CN1351660A - 微生物的定向进化 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了微生物定向进化的方法,包括使用增变基因及在选择压力条件下培养。此方法公开了能用于本发明各种方法中的增变基因,并提供了ATCC保藏物,以作为通过此方法生产的进化微生物的例证。
Description
发明领域
本发明涉及利用增变基因定向进化微生物的方法。此方法提供了一个有利于工业应用的微生物遗传多样性库,这些工业应用的例子包括激素、生长因子和酶等异源蛋白的工业生产及化学制剂、维生素、氨基酸和染料的生物催化生产等。
发明背景
由溶剂、pH值、各类溶质、盐及温度等界定的微生物生理限制制约了微生物在工业上的适用性。有机溶剂即使在低浓度下对微生物也通常是有毒的。溶剂的毒性极大限制了微生物在工业生物技术中生产特殊化学制剂及生物除污上的应用。溶剂分子掺入到细菌膜中并破坏膜结构(Isken和Bont,1998,Extremophiles2(3):229-238);(Pinkart和White,1997,J.Bacteriol.179(13):4219-4226);(Ramos,Duque等,1997,J.Biol.Chem.272(7):3887-3890);(Alexandre,Rousseaux等1994,FEMSMicrobiol.Lett.124(1):17-22);和(Kieboom,Dennis等1998,J.ofBacteriology 180(24):6769-6772)。包括紫外线(UV)诱变及化学诱变在内的常规菌种改良方法已用于强耐受性菌株的筛选(Miller,J.,《细菌遗传学简明教程》(A Short Course In Bacterial Genetics),ColdSpring Harbor Laboratory出版社,1992)。已有许多研究致力于从各类细菌菌株中鉴别和分离耐溶剂性突变体。从K-12菌株获得了大肠杆菌自发耐溶剂突变体和在1-甲基-3-亚硝基胍(NTG)诱变过程中分离的突变体(Aono,Aibe等,1991,Agric.Biol.Chem 55(7):1935-1938)。此突变体可在二苯醚、正己烷、丙基苯、环己烷、正戊烷、对二甲苯存在的环境中生长。多种假单胞杆菌属菌株能在含有对二甲苯(Cruden,Wolfram等,1992,Appl.Environ.Microbiol.58(9):2723-2729)、苯乙烯及其它有机溶剂(Weber,Ooijkaas等,1993,Appl.Environ.Microbiol.59(10):3502-3504;de Bont,1998,生物技术发展趋势(Trends inBiotechnology),16:493-499)的甲苯-水两相体系(Inoue和Horikoshi,1989,自然(Nature),338:264-266)中适应和生长。Yomano等分离出了耐乙醇的突变体,在32次连续传代中它对乙醇的耐受性从35g/l提高到50g/l(Yomano,York等,1998,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.20(2):132-138)。使用大肠杆菌的高温进化已在本领域中公开(Bennett,1990,自然,第346卷,第79-81页),但其所达到的适合度(fitness gain)比本专利的要低。
已有描述,在一条DNA修复途径中携带突变的大肠杆菌菌株具有比典型野生型菌株更高的随机突变率(见,Miller,同上,第193-211页)。据Degenen和Cox(J.Bacteriol.,1974,第117卷,第2期,第477-487页)报导,一种携有mutD5等位基因的大肠杆菌菌株的突变率为其野生型亲本的100至10000倍。Greener等(《分子生物学中的战略》1994,第7卷,第32-34页)公开了一种增变菌株,它在经过约30次倍增生长后平均每2000bp发生一个突变。
在工业上,微生物被应用于生产目的蛋白如激素、生长因子和酶,或化学制剂如甘油和1,3-丙二醇(WO98/21340,1998年5月22日公布;及美国专利5686276,1997年11月11日颁发),维生素如抗坏血酸中间体(1985,科学(Science),230:144-149),氨基酸,和染料如靛(美国专利4520103,1985年5月28日颁发)。尽管在本领域已取得进展,但仍需改良生产这类目的蛋白、化学制剂、氨基酸和染料的微生物及其方法。
发明概述
本发明一般涉及定向进化微生物的方法,即微生物对选择压力条件作出反应而定向遗传改变的方法。一方面,本发明涉及进化微生物以使其可在例如高温、极端pH环境、存在溶剂和存在高盐等极端环境下生长的方法。另一方面,本发明还涉及进化如下微生物以使其可在期望条件下生长的方法,该微生物包含至少一个编码期望蛋白质或一酶促途径的酶的核酸。
本发明部分基于使用此说明书描述的方法可将微生物如野生型大肠杆菌(E.coli)和蟑螂埃希氏菌(E.blattae)进化成能在高浓度溶剂(如DMF或1,3-丙二醇)存在时生长的微生物的发现。本发明也部分基于使用本文描述的方法可将大肠杆菌进化成能在高温下生长的微生物的发现。本发明还部分基于微生物最佳突变率的确定以及突变率可被控制的发现。
因此,本发明提供了一种制备进化微生物的方法,其包括步骤:在适于选择进化微生物的条件下将包含至少一个异源增变基因的微生物培养增殖至少20次倍增,其中由以上异源增变基因导致的突变率至少为其野生型的约5到100000倍;和将所述进化微生物恢复野生型突变率。在一个实施方案中,此微生物还包含至少一个编码异源蛋白质的引入的外源核酸,所述蛋白质包括但不限于激素、酶、生长因子。在另一个实施方案中,酶包括但不限于水解酶如蛋白酶、酯酶、脂酶,酚氧化酶,通透酶,淀粉酶,支链淀粉酶,纤维素酶,葡萄糖异构酶,漆酶和蛋白质二硫键异构酶。本发明包括微生物的遗传改变以及引入的外源核酸的变化。
在另一个实施方案中,此微生物还含有编码至少一个酶促途径必需酶的引入核酸。在一个实施方案中,此引入核酸对此微生物是异源的,而在另一个实施方案中,此引入核酸对此微生物是同源的。在另一个实施方案中,该酶为还原酶或脱氢酶,所述酶促途径是用于生产抗坏血酸或其中间体的。在另一个实施方案中,酶为甘油脱水酶或1,3-丙二醇脱氢酶,所述酶促途径用于生产1,3-丙二醇、1,3-丙二醇前体或1,3-丙二醇衍生物。在另一个实施方案中,该酶为甘油-3-磷酸脱氢酶或甘油-3-磷酸磷酸酶,所述酶促途径用于生产甘油或甘油衍生物。在另一个实施方案中,酶促途径用于生产氨基酸如色氨酸、赖氨酸,或生产染料,如靛。
在本发明一个实施方案中,将微生物培养约20至约100次倍增;在另一个实施方案中,将微生物培养约100至约500次倍增;在另一个实施方案中,将微生物培养约500至约2000次倍增;在另一个实施方案中,将微生物培养2000次倍增以上。在一个实施方案中,增变基因导致的突变率至少为野生型的约5至约10000倍;在另一个实施方案中,增变基因导致的突变率至少为野生型的约5至约1000倍;在另一个实施方案中,增变基因导致的突变率比野生型高约5至约100倍。
在一个实施方案中,进化微生物在约3至约500个基因中包含约3至约1000个被选择突变,并可以还包含约20至约100000个中性突变。一方面,此产生的突变是非特异性的,而另一方面,此产生的突变是特异性的。
在本发明一个实施方案中,所述微生物包含一种质粒,这种质粒含有所述异源增变基因,而且将所述进化微生物恢复野生型突变率的步骤包括消除进化微生物的所述质粒。在另一个实施方案中,该质粒包含一个温度敏感型复制起点,消除包括将进化微生物在限制温度下生长。在另一个实施方案中,该微生物在染色体中包含至少一个拷贝的所述增变基因,将所述进化微生物恢复野生型突变率的步骤包括从宿主基因组中切下或除去所述增变基因,或以相同基因的功能性(非增变的)等位基因替换该增变基因。
在一个实施方案中,本发明包括使用至少一个增变基因进化微生物。在另一个实施方案中,增变基因包括但不限于mutD基因突变,mutT基因突变,mutY基因突变,mutM基因突变,mutH基因突变,mutL基因突变,mutS基因突变或mutU基因突变以及这些DNA修复基因的已经突变的同源基因,只要该突变基因已经削弱了校正功能。在另一个实施方案中,增变基因包含至少一个表I中所公开的mutD突变。
在本发明一个实施方案中,适于筛选的条件包括但不限于,在存在至少一种有机溶剂,例如醇类、二元醇类、烃类、矿物油、矿物油衍生产品、卤代化合物及芳香族化合物;存在高温,如42℃-48℃;存在高盐,和存在极端pH条件如碱性或酸性条件时培养所述微生物。
本发明包括进化革兰氏阳性与革兰氏阴性微生物以及酵母、真菌和真核细胞,包括杂交瘤。在一个实施方案中,革兰氏阴性微生物包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员,在另一个实施方案中包括埃希氏菌属(Escherichia),在另一个实施方案中包括大肠杆菌(Escherichiacoli)和蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)。在本发明另一个实施方案中,进化微生物包括ATCC保藏号为PTA-91的大肠杆菌和ATCC保藏号为PTA-92的蟑螂埃希氏菌。
本发明还提供了包含增变基因的表达载体和宿主细胞以及制备这种表达载体和宿主细胞的方法。
附图简述
图1显示了mutD基因的核酸序列SEQ ID NO:1与氨基酸序列SEQ ID NO:2。提供了mutD基因突变的说明性实例。
图2提供了1,3-丙二醇脱氢酶(PDD)的核酸序列SEQ ID NO:3。
图3提供了1,3-丙二醇脱氢酶(PDD)的氨基酸序列SEQ ID NO:4。
图4提供了大肠杆菌培养物在提高的温度下定向进化和选择的时间进程。
图5:蟑螂埃希氏菌在pH7.0时的甘油发酵。培养条件见本文。通过系列稀释进行平板计数,在Luria琼脂平板上重复3次。用HPLC测量底物和产物。
图6:蟑螂埃希氏菌GEB031-4菌株在pH7.0时的甘油发酵。培养条件见本文。通过系列稀释进行平板计数,在Luria琼脂平板上重复3次。用HPLC测量底物和产物。
根据布达佩斯条约进行的微生物保藏的说明
依据布达佩斯条约用于专利程序目的的国际承认的微生物保藏条款,申请人已经进行了以下生物保藏:
发明详述定义
保藏物性质鉴定 | 国际保藏名称 | 保藏日期 |
大肠杆菌MM294衍生物 | ATCC PTA-91 | 1999年5月19日 |
蟑螂埃希氏菌33429衍生物 | ATCC PTA-92 | 1999年5月19日 |
突变是指微生物核酸发生的任何遗产改变,它可以反映或不反映为微生物的表型变化。突变可以包含单一碱基对的改变、缺失或***;突变可以包含大量碱基对的改变、缺失或***;突变也可以包含大区域DNA的改变,如通过复制或倒位。
当有许多可能的不同核酸突变能导致一种特定表型时,则向此表型突变的机率将会高于仅少数类型的突变能导致此特定表型的情况。本文所使用的术语“野生型突变”与“自发突变”可以互换使用。自发突变率定义为基因组每被复制或倍增一次时发生突变的概率。本文所使用的术语“突变率”与“频率”相同,是指每一次倍增每个碱基对所发生突变的绝对数目。本文所使用的术语“相对率”是指两个菌株突变率的比率,其中一个菌株通常为野生型菌株。相对率指与野生型菌株相比,一个菌株更可能发生突变的可能性。野生型大肠杆菌(大肠杆菌基因组大小约为4.6×106bp)的自发突变率为每次倍增每个碱基对发生约5×10-10个突变(见Drake,1991)。倍增(doubling)指生物体基因组至少部分进行复制的过程,通常涉及通过二分***进行复制。本文所使用的“倍增”包括通过任何途径在微生物体内发生的核酸复制。
本文所用的“增变菌株”是指具有比自发突变自然发生率更高的突变率的微生物。本文所用的“增变基因”是指包含突变并削弱了校正功能的DNA修复基因。本文所用的“增变质粒”是指包含增变基因的质粒、表达载体或盒。培养含有增变基因的微生物将会在基因组复制期间导致突变事件的发生。本发明包括使用含突变的任何DNA修复基因,只要该突变的DNA修复基因能在微生物基因组或引入该微生物的外源基因中引入突变事件即可。DNA修复基因包括但不限于mutD,mutT,mutY,mutM,mutH,mutL,mutS或mutU以及这些基因的同源物。本文所用的同源物是指功能上相关的DNA修复基因。在一个实施方案中,该增变基因为含有突变的mutD基因(DNA聚合酶III的ε亚基,见Degnen等,1974,J.Bacteriol.117:477-487),所述突变提供削弱的校正功能。在本文所公开的一个实施方案中,通过质粒将此mutD突变导入微生物中。mutD突变的说明性实施方案公开于表I中。这些mutD突变通过显著降低3’-5’外切核酸酶活性而削弱了DNA聚合酶III全酶ε-亚基的校正功能(Takano等,1986,Mol.Gen.Genet.205(1):9-13)。
在提到进化微生物中的突变或遗产改变时,“中性突变”是指在给定条件下对进化菌株的表型影响很小或不可测量的突变。“中性突变”的例子包括但不限于:不会导致被编码蛋白质的氨基酸序列改变的沉默突变,影响给定条件下生长非必需的蛋白质的突变,以及染色体非编码区的突变。在本文一个说明性实施方案中,一个大肠杆菌的高温进化菌株具有对三种氨基酸的营养缺陷型特征(即不能在缺乏Cys/Met、Asp/Asn、和Pro的培养基上生长),这表明在大肠杆菌中除与在高温条件下生长有关的突变外,至少还存在三个中性突变。本文所用术语“被选择突变”是指那些在给定条件下与进化菌株表型相关的突变。“与……相关”意指此突变直接或间接负责此改进或变化的表型。
在提到宿主细胞或微生物中的突变或遗传改变时,非特异性是指宿主细胞基因组中的改变在整个基因组中随机发生并潜在可能影响所有碱基,且包括移码。非特异性突变包括单个碱基对的改变、大量碱基对的改变以及大区域DNA的改变。例如,在一个实施方案中,一种暴露于含削弱校正功能突变的MutD基因下的进化微生物将包含突变率比野生型高约5-1000倍的随机突变。在采用mutD突变的方法的一个说明性实施方案中,进化菌株至少包含3个随机突变。本发明包括提供期望表型的任何突变率。在提到宿主细胞中的遗传改变时,特异突变是指可被表征或包含可定义遗传改变的突变,所述可定义遗传改变的例子是mutT突变特征性的A∶T到C∶G的颠换;mutY与mutM突变特征性的G∶C到T∶A的颠换;mutH、mutL、mutS、uvrD(mutD)突变特征性的A∶T到G∶C与G∶C到A∶T的转换和移码;mutYmutM双突变特征性的G∶C到T∶A的多个颠换(Miller等,《细菌遗传学简明教程》,《大肠杆菌及其相关细菌实验手册》(aLaboratory Manual and Handbook for E.coli and Related Bacteria))。
在提到增变基因时,“异源”意指基因通过重组方法引入细胞中,优选在质粒上引入。增变基因也可以通过重组技术引入微生物基因组中。引入微生物的增变基因可以是此细胞中自然存在的DNA修复基因的突变,或可以与该宿主微生物异源。所提核酸被“引入”微生物中意指使用标准分子生物学技术将此核酸导入该微生物内。被引入的核酸可以与微生物中自然存在的核酸相同或不同。
本文所使用的术语“恢复野生型突变率”是指从进化微生物中除去增变基因从而恢复野生型突变率的过程。本发明包括用于从进化微生物中除去增变基因的任何过程,包括但不限于消除(curing)生物体含增变基因的定居质粒或者通过切除或其它方式从宿主基因组中除去增变基因来使正常的DNA修复功能得到恢复。消除是指产生不含携增变基因质粒的细胞的方法。使用本领域技术人员熟知的技术可消除微生物中任何定居质粒。详细说明
遗传的一个基本原理是突变随机发生并被环境选择。赋予生物体选择优势的偶发突变被优先传递给后代。本发明涉及微生物中定向期望遗传改变即定向微生物进化的方法,其方式是:将微生物暴露于增变基因下,在进化微生物中选择期望特征的获得,以及消除微生物的增变基因,或以别的方法除去增变基因,以恢复野生型突变率。
I.本发明的用途
在本发明的一方面,使用该方法进化微生物,使其可在诸如高温、高溶剂、变化的pH值、或高盐等极端环境下生长。在本发明的另一方面,使用该方法进化含有编码异源蛋白质或酶促途径(即生物催化途径)中至少一个酶的引入核酸的微生物。这种在商业上有重要意义的蛋白质包括激素、生长因子和酶。生物催化途径的实例包括那些美国专利5686276(1997年11月11日发布)公开用于生产1,3-丙二醇的途径及1985,科学,230:144-149中公开用于生产抗坏血酸中间体的途径。
本发明的方法特别有利于产生用于化学制剂和维生素生物催化生产的改良微生物,在此宿主微生物内同时或顺序发生着许多酶促反应。在这种复杂的生物催化***中,通常很难鉴别出导致低产、宿主毒性或催化失败的特定分子事件,因而很难(如果有可能的话)知道为了修正此缺陷要改变哪些特定遗传事件。本发明的方法提供了允许微生物对选择压力作出反应而进行必要改变的优点。
此外,本发明的方法提供了获得包含与多基因相关的期望表型特征(例如微生物在高温下生长的能力)的微生物的优点。增变基因的使用提供了一条产生遗传多样性的途径,在选择压力条件下同时生长允许微生物识别其生存所必需的特定遗传改变。MutD基因突变的利用使得可以为微生物提供非常大的多样性,从中可筛选出提供生长优势的特定遗传改变。因此,本文所公开的方法避免了采用从一定范围基因开始定向进化过程的现有方法常常产生的有限多样性。此外,本文所公开的方法减少了通常与产生遗传多样性的现有方法相关的额外筛选步骤。本发明的另一个优点是这些方法能被应用于没有测序及在设计遗传改变方面信息可能有限的微生物。
在本文公开的说明性实施方案中,通过重组技术将一种位于质粒上的突变mutD基因引入大肠杆菌或蟑螂埃希氏菌。然后将大肠杆菌或蟑螂埃希氏菌细胞在适当条件下培养,该条件使得可以在选择压力条件下生长至少20次倍增、多达至少约2000次倍增的时间。在一个实例中,大肠杆菌生长在提高的温度或存在DMF的条件下,在另一个实例中,蟑螂埃希氏菌生长在存在溶剂如DMF或1,3-丙二醇的环境下。结果,大肠杆菌进化成了能在高达约48℃的温度下或存在80g/l的DMF下生长的微生物。进化了的高温生长大肠杆菌同时也成为了三种氨基酸Cys/Met、Asp/Asn及Pro的营养缺陷型。蟑螂埃希氏菌进化成为了能在至少105g/l的1,3-丙二醇下厌氧生长的微生物,此微生物在与产生1,3-丙二醇相关的至少一个催化活性1,3-丙二醇脱氢酶中包含遗传改变,如图3所示。
含增变基因的质粒,即增变质粒,能被用来控制微生物的突变率。如以下第II部分所述,可以设计质粒结构以提供增变基因的降低表达水平,由此提供了一条改变天然存在DNA修复基因与增变基因的比率的途径。这提供了一种将mutD突变(导致随机突变发生)的优势与其它已知增变基因(对细胞负担较轻的低突变频率)的优势相结合的方法。此外,质粒结构可被设计来允许消除进化微生物的增变基因,例如使用温度敏感型起点,从而获得一种在微生物中打开和关闭突变事件的方法。对于革兰氏阳性微生物如整个基因组已经测序的枯草芽孢杆菌(B.subtilis),本发明可包括步骤:缺失或突变DNA修复基因,进化芽孢杆菌(Bacillus),通过发生重组事件来恢复天然存在的DNA修复***。如本文所示,对埃希氏菌属的几个成员如大肠杆菌和蟑螂埃希氏菌已用定向进化方法处理。进化的大肠杆菌和蟑螂埃希氏菌的说明性实例已经保藏于ATCC,保藏号分别为PTA-91和PTA-92。
本发明的方法提供了一种完成微生物长期进化的方法。一个内含携mutD突变的质粒的大肠杆菌菌株生长1000次倍增以上而不降低突变率。本发明还提供了一种削减生物体功能性基因组的方法。微生物能培养数千代,以仅使其必需基因保持功能状态。大部分其它基因将会携带随机性和失活性突变。
本发明还提供了一种制备非致病生物体的方法。通过引入增变基因并经过长时间培养可将致病菌株进化成增变菌株。结果是许多与致病性相关的基因将失去活性,从而使菌株可得到安全利用。
本发明还提供了一种精简生物体代谢的方法。用本文所公开的方法可制备具有营养物质高产率或低代谢率(维持性代谢)的菌株。这样的菌株可用于生产化学制剂和酶。本发明提供了一种通过引入增变基因制备微生物增变菌株的方法,从而避免了微生物天然存在的DNA修复基因对选择压力发生反应变成增变基因。这就是说,无论通过质粒还是通过进入基因组将增变质粒引入微生物中,都避免了细胞对选择压力发生反应产生增变表型。
II.增变基因与突变频率
本发明的增变基因包括但不限于DNA修复基因mutD、muT、mutY、mutM、mutH、mutL、mutS或mutU或它们在其它微生物中的同源物的突变。Miller(同上)公开了这些DNA修复基因的描述;Maki等(1983,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.80,7137-7141)公开了mutD基因(GenBank登记号K00985.1 G1:147678以及图1);Ginetti等(1996,微生物学(Microbiology),Aug,142(Pt8):2021-9)公开了枯草芽孢杆菌mutS与mutL基因;Prudhomme等(1989,J.Bacteriology,8月,171(10):5332-8)公开了肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的hex B修复基因、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的mutL、以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PMS1;Priebe等(J.Bacteriol.,1988,1月,170(1):190-6)和Prudhomme等(1991,J.Bacteriol.,11月,173(22):7196-203)公开了肺炎链球菌的hexA以及鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的mutS;Macdonald等(1998,Heptology,7月,28(1):90-7)公开了人类mutS同源基因hMSH2与人MutL同源基因hMLH1;Dillon等(1994,遗传学(Genetics),9月,138(1):61-74)公开了脉孢菌属(Neurospora)的mut-1;mutL与mutS的酵母同源基因公开于WO97/15657。本发明方法包括使用至少一个突变的DNA修复基因,并且可以涉及使用一个以上突变的DNA修复基因。优选增变基因对微生物的野生型基因是显性的,以致在微生物基因组中引入突变。在一个优选的实施方案中,该增变基因为mutD基因的突变。图1显示了mutD基因的核酸与氨基酸序列。Takano,K.等(1986,Mol Gen Genet 205,9-13,大肠杆菌的增变基因dnaQ与mutD的结构和功能)公开了一种特殊的mutD突变mutD5。Miller,J.H.描述获得了CSH116菌株(1992,细菌遗传学简明教程)。据报导,此菌株携带mutD5等位基因。发现此菌株中的mutD基因与已公布的mutD5基因有很大的区别。本文将CSH116菌株中的mutD基因称为mutD5’。表I显示了mutD5与mutD5’基因中发现的突变。Taft-Benz,S.A.等(1998,Nucl.Acids Res.26,4005-4011,大肠杆菌DNA聚合酶III的3’-5’校正核酸外切酶的突变分析)最近鉴定了导致突变频率水平增加的mutD基因的进一步突变。表I描述了本发明中有用的各种mutD突变。表II描述了mutD突变所使用的各种启动子,表III描述了增变质粒和大肠杆菌中现有突变频率的范围。
表I.mutD编码区中的突变
MutD | 克隆 | |||||
#核苷酸 | #氨基酸 | 核苷酸 | 氨基酸 | 核苷酸 | 氨基酸 | |
44 | 15 | C | Thr | T | Ile | mutD5’ |
218 | 73 | T | Leu | G | Trp | mutD5 |
69 | 123 | T | Thr | C | Thr | mutD5’ |
418 | 138 | C | Pro | T | Pro | mutD5’ |
451 | 151 | T | Ala | C | Ala | mutD5’ |
484 | 161 | G | Leu | A | Arg | mutD5’ |
491 | 164 | C | Ala | T | Val | mutD5 |
661 | 220 | A | Glu | C | Asp | mutD5’ |
665 | 222 | A | Ile | C | Leu | mutD5’ |
673 | 225 | T | Ala | A | Ala | mutD5’ |
688 | 228 | C | Leu | T | Leu | mutD5’ |
706 | 236 | A | Lys | G | Lys | mutD5’ |
715 | 239 | T | Ser | C | Ser | mutD5’ |
727 | 243 | A | Arg | G | Arg | mutD5’ |
表II.mutD突变
名称 | 突变 |
野生型 | ATGACCGCTATG...SEQ ID NO:5 |
pOS100 | TTGA-CGCTTG...SEQ ID NO:6 |
pOS101 | GTGACCGCTGTG...SEQ ID NO:7 |
pOS102 | GTG-CCGCTGTG...SEQ ID NO:8 |
pOS104 | TTGACCGCTTTG...SEQ ID NO:9 |
pOS105 | GTGACCGCTGTGAGCACTT(G)CAATTACACGCCAGATCGTTCTCGATACCGAAAT(C)...SEQ ID NO:10 |
pOS106 | GTGACCGCT-TG...SEQ ID NO:11 |
表III.
增变(mutD5)和对照(mutD)质粒及大肠杆菌中现有突变频率的范围 | |||||||
# | 质粒 | 基因型 | ori | ab抗性 | size(kb) | 突变频率(平均) | 增变率(相对) |
1 | pMutD5-61 | mutD5’ | pSc | kan | 5.97 | 6.4×10-5 | ~1000-fold |
2 | pMutD71-Ts | mutD | pSc | kan | 5.97 | 2.5×10-8 | wild type |
3 | pBRmutD68 | mutD5’ | pBR322 | kan,bla | 6.16 | 1.1×10-4(AL data) | ~10000-fold |
4 | pBRmutD727 | mutD | pBR322 | kan,bla | 6.16 | nd | wild type |
修饰的 | |||||||
5 | pOS100 | mutD5’ | pBR322 | kan,bla | 6.16 | 2×10-5 | ~800-fold |
6 | pOS101 | mutD5’ | pBR322 | kan,bla | 6.16 | 3.8×10-6 | ~152-fold |
7 | pOS102 | mutD5’ | pBR322 | kan,bla | 6.16 | 1.1×10-6 | ~44-fold |
8 | pOS104 | mutD5’ | pSc | kan | 5.97 | 4.35×10-7 | ~17-fold |
9 | pOS105 | mutD5’ | pSc | kan | 5.97 | 1.1×10-6 | ~44-fold |
10 | pOS106 | mutD5’ | pSc | kan | 5.97 | 5×10-6 | ~200-fold |
MutD突变能导入包括移码在内的所有类型的碱基对改变(Miller,同上)。据报导,mutD5在富含营养的培养基中具有1000到10000倍的相对突变频率,即每一次倍增每个碱基对发生5×10-6到5×10-7个突变(Denegen等,1974,J.Bacteriol.117,477-478)。考虑到大肠杆菌基因组有4.6×106bp,则每个基因组每一次倍增,mutD5基因将发生2.3至23个突变。在本发明一个优选实施方案中,制备了允许降低突变mutD修复基因表达水平的增变质粒,从而使相对于野生型的突变率减小。如表II所举例说明的,mutD基因具有2个位置相邻、中间包含6个核苷酸的ATG起始密码子。第一个ATG被认为是假定的。以GTG或TTG密码子替换两个ATG密码子以降低mutD5’的表达水平。两个ATG密码子间多达5个核苷酸的间隔被截短。与mutD5’质粒相比,包含这些增变基因的质粒引入大肠杆菌时会提供更低的突变率。
结果,包含携带此突变mutD基因的质粒的微生物表达正常水平由天然mutD编码的功能性ε-亚基以及低水平由此突变mutD5’编码的无功能ε-亚基。这两类亚基竞争聚合酶III。因此,此微生物在大部分时间内将具有校正功能,但在某一小部分时间内,由于mutD突变的存在,细胞将会不加校正地复制其DNA。这样,微生物的诱变频率可通过调节增变基因的表达或通过改变天然DNA修复基因与其对应的突变DNA修复基因的比率而改变。这些质粒引入的增变基因所导致的突变应当仍与由mutD5的染色体拷贝所产生的突变是一样随机的。实施例III的数据显示,大部分应用优选比野生型高5至1000倍的突变率。控制突变频率的其它方法包括在质粒中含有mutD的双拷贝或将其整合进微生物基因组,和/或通过使用可传递热敏感质粒,这种质粒可用于将细胞暂时转变成增变株,然后再使其恢复野生型突变率。调节突变频率的再一种方法是鉴定由于使校正降低而导致中等突变频率的mutD突变。这类突变体最近已被鉴别,但不知道这些突变是否优先导致几种类型的特定突变(Taft-Benz等,1998,Nucl.Acids Res.26:4005-4011)。突变率按Horiuchi等所述用利福平或链霉素测定(Horiuchi等,1978,Mol.Gen.Genet.163:227-283)。
按布达佩斯条约规定保藏于ATCC的微生物保藏物也举例说明了用本文所公开和要求保护的方法制备的微生物的突变率和分子指纹说明。
III.增变基因与增变质粒的构建
可通过本领域技术人员常规使用的方法进行含增变基因质粒的构建和微生物的转化。在本文的一个实施方案中,编码增变基因的核酸在复制型质粒(即增变质粒)上引入微生物中,在进化后将该质粒从微生物中消除或以其它方法除去。在本文公开的另一个实施方案中,在天然DNA修复基因之外或替代此天然基因,将编码增变基因的核酸引入微生物的基因组中。
如同编码蛋白质或酶的核酸一样,编码增变基因的核酸可以从天然来源分离或化学合成。获取编码DNA修复基因mutD、mutT、mutY、mutM、mutH、mutL、mutS或mutU的核酸的来源见第II部分。图1提供了mutD的核酸及氨基酸序列,表I和表III提供了mutD的优选突变以及每一结构的突变率。一旦得到了编码增变基因的核酸,就可以通过本领域熟知的技术构建含有此增变基因的质粒或其它表达载体。分子生物学技术见《分子生物学克隆实验室手册》(Molecular Biology Cloning:A LaboratoryManual)(Sambrook等,第二版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,纽约(1989年))及《分子生物学当代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)(Brown,T.,Supplements 21、24、26及29)。获得编码增变基因的核酸并利用适当载体将其转化到宿主细胞中。各种适于在细菌中克隆、转化及表达的载体、转化方法与表达盒均为本领域技术人员所知。
典型地,质粒载体包含指导核酸转录和翻译的序列、选择标记及允许其自主复制或染色体整合的序列。适宜的载体包含携带转录起始控制的基因的5’区及控制转录终止的DNA片段的3’区。这些控制区可以来源于宿主的同源或异源基因,只要这些所选控制区域在此宿主细胞中能起作用。
起始控制区域或启动子用于启动增变基因的表达。实际上,任何具有启动表达能力的启动子都适用于本发明。一旦构建了合适的盒,即可将它们转化宿主细胞。一般的转化程序见《分子生物学当代方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)(第1卷,Ausubel等编,John Wiley& Sons公司,1987,第9章),包括磷酸钙法、PEG转化、电穿孔及原生质转化。
在使用增变质粒将微生物定向进化后,消除此微生物的增变质粒以使微生物恢复野生型突变率。消除微生物中包含增变基因的定居质粒的方法包括用不亲和质粒转化含增变质粒的微生物;Heery等所描述的电穿孔技术(1989,Nucl.Acids.Res.,17:10131);在含吖啶橙或溴化乙锭的培养基中生长(Jeffery Miller,1972,以吖啶橙消除大肠杆菌菌株中的附加体,分子遗传学实验(Curing of Episomes from E.Coli strainswith Acridine Orange from Experiments in Molecular Genetics),ColdSpring Harbor Laboratories,第140页)。在此方法中,将吖啶橙以125ug/ml加至5ml肠杆菌科(Enterobacteriaceae)菌株培养物中,然后在37℃过夜培养。第二天,将培养物铺板,采用单一菌落制备质粒核酸。以本领域技术人员熟知的方法分析此核酸,以确定此质粒是否存在。对基因组中包含增变基因的微生物来说,可用本领域技术人员所熟知的技术将此微生物恢复野生型突变率,这些技术例如通过同源重组技术切除增变基因或以天然DNA修复基因替换增变基因。
IV.培养条件和选择压力
在微生物暴露于增变基因下后,将微生物培养在期望的选择压力条件下,选择压力的例子是提高的温度、pH值、盐或者有诸如DMF或1,3-丙二醇等溶剂存在。其它溶剂的例子包括醇类、二元醇类、烃类、矿物油、矿物油衍生产物、卤代化合物及芳香族化合物。
如本领域技术人员所知,生长条件具有菌株依赖性。Truesdell等(1991,细菌学杂志(Journal of Bacteriology),173:6651-6656)及Sonoyama等(1982,应用与环境微生物学(Applied and EnvironmentalMicrobiology),卷43,第1064-1069页)公开了常规培养条件。当存在例如抗生素抗性基因等选择标记时,可以在培养基中添加包括但不限于四环素、氨苄青霉素或氯霉素。
在本发明的方法中,根据微生物和选择的类型,培养物可以在或者液体培养基或者固体培养基中进行或需氧或厌氧生长。如果培养物在液体培养基中生长,则优选经过多轮复制(20或更多轮),以使选择的生存微生物的生长超过其野生型。如果培养物在固体培养基中(例如在琼脂平板上)生长,则优选进行大量重复平板培养,以直接挑选出选择的生存微生物,于每一轮应用更高的选择压力,并扩大能在特定条件下生长的群体。
参照以下实施例,本领域技术人员将能更充分地理解实施本发明的方式和方法,这些实施例不是意以任何方法限制本发明或其权利要求书的范围。
实施例
实施例1:mutD质粒与mutD5’质粒的构建及在3个细菌菌株中的测试以下实施例阐述了包含增变基因MutD5’的质粒的构建。
使用引物mutd1(5’-CGCCTCCAGCGCGACAATAGC GGCCATC-3’)SEQ IDNO:12和mutd2(5’-CCGACTGAACT ACCGCTCCGCGTTGTG-3’)SEQ ID NO:13,通过PCR分别从大肠杆菌和大肠杆菌CSH116(Miller1992)的基因组DNA扩增mutD与mutD5’基因。将PCR产物克隆进pCR-Blunt载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。将方向正确的克隆中分离质粒,并以限制性酶SamI-HindIII消化。突出末端以T4聚合酶补齐后,克隆至以SmaI-PvuII消化的pMAK705质粒中。将连接产物转化至JM101感受态细胞中。所产生的质粒具有温度敏感型复制起点,并携带卡那霉素抗性标记,命名为pMutD-71(对照质粒,野生型基因型)与pMutD5-61(增变质粒)。
质粒在大肠杆菌MM294(F-endA1 hsdR17(rk -mK +)supE44 thi-1relA1)菌株及蟑螂埃希氏菌ATCC 33429的耐溶剂进化中进行了成功的测试。所有的进化实验均在LB培养基中进行。通过将细胞悬液等分试样在含100ug/ml利福平或链霉素的LB平板上铺板测定突变率。以抗性细胞数除以平板培养细胞总数来计算突变频率。实施例2:溶剂耐受性的进化
以下实施例阐述了利用实施例1中构建的增变质粒进行耐溶剂性微生物的进化。
为使进化实验量化,使用添加了50、60、70、80及90g/l DMF和25ug/ml卡那霉素的LB琼脂平板。每个进化群体的大小限制在106个细胞。每次铺板后,计数产生的菌落数并选择10个菌落进行下一次铺板。将所选菌落的细胞混合,将包含106个细胞的等分试样铺于含有相同和更高浓度DMF的新鲜平板上。在2次连续铺板后,通过在提高的温度下培养以消除细胞中的质粒。蟑螂埃希氏菌33429与大肠杆菌MM294分别于41℃和43℃下消除。在指定温度下继代培养3至4次足以进行87%-100%的消除。通过在选择性或非选择性培养基上平行培养克隆筛选单个消除了的克隆。此消除还通过从所选克隆分离纯化质粒并进行凝胶分析而得到证实。
用与其含质粒的亲本所用相同浓度的DMF测试该消除菌株的生长。实验显示:(1)含增变质粒的菌株比含对照质粒的菌株具有优势;(2)在消除了增变质粒的菌株中进化特征得到了保留。
短期进化结果总结于表IV。在2次铺板方法中,我们获得了大肠杆菌菌落,它们能够在含浓度比对照克隆高20g/l的DMF的平板上生长。对包含对照质粒及增变质粒的大肠杆菌MM294菌株的分析表明:携带对照质粒的细胞的突变频率比含pMutD5-61增变质粒的细胞的突变频率低3个数量级以上。我们的结果显示,高频突变非常有利于细胞在提高浓度的DMF下生存(表V)。蟑螂埃希氏菌33429表现对DMF更敏感。在2次铺板中,106个细胞的群体产生了968个菌落。在混合10个更大菌落后,将新的106个细胞的等分试样铺于添加有70g/l DMF的平板上,平板上生长的小菌落超过1000个。然而,这些小菌落在转移至新鲜的含70g/l DMF的平板上后不能生存。在第2次于含60g/l DMF的平板上铺板后,蟑螂埃希氏菌33429菌株(pMutD5-61)的突变频率从4.55×10-6下降到1.1×10-7(表V)。与大肠杆菌相比较,在蟑螂埃希氏菌中质粒MutD5-61首先提供了更低的突变频率。在含DMF环境下培养后,蟑螂埃希氏菌菌株的突变能力显著降低。尽管大肠杆菌和蟑螂埃希氏菌均属于肠杆菌科,在蟑螂埃希氏菌细胞环境中大肠杆菌mutD5基因产物的行为可能有所不同。然而,pMutD5使蟑螂埃希氏菌在60g/l DMF平板上存活的优点是显而易见的。携带pMutD-71的对照细胞在50g/l以上DMF存在时不能生长。
与蟑螂埃希氏菌33429菌株(pMutD5-61)相反,在大肠杆菌菌株中,我们没有观察到其突变能力的明显调整。到进化实验结束时,突变频率一直保持在相同范围内(表V)。
使用进化培养物的单一菌落进行消除实验。在蟑螂埃希氏菌33429菌株和大肠杆菌MM294菌株中,消除的效率为87-100%。已消除克隆的突变频率与野生型对照的频率相近,且已消除克隆保持了其在提高浓度的DMF下生长的能力。蟑螂埃希氏菌33429的消除克隆生长在60g/l DMF下,大肠杆菌MM294菌株生长在80g/l DMF下。MM294和蟑螂埃希氏菌33429菌株的最初耐受性分别为60g/l和50g/l DMF。该进化菌株将其耐受性分别提高了20g/l和10g/l DMF。因此,对DMF的敏感性是菌株依赖性的。
在液体培养中增变质粒对进化的优势也得到测试。在添加有DMF或乙醇的液体培养基中经过4天的耐溶剂进化后,与对照培养物相比,蟑螂埃希氏菌33429菌株(pMutD5-61)在更高浓度的两种溶剂中均表现出生长。
增变质粒可被应用于细菌对不同溶剂、各种环境压力和工业生物技术中的潜在毒性特种化学物质的耐受性进化。本发明所公开的定向进化方法的一个优点是,能在任何时间停止携带增变质粒的微生物的进化。能从进化中的菌株中消除增变质粒,因此,能够保留整个菌株获得进化的期望特性。表IV.溶剂耐受性进化。抗性克隆在添加了各种浓度的DMF的LB平板上的菌落形成。
平板1 平板2菌株 基因型 DMF(g/l) 菌落数* 菌落数*MM294(pMutD5-61) 增变基因 60g/l 低密度菌苔 高密度菌苔MM294(pMutD5-61) 增变基因 70g/l 11 824MM294(pMutD5-61) 增变基因 80g/l 0 4MM294(pMutD-71) 野生型 60g/l 17 低密度菌苔MM294(pMutD-71) 野生型 70g/l 0 0EB33429(pMutD5-61) 增变基因 50g/l 低密度菌苔 高密度菌苔EB33429(pMutD5-61) 增变基因 60g/l 0 968EB33429(pMutD-71) 野生型 50g/l 793 高密度菌苔EB33429(pMutD-71) 野生型 60g/l 0 0
*菌落数表示培养在LB-DMF平板上的106个细胞中的存活菌落表V含增变质粒和对照质粒的细菌的突变频率菌株 进化前突变率 DMF(g/l)* 进化后突变率MM294(pMutD5-61) 9.2±6.5×10-5 80g/l 4.7±4×10-5MM294(pMutD-71) 4.15±3.4×10-8 60g/l 2.9±2.4×10-8EB33429(pMutD5-61) 4.55±3.7×10-6 60g/l 1.13±0.9×10-7EB33429(pMutD-71) 2.6±2.1×10-8 50g/l 4.7±3.8×10-8
*将LB-DMF平板上挑选的单一菌落在LB培养基中培养至ODA260=0.8-1.2,在30℃下铺于LB-利福平或链霉素平板上。实验重复3次。实施例3:高温菌株的进化
实施例3阐述了以允许进行发酵的恒浊方式在连续发酵条件下的高温进化,在恒浊方式中细胞密度保持稳定。采用菌株A:W1485(ATCC12435)(=非增变株)与B:W1485/pBRmutD68(含增变质粒的同样菌株)进行了两个独立实验。两个菌株均在恒浊器内的LB培养基中连续培养约1800次倍增。基于测定的生长速率由计算机控制温度,以维持一次倍增时间约1小时。当培养物生长速度较快时提高温度,反之亦然。两种培养的时间进程见图4。最初,始于W1485/pBRmutD68的培养物的进化比始于W1485的培养物的进化快。这表明了增变质粒的优势。然而,在约400次倍增后,W1485达到更高的温度。我们还测定了从这两个进化实验所采样品的突变率。表6表明,初始克隆的突变频率相差3000倍。然而,在进化实验期间,突变频率会聚到了2倍以内。这个实验说明,温度进化的速率随着实验的进行而降低。可以预料,在野生型菌株中,存在少数最初限制高温生长的基因。这些基因中的有利突变将会导致适应性的相对大的增加。然而,随着温度的增加,可以预料,会有越来越多的基因限制生长,从而减缓了进化的步伐。如果单个突变只给其携带者带来很小的生长益处,则需将群体生长相当多的倍增次数,以从群体中富集携带这些突变的克隆。结果,在进化期间,进化的最佳突变率将会降低。在表6中,按Miller(1992,同上)给出的方法利用利福平测定了突变率。
表VI用于温度进化的菌株和群体的突变率
实施例4:蟑螂埃希氏菌的定向进化及在1,3-丙二醇溶剂存在下的筛选
菌株/群体 | 倍增次数 | 温度℃ | 突变率 |
W1485/pBRmutD68 | 0 | 45 | 3142.9 |
AL018 | 210 | 47.22 | 3428.6 |
AL019 | 376 | 47.50 | 2028.6 |
AL038 | 1811 | 48.21 | 1442.9 |
W1485 | 0 | 45 | 1.0 |
AL017 | 231 | 47.10 | 0.9 |
AL035 | 543 | 47.91 | 134.3 |
AL040 | 1385 | 48.57 | 514.3 |
向蟑螂埃希氏菌ATCC PTA-92中转入质粒pMutD68(见表III),然后将其培养在含1、5、10、20及30g/l 1,3-丙二醇的培养基中(培养物标示为GEBxxx,其中“xxx”表示转入新鲜培养基的次数)。所有的定向进化实验均在以甘油作为唯一碳源的已知成分极限培养基中于厌氧条件下进行。蟑螂埃希氏菌的生长不需要维生素B12,然而,最初的实验在生长培养基中于两种条件下进行:(1)含维生素B12,(2)不含维生素B12。
对所有浓度的1,3-丙二醇,GEB001在18-22小时内达到最大的1030-1060mOD(A650)。因此,30g/l的1,3-PD不抑制GEB001的生长。GEB在50g/l的1,3-PD存在时的生长速率为在30g/l的1,3-PD存在时的约一半(第22小时为590mOD:1030mOD)。发现1,3-PD耐受性的临界值为70至80g/l。经过10次转移后,GEB010能在78小时内于80g/l 1,3-PD存在时生长至350mOD。然而,这些细胞经下一次转移后不能在80g/l 1,3-PD浓度下生长。
本领域已知蟑螂埃希氏菌中存在产生1,3-丙二醇的酶促途径(Roth等,1986,Annu.Rev.Microbiol.50:137-181)。为了确定蟑螂埃希氏菌是否能够在培养基中添加的1,3-丙二醇浓度以外产生1,3-丙二醇,将GEB011培养在添加有2-13C甘油和70g/l 1,3-PD的培养基上。然后以NMR(13C)分析上清液,结果显示,形成了约2.6g/l 13C 1,3-PD。因此,GEB细胞在1,3-PD存在时能够产生1,3-丙二醇。
在B12存在时,1,3-丙二醇抗性进化更快。经过2个月的进化后,GEB025(+B12)能在95-100g/l的1,3-丙二醇存在时生长。在存在1,3-丙二醇下选择时厌氧生长3个月后,GEB028(-B12)能够在添加有110g/l 1,3-丙二醇的培养基中生长。对GEB031在添加有85、95、105及115g/l 1,3-丙二醇的LB平板上厌氧生长的分析表明,细胞在85g/l存在时比在105g/l存在时形成大得多的菌落。在115g/l 1,3-丙二醇中没有观察到细胞生长。结果表明,在以本发明所述的定向进化技术对蟑螂埃希氏菌经过3个月应用后,在需氧条件下对1,3-丙二醇的耐受性从75g/l提高到105g/l。GEB031菌株中的质粒通过在41.5℃下培养而得到消除。GEB031-4被作为示例性克隆保藏于ATCC并具保藏号。实施例5:进化的蟑螂埃希氏菌中的遗传改变
比较了野生型蟑螂埃希氏菌和进化的菌株GEB031之间的1,3-丙二醇脱氢酶(PDD)。进化菌株的PDD对1,3-丙二醇具有更高的Km值。材料和方法
菌株:野生型ATCC 33429,蟑螂埃希氏菌,含有实施例4所述的突变PDD并具有ATCC保藏号PAT-92。
培养:细胞在2800ml冯巴赫瓶内的500ml复合培养基中于30℃以225rpm的转速振荡培养20小时。此培养基由5.4g/l KH2PO4、1.2g/l(NH4)2SO4、0.4g/l MgSO47H2O、2.0g/l酵母提取物、2.0g/l色氨酸及9.2g/l甘油的自来水溶液组成。在高压灭菌前以KOH调节pH值至7.1(Honda等,1980,J.Bacteriol,143:1458-1465)。
提取:离心收集细胞,注意避免厌氧条件。沉淀重悬于含50mM KCl与1mM DTT pH8.2的100mM Tricine中。通过弗氏压碎器破碎细胞。于20K×g离心20分钟澄清粗提物,然后100K×g离心1小时,得到高速上清液(HSS)组分。
测定:PDD的测定按Johnson,E.A.等(1987,J.Bacteriol.169:2050-2054)描述的方法进行。
PDD的部分纯化:在16×100Poros 20HQ柱上分离HSS。缓冲液为A:含100uM MnCl的50Mm HEPES,pH7.4;和B:含500mM KCl的A缓冲液。上柱后调流速10ml/min。梯度为10CV洗涤,线形梯度至10CV中的70%B,及1CV至100%B。在梯度的极早组分中检测到活性。在添加额外DTT到1mM后将33429菌株的合并柱组分用于测定。合并GEB031菌株的活性组分,并于PM30膜上浓缩,加入额外1mM DTT后以浓缩形式使用。
菌株 | GD(U/mg) | PDD(U/mg) | 比率GD/PDD |
33429 | 0.64 | 0.22 | 2.9 |
GEB031 | 0.79 | 0.08 | 9.9 |
PDD的动力学:结果如下。
实施例6:蟑螂埃希氏菌1,3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)的克隆及测序
菌株 | Km(mM丙二醇) | Km(uM NAD) |
33429 | 28 | 57 |
以蟑螂埃希氏菌基因组作为模板,使用基于肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)dhaT序列并在5’端引入了一个XbaI位点、3’端引入了一个BamH I位点的合成引物,采用PCR扩增dhaT基因。产物亚克隆于pCR-BluntII-TOPO(Invitriogen)中。克隆的dhaT以标准技术测序。
DNA测序结果列于SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2。引物15’TCTGATACGGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT 3’SEQ ID NO:14引物25’GCGCCGTCTAGAATTATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTG 3’SEQ ID NO:15
如本领域技术人员所知,通过PCR方法产生的核酸序列可能无意中包含错误。本发明也包括可来源于蟑螂埃希氏菌ATCC PTA-92的编码PDD的核酸。
实施例7:野生型蟑螂埃希氏菌(ATCC保藏号33429)与进化菌株GEB031-4(ATCC保藏号PTA-92)的比较
此实施例显示,以本发明的方法处理过的具有ATCC保藏号PTA-92的蟑螂埃希氏菌在厌氧发酵期间能够完全消耗800mM的甘油,而且不积累3-羟基-丙醛(3HPA),不失去生活力。与此相反,野生型蟑螂埃希氏菌积累50mM的3HPA,并在仅消耗350mM的甘油后即失去生活力。
野生型蟑螂埃希氏菌与进化型蟑螂埃希氏菌在以下培养基中进行发酵:每升水中含有75g甘油、5gK2HPO4·3H2O、3gKH2PO4、2g(NH4)2SO4、0.4gMgSO4·7H2O、0.2gCaCI2·2H2O、4mgCoCl2·2H2O、2g酵母提取物及1g蛋白胨。以20%NaOH调节pH值。两个发酵均于30℃在充N2下进行,用静置过夜的预培养物接种。野生型蟑螂埃希氏菌积累3HPA,并停止生长和代谢甘油。3HPA的积累很高,达到50mM。随着培养时间增加,细胞密度没有改变,但细胞的生活力却发生了变化。平板计数表明了3HPA的积累具有毒性。与此相反,进化菌株积累的3HPA不超过6mM,且随着培养时间增加细胞的生活力没有失去。在培养物消耗掉全部甘油后,再加入甘油,培养物继续将甘油转化为1,3-丙二醇。见图5和图6。
本文所引用全部参考文献,包括专利、专利申请、序列以及出版物,在此完整地引入作为参考。
Claims (48)
1.制备进化微生物的方法,包含步骤:
a.将包含至少一个异源增变基因的微生物在适于选择进化微生物的条件下培养至少20次倍增,其中所述异源增变基因产生至少为野生型的5-100000倍的突变率,和
b.使所述进化微生物恢复野生型突变率。
2.权利要求1的方法,其中所述微生物还包含至少一个编码异源蛋白质的引入核酸。
3.权利要求2的方法,其中所述异源蛋白质包括激素、酶和生长因子。
4.权利要求3的方法,其中所述异源蛋白质是酶。
5.权利要求4的方法,其中所述酶包括水解酶如蛋白酶、酯酶、脂酶,酚氧化酶,通透酶,淀粉酶,支链淀粉酶,纤维素酶,葡萄糖异构酶,漆酶和蛋白质二硫键异构酶。
6.权利要求1的方法,其中所述微生物还含有编码一酶促途径所必需的至少一种酶的引入核酸。
7.权利要求6的方法,其中所述酶为还原酶或脱氢酶,所述酶促途径用来产生抗坏血酸或抗坏血酸中间体。
8.权利要求6的方法,其中所述酶为甘油脱水酶或1,3-丙二醇脱氢酶,所述酶促途径用来产生1,3-丙二醇、1,3-丙二醇前体或1,3-丙二醇衍生物。
9.权利要求6的方法,其中所述酶为甘油-3-磷酸脱氢酶或甘油-3-磷酸磷酸酶,所述途径用来产生甘油和甘油衍生物。
10.权利要求6的方法,其中所述酶促途径用来产生氨基酸或染料。
11.权利要求1的方法,其中将所述微生物培养约20到约100次倍增。
12.权利要求1的方法,其中将所述微生物培养约100到约500次倍增。
13.权利要求1的方法,其中将所述微生物培养约500到约2000次倍增。
14.权利要求1的方法,其中将所述微生物培养2000次倍增以上。
15.权利要求1的方法,其中所述进化微生物包含约3到约1000个被选择突变。
16.权利要求1的方法,其中所述进化微生物还包含约20到约100000个中性突变。
17.权利要求1的方法,其中所述进化微生物在约3至约500个基因中包含约3到约1000个被选择突变。
18.权利要求17的方法,其中所述突变为非特异性的。
19.权利要求17的方法,其中所述突变为特异性的。
20.权利要求1的方法,其中所述增变基因产生至少为野生型的约5倍到约10000倍的突变率。
21.权利要求1的方法,其中所述增变基因产生至少约5倍到约1000倍的突变率。
22.权利要求1的方法,其中所述增变基因产生比野生型高约5倍到约1000倍的突变率。
23.权利要求1的方法,其中所述微生物中含有携带所述异源增变基因的质粒,且所述使所述进化微生物恢复野生型突变率的步骤包括消除此进化微生物的所述质粒。
24.权利要求23的方法,其中的质粒含有温度敏感型复制起点。
25.权利要求1的方法,其中所述微生物在染色体中包含至少一个拷贝的所述增变基因,且所述使所述进化微生物恢复野生型突变率的步骤包括切除所述增变基因。
26.权利要求1的方法,其中所述增变基因包含mutD、mutT、mutY、mutM、mutH、mutL、mutS或mutU突变或其同源物。
27.权利要求26的方法,其中所述增变基因包含具有表I所示突变的mutD。
28.权利要求1的方法,其中所述适于选择的条件包含将所述微生物在至少一种有机溶剂存在时培养。
29.权利要求28的方法,其中所述有机溶剂包括醇类、二元醇类、烃类、矿物油、矿物油的衍生产品、卤代化合物及芳香族化合物。
30.权利要求1的方法,其中所述适于选择的条件包含将所述微生物在提高的温度下培养。
31.权利要求30的方法,其中所述提高的温度为约42℃到约48℃。
32.权利要求1的方法,其中所述适于选择的条件包含将所述微生物在高盐存在时培养。
33.权利要求1的方法,其中所述微生物包括革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物、真菌、酵母或真核细胞。
34.权利要求33的方法,其中所述微生物为肠杆菌科。
35.权利要求34的方法,其中所述微生物为埃希氏菌属。
36.权利要求35的方法,其中所述微生物为大肠杆菌。
37.权利要求35的方法,其中所述微生物为蟑螂埃希氏菌。
38.权利要求1的方法,其中所述进化微生物为具有ATCC保藏号PTA-91的大肠杆菌。
39.权利要求1的方法,其中所述进化微生物为具有ATCC保藏号PTA-92的蟑螂埃希氏菌。
40.包含增变基因的表达载体。
41.权利要求40的表达载体,其中所述增变基因为突变的MutD。
42.权利要求40的表达载体,其中所述突变的MutD具有表I所示的突变。
43.包含权利要求40的表达载体的宿主细胞。
44.权利要求43的宿主细胞,其是革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物。
45.权利要求44的宿主细胞,其是肠杆菌科。
46.已分离的蟑螂埃希氏菌微生物,其保藏在ATCC且具有保藏号PTA-92。
47.已分离的大肠杆菌微生物,其保藏在ATCC且具有保藏号PTA-91。
48.制备进化微生物的方法,包括步骤:
a.将微生物中的DNA修复基因突变以得到突变株,
b.在适于选择进化株的条件下将此突变株培养至少20次倍增,其中所述突变株产生至少为所述野生型微生物的5-100000倍的突变率,和
c.恢复所述进化微生物的所述天然DNA修复基因。
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