("최종배양 pH"). 여기서 설명한 바와 같이, "최종배양 pH"는 내산성 세균에 의한 성장 및/또는 락트산염 제조가 중단되는 시점의 발효액의 pH이다. 성장 및/또는 락트산염제조의 중단은 반응온도변화, 발효액내 하나 이상의 필수영양소 고갈, pH의 점진적인 변화, 또는 세균세포로부터 발효액의 분리 등의 결과로 일어나기도 한다. 충분한 양의 산 혹은 염기를 발효액에 첨가하여 발효과정을 억제하고 이에 의해 락트산염 제조가 중단되는 경우, 최종배양 pH는 첨가 직전의 영양배지의 pH값으로 정의한다. 또는 성장 및/또는 락트산염 제조가 하나 이상의 발효생성물의 축적 및/또는 발효생성물 축적결과로 생긴 발효액pH의 변화로 인해 중단되기도 한다. 즉, 발효반응은 특정 배양조건에 있어서의 자체 한계점에 도달했다. 상술한 바와 같이, 최종생성물 억제를 위해 락트산 같은 유기산을 생성하는 세균 발효방법은 널리 공지되어 있다.

여기서의 "락트산염"은 유리산이나 염형태의 2-히드록시프로피오네이트 (즉, "전체 락트산염")을 말한다. "락트산" 및 "유리락트산"은 서로 중복해서 사용하며 산형태 즉, 2-히드록시프로피온산을 말한다. 염형태 즉 락트산염은 특별히 락트산염으로서 락트산의 나트륨염 혹은 락트산나트륨을 말한다.

본 발명은 또한 내산성 호모락트산세균을 제공한다. 내산성 호모락트산세균은 일반적으로 적어도 40℃의 배양온도에서 약 25g/L 유리락트산을 제조할 수 있다.

본 발명의 내산성세균의 또다른 구현은 약 40℃ 이상의 온도와 pH4.2를 넘지않는 평균배양pH에서 약 50g/L을 제조할 수 있다. 전형적으로, 내산성세균은 상기 두가지의 락트산염 생산량 측정값을 만족할 수 있다.

도 1은 유리락트산 결합제거를 포함한 발효공정을 보여주는 개략적인 흐름도.

도 2는 콘침지수에서 분리한 다수의 락트산염 생성박테리아균주에 대한 리보형패턴을 보여주는 그래프,

도 3은 10부피% 콘침지액, 100g/L 글루코스 및 33.4g/L 탄산칼슘을 함유하는 영양배지내 균주#41의 배양에 대한 글루코스, 프룩토스 및 락트산염의 발효프로파일을 보여주는 그래프.

도 4는 90g/L 글루코스, 33.4g/L 탄산칼슘 및 12부피% 콘침지액이나 36부피% 콘침지희석액을 함유하는 영양배지내 균주#41의 배양에 의한 락트산염생성을 보여주는 그래프.

도 5는 90g/L 글루코스, 36.6g/L 탄산칼슘 및 변화량의 콘침지수를 함유하는 영양배지내 호모락트산 균주#41의 배양에 대한 글루코스, 프룩토스 및 락트산염의 발효프로파일을 보여주는 그래프.

도 6은 결합되지않은(유리형)락트산과 pH값의 함수관계를 보여주는 그래프.

세균학적 체계에 따라 5.0이하, 바람직하게는 4.8 이하로서 통상 3.5 내지 4.5의 pH값을 갖는 락트산용액을 제조하면 락트산형태의 락스탄염물질의 생성비율이 증가한다. 락트산염이 아닌 락트산형태의 생성물이 발효공정에서 다량 생성되는 것이 유리한 이유는 후속공정단계 즉 산성화 및/또는 "염 제거"단계가 필요없기 때문이다. 즉, 다량의 물질이 유리락트산 형태로 생성될 경우 락트산염으로부터 락트산을 수득하기 위한 추가처리공정이나 이에 수반되는 비용등을 줄이거나 없앨 수 있다. 산성화처리를 실행하는 경우라도 높은 산계를 수반하는 경우보다 휠씬 적은 양의 산만 첨가하면된다.

일반적으로, pH4.8이하 (바람직하게는 pH4.5이하, 더 바람직하게는 pH4.3이하 특히 3.5 내지 4.2)에서의 발효액을 제공하는 공정이 있을 경우 전체효율이 우수한 공정을 개발할 수 있으며 여기서 생성된 락트산은 고분자제조에 사용되고 또한 회수된 락트산염은 완충제 등으로 이용하여 발효장치로 돌려보내거나 pH제어에 이용할 수 있다.

본 발명은 락트산염의 효율적제조 및 특히 내산성 호모락트산세균을 적절한 영양배지내에서 배양하여 고농도 유리락트산을 효율적으로 제조할 수 있게해준다.내산성 호모락트산세균은 통상의 옥수수제분공장의 콘침지수(corn steep water)로부터 분리할 수 있다. 라세미형 락트산염, 혹은 D-나 L-이성체형의 락트산염을 생성하는 다양한 세균종류가 있으며, 본 발명은 L-이나 D-락트산염 및 더 바람직하게는 광학적순수형 L-락트산염을 생성할 호모락트산세균을 이용한다.

본 발명의 방법은 유리산 형태의 고농도 락트산 광학이성체를 효율적으로 생성할 수 있다. 발효액내의 유리락트산 농도는 전체 생성율을 측정하는 한가지 방법이다. 본 발명의 방법은 통상 적어도 25g/L, 바람직하게는 30g/L 또한 더 바람직하게는 적어도 40g/L 유리락트산을 함유하는 용액을 만든다. 생성된 락트산염( 및 유리락트산)의 광학순도는 적어도 50%이상, 바람직하게는 80% 이상 더 바람직하 게는 하나의 락트산염 광학이성체가 유일한 순수형태로 생성된다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 락트산염은 L-락트산염 형태가 우세하다. 예컨대, 본 발명의 한가지 구현에서 영양배지내에 내산성 호모락트산세균을 배양하여 적어도 75중량% L-락트산염(즉, 적어도 50% 이상의 광학순도를 갖는 L-락트산염)을 포함하는 락트산염을 제조하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서 생성된 락트산염의 광학순도는 적어도 80%이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상이다 (즉, 적어도 약 95중량%의 L-락트산염을 포함한다). 더 바람직하게는, 본 발명의 방법은 광학순수형태의 L- 또는 D-락트산염을 제조할 수 있다 (즉, 제조된 락트산염은 99중량% 이상의 단일형 광학이성체를 함유한다).

발효액의 pH값이 3.0 내지 4.5인 경우 결합형태의 락트산이 다량 존재한다. (도6 참조). pH3.0이면 락트산염이온에 대한 유리락트산(결합형태)의 몰비는 25℃에서 약 7.0이며 pH4.5일 때는 역시 25℃에서 약 0.23이다. 용액에 함유된 총 락트산 양은 용액의 pH값과 또한 혼합물내 락트산염 총농도에 관한 함수이다. 따라서, 발효액 같은 주어진 용액에서 이 두가지 변수를 규정할 수 있다면 유리락트산 농도를 결정할 수 있다. 본 발명은 또한 적어도 50g/L 바람직하게는 80g/L이나 더 바람직하게는 약 100g/L의 락트산염을 비교적 낮은 pH로 포함하는 용액을 제조할 수 있다. 용액의 pH가 낮으면 유리산형태로 존재하는 락트산염의 백분율은 커진다. 예를들어, 중간pH가 락트산의 pK_a(약 3.8)와 같으면 50%의 락트산염이 유리산형태로 존재한다. pH4.2에서는 약 31%의 락트산염이 유리산으로 또한 pH4.0 및 3.9일때는 각각 락트산염의 41% 및 47%가 유리산형태로 존재한다. 유리락트산의 비율은 고pH에서도 낮으며 pH4.5일 때 18% 및 pH5.0일 때 6.6%이다.

배양단계에서 발효액의 pH는 다양한 방식으로 표현할 수 있다 즉, 평균배양pH이거나 최종배양pH에 관하여 표시할 수 있다. 본 발명의 발효방법은 평균배양pH가 약 4.3을 넘지않을 때, 바람직하게는 4.2를 넘지않거나 더바람직하게는 4.0을 넘지않을 때 고수준의 락트산염을 제조할 수 있다. 별도로, 배양시 발효액의 pH를 최종배양pH에 관하여 표시할 수 있다. 본 발명의 방법은 통상 pH4.2이하 더 바람직하게는 pH4.0이하 특히 pH3.9이하의 최종배양pH에서는 고락트산염 농도로 제조할 수 있다. 특히 효과적인 본 발명 발효방법의 구현은 평균배양pH가 4.0을 넘지 않고 또한/또는 최종배양pH가 약 3.9일 때 적어도 80g/L의 락트산염을 제조할 수 있다.

본 발명의 발효방법은 발효액 일부성분이 발효진행시 제거되는 연속식으로 실행한다. 충분한양의 영양배지를 반응기에 정상적으로 첨가하여 일정한 액체부피를 유지한다. 상기의 발효조건에서, 초기개시단계가 완료된후 정상상태조건(pH, 락트산염농도 및 영양물농도)에 도달하여 유지된다. 이 방식으로 발효를 실행할 때, 배양액의 평균배양pH(개시단계의 pH는 무시한다)와 최종배양pH는 기본적으로 동일하다. 이러한 조건에서, 발효는 pH4.2를 넘지않는 값에서 통상 실행되며 더 바람직하게는 약 pH4.0 특히 바람직하게는 약pH3.9를 넘지않는 한도에서 실행된다.

본 배양방법을 약 30℃ 내지 38℃ 정도의 비교적 낮은 온도에서 실행해도 좋으나 내산성 호모락트산세균은 적어도 약 43℃, 더 바람직하게는 45℃ 내지 52℃에 서 적절한 영양배지내에서 배양된다. 가장 바람직하게는 47℃ 내지 50℃에서 발효하는 것이다. 상기의 온도에서 발효반응을 조작하는 것은 여러가지로 유리하다. 이 온도에서는 다른 경쟁미생물의 성장으로인한 복잡성이 줄어든다. 또한, 고온에서 반응은 처리장치의 효율적인 이용이 가능한 더 빠른속도로 진행된다. 54℃ 이상의 지나치게 높은 온도에서 발효가 진행되면 호모락트산세균에 의한 성장 및/또는 락트산염 생성은 무시할 수 있다. 그러나 표준선별방법을 이용하면 55℃ 이상의 온도에서 성장 및/또는 락트산염 생성을 가능하게하는 돌연변이형 호모락트산세균을 확인할 수 있다.

상술한 "영양배지"는 본 발명의 세균성장에 필요한 무기물 및 이들의 염을 포함한 수성조성물을 말한다. 영양배지는 통상 효과량의 탄소공급원, 질소공급원, 인산염공급원, 황산염공급원, 칼슘공급원 및 흔적량의 원소 등을 포함한다. 여기서 흔적량의 원소라 함은 1퍼센트의 10분의 1(1000ppm 이하)에 해당하는 흔적량의 필수성장원소를 말한다.

본 발명의 세균은 통상 다수의 탄소 및 에너지원을 성장 및 락트산염 생성에 활용하며 예를들면, 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 멜리비오스, 수크로스, 라피노스 및/또는 스타치오스 등이 있다. 세균중 일부는 탄소 및 에너지공급원으로 모두 혹은 대부분 설탕을 사용하며 반면에 다른 균주는 더욱 빨리 또한 열거된 것 중 1 또는 2개의 설탕에서만 성장할 수 있다. 다른 예에서, 전분(옥수수전분 등)이나 이것의 가수분해물을 1차 탄수화물공급원으로 이용하기도 한다.

여기서 "콘침지수"는 콘침지탱크에서 나온 액과 또한 이로부터 유도된 동일한 스펙트럼의 영양소를 함유한 다른용액을 말한다. 예를들어, 콘침지액(혹은 "농후침지액" 이라고도 함)은 물이나 기타 휘발성분을 진공제거한 후 수득한 농축형태의 콘침지수를 말한다. 콘침지액은 보통 건조 고형물 함량이 약 35중량% 내지 50중량%이며 본 실시예에서 설명한 실험에서 사용된 콘침지액은 건조 고형물 함량이 36중량%로서 "CSL"라고 한다. 농축전 콘침지탱크나 연결관에서 직접수득한 콘침지수는 보통 건조 고형물함량이 10 내지 15중량%이며 "희석침지수"("LSW")라고 한다. 희석침지수는 SO₂ 함량이 약 500ppm을 넘지않는 것이다. 본 발명의 방법에서 사용된 영양배지를 보충하기위한 침지수는 SO₂함량이 약 300ppm을 넘지않는 것이 바람직하며 더 바람직하게는 200ppm을 넘지않아야한다. 본 실시예에서 설명한 실험에서 이용된 희석침지수는 건조 고형물함량이 12중량%이었다.

콘침지수에서 분리된 하나이상의 호모락트산균주를 사용하여 락트산염을 생성하는 경우, 영양배지는 적어도 약 15g/L침지수의 건조 고형물에 상응하는 콘침지수를 함유한다. 바람직하게는, 영양배지는 적어도 25g/L, 바람직하게는 적어도 30g/L침지수의 건조 고형물에 상응하는 콘침지수를 포함한다.

본 발효방법에서 사용하기 위한 적합한 영양배지의 한가지 예로서 MRS배지(Becton Dickinson & Co.사 제품인 MRS배지 등)가 있다. MRS배지는 일반적으로 콘침지수로 보충하여 질소공급원 및 기타 일반적인 영양소 공급원을 제공하고 또한 탄소와 에너지 공급원인 탄수화물을 더 보충할 수도 있다. 본 발효방법에 사용하기 적합한 베지는 또한 마그네슘염, 망간염, 인산염, 칼륨염 및/또는 시트르산염 등도 포함한다. 그러나, 특정량의 염을 배지에 첨가할 필요는 없다. 영양배지는 또한 소르비탄의 폴리옥시에틸렌 유도체의 지방산모노에스테르 같은 비이온형 계면활성제도 포함할 수 있다 (예; 트윈^R80, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노올레이트)

배지는 각종 무기성분 각각의 공급원인 각각의 염류를 이용하여 제조하기도 한다. 또한, 한가지 성분 이상의 공급원으로서 작용하는 단일염을 영양배지를 제조하기위해 사용할 수도 있다. 예를들어 인산수소칼륨(K₂HPO₄)를 칼륨양이온과 인산염음이온 양측의 공급원으로 첨가할 수도 있다. 각종성분을 영양배지제조시 물에 용해시킨 후 용해된 염중의 존재하는 양이온 및 음이온의 교환반응이 일어난다. 예를들어, 황산마그네슘과 시트르산암모늄을 배지 제조시 물에 첨가하는 경우 그 결과로 나온 용액에는 또한 황산마그네슘 및 시트르산암모늄 종류 이외에도 황산암모늄 및 시트르산마그네슘을 일부 포함할 것이다. 본 발명의 발효방법에서 사용하기에 적합한 영양배지중 한가지는 글루코스 및/또는 프룩토스가 보충된 콘침지수를 또다른 탄소 및 에너지원으로 포함한다.

본 발명에서 사용하기 적합한 배지중 한가지 예는:

30 내지 45g/L의 침지수 건조 고형물 함량에 상응하는 콘침지수;

80 내지 120g/L의 글루코스, 프룩토스 혹은 그 혼합물;

0 내지 10g/L 이스트추출물;

트윈^R80 등의 0 내지 1g/L의 비이온성 계면활성제;

0 내지 2g/L의 인산수소칼륨(K₂HPO₄);

0 내지 0.2g/L의 황산마그네슘(MgSO₄);

0 내지 0.05g/L의 황산망간(MnSO₄);

0 내지 2g/L의 시트르산암모늄; 또한 특별한 경우

10 내지 50g/L의 탄산칼슘(CaCO₃)을 포함한다.

상술한 이유에 의해, 배지를 형성하기 위해 첨가된 각 물질의 분량을 양이라고 하며 영양배지에 함유된 성분들의 실제농도와는 관계없다. 이러한 영양배지의 제조에서 비이온성계면활성제 및 탄산칼슘을 제외한 모든 성분들은 대체로 적정량의 물속에 용해되어 있으며 압력용기내에서 멸균처리하였다. 비이온성계면활성제는 정상적으로 오토클레이브처리된 배지에 첨가되며 아직은 100℃ 정도에 가까운온도로 유지된 상태이다. 그결과로 나온 용액은 통상 약 60℃ 이하의 온도로 냉각한 뒤후 탄산칼슘을 여기에 첨가한다.

적절한 본 발명의 영양배지는 적어도 50g/L의 탄수화물을 포함하는 것을 밝혀졌다. 더 바람직하게, 영양배지는 적어도 70g/L 더 바람직하게는 적어도 약 90g/L의 탄수화물을 포함한다. 탄수화물은 일반적으로 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 멜리비오스, 수크로스, 라피노스, 스타치오스 혹은 그 혼합물로 구성된다. 글루코스, 프룩토스 및 수크로스는 특히 탄소에너지공급원으로 영양배지에 사용하기에 적합하다. 일반적으로 150g/L 이상의 탄수화물을 배지에 첨가하는 것은 유용하지않다.

탄산칼슘(CaCO₃), 수산화나트륨(NaOH), 수산화암모늄(NH₄OH) 및/또는 중탄산나트륨(NaHCO₃)를 포함하는 것이 유리하다고 밝혀졌다. 보통은 적어도 약 30g/L 의 탄산칼슘(혹은 또다른 균등량의 염기)를 영양배지에 첨가한다. 본 발명의 구현 즉, 고농도의 락트산염을 제조하기 위한 구현에서 영양배지내 약 40g/L까지의 탄산칼슘을 포함하는 것이 바람직하다. 더 고농도 염기를 이용할 경우 탄산칼슘염의 용해도 제한성 및 비교적 낮은 발효액pH값을 유지할 필요가 있기 때문에 100g/L 이상의 탄산칼슘을 배지에 첨가하는 것은 그리 바람직하지 않다. 전체 탄산칼슘함유량이 영양배지에 처음부터 모두 용해되는 경우는 흔하지않다. 발효가 진행되면서 탄산칼슘중 일부가 락트산과 반응하여 락트산칼슘을 형성하기도 한다. 이 경우 또다른 불용의 탄산칼슘을 용액에 공급하여 용해시키기도한다. 형성되는 락트산의 일부를 중화시키고 발효액의 pH값이 적정수준 아래(약 3.8-3.9 미만)로 떨어지지 않도록 방지하는 것이 전체적인 효과이다.

이 효과를 얻기위해 탄산칼슘 같은 염기를 첨가해야만 하는 것은 아니다. 락트산염(락트산칼슘, 나트륨 혹은 암모늄 등)을 함유하는 용액이 발효액의 pH값을 완충시킬 보조물로 첨가되기도 한다. 이러한 공정의 한가지 예는 배양세균으로부터 발효액의 일부를 분리하고, 이 일부에서 유리락트산을 부분 혹은 모두 분리한 후 다시 발효과정에 되돌려보내는 단계를 포함하는 것이다. 혹은 별도로, 완충염인 락트산염을 첨가하는 것은, 발효액에 첨가될 중화용 염기의 양을 최소화하고 그결과 염형태로 전환되는 락트산염의 양도 최소화할 수 있기 때문에 바람직할 수 있 다.

약 70g/L의 글루코스 및/또는 프룩토스와 또한 적어도 약 20g/L의 탄산칼슘을 포함하는 영양배지가 특히 본 발명에 적합할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 박테리아균주에 따라, 영양배지에 콘침지수(적어도 약 25g/L 침지수 건조 고형물에 해당하는 양)를 첨가하는 것도 바람직할 수 있다. 특히 발효공정에서 생성되는 것과 동일한 키랄형 락트산염만을 함유하는 콘침지수를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

호모락트산세균의 균주와 발효조건은 유리락트산을 적어도 약 0.5g/L/hr 바람직하게는 약 1.0g/L/hr, 더 바람직하게는 약 2.0g/L/hr 또한 특히 바람직하게는 약 4.0g/L/hr의 전체량으로 유리락트산을 생성하도록 선택한다. 락트산염 혹은 유리락트산의 총생성율은 생성된 유리락트산(또는 락트산염) 총량을 배양시간으로 나누어 계산한다. 특정범위농도의 락트산농축물을 생성하는 발효과정에 있어서, 유리락트산(락트산염)의 전체생성율은 유리락트산(락트산염)농축물 중 90%를 생성하기에 필요한 시간에 대해 계산한 것이다.

본 방법에 따른 생성율은 락트산염에 대한 전체생성율에 관하여 표시할 수 있다. 이 발효방법은 일반적으로 적어도 1.0g/L/hr 바람직하게는 2.0g/L/hr 및 더 바람직하게는 3.0g/L/hr 정도의 전체생성율로 락트산염을 생성하는 조건하에서 실행되는 것이다. 지적한 바와 같이, 락트산염은 pH4.1을 넘지않는, 특히 pH4.0을 넘지않는 평균배양pH의 발효액속에서 상기 속도로 생성되는 것이 바람직하다.

본 발효방법에서 사용되는 적절한 예시의 호모락트산세균은 통상의 옥수수제 분공장에서 사용되는 콘침지수 시료로부터 쉽게 분리할 수 있다. 또한, 다양한 공급원으로부터 분리된 기타의 호모락트산세균은 또한 고농도 유리락트산의 효과적인 저pH 생성을 가능하게하는 필수적인 능력을 갖는다.

콘침지수에서 발견되는 호모락트산세균은 대체로 성장을 위한 콘침지수를 함유하는 영양배지를 필요로 하기 때문에 상기 세균을 확인분리하는 공정의 초기단계는 통상 10부피% CSL-MRS한천 같은 침지수함유배지내에 시료를 깔고 그 뒤 접종된 배지를 혐기상태에서 약 45-50℃로 배양하는 것을 수반한다. 세균분리물은 이 분리물을 하부상에 침지수만을 함유하는 2상계 배지속에 전달하면 헤테로락트산 생성에 관하여 쉽게 검출될 수 있다. 성장균주는 그 뒤 2상계관 하단의 기체발생에 관하여 관찰한다. 분리된 균주는 저온(약 4℃ 이하)에서 편리하게 보관하거나 또는 침지수/토마토주스/MRS한천 성장배지 등에 벤치재료 형태로 유지된다. 필요시, 이 방식으로 콘침지수에서 분리된 하나이상의 내산성균주는 락트산발효시 접종물로 사용하게된다.

이러한 방법학을 이용하여, 미국내 5곳의 옥수수제분공장 및 터어키, 영국 및 네덜란드에 있는 3곳의 옥수수제분공장에서 수득한 침치수시료를 락트산염 생성미생물에 대해 검사하였다. 분리된 미생물은 처음에는 헤테로락트산형(즉, 락트산염 이외에 다른 발효생성물을 제조할 수 있는)이거나 또는 호모락트산형 생성체로 특징지었다. 다시 호모락트산균주는 특히 전체 락트산염생성에 근거할 때, 생성된 락트산염의 광학특성 및 다수경우에서 발효배지에 첨가된 염기(CaCO₃)가 존재하지 않을 때 최종접종pH값을 갖는 특징이 있었다. 총 155가지 세균균주가 분리되었다. 특징적인 109가지 균주중에서 98가지가 (90%) 단독발효생성물("호모락트산형"균주)로서 락트산염을 생성했다. 여기서 "호모락트산형"이란 발효생성물로서 락트산만을 생성하는 세균균주를 뜻한다. 나머지 11가지 균주(11%)는 락트산염 이외에 다른 발효생성물도 생성했다 ("헤테로락트산형"균주). 또한 98가지 호모락트산형 균주 중에서 22가지는 L-락트산염생성체였으며 18가지는 D-락트산염생성체, 또한 58가지는 라세미체락트산염을 생성했다.

본 발명의 호모락트산세균은 일반적으로 적어도 약 25g/L유리산을 생성할 수 잇다. 더 바람직하게는 이 세균은 적어도 약 30g/L 유리 L-락트산을 생성할 수 잇는 호모락트산세균이다. 또다른 본 발명의 구현에서, 호모락트산세균은 적어도 약 40g/L 바람직하게는 약 75g/L의 락트산염 또한 pH4.3을 넘지않는 평균배양pH값에서 적어도 약 90g/L 락트산염을 함유하는 용액을 생성할 수 있다. 검토한 바와 같이 특히, 호모락트산세균의 바람직한 균주는 pH4.0을 넘지않는 평균pH값 및/또는 pH3.9를 넘지않는 최종pH값에서 이러한 농도의 L-락트산염(혹은 D-락트산염)을 생성할 수 있다.

본 발명의 내산성 호모락트산균주는 통상 약 35 내지 53℃의 온도에서 성장 및 락트산을 생성할 수 있다. 최적의 성장온도는 약 43 내지 52℃, 바람직하게는 47 내지 50℃이나, 한편으로 호모락트산세균이 실온에 가까운 온도에서 성장할 수 있음도 증명되었다. 온도가 약 53℃ 이상이거나 30℃ 이하일 때 일어나는 세균의 락트산염생성은 무시해도 좋은 정도이다. 발효과정은 바람직하게는 보통 47 내지 52℃에서 실행되며 이것은, 이스트와 헤테로락트산 락토바실리가 내열성이 약하고 이온도에서 잘 성장하지 않거나 전혀 성장하지 않기 때문이다. 따라서, 락트산염 생성을 개선하는 것에 더하여 내산성 호모락트산세균을 고온에서 발효시키면 다른 미생물에 의한 오염발생문제가 일어날 가능성을 크게 감소시킬 수 있다.

본 발명의 호모락트산세균은 통상 약 pH3.7 내지 6.5 바람직하게는 pH3.8 내지 5.0의 범위에서 성장 및 락트산염을 생성시킬 수 있다. 세균이 중성에 가까운 pH값(6.0-6.5)에서 락트산염을 생성하더라도, 본 발명에서 사용되는 세균은 대부분의 락트산염이 유리산형태로 존재할 때의 pH값에서 락트산염을 고농도로 유지할 수 있다. 바람직한 형태의 내산성 호모락트산세균은 pH4.2 이하에서 다량의 락트산염을 생성할 수 있다 (적어도 50g/L 이상).

충진탑형 반응기, 연속교반식 반응탱크, 회전식 생물학접촉반응기, 순서배열배치형 반응기 및 유동탑형 반응기 등 다양한 반응기구조를 본 발명에서 사용할 수 있다. 전체반응은 발효액의 온도를 제어할 수 있는 적절한 수단이 갖추어진 단일베셀 내에서 실행되거나 혹은 제1베셀에서 실행되고 그 뒤 발효액을 예컨대 플레이트형 열교환기 등의 열교환기에 통과시켜 원하는 온돈로 유지한 뒤 발효반응에 순환시킨다. 후자를 위한 조립설비는 반응혼합물의 신속냉각을 위한 것이며 때로 발효액이 막분리모듈을 통과하여 발효액중 일부를 제거하는 것과 동시에 실행될 수도 있다 (즉, 열교환기와 막모듈이 직렬로 연결된 경우).

일반적으로 이용되는 구조중 하나는 막순환형 바이오반응기를 포함한다. 이러한 종류의 반응기는 보통 2개의 모듈, 발효기(10) 및 막모듈(15)(예, 도1참조)을 포함한다. 이러한 2개의 모듈은 파이프로 연결되거난 단일장치의 일부를 구성하기도 한다.

본 발명의 한가지 구현에 있어서, 내산성 호모락트산세균은 발효기 내 영양배지의 첫번째 부분에서 배양되어 적어도 약 25g/L의 유리L-락트산을 함유하는 제1생성용액을 생성한다. 그 결과로 나온 발효액은 분리하여 유리락트산을 포함하고 사실상 세균세포가 없는 제1성분을 제공하도록 분리처리한다. 이것은 세포분리기(예, 중공섬유형 세포분리기)를 통해 발효물 일부를 펌핑하여 실행된다. 세포함유성분은 대체로 발효기(예, 도1참조)내로 재순환복귀시키고 락트산함유성분은 반면에 격리시켜 후속과정으로 보낸다. 또다른 영양배지를 일정한 레벨로 발효기에 첨가하여 액체부피를 유지시킨다. 이 방식으로 발효를 실행할 경우, 초기 개시단계가 결정된후에 정상상태(pH, 락트산염농도 및 영양소농도)에 도달 및 유지된다. 이러한 방식으로 가동할 경우 본 발명의 발효는 통상 발효액의 pH를 약 4.2 이하로 특히 3.7 내지 4.0 수준으로 유지하기위해 실행된다.

분리된 락트산함유성분은 다수의 공지방법에 따라 처리하여 용액내 다른 성분들로부터 유리락트산을 분리할 수 있다. 예를들어, 락트산은 3차아민함유 추출제를 이용하여 용액에서 추출할 수 있다. 적절한 추출제의 한가지 예는 옥틸알코올에 넣은 알라민336 용액이다. 락트산분리에 사용되는 다른 방법은 이온교환수지(즉, 폴리비닐피리딘컬럼) 같은 고체흡수제에 용액을 접촉시키고 락트산함유성분을 증류제거하거나 막분리법을 통해 제거하는 것을 포함한다. 이러한 분리방법 종류는 락트산함유성분을 처리하여 락트산무함유성분 및 락트산염분리성 분을 만드는 것이다. 락트산무함유성분은 락트산칼슘 같은 락트산염 형태의 물질을 일부함유하기도 한다. 락트산분리성분은 추후 다양한 공지방법으로 처리하여 더 순수한 형태의 유리락트산을 제조한다.

락트산함유성분은 또한 고체 혹은 용액형태의 락트산염(락트산칼슘 등)을 분리제거하기 위한 처리를 거치고 따라서 유리락트산이 농후한 용액만 남기기도한다. 락트산염은 적절한 기술 즉, 추출법, 결정화법, 막분리법 및 고체물에 대한 흡착법 (음이온교환수지 등)등을 통해 분리할수도 있다. 락트산염은 용액의 pH값을 완충시키고 발효액의 pH값이 적정수준 이하로 떨어지지않도록 방지할 수 있는 발효기로 되돌려보낸다. 예를들어, 완충제로서 충분한 양의 락트산칼슘을 재순환시키면, 발효액의 pH값은 락트산의 pK_a와 근사한 값으로 유지시킬 수 있다. 이론에 근거할 때, 락트산염은 pH3.85에서 균등량의 새로운 락트산생성물을 완충생성하게된다. pH4.0에서, 1당량의 락트산염은 0.7당량의 새로운 락트산생성물을 완충생성한다.

다양한 방법을 활용하여 다량의 락트산 생성에 수반되는 락트산염/락트산용액의 처리, 예컨대 pH4.8 이하 (바람직하게는 pH4.2 나 4.3 이하)의 용액을 발효액으로부터 생성하고; 또한 락트산염(통상, 락트산칼슘, 락트산칼륨, 락트산나트륨 및/또는 락트산암모늄)의 오염물을 제거할 수 있다. 이러한 처리는 예컨대 공지 특허출원 "락트산 처리;방법;설비 및 제품" (출원인: 카길 인코퍼레이티드. 발명인: 존 엔.스타, 아하론 엠.에이얼, 리키 카나리, 베티하잔 및 로드피셔, 여기서는 Starr et al.의 출원이라고 한다.) Starr et al.의 출원은 본 출원과 동일자(1997년 10월 14일)로 출원되었다. 바람직한 전체 공정은 대규모 실행시 비용 측면에서 바람직하고 또한 효율적인 처리 흐름을 용이하게 달성하기 위한 접근방식에 따라 부분적으로 달라질 수 있다.

전체공정의 선별에 있어서 기본원칙은 다음 두가지 목적을 달성하기위한 시스템설계에 관련한다:

1. 예컨대 고분자생성을 위한 후속처리에 이용될 락트산생성물의 분리; 및

2. 발효액으로의 재순환이 가능한 형태의 락트산염의 분리.

3가지 일반접근은 다음과 같다:

1. 용액으로부터 락트산을 분리한 뒤 락트산염을 남기고; 필요시 분리후 락트산염을 가진 잔류용액을 발효기에 제공하는 것;

2. 용액으로부터 락트산염을 분리하고; 필요시 락트산염을 발효기에 제공하고; 또한 락트산염분리후 잔류용액으로부터 락트산생성물을 후속분리하는 것; 또한

3. 락트산을 하나의 흐름속으로 또한 락트산염 또다른 흐름속으로 동시분리하여 잔류혼합물을 남기는 것.

상기 목적중 하나 혹은 양쪽을 모두 달성하기위한 스타 등의 발표기술은 당양한 락트산염재료 용액에서 실행가능하다 (예, 락트산 및 용해락트산염 용액). 이들 용액은 발효기로부터 분리 및 여과나 pH조정 등에 의해 변화된 발효액을 포함한다. 실제로, 이 기술은 다른 방식으로 제조한 용액에도 적용할 수 있다.

여기서 발표한 기술안은 그러나 특히 발효액 특히 비교적 산성인 용액을 효율적으로 처리하는 것에 초점을 맞추어 개발된 것이며 산을 첨가하여 pH값을 조정 할 필요가 없고 또한 pH값변화가 일어나지 않도록 한 것이 특징이다. 이 기술을 응용한 통상의 조성물은 pH가 적어도 0.86이상 6.0을 넘지않는 것이다. 즉, 정상적인 조성물은 이 범위내의 pH값을 갖는다. 이러한 조성에서 유리락트산 대 관련산 혹은 용해된 락트산염의 몰비는 25℃에서 약 1,000:1 내지 0.007:1의 범위에 있다. 더 바람직한 처리는 pH1.98-5.00의 용액을 수반하며(HLA:LA비는 약 75:1 내지 0.070:1의 범위), 특히 pH3.0-4.5(HLA:LA비는 약 7.0:1 내지 0.23:1의 범위)의 용액을 수반한다.

상술한 바와 같이, 상술한 바람직한 pH범위의 용액은 락트산염재료의 실제농도에서 본 발효방법을 통해 쉽게 수득된다. 이와 별도로, 예컨대 가장 적합한 pH범위에 도달할 때까지 산을 첨가하여 pH를 조정하여 다른 발효액을 사용할 수도 있다.

여기서, 때로 언급되는 "우선분리"는 락트산 및 락트산염을 함유한 조성물로부터 락트산을 혹은, 락트산 및 락트산염을 함유하는 조성물로부터 락트산염을 분리하는 것을 말한다. "우선분리" 및 다양한 유사용어는 또다른 의미로서 2가지 성분(락트산이나 락트산염) 중 하나를 먼저 분리하는 분리기술을 의미하기도 한다. 바람직한 본 발명의 처리방법에서, 락트산 및 락트산염 혼합물은 2가지 "생성물 흐름"으로 분할된다. 하나의 흐름에서(예, 유리락트산 농후흐름), 락트산 대 수득된 락트산염의 몰비는 약 2/1 이상 바람직하게는 약 3/1이다. 여기서의 기술에 따르면, 적어도 5/1 이상 실제로 10/1 이상의 비가 수득되기 쉽다.

다른 생성물 흐름은 락트산염농후흐름이다. 이 흐름에서, 유리락트산의 락 트산염에 대한 몰비는 0.5를 넘지않는다. 상술한 처리에 따르면 이 몰비는 0.3, 바람직하게는 0.2 더욱 바람직하게는 0.1 이하로 쉽게 수득된다.

여기서 "흐름"이란 분리상 혹은 생성물분획을 의미하며 용액, 고형물 혹은 그의 혼합물 어느 것이나 관계없다. "락트산 농후흐름"은 처리된 본래의 혼합물과 비교하여 락트산농후(락트산염 대비)상 혹은 혼합물을 뜻하는 것이며 또한 "락트산염 농후흐름"은 역시 본래의 혼합물과 비교하여 락트산염농후(락트산 대비) 흐름을 말한다.

유리락트산이 농후한 생성물흐름을 유리산의 분리결과로서 수득할 때 예컨대, 발효액으로부터 수득할 때, 남아있는 수성혼합물은 유리락트산 측면에서 "소모된 것"이라고 지칭하기도 한다. 유사하게, 락트산염 농후흐름은 유리락트산과 락트산염이 함유된 혼합물로부터 락트산염을 분리한 결과로서 얻어진 것이며 이때 남은 혼합물을 락트산염 측면에서 "소모된 것"이라고 칭한다.

바람직하게는, 처리된 용액이 발효액이면 락트산염이 농후한 생성물흐름을 제공 및 형성하여 발효기 내의 락트산염에 대한 불순물의 중량비는 발효액에서 확인된 것보다 적어도 5%정도 낮다. 이 값은 락트산염 분리를 위해 선택된 접근에 있어서 제어관련 기술을 통해 조정가능하며 또한 다양한 정제방법, 백워싱 혹은 재결정화법 등을 통해 조정할 수도 있다.

또한 락트산염 생성물흐름은 수성상 및 고형상의 혼합물이나 수용액 형태로 분리하여 발효장치에 재순환시킬 수 있으며 이결과 나머지인 물의 양을 유지하기에 편리하다. 수용액의 농도가 발효액 내 나머지인 물의 양을 맞추기에 적절히 사용 된다면 역삼투 및 증기재압축법 등의 비교적 저렴한 농축방법을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 다음의 실시예를 참조하여 더 구체적으로 설명하며 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 사상에서 벗어나지않는 한도내에서 다양한 수정과 변형이 가능하다.

[실시예]

실시예1 - 표준 발효조건

별도의 언급이 없을 경우, 다음 실시예에서 설명한 발효방법은 다음의 표준조건에 따른 다양한 성장배지를 사용하여 실행하였다.

세포(250㎕)는 40% 토마토주스/40% LSW-MRS한천 하부상/MRS 상부상의 2상계(TJ-SW-MRS 2상계)속에 담긴 특정균주의 벤치재료로부터 새 TJ-SW-MRS 2상계배지로 옮기고 이것을 정치상태에서 18 내지 24시간동안 47℃에서 배양했다.

MRS 배지(pH=6.2)

10g/L 젤라틴의 췌장소화액

8g/L 소의 추출물

4g/L 이스트 추출물

20g/L 글루코스

2g/L K₂HPO₄

1g/L 트윈^R80

5g/L 아세트산나트륨

5g/L 시트르산암모늄

0.2g/L MgSO₄

0.05g/L MnSO₄

새 KJ-SW-MRS 2상계배지에서 취한 1.0㎖의 배양분취물을 이용하여 10% CSL, 글루코스(60g/L 총 농도)와 또한 밀봉된 혈청병에 담긴 탄산칼슘(20g/L)을 보충하여된 80㎖의 배지B를 접종한 뒤 쉐이커에 담아 47℃에서 18시간동안 교반 및 배양했다.

배지B (pH=4.7)

8-12 부피% 콘침지액

5g/L 이스트추출물

50-100g/L 글루코스

2g/L K₂HPO₄

1g/L 트윈^R80

2g/L 시트르산 암모늄

0.2g/L MgSO₄

0.05g/L MnSO₄

20-40g/L CaCO₃

배지B와 적정농도의 글루코스 및 탄산칼슘(즉, 90g/L의 글루코스 및 33.4g/L 의 탄산칼슘)을 담은 발효기에 10%(v/v)의 18시간 숙성배양물을 접종시켰다. 150rpm에서 교반하면서 47-49℃에서 또한 발효용기를 70-80% 정도 채운상태에서 실행했다. 이 액체부피에서 발효를 실행하면 배지는 크게 호기화하지 않는다.

실시예2 - pH조절없이 실행한 내산성 호모락트산균주의 분리

호모락트산 세균균주는 8곳의 다른 옥수수제분공장에서 수득한 콘침지수 시료로부터 분리했다. 이들 시설은 각각 브레어, 네브라스카; 에디빌, 아이오와; 세다 래피즈, 아이오와; 데이톤, 오하이오; 멤피스, 테네시; 이스탄불, 터키; 틸버리, 영국; 또한 버겐오프준, 네덜란드 등에 있다.

균주는 통상의 옥수수제분공장에서 수득한 침지수시료를 이용하여 분리했다. 이들 시료는 10% CSR-MRS 한천플레이트(pH5.0)에 깔고 혐기성으로 47℃에서 배양하였다. 10% CSL-MRS 한천플레이트 상에서 군집에 선을 다시그어 분리할 수 있게한다. 분리물은 40% LSW-40%토마토주스-MRS하부상/MRS 상부상으로된 2상계배지(pH6.0)에 통과시켜 유지한다. 분리된 균주는 관하단의 기체발생(CO₂)을 관측하여 헤테로락트산 생성에 대해 스크린분석했다. 호모락트산 분리물은 다시 락트산염 수득에 대해 또한 생성된 락트산염의 광학순도에 대해 10부피% CSL과 30g/L 글루코스를 보충한 MRS 배지에서 스크린분석했다. 그 결과는 하기의 표1에서 보는 바와 같다.

분리된 세균균주는 호모락트산염 생성체("호모락트산염") 혹은 헤테로락트산 염 생성체("헤테로락트산형")으로 구분했다. 10부피%의 콘침지액("CSL")을 보충한 MRS배지내 발효과정에 기초하여, 분리된 호모락트산 세균균주는 전체 락트산염생성, 최종발효pH 및 % L-락트산염(표1참조) 등에 관한 특징을 나타났다. 첨가된 콘침지액에서 약 50%의 락트산염이 D-락트산염이었으므로 적어도 약 70% L-락트산염을 생성한 균주는 L-락트산염 생성균주인 것으로 생각되었다. 이러한 가정은 영양배지내 존재하는 침지수로부터 생긴 D-락트산염 오염량이 낮은 조건에서 후속실험에 따라 확인되었다 (즉, 80%(전체 락트산염에 대한 비율로) 이상의 L-락트산염을 갖는 콘침지수를 이용하거나 락트산염생성량이 클 때).

발효반응은 실시예1에서 설명한 표준조건하에서 48℃의 온도로 실행했다. 그 결과는 하기의 표1에서 보는 바와 같다.

실시예3 - 염기를 첨가하여 실행한 내산성 호모락트산균주의 분리

또다른 호모락트산균주 1군을 에디빌(아이오와), 세다래피즈(아이오와) 및 블레어(네브라스카)의 옥수수제분공장에서 얻은 콘침지수시료로부터 분리했다. 분리절차는 실시예2와 동일했다. 분리된 호모락트산균주는 10부피% CSL, 90g/L의 글루코스 및 33g/L의 CaCO₃를 보충한 배지B 내에서 실행한 발효처리에 따른 것이다. 전체 락트산염 생성량 및/또는 생성된 L-락트산염의 백분율은 상기의 균주군에 대해 측정했다. 그 결과는 하기의 표2에서 보는 바와 같다.

[표2] 분리된 호모락트산균주

균주번호	g/L 락트산염	% L-락트산염
90	62	81
92	67.9	59
95	62.47	44
99	63.17	78
103	58.53	75
104	65.18	75
109	66.26	83
114	58.6	46
117	47.99	62
127	49.54	44
129	68.75	77
132	59.12	95
133	60.37	9
134	28.87	63
136	54.1	41
139	66.08	47
140	57.18	94

실시예4 - 락트산염 생성물에 대한 염기 첨가의 효과

L-락트산염 생성체로 확인된 실시예2에서 설명한 다수균주는 스크린분석하여 락트산염 생성에 대한 염기(CaCO₃)의 첨가효과를 검토하였다. 10% CSL과 30g/L 글루코스를 보충한 MRS배지에서 48℃온도로 실행했다. 염기첨가시의 측정에서 10% CSL, 30g/L 글루코스 및 20g/L CaCO₃를 보충한 MRS배지를 사용했다.

표3. 락트산염 생성에 대한 CaCO₃ 의 효과

균주번호	락트산염 생성량 (g/L)
균주번호	염기없음	20g/L CaCO₃
6	21	42
10	20	32
14	24	37
19	17	33
21	26	49
22	19	34
23	28	47
24	18	46
41	24	48
42	27	49
43	23	42
44	24	39
45	21	37
46	21	47
47	21	37
51	24	37

실시예5 - L-락트산염 생성

L-락트산염 생성량을 실시예2에서 설명한 다수의 균주에 대해 확인했다. 10% CSL, 30g/L 글루코스 및 20g/L CaCO₃를 보충한 MRS배지에서 48℃의 온도로 발효했다.

[표4] L-락트산염 생성

균주번호	% L-락트산염	생성된 락트산염(g/L)
10	87%	39.12
14	79%	21.11
21	85%	38.56
23	85%	35.69
24	84%	31.78
41	86%	38.10
42	83%	30.62
43	80%	25.17
44	84%	31.75
46	86%	36.12

실시예 6 - ATCC 기탁의 락토바실러스균주에 의한 락트산염 생성

콘침지수 이외의 다른 공급원으로부터 분리한 다수의 공지 락토바실러스균주의 락트산염 생성율을 조사했다. 11가지 다른 균주의 시료를 미국조직배양수집처(ATCC, 로크빌 메릴랜드)에서 수득했고 이를 75g/L의 글루코스 및 30g/L 탄산칼슘을 보충한 MRS내에서 37℃의 온도로 발효시킨 것에 근거하여 전체 락트산염제조 및 최종배양pH값에 대해 스크린분석했다. 그 결과를 표5에서 나타내었다. 균주는 모두 47℃에서 좋지못한 성장성을 나타냈으며 영양배지내 콘침지수의 존재시 억제되었다. ATCC 기탁균주의 영양소요건은 콘침지수로부터 분리된 균주와 상이하나, 다수 ATCC 기탁균주는 비교적 고농도의 유리락트산을 생성할 수 있는 것으로 나타난다. 특히 락토바실러스 헬비티쿠스(ATCC#15009; 최종배양p4.03일 때 66g/L 락트산염), 락토바실러스 파라카제 톨레란스(ATCC#25599; 최종배양p4.04일 때 66g/L 락트산염), 또한 락토바실러스 살리바리우스 살리바리우스(ATCC#11741; 최종배양p4.12일때 64g/L 락트산염)는 고생성율의 유리락트산 생산체로서의 가능성을 제공하는 것으로 나타난다. 다수 균주에 의해 생성된 락트산염의 광학순도를 결정하였다. 비교적 고농도의 유리락트산를 생성할 수 있는 균주는 L-락트산염 생성균주가 아니었다.

[표5] ATCC 락토바실러스 균주에 의한 락트산염 생성

ATCC번호	락토바실러스	락트산염	%L-락트산염	pH
12315	L.델브루엑키 락틱	47	42	4.93
11741	L.살리바리우스 살리바리우스	64	52	4.12
25302	L.파라카제이 파라카제이	52	69	4.76
25258	L.젠세니	3	-	6.25
15009	L.헬베티쿠스	66	53	4.03
33409	L.델브루엑키 불가리쿠스	18	54	5.45
25599	L.파라카제이 톨레란스	66	53	4.04
39392	L.카제이카제이	50	12	4.71
33323	L.그라세리	18	-	5.62
4536	L.아시도필러스	40	-	5.43
35046	L.애니멀리스	51	-	4.78

실시예7 - 호모락티드산균주 41#의 SO ₂ 내성

호모락티드산균주 41#의 락티드산염 생성율에 대한 이산화황(SO₂)의 레벨변화의 효과를 검사했다. 락티드산염 생성에 대한 이산화황농도 변화의 효과는 균주41#를 이용하여 검사했다. 발효반응은 10부피% CSL, 30g/L 글루코스 및 20g/L CaCO₃를 보충한 MRS배지에서 실행했으며 실시예1에서 기술한 표준발효조건에 따른다. 하기 표6에서 나타낸 결과는 균주#41가 적어도 약600ppm까지의 SO₂농도하에서 락트산염을 생성할 수 있음을 보여준다. 800ppm 하에서 실행한 유사한 발효반응에서, 균주#41은 144시간의 휴지기 이후에 락트산염을 생성하기 시작했다.

[표6] 호모락트산균주#41의 SO₂내성

SO 농도 락트산 생성량(g/L)

24시간 48시간 72시간

200ppm 11 48 66

400ppm 9 27 55

600ppm 9 11 43

실시예8 - 락트산염생성에 대한 온도의 영향

호모락트산균주#41의 락트산염 생성율은 41 내지 54℃의 온도범위에서 결정했다. 10부피%의 CSL, 60g/L 글루코스 및 20g/L 탄산칼슘을 보충한 배지B에서 발효공정을 실행했다. 하기 표7의 결과는 균주#41에 의한 락트산염 생성에 있어서의 최적의 온도범위가 44 내지 54℃임을 보여주는 것이다.

[표7] 락트산염 생성의 온도의존성

온도	락트산 생성량 (g/L)
온도	24시간	48시간	72시간
41°	14	51	68
44°	25	55	68
47°	26	50	63
50°	31	52	57
54°	9	19	23

실시예9 - 락트산염 생성에 대한 침지수농도의 영향

실시예2에서 설명한 다수의 L-락트산염 생성균주를 이용하는 발효공정을 실행하여 락트산염생성에 대한 성장배지내 콘침지액량의 변화효과를 검토하였다. 50g/L 글루코스, 20g/L CaCO₃ 및 1%, 5% 나 10%의 CSL을 보충한 배지A(하기참조)에서 48℃온도로 발효처리를 실행했다.

배지A (pH=5.0)

10g/L 이스트 추출물

0.2% K₂HPO₄

1g/L 트윈^R80

.2% 시트르산암모늄

0.005% MnSO₄ 4H₂O

0.02% MgSO₄ 7H₂O

탄소/에너지원 첨가

질소공급원 첨가

pH 조절을 위한 CaCO₃ 첨가

[표8] 락트산염 생성에 대한 침지수의 효과

균주번호#	락트산 생성량 (g/L)
균주번호#	1%CSL	5%CSL	10%CSL
10	1	19	31
23	1	10	32
24	1	6	22
41	1	9	33
45	1	8	35

실시예10 - 리보형에 기초한 호모락트산균주의 특징화

콘침지수에서 분리한 다수의 L-락트산염 생성 호모락트산균주는 리보복사유형의 분석에 근거하여 분류하였다 (예, Jaquet et al., Zbl. Bakt. 276, 356-365 (1992) 참조). 이 기술은 EciRI제한효소를 이용하여 해당균주의 단일군체로부터 DNA를 소화하고 또한 대장균으로부터 화학라벨화된 rRNA 오페론을 이용하여 아가로스겔 상에서 크기분리한 후 교배형성하는 것에 기초한다. 그 결과로 나온 패턴은 미생물간의 유전적관계를 나타내는 직접표시자가 되며 또한 4가지 박테리아(살모넬라, 리스테리아, 스타필로코쿠스 및 대장균)를 구별하고 서로 밀접한 관련이 있는 그램양성 및 그램음성 균주가 생물분류학적 구분을 위해 제공된다.

콘침지수로부터 분리된 7가지 리보타입 락트산염 생성균주의 결과는 도2에서 보는 바와 같다. 동일 리보그룹명칭의 균주는 동일한 생물분류레벨에 속한다는 것을 쉽게 확인할 수 있다. 도 2에서 보는 7가지 균주에 의해 표현된 리보타입은 공지의 연구소 컴퓨터데이타베이스에 있는 30가지 락트산세균균주 중 어느것의 패턴과도 일치하지 않았다. 일치하지않은 데이터베이스내 세균중에는 락토바실러스 아시도필러스, 락토바실러스 아니말리스, 락토바실러스 델브루엑키, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 아밀로보루스 및 락토바실러스 살리바리우스 등이 있었다. 도 2에서 열거한 균주의 리보타입은 또한 락토바실러스 아길리스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부크네리, 락토바실러스 컨퓨수스, 락토바실러스 코리니포르미스, 락토바실러스 커르바투스, 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 케피르, 락토바실러스 무리누스, 락토바실러스 펜토수스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 세이크 및 락토바실러스 수에비쿠스 등과 일치하지않았다. 또한 도 2에서 열거한 리보타입 패턴은 락토코쿠스 가르비에, 락토코쿠스 락티스 및 락토코쿠스 라피놀락티스 혹은 루코노스톡 카르노숨, 루코노스톡 시트레움, 루코노스톡 메센테로이데스, 로코노스톡 파라메센테로이데스, 페디오코쿠스 아시딜락티시, 페디오코쿠스 덱스트리니쿠스 및 페디오코쿠스 펜톡사세우스 등과도 일치하지 않았다.

도 2의 7가지 균주의 리보타입 패턴은 3가지 리보그룹에 속한다. 2가지 균주(#114 및 #119)는 동일한 리보타입을 갖는다. 이들 균주중 하나는 헤테로락트산 균주(#119)이며 다른 하나는 라세미체락트산염(#114)을 생성하는 호모락트산균주이다. 하나의 D-락트산염 생성균주(#79)는 다른 6가지와 상이한 리보타입 패턴을 나타냈다. 나머지 4가지 균주(#90, 127, 132 및 142)는 동일한 리보그룹으로 분류되며 이들의 리보타입 패턴은 동일하지 않았지만 동일한 생물분류레벨에 속하는 것으로서 유사하다고 판단되었다. MIL 4-1132 패턴을 가진 4가지 균주 중에서 3가지는 L-락트산염 생성균주(#90, 132 및 140)이었고 4번째(#127)는 라세미체 락트산염을 생성했다.

실시예11 - 락트산염 제조에 대한 염기첨가의 효과

변화량의 CaCO₃의 첨가가 호모락트산균주 #41의 락트산염생성도에 미치는 영향를 검사했다. 이 실험은 8부피%의 CSL, 200g/L 의 글루코스를 보충하고 변화량의 탄산칼슘(30-90g/L)을 첨가한 배지A에서 47℃의 온도로 실행하였다. 그결과는 하기표9에서 보는 바와 같다.

[표9] 락트산염생성에 대한 CaCO₃의 영향

CaCO₃ 락트산염 생성량(g/L)
농도	0시간	24시간	51시간	120시간	최종pH
30g/L	3.17	48.1	75.5	75.7	3.98
40g/L	6.12	53.4	81.3	87.0	4.48
50g/L	5.84	49.4	83.4	88.1	4.73
60g/L	3.21	50.2	75.4	77.2	4.75
70g/L	4.85	48.9	75.3	73.8	4.8
80g/L	3.45	54.4	61.1	83.6	4.77
90g/L	5.39	49.6	57.8	83.6	4.74

실시예12 - 12부피% CSL, 90g/L 글루코스 및 33.4g/L CaCO ₃ 을 이용한

균주#41의 발효프로파일

도 3은 대표적인 발효실험과정에서 시간에 대한 함수로서 발효액내 유기성분과 pH 프로파일을 보여준다. 도 3의 프로파일은 10부피% CSL, 100g/L 글루코스 및 33.4g/L 탄산칼슘을 보충한 배지B내 균주#41를 47℃에서 배양하여 수득한 결과에 기초한다.

실시예13 - 90g/L 글루코스 및 33.4g/L CaCO ₃ 및 12%CSL/36%LSW를 이용한

균주#41의 발효프로파일

도 4는 균주#41를 이용한 대표적인 발효실험과정에서 시간에 대한 함수로서 락트산염 생성을 보여준다. 발효는 실시예1에서 설명한 방법을 사용하여 실행했다. 도 4의 프로파일은 90g/L 글루코스, 33.4g/L 탄산칼슘 및 12부피% CSL(36중량% 건조 고형물) 또는 36부피% LSW(12중량% 건조 고형물)를 보충한 배지C내에서 47℃로 균주#41를 배양하여 수득한 결과에 근거한 것이다. 표10에서 요약된 결과를 참조하면 콘침지수의 공급원이 없이 약 40g/L의 최종락트산 레벨을 알 수 있다. 락트산염은 L-락트산염 생성균주(#41)로 생성했기 때문에 발효종료시 적어도 약 35g/L 유리 L-락트산이 존재했다. (나머지는 첨가된 침지수에 존재하는 D-락트산염을 전혀 함유하지 않는다)

[표10] 균주#41을 이용한 락트산염 생성

락트산염(g/L)	콘침지수 공급원
락트산염(g/L)	12% CSL	36% LSW
0시간	10.3	8.4
16시간	44.0	52.4
24시간	80.5	92.2
44시간	91.5	96.8
최종pH	3.92	3.98
최종유리 락트산염(g/L)	42	41

실시예14 - 8~12부피% CSL, 90g/L 글루코스 및 36.6g/L CaCO ₃ 을 이용한

균주#41의 발효프로파일

도 5는 균주#41의 대표적인 발효실험과정에서 시간에 대한 함수로서의 락트산염생성을 보여준다. 실시예1에서 설명한 절차의 변형을 이용하여 발효하였다. 균주#41의 세포는 800ml의 배지내에서 사전증식했으며 그 뒤 배지로부터 분리했다. 사전증식세포는 다시 신선한 800ml의 배지에 재현탁시켰다. 도 5의 프로파일은 90g/L 글루코스, 36.6g/L 탄산칼슘과 또한 8부피% CSL(36중량% 건조 고형물), 12부피% CSL, 24부피%(12중량% 건조 고형물), 혹은 36부피% LSW를 보충한 배지B내에서 상기의 사전증식세포를 47℃로 배양하여 수득한 결과에 기초한다.

[표11] 균주#41을 이용하는 락트산염 생성

콘침지수 공급원	최종pH	락트산염	유리락트산
8% CSL	3.83	93g/L	47g/L
24% LSW	3.90	94g/L	44g/L
12% CSL	3.80	97g/L	52g/L
36% LSW	3,81	99.5g/L	53g/L

실시예15 - 락트산염 생성에 대한 글루코스 첨가의 효과

탄수화물공급원(글루코스) 첨가량 변화가 락트산염 생성에 미치는 영향을 호모락트산균주#41에 대해 검사했다. 10부피% CSL, 20g/L CaCO₃ 와 또한 해당레벨의 글루코스를 보충하여된 배지A에서 균주#41를 48℃에서 실시예1에서 기술된 표준발효방법을 이용하여 배양하여 발효시켰다. 배지는 또한 콘침지액으로부터 나온 1-15g/L의 발효당(주로 글루코스와 프룩토스)를 더 첨가함유했다. 그 결과를 표12에서 나타낸다. 이 실험의 결과에서 적어도 첨가된 염기의 양에 대하여(20g/L CaCO₃) 락트산염 생성도는 적어도 약 50g/L의 글루코스 등의 탄수화물공급원을 더 첨가하면 향상될 것으로 판단된다.

[표12] 락트산염 생성에 대한 글루코스의 효과

글루코스 첨가량	락트산염 생성(g/L)
글루코스 첨가량	24시간	48시간	72시간
30g/L	14	39	42
50g/L	11	51	55
80g/L	11	50	67
100g/L	9	47	65

본 발명을 상기와 같이 다양한 기술과 바람직한 구현을 참조하여 상세히 설명하였다. 그러나 본 발명은 상기의 구현에 한정되지 않는다. 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 한도에서 다양한 변형과 수정이 가능하다고 이해된다.

[표1] 분리된 호모락트산균주

균주번호	g/L 락트산염	pH	% L-락트산염
1	16.7	4.04	34
2	19.4	3.97	36
3		4.51
5	8.1	5.22	18
6	18.4	4.02	69
7	17.5	4.03	38
8	23.8	4.51	43
9	25.1	4.29	34
10	23.6	4.33	73
11	26.2	4.3	37
12	24.6	4.32	36
13	21.6	4.22	54
14	24.3	4.15	77
15	24.2	4.13	51
16	21.3	4.25	64
17	18.1	4.34	39
18	25.2	4.28	74
19	10.4	5.06	35
20	25.3	4.14	69
21	23.1	4.17	76
22	22.4	4.21	75
23	28.6	4.12	78
24	22.8	4.19	41
25	22.6	4.19	44
26	8.1		17
27	23.7	4.19	48
28	22	4.21	44
29	21.1	4.18	51
30	23.6	4.15	47
32	20.4	4.15	46
34	19.5		41
35			40
36			35
37			37
38			42
39			62
40			36
41	24.5	4.17	76
42	25.9	4.25	75
43	25	4.26	74
44	26.2	4.28	74

균주번호	g/L 락트산염	pH	% L-락트산염
45	25.9	4.27	74
46	27.4	4.25	76
47	26	4.27	73
48	13.3	4.54	47
49	28.4	4.19	47
50	29.2	4.21	47
51	26.1	4.22	76
52	30.6		48
55			2
56			31
57			32
58			0
59			0
60			0
61			45
62			88
63			5
64			92
65			41
66			4
67			5
68			5
69			49
70			48
71			44
72			5
73			5
74			5
75			3
76	53.27		2
77			4
78			3
79			3
80			3
81	15.8
82	16.7
83	39.9		55
84	14
85	14.2
86	8.1
87	8.4
88	4.61		55

Claims

(a) 영양배지 내에서 내산성 호모락트산 세균 균주가 락트산을 생산하기에 충분한 배양 pH로 상기 영양배지에서 상기 내산성 호모락트산 세균 균주를 배양하고 이 때의 최종 배양 pH가 4.0 이하이고 상기 배양이 적어도 30℃ 의 온도에서 실시되어 (i) 적어도 25g/L 의 유리 L-락트산 또는 적어도 25g/L 의 유리 D-락트산을 포함하는 용액; (ii) 전체속도가 적어도 1.0g/L/hr 인 유리 락트산; 및 (iii) 적어도 25g/L 의 유리 L-락트산 또는 적어도 25g/L 의 유리 D-락트산을 포함하는 용액으로서, 상기 유리 L-락트산이 적어도 50% 의 광학순도를 갖거나 상기 유리 D-락트산이 적어도 50% 의 광학순도를 갖는 것으로된 용액을 제조하는 단계; 및

(b) 유리 락트산을 회수하는 단계를 포함하는 락트산 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 영양배지 내에서 상기 세균 균주를 배양하여 적어도 40g/L의 유리 L-락트산을 포함하는 용액을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 세균 균주를 35 내지 53℃ 에서 배양하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 영양배지는 적어도 15g/L 의 콘침지수(corn steep water) 건조 고형물을 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 영양배지는 적어도 50g/L 의 탄수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 영양배지는 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 영양배지는 락트산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기의 세균 균주를 적어도 47℃ 의 온도에서 배양하여 적어도 40g/L 의 유리 L-락트산을 함유하는 용액을 생성하는 단계를 포함하고;

상기 영양배지는 (i) 적어도 25gL 의 콘침지수 무수 고형물, (ii) 적어도 50g/L 의 글루코스나 적어도 50g/L 의 프룩토스 또는 적어도 50g/L 의 이들의 혼합물, 및 (iii) 적어도 20g/L 의 CaCO₃ 를 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 8항에 있어서,

상기 영양 배지는 이스트 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 8항에 있어서,

상기 영양 배지는 비이온성 계면활성제을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 6항에 있어서,

상기 염기는 탄산칼슘, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 중탄산나트륨 또는 그의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 7항에 있어서,

상기 락트산염은 락트산칼슘, 락트산나트륨, 락트산암모늄 또는 그 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
(a) 콘침지수를 함유하는 영양배지 내에서 내산성 호모락트산 세균 균주로 락트산을 제조하기에 충분한 배양 pH로 상기 영양배지에서 상기 내산성 호모락트산 세균 균주를 배양하고 이 때의 최종 배양 pH가 4.2 이하이고 상기 배양이 적어도 30℃ 의 온도에서 실시되어 (i) 적어도 25g/L 의 유리 L-락트산 또는 적어도 25g/L 의 유리 D-락트산을 포함하는 용액; 및 (ii) 적어도 25g/L 의 유리 L-락트산 또는 적어도 25g/L 의 유리 D-락트산을 포함하는 용액으로서, 상기 유리 L-락트산이 적어도 80% 의 광학순도를 갖거나 상기 유리 D-락트산이 적어도 80% 의 광학순도를 갖는 것으로된 용액을 제조하는 단계; 및

(b) 유리 락트산을 회수하는 단계를 포함하는 락트산 제조방법.
제 13항에 있어서,

상기 내산성 호모락트산 세균 균주가 적어도 40g/L 의 유리 락트산을 생성하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 13항에 있어서,

상기 내산성 호모락트산 세균 균주가 47℃ 이상의 배양온도에서 적어도 40g/L 의 유리 L-락트산을 생성하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 13항에 있어서,

상기 내산성 호모락트산 세균 균주가 적어도 15g/L 의 콘침지수 건조 고형물을 함유하는 것을 특징으로 하는 락트산 제조방법.
제 13항에 있어서,

상기 염기는 배양 단계 중에 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는 하는 락트산 제조방법.
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