CN1422947A - 一种制备自给自足发酵培养基的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从可再生原料中制备自给自足发酵培养基,用于从可再生的原料中生产代谢物的方法,其特征在于它包括从由小麦、豌豆、和土豆的可溶物,优选的是小麦可溶物的组中选择出可再生原料,处理所述可再生原料,以从中释放出可直接被微生物同化的碳和氮源,以及回收这样获得的自给自足发酵培养基。

Description

一种制备自给自足发酵培养基的方法
本发明涉及一种从可再生原料中制备自给自足发酵培养基的方法。
更准确地，本发明涉及一种处理可再生原料的特殊方法，这样可将其直接用于发酵以直接生产代谢物。
在本发明中，“可再生原料”这种表述可以被理解成廉价的、未精练的、通常是无毒的，并且实氮和碳源的食品工业废料。更具体地，它还包括淀粉工业的副产物，更进一步地，还可以是小麦、豌豆、土豆淀粉工业的副产物。
“自给自足发酵培养基”这种表述也可以被理解成包含了所有微生物的生长所必需的营养素，并且对于生产所需的理想代谢物是必须和充足的，而不需要另外添加任何营养添加剂。
依照本发明的发明目的，“代谢物”可以被理解为通过碳源的发酵途径得到的转换产物，碳源被微生物直接吸收。它们将是选自有机酸和氨基酸中的有利的代谢物，并且优选的有机酸可以是左旋乳酸、葡萄糖酸、柠檬酸，氨基酸可以是左旋赖氨酸或者左旋苏氨酸。
通常认为对于生产理想代谢物的发酵，选择一种可再生原料作为基料，要靠它的实用性、费用和允许的高生产率的能力来确定。
然而还认为，发酵培养基不但要包括添加矿物质和有机盐的碳源，还包括添加矿物和有机盐的氮源。
发酵领域的专家认为“碳源”可以从诸如糖蜜、小麦、玉米、稻米、木薯或土豆淀粉水解物这样的可再生原料中获得，但是“直接同化碳源”是糖，糖是从所述碳源中提炼或提纯的，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和糊精。
“氮源”或蛋白质营养素的例子是，它们的部分可以是酵母抽提物、玉米浆、原生浆、糖蜜蛋白质、肉质提取物或者豆浆。然而通常优选的是酵母抽提物可以作为氮源使用，也可以作为维他命的添加物，以及矿物质的添加物。
在大多情况下，由“直接同化氮源”，即葡萄糖或者果糖，以及酵母抽提物构成的发酵培养基，可以主要的用在大量的发酵上，这样的发酵可以引起有机酸的产生，例如乳酸、丙酸、葡萄糖和柠檬酸等等，本质上的氨基酸，例如赖氨酸或者其他的工业价值的代谢物。
在WO98/54351的专利申请说明书中是这样的，例如描述了用来生产左旋赖氨酸的培养基制备方法，从包含蔗糖的组中选择出一种碳源，但是也有从各种各样的原料(例如玉米和小麦)中获得的糖蜜、淀粉和淀粉水解物，作为碳源。
然而另外添加一种氮源就是必要的了，氮源从包含了酵母抽提物或者糖蜜、蛋白质、缩氨酸和氨基酸、玉米或者小麦的可溶物的组中选择出。
在有机酸领域，这里选择出一个用在乳酸生产上的例子：
在美国专利5416020中描述了一种从乳清渗透物和乳清中生产左旋赖氨酸的方法，在这种方法中酵母抽提物在二价锰元素存在下、以同Lactobacillusdelbrueckii sub.bulgaricus ATCC55163的变形异种一起被添加，这样可以产生本质上的左旋赖氨酸。
乳清渗透物实际上包括了75％到80％重量的乳糖，但不包括大尺寸的蛋白质，因此对微生物的生长必要的氮源就是缺乏的，因此，用酵母抽提物作为补充物就是必要的。补充的乳清基本上包含重量范围65％到75％的乳糖。
然后酵母抽提物就可以提供具有营养物的发酵培养基，通过乳清渗透物和乳清本身提供的营养物不是充分的。
—美国专利4467034中示出了以乳清作为的原料产生乳酸的可能性，它用了新型的Lactobacillus bulgaricus DSM 2129。乳清仍然要用氮源补充，即肉质提取物、玉米浆或者豆浆同时补充维他命和天然盐。
在这些情况下，这些发酵培养基的使用需要依照氮/碳比率的络合剂化合，加上另外用在理想的微生物的有效的生产率的必要的附加物。
这些介质也被用在生物质的生产上(例如用在制备乳酸酵母)，但由于考虑到微生物新陈代谢的需要，也显示出了同样的困难。
然而，此外还认为这些介质具有不可推断出的工业规模生产这些所需的相同代谢物的缺陷(根据它们的组成难于有标准的介质和随后的净化步骤所致的附加成本)。
前述内容的结论是一个没有令人满意的简单、有效的方法，该方法使不必使用繁琐的、大量的、昂贵的步骤而制备一种发酵培养基，发酵培养基的碳源和氮源在这种水平上的选择和结合成可以生产出适合想要发酵的平衡发酵培养基。
期望研究出一种方法，它比已经存在的这些方法在实际应用中有更好的反映，申请人的公司已经发现通过直接从可再生原料中制备自给自足发酵培养基的方法可以达到这个目标。
更具体地说，依照申请人的公司的发明描述的方法能从可再生原料中制备出可产生代谢物的发酵培养基，该方法的特征在于：
—从由小麦、豌豆、和土豆的可溶物，优选的是小麦可溶物的组中选择出可再生原料，
—处理所述可再生原料以从中释放出可直接被微生物吸收的碳源和氮源，
—回收由此获得的自给自足发酵培养基。
因此，依照本发明方法的第一步骤包括从包含小麦、豌豆、和土豆的可溶物，优选的是小麦可溶物的组中选择出可再生原料。
申请人的公司已经克服了技术上的偏见，该偏见认为主要从碳源和氮源的单独来源中制备发酵培养基时，必须重新构成复合的发酵培养基，还必须添加维他命、增长因子和痕量元素。
上面已经说到，实际上通常认为在该技术领域中，利用一种复合的发酵培养基，可以生产出具有好产量和产率的所需代谢物。
然而，这种情形伴生一种特别的重要缺陷，它包括高费用和调整其达到生产微生物要求的困难。
经过大量长期和艰苦的学习研究，申请人的公司已经发现在可再生的原料中，更进一步地说在小麦、豌豆和土豆淀粉工业的剩余物中，适合实际应用需要的发酵培养基。
更进一步地，这里又一次克服了另一个技术缺陷，申请人的公司已经发现可再生的原料可从包含了小麦、豌豆和土豆的可溶物的组中方便地选择出，然而一般认为这些可溶物仅仅作为用来构成发酵培养基的氮源。
依照申请人的公司的发明，已经发现这些可溶物可以直接使用，经过处理后，不但作为一种氮源，而且作为碳和微量元素的独特的来源，或者甚至是维他命来源，这对于通过一种理想的微生物的发酵是必需和足够的。
例如小麦的可溶物可以从小麦“B”淀粉的分离流中获得，小麦“B”淀粉的分离流在湿小麦淀粉磨制过程中从分离淀粉中获得。
B淀粉或者第二种淀粉是基本上由小淀粉颗粒或者被损坏颗粒的占主要比例的淀粉所构成。
除了这种B淀粉，我们知道小麦的可溶物也包括不可忽略量的高分子量蛋白质，该蛋白质能够构成用在重要的微生物中的蛋白质来源。
至于土豆的可溶物，它们可以通过回收可溶物部分而得到，此可溶物部分从粉碎的土豆中在起始阶段提取的淀粉中获得。
豌豆的可溶物由豌豆的浸渍水产生，并且在粉碎和分离豌豆的各种组成之前被回收。
因此依照本发明的方法的第二步骤包括处理所述的可再生原料，以从中释放出可被微生物直接吸收的碳源和氮源。
这里的可再生原料除了包括作为氮源的缩氨酸和游离氨基酸外，还包括作为碳源或者葡萄糖来源的淀粉，而且包括高分子量的蛋白质。
然而，一些可以直接吸收淀粉或者高分子量蛋白质的微生物是可以接受的，因为它们具有对它们的生长和生产理想代谢物起到衰减作用所必需的酶结构。对于其他的微生物，需要把它们置于经过处理的碳源和氮源下，以便于被直接吸收。
因此这些处理要适应理想的微生物的生理机能要求。
在依照本发明的方法中的第一具体实施例中，例如对于微生物，缺乏的淀粉酶、通过对所述的可溶物加热到至少60℃，用α酶和葡萄糖淀粉酶和随意的使用一种酶进行处理，该酶能够降解从具有半纤维素酶、果酸酶和木聚糖酶的组中选择出的植物来源的体壁的多糖，则可发酵的糖可以方便的从可溶物中释放出。
在依照本发明的方法中的第二具体实施例中，对于不能吸收高分子量的蛋白质的微生物，通过用蛋白水解酶(例如选自碱性蛋白酸和酸性蛋白酸进行处理)，被吸收的氨基酸和/或缩氨酸从可溶物中被方便的释放出。
在PH值为7和温度为60℃的条件下实施6个小时的处理，使用剂量为1％的干基剂量，可以方便地用碱性蛋白酶进行处理。
至于用来实施蛋白质水解的合适的酸性蛋白酶，它们可以从胰液素、胰岛素、胰凝乳蛋白酶和类似物中选择出。
在PH值为4.5和温度为60℃的条件下实施6个小时的处理，使用剂量为1％的干基剂量，可以方便地用酸性蛋白酶进行处理。
蛋白质水解步骤形成了肽，另外肽还可以对某种微生物起到活化的作用。
最后，在依照本发明的方法中的第三具体实施例中，通过液化和糖化对可溶物进行处理，另一方面，也可以对不能直接同化存在于所述可溶物的碳源和氮源的微生物实施发酵处理。
下面我们将举例说明可溶物的微量元素，或者甚至其中的维他命使得对于大量的发酵过程起到特殊的作用。
因此依照本发明的方法的第三步骤包括回收这样制得的自给自足的发酵培养基和直接将它使用到发酵中。
最好选择使自给自足的发酵培养基经过微量过滤步骤以去除掉其中的不可溶的杂质。
使用一些其他被本领域的技术人员熟知的装置可以实施这个步骤，例如薄膜微量过滤法，薄膜孔经的尺寸随所述不可溶的杂质的尺寸而改变，例如可以使用一个0.14μm的薄膜。
这些培养基对于生产乳酸、赖氨酸、乙醇、酶特别适宜，生产从麦芽糖和右旋糖苷组中选择出的多聚糖，和生产与其相关的微生物种群如乳酵素或者酵母也是特别合适的。
如果希望无需实施麻烦和昂贵的净化步骤而回收生产出的代谢物，申请人公司提议的特殊的溶液也具有这样的优点，该溶液用在依照本发明的自给自足的发酵培养基上。
实际上一般认为，在使用小麦的可溶物的情况下，B淀粉或者第二种淀粉包括如戊聚糖和脂类的这种杂质。
这些杂质(其中一些可以无需传统的净化和软化处理)发现在这些杂质的水解产物中，这样会使B淀粉不适宜例如用在食物级的葡萄糖生产中，这就是为什么认为B淀粉工业应用存在困难的原因。
在这些情况下，申请人的公司具有一定的优势，不仅已经研究出一种处理这些小麦的可溶物，可以产生自给自足的发酵培养基的方法，而且提供了一种制备这样质量的代谢物的溶液，该溶液可以不必要求所述代谢物过分苛求的净化方法。
这种溶液包括减少自给自足的发酵培养基的量，并且用可以直接同化的碳源补充，从而用一定数量的必需的碳源提供给选择出的微生物，该碳源既用于它的生长，并且可以生产出理想的代谢物，而且没有产量或者产率的损失。
然而要调整自给自足的发酵培养基的剩余部分，从而保证微生物必须的氮、天然盐和维他命成分供应，这将在下面的赖氨酸发酵中作举例说明。
本发明的其他的特征和优点将通过阅读下面的例子会显而易见，尽管以例举方式给出但不受限制。
例1
小麦的可溶物包括20％的干物质，其是从小麦“B”淀粉的分离流中制得的经过60℃、12个小时的加热，用0.05％的干基的来自NOVO的α酶TERMAMYLLC处理。
从这样被处理的小麦的可溶物中可以获得三种自给自足的发酵培养基，从这样被液化的小麦的可溶物的淀粉的糖化中可以获得第一产物(产品A)，对被液化的小麦的可溶物进行蛋白酶处理可以获得第二产物(产品B)，同时实施上面的两种处理可以获得第三产物(产品B)。
对于产品A的生产，这样液化可溶物被引入介于15％到20％之间的DM中，用0.5％干基的来自GENENCOR的淀粉水解酶OPTIDEX L 300和用0.3％的干基的来自GENENCOR的半纤维素酶SPEZYME CP，以60℃的温度实施3到5个小时的处理，从而可以释放出可发酵的糖。通过在0.14μm薄膜上的微量过滤，不能溶解的物质被移掉。
依照本发明，产品A具有14.6％干物质，具有的成分在下面的表I中被示出。
表I
    产品A
    自由基葡萄糖(％干基)     55.4
    果糖(％干基)     8.9
    氮(N6.25)(％干基)     6.4
    盐(％干基)     4.9
    PO4(％干基)     1.7
为了制备产品B，这样液化的小麦的可溶物也被引入介于在15％到20％之间的DM中(PH值用1N氢氧化钠调整到7.5～8之间)，并用0.2％到1％干基的ALCALASENOVO，以60℃的温度实施4到6个小时的处理，获得的产品具有一个最后的从6.5到7范围的PH值。通过在0.14μm薄膜上的微过滤，不能溶解的物质被移掉。
依照本发明，产品A具有14.8％干物质，具有的成分在下面的表II中被示出。
表II
    产品B
    所有的葡萄糖(％干基)     55.2
    果糖(％干基)     7
    氮(N6.25)(％干基)     7
    盐(％干基)     5.2
    PO4(％干基)     1.5
为了制备产品C，在如同制备产品A的相同的条件下，所有的小麦的可溶物先被糖化，然后在如同可能获得产品B的相同的条件下，使用ALCALASE进行处理。通过在0.14um薄膜上的微过滤，不能溶解的物质被移掉。
依照本发明，产品C具有18.4％干物质，具有的成分在下面的表III中被示出。
表III
    产品C
    自由基葡萄糖(％干基)     42.4
    果糖(％干基)     6.5
    氮(N6.25)(％干基)     10.9
    盐(％干基)     5.0
    PO4(％干基)     1.8
依据本发明的这三种小麦可溶物基的自给自足的发酵培养基中产生的氨基物具有着显著量的酸性氨基酸和非极性基团的氨基酸，即DM的数量级各自在2250mg/kg和1050mg/kg的范围。
例2
在土豆的可溶物中，实施在例1中产生产品A的处理方法，将获得下面的自给自足的发酵培养基D。
下面的表IV表示出了这种自给自足的发酵培养基的构成。
表IV
    产品D
    自由基葡萄糖(％干基)     8
    氮(N6.25)(％干基)     25.3
    盐(％干基)     20.2
    PO4(％干基)     2
在这种自给自足的发酵培养基中依照本发明产生的氨基酸具有有着显著量的酸性氨基酸和非极性基团的氨基酸，即DM的数量级各自在2730mg/kg和1100mg/kg的范围。
另外，这样获得的发酵培养基具有丰富的维他命B7(含量是传统方法获得的酵母提取物的4倍)和维他命B3。
例3
在豌豆的可溶物中，实施在例1中产生产品A的处理方法，将获得下面的自给自足的发酵培养基E。
下面的表V表示出了这种自给自足的发酵培养基的成分。
表V
    产品E
    自由基葡萄糖(％干基)     13
    氮(N6.25)(％干基)     24.2
    盐(％干基)     15.6
    PO4(％干基)     1.2
在这种自给自足的发酵培养基中依照本发明产生的氨基酸具有有着显著量的碱性基团的氨基酸和酸性基团的氨基酸，即DM的数量级各自在13150mg/kg和26780mg/kg的范围。
例4
下面的表VI示出了在发酵桶中获得的左旋赖氨酸的产率和产量，发酵桶具有15L的可用容积，依照本发明的方法对13L的小麦的可溶物进行了处理(实施例1的产物A到C)。
作为“标准的培养基”对照物，由80g/l的葡萄糖、10g/l的酵母抽提物和0.5g/l的(NH4)2HPO4构成的发酵培养基被测试。
使用依照本发明的具有150到180g/l的容量的干物质量的自给自足的发酵培养基，所述介质含有80g/l标准的“葡萄糖当量”。
依靠对小麦的可溶物的处理方法，因此这些“碳或氮当量”被直接同化，或者不用在考虑过的微生物上。
对在例1中的产品C中没有被微过滤的(称为“粗”产品C)自给自足的发酵培养基当量被作为一个“未微过滤”对照物也被测试。
使用从一个7h的预先培养的lactococcus lactis菌株(strain)得到的1.5l的培养基对这些发酵桶进行接种。
PH值设定为6.5，用NH4OH为调节12，温度是40度。
表VI
  发酵时间(h)   生物的数量(g/l)  左旋赖氨酸(g/l)  PO4(g/l)
  “标准培养基”对照物   20   8  80  0
   180g/l的产品A   20   2  20  2.4
   180g/l的产品B   20   2  30  2.2
   150g/l的产品C   18   7  80  2
   180g/l的粗产品A   18   8  80  2.1
这个表格表示出了LACTOCOCCUS LACTIS属的微生物生产左旋赖氨酸，公基于小麦的可溶物的自给自足培养基，其中通过适当的处理(在这种情况下，就是小麦B淀粉的液化和糖化以及使用ALCALASE蛋白质水解蛋白质)，碳源和氮源被直接地同化，使获得一定的产量和产率成为可能，这至少等价于使用标准生产培养基获得的产率和产量，在纯葡萄糖和酵母抽提物基础上的标准生产培养基会更昂贵。
因此被液化、糖化、蛋白质水解的小麦的可溶物可以方便地使用于乳酸的发酵上。对没有被微过滤的产品进行测试也显示出这种特殊的发酵，不可溶的杂质在哪种方式下也不会影响左旋乳酸的产量和产率。
最后，对所有的试验，在发酵后，确定生物的数量。
依照本发明的方法的被处理的可溶物是显而易见的，在这种情况下通过液化、糖化、蛋白质水解，证明对作为重组的标准介质的L.Lactis的生长是有效的。因此，依照本发明的自给自足的培养基是适合生物的量的生产，特别适合赖氨酸酵母的生产。
例5
对于生产高质量代谢物过分的使用小麦的可溶物，因此研究繁琐的净化技术的可行性是令人痛惜的。
依照本发明的下述方法，有可能限制补充被处理的小麦的可溶物，通过控制发酵的环境，也就是说完全了解所关注微生物的营养要求。
如例4中所示，在用LACTOCOCCUS LACTIS生产左旋赖氨酸的情况下，可能使产品C的干基量达到40g/l(20g/l葡萄糖当量)以及通过添加另外的85g/l葡萄糖(也就是在小麦的淀粉水解物中产生的)的补偿减少的所需碳源和氮源。
下面的表VII表示出了获得的结果。
表VII
  发酵时间(h)  生物量(g/l)  左旋赖氨酸(g/l)  PO4(g/l)
“标准培养基”对照物   20  8  80  0
 150g/l的产品C   18  7  80  2
 40g/l的产品C+85g/L的葡萄糖 23 8.1 103.5 ＜＜0.05
氮源、碳源和微量元素的“剩余的”补充使保持等效产率和产量成为可能，对于已通过3.75系数降低了的杂质量而言。
例6
S.cerevisiae类型的酵母的发酵被常规的应用在乙醇生产上。
使用依照本发明的自给自足的发酵培养基，和补充了盐类所构成的常规培养基相比较，与由作为氮源的酵母抽提物以及作为碳源的葡萄糖可以研究酵母的生物量生产。
在从例1中的产品A中制备的培养基中以80g/l的量实施S.cerevisiae生物量的生产。
参照物培养基由45g/l的葡萄糖、5g/l的酵母抽提物，10g/l的(NH4)2SO4以及5g/l的KH2PO4和2g/l的MgSO4构成。
通过用氢氧化物钠将PH值调整为5，温度设定为30度，并且在一个2L反应器中进行培养，并带有600rpm的搅拌和1vvm的通风。
下面的表格VIII表示出了在整个事件过程中两种发酵培养基中的酵母的生长的结果。
表VIII
                80g/l的产品A                     传统的培养基
    时间(h)     生物量(g/l)     葡萄糖(g/l)     生物量(g/l)     生物量(g/l)
    0     0.6     49     0.4     45
    5     2.5     Nd*     1.2     35
    8     5.7     Nd*     4     15
    23     17.6     0     10.8     0
*表示不确定
这个结果同样表示出了依照本发明的自给自足的发酵培养基特别适用于酵母生物量的生产，并且通过推广，对于所有的其合成随着所述酵母的生长的代谢物的生产也适用，这在乙醇的生产中也是如此。
例7
使用依照本发明的自给自足的发酵培养基，与由作为氮源的酵母抽提物以及作为碳源的葡萄糖和补充了盐类所构成的常规培养基相比较，可以研究乙醇的生产量。
在从例1中的产品A中制备的培养基中以180g/l的量实施S.cerevisiae生物量的生产。
培养基的培养基包括10g/l的葡萄糖、5g/l的酵母抽提物，10g/l的(NH4)2SO4以及5g/l的KH2PO4和2g/l的MgSO4。
用标准的的氢氧化钠将PH值调整为5，温度设定为30度，并且在一个15L的反应器中进行培养，并带有200rpm的搅拌。
下面的表格VIII表示出了在整个时间过程中于两种发酵培养基中的酵母的生长的结果。
表VIII
              80g/l的产品A                 传统的培养基
    时间(h)     葡萄糖(g/l)     乙醇(g/l)     葡萄糖(g/l)     乙醇(g/l)
    0     95     0     100     0
    8     75     10     81     8
    24     45     23     53     20
    48     0     42     0     43
因此，依照本发明的自给自足的发酵培养基特适用于乙醇的生产。

Claims (12)

1、一种从可再生原料中制备自给自足发酵培养基，用于代谢物生产的方法，它包括：
—从由小麦、豌豆、和土豆的可溶物，优选的是小麦可溶物的组中选择出可再生原料，
—处理所述可再生原料，以从中那里释放出可直接被微生物吸收的碳和氮源，
—回收由此获得的自给自足发酵培养基。
2、如权利要求1所述的方法，其中对自给自足的发酵培养基实施一个微过滤步骤，从中移除掉不可溶的杂质。
3、如权利要求1所述的方法，其中对可再生的原料用酶进行淀粉的液化和糖化处理，从中释放出一定量的可被直接同化的碳源。
4、如权利要求1所述的方法，其中对可再生的原料用水解蛋白酶处理，水解蛋白酶从碱性蛋白酶中选择出，从而从其中释放出一定量的可被直接同化的氮源。
5、一种从权利要求1所述的方法制备的自给自足发酵培养基中制备可以生产易提纯代谢物的发酵培养基的方法，其特征在于用可直接同化碳源补充到该发酵培养基中。
6、依照权利要求1的方法获得的发酵培养基。
7、生产乳酸的方法，包括一个使用依照权利要求6的发酵培养基的发酵步骤。
8、生产赖氨酸的方法，包括一个使用依照权利要求6的发酵培养基的发酵步骤。
9、生产多糖的方法，该多糖从麦芽糖和右旋糖苷、更优选的是麦芽糖的组中选择出，该方法包括一个使用依照权利要求6的发酵培养基的发酵步骤。
10、生产微生物种群的方法，包括一个使用依照权利要求6的发酵培养基的发酵步骤。
11、生产酶的方法，包括一个使用依照权利要求6的发酵培养基的发酵步骤。
12、生产乙醇的方法，包括一个使用依照权利要求6的发酵培养基的发酵步骤。
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