JPWO2010032698A6 - 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌 - Google Patents
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Abstract
本発明は、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子(ただし、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせと、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせとを除く)を有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系を備えている乳酸生産大腸菌と、この乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産する乳酸生産方法を提供する。
Description
本発明は、植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌に関する。
乳酸は、ポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある有用な物質である。乳酸にはL−乳酸とD−乳酸があり、現在工業生産されているポリ乳酸はL−乳酸ポリマーであるが、D−乳酸についてもポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。自然界には乳酸菌や糸状菌など乳酸を効率良く生産する微生物が存在し、それらを用いた乳酸製造法には、L−乳酸を効率良く生産させる微生物としてLactbacillus delbrueckii等を、またD−乳酸を効率良く生産させる微生物としてSporolactobacillus属の微生物等を用いた方法が知られている。
但しいずれの用途においても、原料たる乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。
但しいずれの用途においても、原料たる乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。
近年の研究の進展によって、D−乳酸を選択性高く高生産する微生物が発明されている(国際公開2005/033324号パンフレット参照)。
また、安価な糖原料であるスクロースから高選択的にD−乳酸を生産する大腸菌も知られている(Biotechnolohy Letters,Vol.27,pp.1891−1896(2005)参照)。しかし、スクロースからD−乳酸を生産する大腸菌は生産性が低く、また、スクロースの資化に非常に時間がかかり、工業化において課題となっていた。
L−乳酸については、グルコースを原料としてL−乳酸を高い選択性で高生産する大腸菌は知られているものの(特開2007−49993号公報)、スクロースからL−乳酸を生産する大腸菌はなかった。
また、安価な糖原料であるスクロースから高選択的にD−乳酸を生産する大腸菌も知られている(Biotechnolohy Letters,Vol.27,pp.1891−1896(2005)参照)。しかし、スクロースからD−乳酸を生産する大腸菌は生産性が低く、また、スクロースの資化に非常に時間がかかり、工業化において課題となっていた。
L−乳酸については、グルコースを原料としてL−乳酸を高い選択性で高生産する大腸菌は知られているものの(特開2007−49993号公報)、スクロースからL−乳酸を生産する大腸菌はなかった。
従来の知見によれば微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースPTS(Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System)とスクロース非PTSの2つに大別される(例えば、特開2001−346578号公報)。スクロース非PTSを経由する場合、微生物はスクロースをそのままの形で取り込み、その後にグルコースとフルクトースに分解する。一方スクロースPTSを経由する場合では、微生物はスクロースを取り込む際にスクロースをリン酸化し、スクロース−6−リン酸へと変換する。そして微生物内部でグルコース−6−リン酸とフルクトースに分解する。
即ちいずれのメカニズムを経由した場合でも、スクロース由来のフルクトースは、まずはリン酸化されない形で微生物内部に出現することとなる。そしてこのリン酸化されていないフルクトース(以下、非リン酸化フルクトースと呼ぶ)が解糖系へ取り込まれるためには、フルクトースがグルコースに異性化されるか、又はリン酸化される必要がある。しかし該微生物が大腸菌(一部のスクロースを資化できる大腸菌は除く)の場合、非リン酸化フルクトースをグルコースへ異性化する活性、フルクトースをリン酸化する活性はいずれも非常に低いことが文献で示唆されている(FEMS Yeast Res,Vol.5,pp.1055−1062(2005);PNAS,Vol.98(26),pp.15257−15259(2001);J.Bacteriology,Vol.184(19),pp.5307−5316(2002)参照)ため、仮に大腸菌内部で非リン酸化フルクトースを出現させることに成功したとしても、別段の手段を講じない限り、当該大腸菌が非リン酸化フルクトースを資化することは期待できなかった。
スクロース非PTSはCscB(スクロースの取り込みを行う)、CscA(微生物内部でスクロースの分解を行う)、CscK(フルクトースのリン酸化を行う),CscR(CscB,A,Kの発現を制御する)の4つの因子から構成されていることが知られている。上記Biotechnolohy Letters,Vol.27,pp.1891−1896(2005)には、これら4つの因子をD−乳酸生産大腸菌に導入し、スクロースからの対糖収率93%、生産性=96.5g/L/120時間を達成したと記載されている。しかしこの生産性は工業化の観点からは不十分なレベルであり、更なる生産性の向上が望まれた。
またCan.J.Microbiol.,Vol.45,pp.418−422(1999)は、大腸菌にcscAのみを導入することでスクロースを原料にして大腸菌が増殖できるようになったことを開示している。しかしながら、肝心なスクロース由来のフルクトース資化については言及していない。スクロースを原料とした大腸菌による物質生産において重要なことの一つは、スクロース原料からの高収率の実現である。そのためにはスクロース由来グルコースのみならず、スクロース由来フルクトースも効率よく資化されることが必須条件となる。しかるにこの文献では、大腸菌にCscAのみを導入し、スクロースが資化されることは示してはいるものの、スクロース由来フルクトースがどの程度資化されているかについては全くデータを開示してはいない。
cscAについては、cscAとcscBとcscKとcscRの遺伝子群を導入することでホスホエノールピルビン酸(PEP)に由来するアミノ酸、例えばトリプトファンの産生を更に向上することが知られている(例えば、特開2007−49993号公報)。
このように、スクロースから乳酸を生産する従来の方法では、いまだ生産性が低く、スクロースの資化に非常に時間がかかるため、安価で工業的に利用価値の高いスクロースを充分に利用して乳酸を工業的に生産する技術の向上に対する要請が依然として存在している。
本発明は、スクロースの資化をより短時間で行い、スクロースから乳酸をより効率よく生産するために有用な乳酸生産細菌及び乳酸生産方法を提供することを目的とする。
本発明は、乳酸生産細菌及び乳酸生産方法を提供する。即ち、本発明は、以下のとおりである。
[1] スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子(ただし、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせと、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせとを除く)を有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系を備えている乳酸生産大腸菌。
[2] 前記スクロース非PTS遺伝子群の中で、スクロース加水分解酵素遺伝子のみを有し、且つ遺伝子組み換えによる乳酸生産強化系を備えている[1]記載の乳酸生産大腸菌。
[3] 前記乳酸生産大腸菌が、フルクトースの代謝能力向上系を更に有する[1]又は[2]記載の乳酸生産大腸菌。
[4] 前記乳酸生産強化系が、ピルベートホルメートリアーゼ活性の不活化あるいは低減化を含む[1]〜[3]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[5] 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸又はL−乳酸を生成するためのNADH依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[6] 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているFAD依存型D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の不活化あるいは低減化と、を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[7] 前記乳酸生産強化系が、L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性及びFMN依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくともどちらか一方の不活化あるいは低減化と、を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[8] 前記フルクトースの代謝能力向上系が、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化またはフルクトース取り込み能力の強化である[3]〜[7]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[9] 前記フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化が、フルクトース−1−リン酸キナーゼ活性に由来する[8]に記載の乳酸生産大腸菌。
[10] 前記フルクトース代謝経路におけるフルクトース取り込み能力の強化が、該大腸菌が本来有しているFruR活性の不活化あるいは低減化に由来する[8]に記載の乳酸生産大腸菌。
[11] 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来する[1]〜[10]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[12] 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア・コリO157細菌に由来する[1]〜[10]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[13] 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼが、エシェリヒア属細菌に由来する[9]〜[12]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[14] 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼがエシェリヒア・コリMG1655由来の蛋白質である[9]〜[12]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[15] 大腸菌K12由来株である[1]〜[14]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[16] [1]〜[15]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法。
[2] 前記スクロース非PTS遺伝子群の中で、スクロース加水分解酵素遺伝子のみを有し、且つ遺伝子組み換えによる乳酸生産強化系を備えている[1]記載の乳酸生産大腸菌。
[3] 前記乳酸生産大腸菌が、フルクトースの代謝能力向上系を更に有する[1]又は[2]記載の乳酸生産大腸菌。
[4] 前記乳酸生産強化系が、ピルベートホルメートリアーゼ活性の不活化あるいは低減化を含む[1]〜[3]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[5] 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸又はL−乳酸を生成するためのNADH依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[6] 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているFAD依存型D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の不活化あるいは低減化と、を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[7] 前記乳酸生産強化系が、L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性及びFMN依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくともどちらか一方の不活化あるいは低減化と、を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[8] 前記フルクトースの代謝能力向上系が、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化またはフルクトース取り込み能力の強化である[3]〜[7]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[9] 前記フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化が、フルクトース−1−リン酸キナーゼ活性に由来する[8]に記載の乳酸生産大腸菌。
[10] 前記フルクトース代謝経路におけるフルクトース取り込み能力の強化が、該大腸菌が本来有しているFruR活性の不活化あるいは低減化に由来する[8]に記載の乳酸生産大腸菌。
[11] 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来する[1]〜[10]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[12] 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア・コリO157細菌に由来する[1]〜[10]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[13] 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼが、エシェリヒア属細菌に由来する[9]〜[12]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[14] 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼがエシェリヒア・コリMG1655由来の蛋白質である[9]〜[12]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[15] 大腸菌K12由来株である[1]〜[14]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
[16] [1]〜[15]のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法。
本発明によれば、スクロースの資化をより短時間で行い、乳酸をより効率よく生産するために有用な乳酸生産細菌及び乳酸生産方法を提供することができる。
本発明の乳酸生産菌は、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子(ただし、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせと、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせとを除く)を有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系を備えている乳酸生産大腸菌である。
本発明の乳酸生産方法は、上記乳酸生産細菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法である。
本発明の乳酸生産方法は、上記乳酸生産細菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法である。
本発明の乳酸生産菌は、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子(ただし、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせと、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせとを除く)を有し、且つ、乳酸生産強化系を備えているので、スクロース由来のフルクトースをリン酸化して菌体内に取り込むことができると共に、このフルクトースを、乳酸生産強化系を用いて乳酸へ変換する。スクロース資化能を持たない菌において、スクロース非PTS遺伝子群のうち、スクロース加水分解酵素を少なくとも含む1種以上の遺伝子を付与し、スクロースを炭素源として物質生産をさせた例はこれまで全く報告されていない。
本発明は、スクロース非PTS遺伝子群を全てではなく不完全な状態で、即ち、スクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子を、乳酸生産大腸菌に導入することによって、スクロース由来フルクトースが高効率に資化されること、更には従来よりも著しく生産性が高まることを見出したものである。この結果、植物に由来し、安価で工業的に価値の高いスクロースから、効率よく短時間で乳酸を得ることができる。
本発明は、スクロース非PTS遺伝子群を全てではなく不完全な状態で、即ち、スクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子を、乳酸生産大腸菌に導入することによって、スクロース由来フルクトースが高効率に資化されること、更には従来よりも著しく生産性が高まることを見出したものである。この結果、植物に由来し、安価で工業的に価値の高いスクロースから、効率よく短時間で乳酸を得ることができる。
特に、本発明の乳酸生産細菌は、他の糖資源であるグルコースの有無にかかわらず、スクロースやその分解産物であるフルクトースを資化して、乳酸を生産することができるので、グルコースなどの他の糖基質の減少又は枯渇を待たずに乳酸を生産することができ、より効率的である。
一般に、大腸菌では通常グルコースの取り込みがフルクトースよりも優先され、グルコースの存在下ではフルクトースは充分に代謝されないことが知られている。また、糖代謝は生物にとって基本的な機能である。このため、フルクトース代謝経路のリン酸化活性又はフルクトース取り込み能力を強化することで、細菌の生育が阻害されず、またグルコースによる代謝抑制(カタボライトリプレッション)の影響を受けずに、効率よく乳酸の生産を行うことができたことは、驚くべきことである。
一般に、大腸菌では通常グルコースの取り込みがフルクトースよりも優先され、グルコースの存在下ではフルクトースは充分に代謝されないことが知られている。また、糖代謝は生物にとって基本的な機能である。このため、フルクトース代謝経路のリン酸化活性又はフルクトース取り込み能力を強化することで、細菌の生育が阻害されず、またグルコースによる代謝抑制(カタボライトリプレッション)の影響を受けずに、効率よく乳酸の生産を行うことができたことは、驚くべきことである。
本発明におけるスクロース非PTS遺伝子群とは、微生物のスクロース資化経路のうち非PTS系に関与する遺伝子群のことをいう。詳しくは、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)、スクロース透過酵素(cscB)で構成される遺伝子群である。本発明では、このうちcscAを少なくとも含む1種以上であればよく、例えば、cscAのみ、cscA及びcscKの組み合わせ、cscA及びcscBの組み合わせ、cscA及びcscRの組み合わせ、cscAとcscBとcscRの組み合わせ、cscAとcscKとcscRの組み合わせが挙げられる。なお、本発明では、導入されるスクロース非PTS遺伝子群の遺伝子の組み合わせから、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせと、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせは除かれる。
なかでも、乳酸を更に効率よく生産するという観点から、cscAをコードする遺伝子のみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。
なかでも、乳酸を更に効率よく生産するという観点から、cscAをコードする遺伝子のみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。
本発明におけるスクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号3.2.1.26に分類され、スクロースからD−グルコースとD−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
この酵素は、K12株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、プロトン共輸送体、インベルターゼ、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非PTS代謝経路の酵素の1つである(Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照)。本発明においてこのCscAを付与することにより、特にcscAのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースを細胞膜上でグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースPTS及びフルクトースPTSを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化を可能にすることができる。
この酵素は、K12株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、プロトン共輸送体、インベルターゼ、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非PTS代謝経路の酵素の1つである(Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照)。本発明においてこのCscAを付与することにより、特にcscAのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースを細胞膜上でグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースPTS及びフルクトースPTSを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化を可能にすることができる。
本発明の宿主細菌に導入されるスクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。またcscAには、cscAを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。
本発明の宿主細菌に導入されるリプレッサー蛋白質(CscR)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質(CscR)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明の宿主細菌に導入されるフルクトキナーゼ(CscK)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ(CscK)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明の宿主細菌に導入されるスクロース透過酵素(CscB)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素(CscB)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明においてスクロース資化とは、スクロースを、そのまま、低分子化または高分子化して、好ましくは低分子化して、生体内に取り入れる能力、あるいは代謝的に別物質に変換する能力をいう。また、本発明において、資化とはスクロースをより低分子化する分解を含む。詳しくは、スクロースをD−グルコースとD−フルクトースに分解することを含む。
本発明におけるフルクトースの代謝能力が向上しているとは、フルクトースの菌体内への取り込みが増加している状態を指す。フルクトースの代謝能力向上系とは、フルクトースの代謝能力を向上させるための構造を意味する。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明の乳酸生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
本明細書中で示された数値範囲は、記載された数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本発明におけるフルクトースの代謝能力が向上しているとは、フルクトースの菌体内への取り込みが増加している状態を指す。フルクトースの代謝能力向上系とは、フルクトースの代謝能力を向上させるための構造を意味する。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明の乳酸生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
本明細書中で示された数値範囲は、記載された数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本発明における乳酸生産強化系とは、遺伝子組み換えにより導入又は改変された乳酸生産能力を向上させるための構造をいう。このような乳酸生産強化系は、対象となる大腸菌における本来の乳酸生産量を増加させるものであればいずれのものであってもよい。好ましくは、乳酸生産活性に関与する酵素活性の不活性化、低減化若しくは増強又はこれらの組み合わせを挙げることができる。これにより、上記のCscA活性と組み合わせて、本来はスクロース資化能を有しない大腸菌であっても、スクロースから乳酸を効果的に生産することができる。
なお、本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のDNAの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
なお、本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のDNAの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
本発明における「不活化」とは、既存のいかなる測定系によっても、測定された当該酵素又は転写因子であるFruRの活性が検出限界以下である状態を指す。ここでいうFruRの活性とは、FruRによって制御される遺伝子の発現によって生じる蛋白質の量、又は蛋白質の機能を定量化したものを指す。
本発明における「低減化」とは、当該酵素又は転写因子であるFruRをコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素又はFruRの活性が低下している状態を指す。ここでいうFruRの活性とは、FruRによって制御される遺伝子の発現によって生じる蛋白質の量、又は蛋白質の機能を定量化したものを指す。
本発明における「低減化」とは、当該酵素又は転写因子であるFruRをコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素又はFruRの活性が低下している状態を指す。ここでいうFruRの活性とは、FruRによって制御される遺伝子の発現によって生じる蛋白質の量、又は蛋白質の機能を定量化したものを指す。
本発明における乳酸生産強化系については、ピルベートホルメートリアーゼ(Pfl)活性の不活化あるいは低減化、D−乳酸又はL−乳酸を生成するためのNADH依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、又はこれら双方を含むものであることが、副生物の低減及び乳酸生産量の増加の観点から好ましい(ピルベートホルメートリアーゼ(Pfl)活性の不活化あるいは低減化についてはWO2005/033324参照。NADH依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強についてはYangらの文献(Metab.Eng.Vol.1(2),pp141−152(1999)参照)。
本発明におけるピルベートホルメートリアーゼ(Pfl)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号2.3.1.54に分類され、ホルメートアセチルトランスフェラーゼとも呼ばれる酵素である。本酵素はピルビン酸からギ酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
本発明におけるNADH依存性乳酸デヒドロゲナーゼには、D−乳酸デヒドロゲナーゼ(LdhA)とL−乳酸デヒドロゲナーゼ(Ldh2)が挙げられる。LdhAとは、ピルビン酸とNADHからD−乳酸とNADを生成するエシェリヒア・コリ由来の酵素を指す。Ldh2とは、ピルビン酸とNADHからL−乳酸とNADを生成する酵素を指し、例えばビフィドバクテリウム・ロングム由来の酵素を例示することができる。
本発明において乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強とは、LdhA又はLdh2をコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意にLdhA又はLdh2をコードする遺伝子より生産される酵素の活性が増加した状態を指す。
本発明において乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強とは、LdhA又はLdh2をコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意にLdhA又はLdh2をコードする遺伝子より生産される酵素の活性が増加した状態を指す。
なお、乳酸にはD−乳酸及びL−乳酸の光学異性体があるため、いずれか一方の光学異性体の生産量を高めるために、NADH依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼ又はNADH依存型L−乳酸デヒドロゲナーゼの活性の強化を含む系を、本発明では特に「D−乳酸生産強化系」又は「L−乳酸生産強化系」と称する場合がある。従って、目的とする乳酸の種類によって適宜、乳酸生産強化系の種類を選択することができる。
特に、D−乳酸をより迅速に生成するためには、D−乳酸生産強化系は該大腸菌が本来有しているFAD依存型D−乳酸デヒドロゲナーゼ(Dld)活性の不活化あるいは低減化を更に含むものであってもよい。更に好ましくは、D−乳酸生産強化系は、該大腸菌が本来有しているFAD依存型D−乳酸デヒドロゲナーゼ(Dld)活性の不活化あるいは低減化と、ピルベートホルメートリアーゼ(Pfl)活性の不活化あるいは低減化及びNADH依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強の少なくとも一方、との双方を備えることができ、Dld活性の不活性化あるいは低減と、Pfl活性の不活性化あるいは低減と、エシェリヒア・コリ由来のNADH依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼ(LdhA)活性の増強とのいずれも備えたものであることが最も好ましい。
またL−乳酸をより迅速に生成するためには、L−乳酸生産強化系は、該大腸菌が本来有しているFMN依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ(LldD)活性又はD−乳酸デヒドロゲナーゼ(LdhA)活性の不活化あるいは低減化を更に含むものであってもよく、好ましくは、LldD活性とLdhA活性が同時に不活化あるいは低減化されているとよい。更に好ましくは、pfl活性、lld活性及びldhA活性の少なくとも1つの活性が不活化あるいは低減化され、且つNADH依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されているとよい。最も好ましくは、Pfl活性及びLldD活性及びLdhA活性のいずれもが不活化あるいは低減化され、且つビフィドバクテリウム由来NADH依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されているとよい。
本発明におけるFMN依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ(LldD)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.2.3に分類される酵素である。本酵素はL−乳酸からピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
本発明においてLdhA活性が増強され、かつPfl活性が不活化あるいは低減化された細菌の例として、WO2005/033324号に記載のMT−10934/pGlyldhAを例示できる。
本発明におけるLdhA活性又はLdh2を増強する方策の一つとして、LdhA又はLdh2をコードする遺伝子を、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結した状態で発現プラスミドに組込み、それを所望の細菌へ導入する方法が有効である。その場合の解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に細菌内、好ましくはエシェリヒア・コリ内で機能する強力なプロモーターで、且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターを指し、具体的にはグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(GlyA)プロモーターが例示できる。このようにして得られた細菌は、通気条件下でD−乳酸又はL−乳酸を生産させる時にldhA又はldh2の発現が増強されていないものと比較してD−乳酸又はL−乳酸の蓄積量が向上し、不純物のピルビン酸濃度が減少すると共にD−乳酸又はL−乳酸の光学純度を向上させることが可能となる。
本発明におけるFAD依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼ(Dld)とは、D−乳酸から、補酵素である酸化型フラビンアデニンジヌクレオチドの存在下でピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。
本発明におけるDld活性が不活化あるいは低減化されている、且つ/またはPfl活性が不活化あるいは低減化されている、且つ/またはLdhA活性が増強されていることを特徴とする微生物として、WO2005/033324号に記載のエシェリヒア・コリMT−10994(FERM BP−10058)株が例示できる。
本発明におけるDld活性が不活化あるいは低減化されている、且つ/またはPfl活性が不活化あるいは低減化されている、且つ/またはLdhA活性が増強されていることを特徴とする微生物として、WO2005/033324号に記載のエシェリヒア・コリMT−10994(FERM BP−10058)株が例示できる。
本発明における解糖系、核酸生合成系、またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターで、具体的にはグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のGAPDHプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号397−440に記されている。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のGAPDHプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号397−440に記されている。
本発明におけるLdhAをコードする遺伝子がゲノム上において、解糖系、核酸生合成系、またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで該ldhAを発現し、Pfl活性が不活化あるいは低減化されている、且つ/またはDld活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする微生物としては、WO2005/033324号に記載のエシェリヒア・コリMT−10994(FERM BP−10058)株を例示することができる。
エシェリヒア・コリMT−10994株は、ldhA遺伝子をゲノム上においてGAPDHプロモーターと機能的に連結することで発現させており、また遺伝子破壊によりPflB、Dldが不活化している。該菌株は、FERM BP−10058の寄託番号で、茨城県つくば市東1丁目1番1号中央第6の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基いて、平成16年3月19日より寄託されている。
エシェリヒア・コリMT−10994株は、ldhA遺伝子をゲノム上においてGAPDHプロモーターと機能的に連結することで発現させており、また遺伝子破壊によりPflB、Dldが不活化している。該菌株は、FERM BP−10058の寄託番号で、茨城県つくば市東1丁目1番1号中央第6の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基いて、平成16年3月19日より寄託されている。
本発明の乳酸生産細菌は、フルクトース代謝能力向上系を更に備えていることが、乳酸生産効率の観点から好ましい。このようなフルクトース代謝能力向上系としては、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化あるいはフルクトース取り込み能力の強化によるものを挙げることができる。このとき、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化がフルクトース−1−リン酸キナーゼ活性の付与であり、フルクトース取り込み能力の強化がFruR活性の低減に由来するものであることが、乳酸生産効率の観点から更に好ましい。
本発明における能力の「付与」又は「強化」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものを含む。
本発明におけるリン酸化能力の「強化」とは、リン酸化酵素の活性が向上して、リン酸化された基質の量、又は当該リン酸化された基質から派生する代謝物の量が、有意に増加した状態を指す。
本発明におけるフルクトース取り込み能力の強化とは、FruRが制御する酵素活性が、FruRをコードする遺伝子の遺伝子組み換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意に当該酵素活性が低下している状態を指す。
本発明における酵素の活性は、既存の測定系のいずれによって測定された活性であってもよい。
本発明におけるフルクトース取り込み能力の強化とは、FruRが制御する酵素活性が、FruRをコードする遺伝子の遺伝子組み換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意に当該酵素活性が低下している状態を指す。
本発明における酵素の活性は、既存の測定系のいずれによって測定された活性であってもよい。
本発明におけるフルクトース−1−リン酸キナーゼ(FruK)は、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号2.7.1.56に分類され、ホスホフルクトキナーゼ1とも呼ばれる酵素である。細菌類、例えば大腸菌においてグルコース存在下でのフルクトース取り込みが一般に抑制されるのに対して、FruKの発現強化がグルコースの存在下にもかかわらず、フルクトースの取り込みを促進し、D−乳酸生産細菌においてD−乳酸の生産性の向上に寄与するという知見はこれまでに全くみられていない。また、上記CscAによってスクロースからできたフルクトースが細胞内に取り込まれてフルクトース−1−リン酸に代謝された後、一連のフルクトース代謝系におけるfruKの発現強化のみで乳酸の生産性が向上することも予想外であった。
本発明の宿主細菌に導入されるフルクトース−1−リン酸キナーゼ(FruK)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトース−1−リン酸キナーゼ(FruK)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、エシェリヒア属菌(Escherichia)、シュードモナス属菌(Pseudomonas)、アエロバクター属菌(Aerobacter)、クロストリジウム属菌(Clostridium)に由来するもの、特にエシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリMG1655株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリMG1655株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
本発明におけるFruRは、微生物がフルクトースをリン酸化して細胞内へ取り込む系であるフルクトースPTS経路を構成する遺伝子群、即ちフルクトースオペロンの発現を制御している。大腸菌の場合であれば、具体的にはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の88028〜89032に記載されている配列を有する遺伝子を挙げることができる。FruR遺伝子を破壊すると、フルクトースへのリン酸供与体であるホスホエノールピルビン酸(PEP)の合成活性が抑制されることが知られており、結果としてフルクトースは菌体内に取り込まれないことになると一般には予想される(Microbiology Reviews, Sept., pp.543-594 (1993) 参照)。従って、fruRの発現の低減がフルクトースの取り込みを促進することがあるということは全く予想外のことであり、D−乳酸生産細菌においてD−乳酸の生産性の向上に寄与するという知見も全く新規なものである。
本発明において発現が低減されるFruRの遺伝子としては、宿主細菌が本来保有するものであればよく、宿主細菌が本来有するFruRをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて組み込まれた合成DNA配列としてもよい。
より好ましくは、スクロース加水分解酵素及びフルクトース−1−リン酸キナーゼ(FruK)がいずれも、エシェリヒア・コリO157又はエシェリヒア・コリMG1655由来の各蛋白質をコードする遺伝子の導入により得られたものとすることができる。これらの細菌由来の遺伝子とすることにより、確実に機能発現させることができる。
本発明において酵素の活性を付与した細菌とは、菌体外から菌体内へ何らかの方法によって該酵素活性が与えられた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内に導入する等の方法を用いて作出することができる。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムDNAの調製、DNAの切断及び連結、形質転換、PCR(Polymerase Chain Reaction)、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et.al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。
本発明において酵素の活性が低減された細菌とは、上記の活性を付与した細菌と同様に、菌体外から菌体内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を破壊すること(遺伝子破壊)により作出することができる。
本発明における遺伝子破壊とは、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のDNAを挿入する、あるいは、遺伝子のある部分を欠失させることを示している。遺伝子破壊の結果、その遺伝子がmRNAへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたmRNAが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能になる。
遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法(自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊)が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はJ.Bacteriol.,161,1219−1221(1985)やJ.Bacteriol.,177,1511−1519(1995)やProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,97,6640−6645(2000)に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。
本発明において大腸菌とは、本来植物由来原料から乳酸を生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料から乳酸を生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。
ここで上記の各遺伝子を導入する大腸菌としては、通常の乳酸生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。より好ましくは、乳酸生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よく乳酸を生産させることができる。特に、本発明よれば、本来はスクロース資化能を備えていない大腸菌にスクロース資化能を付与し、スクロースから効率よく乳酸を生産することができる。このような、スクロース資化能を本来は備えていない大腸菌としては、K12株、B株、C株及びその由来株等を挙げることができる。
このような乳酸生産細菌としては、例えば国際公開2005/033324号パンフレットに記載されているピルベートホルメートリアーゼ(Pfl)活性が不活性化あるいは低減化され、且つエシェリヒア・コリ由来NADH依存性D-乳酸デヒドロゲナーゼ(LdhA)活性が増強された大腸菌、あるいは、これらの特性に加えて更にFAD依存性D-乳酸デヒドロゲナーゼ(Dld)活性が不活性化された大腸菌、又は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Mdh)活性が不活化または低減されている大腸菌であって、Pfl活性が不活化または低減されている、且つ/またはDld活性が不活化または低減された大腸菌などを挙げることができる。
本発明において各種遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターであることが好ましく、具体的にはグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。
また各種遺伝子を不活性化させるための手段としては、この目的で通常用いられる手段であれば特に制限されずに用いることができ、例えば相同組換え等による遺伝子破壊を挙げることができる。
また各種遺伝子を不活性化させるための手段としては、この目的で通常用いられる手段であれば特に制限されずに用いることができ、例えば相同組換え等による遺伝子破壊を挙げることができる。
本発明の乳酸生産方法は、上記乳酸生産細菌を用いてスクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産させることを含むものであり、即ち、上記乳酸生産細菌と、スクロースを含む植物由来原料とを接触させる工程と、接触により得られた乳酸を回収する回収工程とを含むものである。
上記乳酸生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、スクロースを含む植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花又は種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
このような植物由来原料に包含される炭素源には、スクロースの他に、一般的なものとしてデンプン、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物やセルロース加水分解物など又はこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、又はこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
接触工程における乳酸生産細菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地で乳酸生産細菌を培養することにより行われる。
植物由来原料と乳酸生産細菌との接触密度は、乳酸生産細菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して20質量%以下とすることができ、細菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を15質量%以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
また培地中の乳酸生産細菌の含有量としては、細菌の種類及び活性によって異なるが一般に、初発の菌濃度を培養液に対して0.1質量%〜30質量%、培養条件制御の観点から好ましくは1質量%〜10質量%とすることができる。
乳酸生産菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び乳酸を生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた培地であれば特に制限はない。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機体窒素源、及び蛋白質加水分解物等の有機体窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。
有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
好ましくは、2種以上のアミノ酸が添加された培地を挙げることができる。このような培地を用いることによって、より効率よく乳酸を生産することができる。2種以上のアミノ酸が添加された培地とは、天然に存在する各種アミノ酸の中から少なくとも2種以上を含有する培地を意味し、酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、ホエー、廃糖蜜、コーンスティープリカーなどの天然物や天然物抽出物の加水分解物を含有する培地も含む。より好ましい結果を得るためには酵母エキス、ペプトン、ホエー、廃糖蜜及びコーンスティープリカーより選ばれる少なくとも1種類、もしくはそれらの混合物が0.5質量%から20質量%含む培地が好ましく、2質量%から15質量%ではさらに好ましい。特にコーンスティープリカー添加は大きな効果が得られ、このとき硫酸アンモニウムなどの塩は添加しないほうがむしろよい結果となる場合がある。培地は通常液体培地である。
培養条件としては作成された菌体、培養装置により変動するが、一般に、培養温度は20℃から40℃、より好ましくは25℃から35℃で培養することが好ましく、pHはNaOH、NH3等で4〜9、好ましくは6.0〜7.2、より好ましくは6.5〜6.9で調整し、培養することが好ましい。培養時間は特に限定されないが、菌体が十分に増殖し、且つ乳酸が生成するに必要な時間である。
培養に際しては通常は温度、pH、通気条件、攪拌速度を制御し得る培養槽を用いるのが一般的であるが、本発明の培養に際しては培養槽を使用することに限定されない。培養槽を用いて培養する場合には、必要により、予め前培養として種培養を行い、これを必要量予め調製しておいた培養槽内の培地に接種してもよい。
本発明で得られた微生物を培養して乳酸を生産させる際には、通気を全く行わなくともよいが、より好ましい結果を得るためには通気を行った方がよい。ここで言う通気条件下とは必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、培養槽の形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるような上面通気も含み、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。
液中に通気する場合は内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせにより溶存酸素濃度が変化するために乳酸の生産性および乳酸以外の有機酸量などを指標に次のように最適条件を求めることができる。例えばABLE社製培養装置BMJ−01等の比較的小型の培養槽で培養する場合は、500gの培養液を使用した際、空気を常圧で0.005L/分〜0.5L/分、撹拌速度50rpm〜500rpm、より好ましくは、常圧で0.05L/分〜0.25L/分、撹拌速度100rpm〜400rpmで達成し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。この条件は通気撹拌条件が温度30℃の水を対象とした場合常圧で酸素移動速度係数kLaが1/h以上400/h以下となる条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件である。
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。
回収工程では、この接触によって得られた乳酸を回収するものであり、一般に、上記培養により得られた培養物から乳酸を回収することにより行われる。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。
培養物から乳酸を回収する方法は、例えば培養液からならば通常知られた方法が利用でき、例えば、菌体を遠心分離などで除去した後、酸性化した後直接蒸留する方法、ラクチドを形成させて蒸留する方法、アルコールと触媒を加えエステル化した後蒸留する方法、有機溶媒中に抽出する方法、イオン交換カラムで分離する方法、電気透析により濃縮分離する方法などやそれらを組み合わせた方法が採用できる。また、本発明の方法により生産された菌体は、乳酸の生産に適した酵素群を生産していることから、これを利用してさらに乳酸を生産し、回収することも培養物から乳酸を回収する方法の一部とみなされる。
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、特に断りのない限り、「%」及び「部」は質量基準である。
[実施例1]
<エシェリヒア・コリMG1655株dld遺伝子欠失株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのFAD依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(以下dldと略すことがある)の塩基配列も報告されている(Genbank accession number M10038)。
<エシェリヒア・コリMG1655株dld遺伝子欠失株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのFAD依存性D−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(以下dldと略すことがある)の塩基配列も報告されている(Genbank accession number M10038)。
エシェリヒア・コリMG1655株ゲノムDNAのdld遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、CAACACCAAGCTTTCGCG(配列番号1)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC(配列番号2)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(配列番号3)及びTGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(配列番号4)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを、Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley & Sons)記載の方法により調製し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号1と配列番号2のプライマーを用いて、通常の条件でPCRを行うことにより約1.4kbpのDNA断片(以下dld−L断片と呼ぶことがある)を増幅し、配列番号3と配列番号4のプライマーを用いて、通常の条件でPCRを行うことにより約1.2kbpのDNA断片(以下dld−R断片と呼ぶことがある)を増幅した。得られたdld−L断片、dld−R断片をそれぞれ、制限酵素HindIIIとPstI、PstIとXbaIで消化した。このフラグメントを温度感受性プラスミドpTH18cs1(Hashimoto-Gotoh, T., et.al., Gene, Vol.241(1), pp185-191 (2000))をHindIII、XbaIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。得られたプラスミドをpTHΔdldと命名した。
なおエシェリヒア・コリMG1655株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
なおエシェリヒア・コリMG1655株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
[実施例2]
実施例1で得られたプラスミドpTHΔdldをMG1655株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。
実施例1で得られたプラスミドpTHΔdldをMG1655株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。
次に上記クローンをLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地(3ml/試験管)に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10−2〜10−6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりdldを含む約2.0kb断片を増幅させ、dld遺伝子領域が欠失している株を選抜し、以上を満足するクローンをdld欠失株とし、得られた株をMG1655Δdld株と命名した。
[実施例3]
<エシェリヒア・コリMG1655pflB、dld遺伝子欠失株作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子(pflB)の塩基配列も報告されている(Genbank accession number X08035)。pflB遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、GCACGAAAGCTTTGATTACG(配列番号5)、TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(配列番号6)TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(配列番号7)AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(配列番号8)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
<エシェリヒア・コリMG1655pflB、dld遺伝子欠失株作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子(pflB)の塩基配列も報告されている(Genbank accession number X08035)。pflB遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、GCACGAAAGCTTTGATTACG(配列番号5)、TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(配列番号6)TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(配列番号7)AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(配列番号8)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号5と配列番号6のプライマーを用いて、通常の条件でPCRを行うことにより約1.8kbpのDNA断片(以下pflB−L断片と呼ぶことがある)を増幅し、配列番号7と配列番号8のプライマーを用いて、通常の条件でPCRを行うことにより約1.3kbpのDNA断片(以下pflB−R断片と呼ぶことがある)を増幅した。このDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、pflB−L断片をHindIII及びSphIで、pflB−R断片をSphI及びPstIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のHindIII及びPstI消化物とをT4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換して、pflB遺伝子の5´上流近傍断片と3´下流近傍断片の2つの断片を含むプラスミドを得、pTHΔpflと命名した。
得られたプラスミドpTHΔpflを、実施例2で得られたMG1655Δdld株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。
得られたクローンから、実施例2と同様の方法に従ってpfl遺伝子が破壊されたMG1655Δdld株を得、MG1655ΔpflΔdld株と命名した。
得られたクローンから、実施例2と同様の方法に従ってpfl遺伝子が破壊されたMG1655Δdld株を得、MG1655ΔpflΔdld株と命名した。
[実施例4]
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdh株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのmdh遺伝子の塩基配列も報告されている(Genbank accession number M24777)。mdh遺伝子(939bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC(配列番号9)、AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(配列番号10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG(配列番号11)及びAAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(配列番号12)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdh株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのmdh遺伝子の塩基配列も報告されている(Genbank accession number M24777)。mdh遺伝子(939bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC(配列番号9)、AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(配列番号10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG(配列番号11)及びAAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(配列番号12)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号9と配列番号10、配列番号11と配列番号12の組み合わせで、通常の条件でPCRを行うことにより約800bp(以下mdh−L断片と呼ぶことがある)及び、約1,000bp(以下mdh−R断片と呼ぶことがある)のDNA断片を増幅した。このDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、mdh−L断片をKpnI及びBamHIで、mdh−R断片をBamHI及びXbaIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のKpnI及びXbaI消化物とをT4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換して、mdhをコードする遺伝子の5´上流近傍断片と3´下流近傍断片の2つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをpTHΔmdhと命名した。
プラスミドpTHΔmdhを実施例3で得られたエシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdld株に形質転換し、実施例2と同様の方法に従って、mdh遺伝子が破壊されたMG1655ΔpflΔdld株を取得した。本株をMG1655ΔpflΔdldΔmdh株と命名した。
[実施例5]
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのaspA遺伝子の塩基配列も報告されている(Genbank accession number X04066)。aspA遺伝子(1,482bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(配列番号13)、CGAACAGTAATCGTACAGGG(配列番号14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG(配列番号15)及びTTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(配列番号16)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのaspA遺伝子の塩基配列も報告されている(Genbank accession number X04066)。aspA遺伝子(1,482bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(配列番号13)、CGAACAGTAATCGTACAGGG(配列番号14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG(配列番号15)及びTTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(配列番号16)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号13と配列番号14、配列番号15と配列番号16の組み合わせで、上記プライマーを用いて、通常の条件でPCRを行うことにより約910bp(以下aspA−L断片と呼ぶことがある)及び、約1,100bp(以下aspA−R断片と呼ぶことがある)のDNA断片を増幅した。このDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、aspA−L断片とaspA−R断片の両者ともにDNA Blunting Kit(タカラバイオ)で末端を平滑化した後、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にて5´末端をリン酸化した。また、温度感受性プラスミドpTH18cs1を、SmaI消化後、アルカリフォスファターゼにて脱リン酸化処理を行った。上記のリン酸化した2種類の断片と、脱リン酸化したプラスミドをT4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換して、aspA遺伝子の5´上流近傍断片と3´下流近傍断片の2つの断片を含むプラスミドを得て、このプラスミドをpTHΔaspと命名した。
プラスミドpTHΔaspを実施例4で得られたエシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdh株に形質転換し、最終的にaspA遺伝子が破壊されたMG1655ΔpflΔdldΔmdh株を得、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株と命名した。本株を得る詳細な方法は、本発明の実施例2に記載された方法に準じた。
[実施例6]
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株のゲノム上ldhAプロモーターのGAPDHプロモーターへの置換>
エシェリヒア・コリのldhA遺伝子の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number U36928)。グリセルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてAACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(配列番号17)、及びACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(配列番号18)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにD−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ldhA)を取得するためにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてGGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(配列番号19)、及びCCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(配列番号20)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで約1.0kbpのD−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)遺伝子フラグメントを得た。上記の2つのDNAフラグメントとプラスミドpUC18を制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−ldhAを回収した。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株のゲノム上ldhAプロモーターのGAPDHプロモーターへの置換>
エシェリヒア・コリのldhA遺伝子の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number U36928)。グリセルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてAACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(配列番号17)、及びACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(配列番号18)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにD−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ldhA)を取得するためにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてGGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(配列番号19)、及びCCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(配列番号20)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで約1.0kbpのD−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)遺伝子フラグメントを得た。上記の2つのDNAフラグメントとプラスミドpUC18を制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−ldhAを回収した。
さらにエシェリヒア・コリMG1655株のldhA遺伝子5’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(配列番号21)とGCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(配列番号22)を用いて、エシェリヒア・コリゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより約1000bpのDNA断片を増幅した。
また、エシェリヒア・コリMG1655株のグリセルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターの配列情報に基づいて作製されたGGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(配列番号23)とエシェリヒア・コリMG1655株のldhA遺伝子の配列情報に基づいて作製されたAACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(配列番号24)を用いて、先に作製したプラスミドpGAPldhAを鋳型としてPCRを行い、GAPDHプロモーターとldhA遺伝子の開始コドン近傍領域からなる約850bpのDNAフラグメントを得た。
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素KpnIとXbaI、XbaIとPstIで消化し、このフラグメントを、温度感受性プラスミドpTH18cs1をKpnIとPstIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、pTH−GAPldhAと命名した。
得られたプラスミドpTH−GAPldhAを、実施例5で得られたエシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを、クロラムフェニコールを含まないLB液体培地で30℃一晩培養し、さらにクロラムフェニコールを含まないLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれを、クロラムフェニコールを含まないLB寒天プレートとクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりGAPDHプロモーターとldhA遺伝子を含む約800bp断片を増幅させ、ldhAプロモーター領域がGAPDHプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株と命名した。
[実施例7]
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655のfruR遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、fruR遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の88028〜89032に記載されている。
<エシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株の作製>
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655のfruR遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、fruR遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の88028〜89032に記載されている。
fruR遺伝子(1005bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、TACTGCAGATCTCAATAACCGCTATCTGG(配列番号25)、GCTCTAGATAGCCATTGTACTGGTATGG(配列番号26)、TATCTAGATGCTCAGCCGTAGCTAAGC(配列番号27)及びCGAATTCATCCATCTGACATTCGCTGG(配列番号28)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号25と配列番号26、配列番号27と配列番号28の組み合わせで上記プライマーを用いて、通常の条件でPCRを行うことにより約950bp(以下fruR−L断片と呼ぶことがある)及び、約880bp(以下fruR−R断片と呼ぶことがある)のDNA断片を増幅した。このDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、fruR−L断片をPstI及びXbaIで、fruR−R断片をXbaI及びEcoRIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のPstI及びEcoRI消化物とをT4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換して、fruR遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の2つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをpTHΔfruRと命名した。
プラスミドpTHΔfruRを実施例6で得られたエシェリヒア・コリMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株に形質転換し、実施例2と同様の方法に従って、fruR遺伝子が破壊されたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株を取得した。本株をMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株と命名した。
[実施例8]
<エシェリヒア・コリO157由来スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリO157のインベルターゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、インベルターゼをコードする遺伝子(cscA)はGenBank accession number AE005174に記載のエシェリヒア・コリO157株ゲノム配列の3274383〜3275816に記載されている。上記遺伝子がコードする蛋白質のN末端側には、アミノ酸一文字表記でMTQSRLHAA(配列番号35)で表記される、疎水性が高くシグナルペプチダーゼで切断されるアミノ酸配列と同様な配列が存在する。上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
<エシェリヒア・コリO157由来スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリO157のインベルターゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、インベルターゼをコードする遺伝子(cscA)はGenBank accession number AE005174に記載のエシェリヒア・コリO157株ゲノム配列の3274383〜3275816に記載されている。上記遺伝子がコードする蛋白質のN末端側には、アミノ酸一文字表記でMTQSRLHAA(配列番号35)で表記される、疎水性が高くシグナルペプチダーゼで切断されるアミノ酸配列と同様な配列が存在する。上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてCGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(配列番号29)、及びTCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(配列番号30)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeIで消化することで約110bpのGAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素NdeI及びPvuIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpBRgapPを回収した。
インベルターゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリO157のゲノムDNA(SIGMA-ALDRICH:IRMM449)をテンプレートに用いて、GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG(配列番号31)、及びATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(配列番号32)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素XbaIで消化することで約1.4kbpのインベルターゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpBRgapPを制限酵素XbaI及びPshAIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−cscAを回収した。
このプラスミドpGAP-cscAを実施例7で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株を得た。
また実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株を得た。
また実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株を得た。
[実施例9]
<エシェリヒア・コリO157由来インベルターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリMG1655由来フルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリMG1655のフルクトース−1−リン酸キナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、フルクトース−1−リン酸キナーゼをコードする遺伝子(fruK)はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2260387〜2259449に記載されている。
<エシェリヒア・コリO157由来インベルターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリMG1655由来フルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリMG1655のフルクトース−1−リン酸キナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、フルクトース−1−リン酸キナーゼをコードする遺伝子(fruK)はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2260387〜2259449に記載されている。
フルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリMG1655のゲノムDNAをテンプレートに用いて、ATGGTACCGGAGAAAGTCTTATGAGCAGACGTGTTGCTAC(配列番号33)、及びTCGGATCCTTATGCCTCTCCTGCTGTCAG(配列番号34)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素KpnIで消化することで約1.0kbpのフルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと実施例8で作成したプラスミドpGAP−cscAを制限酵素KpnI及びEcoRVで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−cscA−fruKを回収した。
このプラスミドpGAP−cscA−fruKを実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−fruK株を得た。
[実施例10]
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−fruK株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株によるD−乳酸生産>
前培養としてLB Broth、Miller培養液(Difco244620)25mlを入れた500ml容バッフル付三角フラスコ3本に、実施例8で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株(以下、「fruR破壊株」又は「ΔfruR株」)、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株(以下、「cscA株」)、実施例9で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−fruK株(以下、「fruK強化株」又は「+fruK株」)を各々植菌し、一晩35℃、120rpmで攪拌培養を行った。その後、3台の1L容培養槽(ABLE社製培養装置BMJ−01)に、表1に示す培地475gを入れたものに、別々に上記フラスコ内容物全量を植菌した。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−fruK株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株によるD−乳酸生産>
前培養としてLB Broth、Miller培養液(Difco244620)25mlを入れた500ml容バッフル付三角フラスコ3本に、実施例8で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-cscA株(以下、「fruR破壊株」又は「ΔfruR株」)、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株(以下、「cscA株」)、実施例9で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−fruK株(以下、「fruK強化株」又は「+fruK株」)を各々植菌し、一晩35℃、120rpmで攪拌培養を行った。その後、3台の1L容培養槽(ABLE社製培養装置BMJ−01)に、表1に示す培地475gを入れたものに、別々に上記フラスコ内容物全量を植菌した。
培養は大気圧下、通気量0.25L/min、攪拌速度200rpm、培養温度35℃、pH7.4(24% NaOHで調整)で48時間行った。培養終了後、得られた培養液中の乳酸の濃度を、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーを用い、以下の設定にて定量した。測定の結果を表2及び図1に示した。
カラム:ULTRON PS−80H(信和化工社製)
溶離液:過塩素酸水溶液(pH2.1)
流速:1.0mL/min
検出器:UV検出器
測定波長:280nm
カラム:ULTRON PS−80H(信和化工社製)
溶離液:過塩素酸水溶液(pH2.1)
流速:1.0mL/min
検出器:UV検出器
測定波長:280nm
cscAを含む4種の非PTSスクロース資化経路の遺伝子(cscA、cscR、cscK、cscB)を大腸菌に導入してスクロースから乳酸を生産させた公知例(Biotechnology Letters.27,1891−1896(2005))では、96.5gの乳酸を生産させるために120時間の培養時間を要している。これに対して本発明の上記乳酸生産大腸菌(cscA、fruK強化株、fruR破壊株)はいずれも、ほぼ同量以上の乳酸を僅か48時間の培養で生産しており、スクロースの資化を、一部のスクロース非PTS遺伝子群の活性、特にcscAのみを導入することによって乳酸生産時間を大幅に短縮できることを実証した。
特に、cscAに対してfruK遺伝子を導入することによって、スクロースを原料としたD−乳酸の生産性が約1.2倍、fruR遺伝子を破壊することによってD−乳酸の生産性が約1.1倍向上することが明らかとなった。
このとき、全ての株において培養開始時に投入されたスクロースは完全になくなっていた。また、fruK遺伝子を導入またはfruR遺伝子を破壊することによって、スクロースの分解によって得られるフルクトースが、遺伝子の導入または破壊のない株に比べて早く資化されることが明らかとなった。
このとき、全ての株において培養開始時に投入されたスクロースは完全になくなっていた。また、fruK遺伝子を導入またはfruR遺伝子を破壊することによって、スクロースの分解によって得られるフルクトースが、遺伝子の導入または破壊のない株に比べて早く資化されることが明らかとなった。
[比較例1]
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pBRgapP株によるD−乳酸生産>
実施例10と同様に、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pBRgapP株のD−乳酸生産を調べた。本菌株は、導入したプラスミドにcscA遺伝子が含まれていないだけで、基本的にMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株と同等である。培地組成も実施例10と同じであるが、スクロースはフィルターろ過滅菌をして用いた。48時間培養後の培養液中のD−乳酸濃度は、0g/Lだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトースの濃度も0g/Lだった。
この結果より、cscA遺伝子を欠失するとスクロースを資化して乳酸を生産できないことが確認された。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pBRgapP株によるD−乳酸生産>
実施例10と同様に、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pBRgapP株のD−乳酸生産を調べた。本菌株は、導入したプラスミドにcscA遺伝子が含まれていないだけで、基本的にMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株と同等である。培地組成も実施例10と同じであるが、スクロースはフィルターろ過滅菌をして用いた。48時間培養後の培養液中のD−乳酸濃度は、0g/Lだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトースの濃度も0g/Lだった。
この結果より、cscA遺伝子を欠失するとスクロースを資化して乳酸を生産できないことが確認された。
[実施例11]
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株による廃糖蜜からのD−乳酸生産>
実施例10と同様に、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株の廃糖蜜からのD−乳酸生産を調べた。
下記の表3に示す培地475g入れたものに、実施例10で得られたものと同様の前培養したフラスコ内容物全量(25ml)を植菌した。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株による廃糖蜜からのD−乳酸生産>
実施例10と同様に、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株の廃糖蜜からのD−乳酸生産を調べた。
下記の表3に示す培地475g入れたものに、実施例10で得られたものと同様の前培養したフラスコ内容物全量(25ml)を植菌した。
培養は大気圧下、通気量0.25L/min、攪拌速度300rpm、培養温度35℃、pH7.4(24% NaOHで調整)で48時間行った。
48時間培養後の培養液中のD−乳酸濃度は、96.47g/Lだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトース、スクロースの濃度は0g/Lだった。
この結果より、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料として乳酸を生産できることが確認された。
48時間培養後の培養液中のD−乳酸濃度は、96.47g/Lだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトース、スクロースの濃度は0g/Lだった。
この結果より、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料として乳酸を生産できることが確認された。
[実施例12]
<ビフィドバクテリウム由来ldh2遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株の構築>
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)のL−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)はGenBank accession number M33585に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の555〜1517に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
<ビフィドバクテリウム由来ldh2遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株の構築>
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)のL−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)はGenBank accession number M33585に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の555〜1517に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてCGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(配列番号29)、及びTCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(配列番号30)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeIで消化することで約110bpのGAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素NdeI及びPvuIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpBRgapPを回収した。
L−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、ビフィドバクテリウム・ロンガム(ATCC 15707)をテンプレートに用いて、AATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(配列番号36)、及びCTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(配列番号37)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素XbaIで消化することで約1.0kbpのL−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpBRgapPを制限酵素XbaIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-ldh2を回収した。
このプラスミドpGAP-ldh2を実施例3で作成したpTHΔpflを用い、実施例2と同様な手法でpfl遺伝子を欠失させたMG1655株(MG1655Δpfl株と呼ぶ)のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株を得た。
[実施例13]
<MG1655Δpfl/pGAP−ldh2株によるL−乳酸生産>
実施例10と同様に、実施例12で得られたMG1655Δpfl/pGAP−ldh2株のグルコースからのL−乳酸生産を調べた。
下記の表4に示す培地475g入れたものに、実施例10で得られたものと同様に前培養したフラスコ内容物25mlを植菌した。
<MG1655Δpfl/pGAP−ldh2株によるL−乳酸生産>
実施例10と同様に、実施例12で得られたMG1655Δpfl/pGAP−ldh2株のグルコースからのL−乳酸生産を調べた。
下記の表4に示す培地475g入れたものに、実施例10で得られたものと同様に前培養したフラスコ内容物25mlを植菌した。
培養は大気圧下、通気量0.25L/min、攪拌速度200rpm、培養温度35℃、pH7.5(24% NaOHで調整)で18時間行った。
18時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、97.02g/Lだった。
この結果より、ビフィドバクテリウム由来のL−乳酸デヒドロゲナーゼを用いて、グルコースからL−乳酸を生産できることを確認した。
18時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、97.02g/Lだった。
この結果より、ビフィドバクテリウム由来のL−乳酸デヒドロゲナーゼを用いて、グルコースからL−乳酸を生産できることを確認した。
[実施例14]
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-ldh2株の構築>
実施例12で作成したpGAP-ldh2プラスミドを実施例6で構築したD−乳酸生産株に導入した形質転換体を作成した。具体的には以下のように行った。
プラスミドpGAP-ldh2を実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換した。アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-ldh2株を得た。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-ldh2株の構築>
実施例12で作成したpGAP-ldh2プラスミドを実施例6で構築したD−乳酸生産株に導入した形質転換体を作成した。具体的には以下のように行った。
プラスミドpGAP-ldh2を実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換した。アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP-ldh2株を得た。
[実施例15]
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−ldh2株によるL−乳酸生産>
実施例13と同様に、実施例14で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−ldh2株のグルコースからのL−乳酸生産を調べた。
培養は大気圧下、通気量0.25L/min、攪拌速度200rpm、培養温度35℃、pH7.5(24% NaOHで調整)で18時間行った。
18時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、116.84g/Lだった。
この結果より、D−乳酸生産用大腸菌株を用いて、グルコースを原料としてL−乳酸を生産できることを確認した。L−乳酸が生産されたことは、F−キット D−/L−乳酸(ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号1112821)に従い、L−乳酸量、及びD−乳酸量を測定することで確認した。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−ldh2株によるL−乳酸生産>
実施例13と同様に、実施例14で得られたMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−ldh2株のグルコースからのL−乳酸生産を調べた。
培養は大気圧下、通気量0.25L/min、攪拌速度200rpm、培養温度35℃、pH7.5(24% NaOHで調整)で18時間行った。
18時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、116.84g/Lだった。
この結果より、D−乳酸生産用大腸菌株を用いて、グルコースを原料としてL−乳酸を生産できることを確認した。L−乳酸が生産されたことは、F−キット D−/L−乳酸(ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号1112821)に従い、L−乳酸量、及びD−乳酸量を測定することで確認した。
[実施例16]
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入株の構築>
実施例6で用いたD−乳酸生産用大腸菌株(MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株)のldhA遺伝子をldh2遺伝子に置き換え、更にL−乳酸の分解を触媒する酵素の遺伝子lldDを破壊して、L−乳酸生産用大腸菌株を構築した。更にfruR遺伝子を破壊し、L−乳酸生産用大腸菌fruR破壊株を構築した。具体的には、以下のようにして行った。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入株の構築>
実施例6で用いたD−乳酸生産用大腸菌株(MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株)のldhA遺伝子をldh2遺伝子に置き換え、更にL−乳酸の分解を触媒する酵素の遺伝子lldDを破壊して、L−乳酸生産用大腸菌株を構築した。更にfruR遺伝子を破壊し、L−乳酸生産用大腸菌fruR破壊株を構築した。具体的には、以下のようにして行った。
(ldhA遺伝子破壊株の作成)
MG1655ゲノムDNAのldhA遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(配列番号21)、GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(配列番号22)、GCTCTAGAGCATTCCTGACAGCAGAAGC(配列番号38)及びAACTGCAGTCGGCGTGTAGTAGTGAACC(配列番号39)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。これらのプライマーを用い、実施例1と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドpTHΔldhAを構築した。更に、pTHΔldhAをMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてldhA欠失株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
MG1655ゲノムDNAのldhA遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(配列番号21)、GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(配列番号22)、GCTCTAGAGCATTCCTGACAGCAGAAGC(配列番号38)及びAACTGCAGTCGGCGTGTAGTAGTGAACC(配列番号39)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。これらのプライマーを用い、実施例1と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドpTHΔldhAを構築した。更に、pTHΔldhAをMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてldhA欠失株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
(dld遺伝子復帰株の作成)
大腸菌MG1655ゲノムDNAのdld遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、CAACACCAAGCTTTCGCG(配列番号40)、TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(配列番号41)のオリゴヌクレオチドプライマーを2種合成した。これらのプライマーを用い、大腸菌MG1655のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRを実施し、得られたDNA断片を制限酵素HindIII、XbaIで切断した。さらにプラスミドpTH18cs1を制限酵素HindIII、XbaIで切断し、上記dld断片と混合した後、リガーゼで結合し、プラスミドpTHDLDを構築した。更に、pTHDLDをMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてdld復帰株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
大腸菌MG1655ゲノムDNAのdld遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、CAACACCAAGCTTTCGCG(配列番号40)、TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(配列番号41)のオリゴヌクレオチドプライマーを2種合成した。これらのプライマーを用い、大腸菌MG1655のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRを実施し、得られたDNA断片を制限酵素HindIII、XbaIで切断した。さらにプラスミドpTH18cs1を制限酵素HindIII、XbaIで切断し、上記dld断片と混合した後、リガーゼで結合し、プラスミドpTHDLDを構築した。更に、pTHDLDをMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてdld復帰株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
(lldD遺伝子破壊株の作成)
MG1655株ゲノムDNAのlldD遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、GGAAGCTTCAAATTGGCGTCTCTGATCT(配列番号42)、AAACCCGGGCCATCCATATAGTGGAACAGGAACGG(配列番号43)、GGGCTCGAGTGGCGATGACGCTGACTGG(配列番号44)及びCGTCTAGAACGGGTAAATCTGGTGGTGACCGTCACCCG(配列番号45)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。これらのプライマーを用い、実施例1と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドpTHΔlldDを構築した。更に、pTHΔlldDをMG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてlldD欠失株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
MG1655株ゲノムDNAのlldD遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、GGAAGCTTCAAATTGGCGTCTCTGATCT(配列番号42)、AAACCCGGGCCATCCATATAGTGGAACAGGAACGG(配列番号43)、GGGCTCGAGTGGCGATGACGCTGACTGG(配列番号44)及びCGTCTAGAACGGGTAAATCTGGTGGTGACCGTCACCCG(配列番号45)のオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。これらのプライマーを用い、実施例1と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドpTHΔlldDを構築した。更に、pTHΔlldDをMG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株コンピテントセルに形質転換し、実施例2と同様な手法を用いてlldD欠失株を選択した。得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株と命名した。
(ldh2遺伝子ゲノム挿入株の作成)
ビフィドバクテリウム・ロンガムのL−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)はGenBank accession number M33585に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の555〜1517に記載されている。
L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)を取得する為にビフィドバクテリウム・ロンガム(ATCC15707)のゲノムDNAをテンプレートに用いてAAGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(配列番号46)、CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(配列番号47)のオリゴヌクレオチドプライマーを2種合成した。これらのプライマーを用いてPCRを実施し、得られたDNA断片を制限酵素EcoRI、及びXbaIで切断した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムのL−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)はGenBank accession number M33585に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の555〜1517に記載されている。
L−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldh2)を取得する為にビフィドバクテリウム・ロンガム(ATCC15707)のゲノムDNAをテンプレートに用いてAAGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(配列番号46)、CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(配列番号47)のオリゴヌクレオチドプライマーを2種合成した。これらのプライマーを用いてPCRを実施し、得られたDNA断片を制限酵素EcoRI、及びXbaIで切断した。
GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてGGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG(配列番号48)、CGGAATTCCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAG(配列番号49)のオリゴヌクレオチドプライマーを2種合成した。得られたDNA断片を制限酵素EcoRI、及びXbaIで切断した。
上記で得られたpTHΔldhAをXbaIで切断したプラスミド、上記で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム由来ldh2のEcoRI−XbaI断片、及び大腸菌由来GAPDHプロモーターのEcoRI−XbaI断片を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA−903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpTHΔldhA::GAPLDH2を回収した。得られたプラスミドをMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlld/GAPldhAゲノム挿入ΔldhA株に形質転換し、実施例2と同様の方法を用いてldh2ゲノム挿入株をldh2をPCRで増幅することにより選択した。
得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株と命名した。
得られた株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株と命名した。
(fruR遺伝子破壊株の作成)
実施例7で作成したプラスミドpTHΔfruRをMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株に形質転換し、実施例2と同様の方法に従って、fruR遺伝子が破壊されたMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株を取得した。本株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入株と命名した。
実施例7で作成したプラスミドpTHΔfruRをMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株に形質転換し、実施例2と同様の方法に従って、fruR遺伝子が破壊されたMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株を取得した。本株をMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入株と命名した。
[実施例17]
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株の構築>
実施例16で構築したL−乳酸生産用大腸菌株とL−乳酸生産用大腸菌fruR破壊株のそれぞれに、スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)遺伝子発現ベクターを導入し、スクロースからL−乳酸を生産する大腸菌株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株の構築>
実施例16で構築したL−乳酸生産用大腸菌株とL−乳酸生産用大腸菌fruR破壊株のそれぞれに、スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)遺伝子発現ベクターを導入し、スクロースからL−乳酸を生産する大腸菌株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
実施例8で構築したプラスミドpGAP−cscAを実施例16で作成したMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株とMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで各々37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株とMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株を得た。
[実施例18]
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株の構築>
実施例16で構築したL−乳酸生産用大腸菌株に、スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)及びフルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターを導入し、L−乳酸生産大腸菌fruK強化株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株の構築>
実施例16で構築したL−乳酸生産用大腸菌株に、スクロース加水分解酵素(インベルターゼ)及びフルクトース−1−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターを導入し、L−乳酸生産大腸菌fruK強化株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
実施例9で構築したプラスミドpGAP−cscA−fruKを実施例16で作成したMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株を得た。
[実施例19]
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株によるL−乳酸生産>
MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株の廃糖蜜からのL−乳酸生産を調べた。
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株によるL−乳酸生産>
MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株の廃糖蜜からのL−乳酸生産を調べた。
前培養として、表5に示す前培養培地50mlを入れた500ml容バッフル付三角フラスコに、実施例17及び実施例18で得られたMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株及びMG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株を各々植菌し、一晩35℃、120rpmで攪拌培養を行った。その後、下記の表6に示す培地475gを入れたものに、前培養したフラスコ内容物25mlを各々植菌し、実施例10と同様に培養実験を行った。
培養は大気圧下、通気量0.25L/min、攪拌速度350rpm、培養温度35℃、pH7.5(24% NaOHで調整)で24時間行った。
24時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株(cscA)が75.12g/L、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株(fruR破壊株)が83.79g/L、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株(fruK強化株)が84.32g/Lだった。
これにより、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料としてL−乳酸を生産できることが確認された。また、乳酸生産大腸菌のfruR遺伝子を破壊することによりL−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。更に、乳酸生産大腸菌のfruK遺伝子を強化することによってもL−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。
24時間培養後の培養液中のL−乳酸濃度は、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株(cscA)が75.12g/L、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA株(fruR破壊株)が83.79g/L、MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2ゲノム挿入/pGAP−cscA−fruK株(fruK強化株)が84.32g/Lだった。
これにより、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料としてL−乳酸を生産できることが確認された。また、乳酸生産大腸菌のfruR遺伝子を破壊することによりL−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。更に、乳酸生産大腸菌のfruK遺伝子を強化することによってもL−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。
[比較例2]
<エシェリヒア・コリO157由来インベルターゼ遺伝子、ザイモモナス菌由来グルコース輸送促進蛋白質(glf)遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリのGAPDH遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターを取得するため、CCAAGCTTCTGCAGGTCGACGGATCCGAGCTCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (配列番号50)の塩基配列を有するプライマーを合成した。エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いて配列番号29との組み合わせによりPCR法でDNA断片を増幅した。配列番号29のプライマーはその5´末端側にNdeI認識部位を、配列番号50のプライマーはその5´末端側から順にHindIII、PstI、SalI、BamHI、SacI認識部位を有している。得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeIとHindIIIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のDNAフラグメントと、NdeI、HindIIIで消化した大腸菌用クローニングベクターpBR322(GenBank accession number J01749)を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをpGAPと命名した。
このプラスミドpGAP−cscA−glfを実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株を得た。
<エシェリヒア・コリO157由来インベルターゼ遺伝子、ザイモモナス菌由来グルコース輸送促進蛋白質(glf)遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリのGAPDH遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターを取得するため、CCAAGCTTCTGCAGGTCGACGGATCCGAGCTCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (配列番号50)の塩基配列を有するプライマーを合成した。エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いて配列番号29との組み合わせによりPCR法でDNA断片を増幅した。配列番号29のプライマーはその5´末端側にNdeI認識部位を、配列番号50のプライマーはその5´末端側から順にHindIII、PstI、SalI、BamHI、SacI認識部位を有している。得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeIとHindIIIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のDNAフラグメントと、NdeI、HindIIIで消化した大腸菌用クローニングベクターpBR322(GenBank accession number J01749)を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをpGAPと命名した。
このプラスミドpGAP−cscA−glfを実施例6で作成したMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃一晩培養することにより、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株を得た。
エシェリヒア・コリO157株が有するインベルターゼ遺伝子(cscA)の塩基配列はすでに報告されている。すなわち、GenBank accession number AE005174に記載のエシェリヒア・コリO157株ゲノム配列の3274383−3275816に記載されている。cscA遺伝子を取得するために、GCGGATCCGCTGGTGGAATATATGACGCAATCTCGATTGC(配列番号51)およびGACGCGTCGACTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC (配列番号52)の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ作製した。配列番号51のプライマーはその5´末端側から順にBamHI認識部位と13塩基のGAPDH遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号52のプライマーはその5´末端側にSalI認識部位を有している。上記2種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリO157株のゲノムDNA(SIGMA-ALDRICH:IRMM449)をテンプレートとして通常条件でPCR法を行い、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI及びSalIで消化することで約1.4kbpのインベルターゼ遺伝子(cscA)フラグメントを得た。このDNAフラグメントとプラスミドpGAPを制限酵素BamHI及びSalIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−cscAを回収して、インベルターゼ遺伝子(cscA)発現ベクターを構築した。
Zymomonas mobilis(ATCC 29191)が有する糖輸送酵素グルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number M60615)。glf遺伝子を取得するために、CCTGTCGACGCTGGTGGAATATATGAGTTCTGAAAGTAGTCAGG (配列番号53)およびCTACTGCAGCTACTTCTGGGAGCGCCACA(配列番号54)の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ作製した。配列番号53のプライマーはその5´末端側から順にSalI認識部位と13塩基のGAPDH遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号54のプライマーはその5´末端側にPstI認識部位を有している。上記2種のプライマーとともに、Zymomonas mobilisのゲノムDNAをテンプレートとして通常条件でPCR法を行い、得られたDNAフラグメントを制限酵素SalI及びPstIで消化することで約1.4kbpの糖輸送酵素グルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)フラグメントを得た。このDNAフラグメントとプラスミドpGAP−cscAを制限酵素SalI及びPstIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP−cscA−glfを回収して、インベルターゼ(cscA)遺伝子及びグルコース輸送促進蛋白質(glf)遺伝子発現ベクターを構築した。
<MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株によるD−乳酸生産>
前培養としてLB Broth、Miller培養液(Difco244620)3mlを入れた試験管に、上記記載のMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株を植菌し、30℃、200rpmで9時間攪拌培養を行った。
その後、10gのCaCO3(純正化学1級)を予め加え滅菌した100mlバッフル付き三角フラスコ4本に表7に示す培地20mlそれぞれ加えたものに、前培養液を各々100マイクロリットル植菌し、35℃、90rpm、培養時間48時間で攪拌培養を行った。コントロールとして実施例10に記載のcscAMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株を用いて同様の培養を行い、培養終了後、実施例10に記載の方法により、得られた培養液中の乳酸濃度を定量した。
48時間後の培養液中のD−乳酸濃度は、cscAが48.9g/L、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株が9.3g/Lだった。
この結果より、cscAと同様に糖代謝系に関連する遺伝子であるグルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)を利用して糖の取り込みを強化しても、乳酸生産性の向上効果はみられないことが分かった。
前培養としてLB Broth、Miller培養液(Difco244620)3mlを入れた試験管に、上記記載のMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株を植菌し、30℃、200rpmで9時間攪拌培養を行った。
その後、10gのCaCO3(純正化学1級)を予め加え滅菌した100mlバッフル付き三角フラスコ4本に表7に示す培地20mlそれぞれ加えたものに、前培養液を各々100マイクロリットル植菌し、35℃、90rpm、培養時間48時間で攪拌培養を行った。コントロールとして実施例10に記載のcscAMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA株を用いて同様の培養を行い、培養終了後、実施例10に記載の方法により、得られた培養液中の乳酸濃度を定量した。
48時間後の培養液中のD−乳酸濃度は、cscAが48.9g/L、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhAゲノム挿入株/pGAP−cscA−glf株が9.3g/Lだった。
この結果より、cscAと同様に糖代謝系に関連する遺伝子であるグルコース輸送促進蛋白質遺伝子(glf)を利用して糖の取り込みを強化しても、乳酸生産性の向上効果はみられないことが分かった。
2008年9月16日に出願の日本国出願番号第2008−237177号、2009年2月13日に出願の日本国出願番号第2009−32043号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (16)
- スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む1種以上の遺伝子(ただし、リプレッサー蛋白質(cscR)、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせと、スクロース加水分解酵素(cscA)、フルクトキナーゼ(cscK)及びスクロース透過酵素(cscB)の組み合わせとを除く)を有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系を備えている乳酸生産大腸菌。
- 前記スクロース非PTS遺伝子群の中で、スクロース加水分解酵素遺伝子のみを有し、且つ遺伝子組み換えによる乳酸生産強化系を備えている請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産大腸菌が、フルクトースの代謝能力向上系を更に有する請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産強化系が、ピルベートホルメートリアーゼ活性の不活化あるいは低減化を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産強化系が、D−乳酸又はL−乳酸を生成するためのNADH依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記乳酸生産強化系が、
D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、
該大腸菌が本来有しているFAD依存型D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の不活化あるいは低減化と、
を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。 - 前記乳酸生産強化系が、
L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、
該大腸菌が本来有しているD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性及びFMN依存性L−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくともどちらか一方の不活化あるいは低減化と、
を含む請求項1記載の乳酸生産大腸菌。 - 前記フルクトースの代謝能力向上系が、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化またはフルクトース取り込み能力の強化である請求項3記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化が、フルクトース−1−リン酸キナーゼ活性に由来する請求項8に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース代謝経路におけるフルクトース取り込み能力の強化が、該大腸菌が本来有しているFruR活性の不活化あるいは低減化に由来する請求項8に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来する請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア・コリO157細菌に由来する請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼが、エシェリヒア属細菌に由来する請求項9記載の乳酸生産大腸菌。
- 前記フルクトース−1−リン酸キナーゼがエシェリヒア・コリMG1655由来の蛋白質である請求項9に記載の乳酸生産大腸菌。
- 大腸菌K12由来株である請求項1記載の乳酸生産大腸菌。
- 請求項1〜請求項15のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法。
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