JPH07255462A - 有機溶媒耐性微生物の取得方法及び該方法により取得した有機溶媒耐性微生物 - Google Patents
有機溶媒耐性微生物の取得方法及び該方法により取得した有機溶媒耐性微生物Info
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- JPH07255462A JPH07255462A JP6264544A JP26454494A JPH07255462A JP H07255462 A JPH07255462 A JP H07255462A JP 6264544 A JP6264544 A JP 6264544A JP 26454494 A JP26454494 A JP 26454494A JP H07255462 A JPH07255462 A JP H07255462A
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C12R2001/38—Pseudomonas
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 有機溶媒耐性微生物を得ること。
【構成】 親株微生物に変異処理を施し、有機溶媒を加
えて選択培養することを特徴とする有機溶媒耐性微生物
の取得方法及び該方法によって得られ得る有機溶媒耐性
微生物。 【効果】 元来、親水性で有用な機能を示すが有機溶媒
中では耐性を示さずその有用機能を発揮出来ない微生物
を、有機溶媒中で増殖し、なおかつ親株の有する有用機
能を発現する微生物に変換することができた。さらに、
親株微生物にシュウドモナス属細菌を用いることで、微
好気・有機溶媒中で難除去性有機硫黄化合物を分解する
バイオ脱硫菌を得ることができた。
えて選択培養することを特徴とする有機溶媒耐性微生物
の取得方法及び該方法によって得られ得る有機溶媒耐性
微生物。 【効果】 元来、親水性で有用な機能を示すが有機溶媒
中では耐性を示さずその有用機能を発揮出来ない微生物
を、有機溶媒中で増殖し、なおかつ親株の有する有用機
能を発現する微生物に変換することができた。さらに、
親株微生物にシュウドモナス属細菌を用いることで、微
好気・有機溶媒中で難除去性有機硫黄化合物を分解する
バイオ脱硫菌を得ることができた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有機溶媒に耐性を有す
る微生物を変換（突然変異及び選択培養）により取得す
る方法及び該方法によって得られ得る有機溶媒耐性微生
物に関するものである。
る微生物を変換（突然変異及び選択培養）により取得す
る方法及び該方法によって得られ得る有機溶媒耐性微生
物に関するものである。
【０００２】また、有機硫黄化合物の分解能を有する有
機溶媒耐性微生物を用いたバイオ脱硫技術も提供する。
機溶媒耐性微生物を用いたバイオ脱硫技術も提供する。
【０００３】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】バイオ
リアクター等に代表されるバイオテクノロジーは、様々
な産業分野で脚光を浴びており、進歩及び発展してき
た。その中には、優れた機能及び活性を有している微生
物等のバイオ触媒（生体触媒）技術も含まれている。
リアクター等に代表されるバイオテクノロジーは、様々
な産業分野で脚光を浴びており、進歩及び発展してき
た。その中には、優れた機能及び活性を有している微生
物等のバイオ触媒（生体触媒）技術も含まれている。
【０００４】これらバイオ触媒の利用分野は、例えば、
アルコール、抗生物質、アミノ酸、タンパク、ホルモン
及び異性化糖の製造、並びにアミノ酸の不斉分割、環境
浄化及び燃料電池等であり、いずれも水系工程での利用
であった。
アルコール、抗生物質、アミノ酸、タンパク、ホルモン
及び異性化糖の製造、並びにアミノ酸の不斉分割、環境
浄化及び燃料電池等であり、いずれも水系工程での利用
であった。
【０００５】現在、石油関連工業及び化学工業に関して
も同様に、バイオテクノロジーの応用が検討されてい
る。しかしながら、非水系の工程を有するこれらの分野
には未だ応用されていないのが実情である。この最大の
理由は、バイオ触媒（即ち、微生物）が、元来、多量の
水の存在下でその活性を示すもの（親水性）であるため
であり、多量の油等（有機溶媒）の存在下では失活し、
さらには生存成育できないのが通常であるからである。
も同様に、バイオテクノロジーの応用が検討されてい
る。しかしながら、非水系の工程を有するこれらの分野
には未だ応用されていないのが実情である。この最大の
理由は、バイオ触媒（即ち、微生物）が、元来、多量の
水の存在下でその活性を示すもの（親水性）であるため
であり、多量の油等（有機溶媒）の存在下では失活し、
さらには生存成育できないのが通常であるからである。
【０００６】一方、世界における石油需要は、世界的な
産業活性化の必要性、発展途上国における消費の増加、
石油代替エネルギーの開発の頭打ち及び省エネルギーの
限界等から未だ底堅いものがある。特にガソリンや灯油
・軽油の需要は堅調で、石油の需要の構造は急速に軽質
化の方向に向かっている。
産業活性化の必要性、発展途上国における消費の増加、
石油代替エネルギーの開発の頭打ち及び省エネルギーの
限界等から未だ底堅いものがある。特にガソリンや灯油
・軽油の需要は堅調で、石油の需要の構造は急速に軽質
化の方向に向かっている。
【０００７】かかる軽質石油の需要の増大に伴い、石油
の精製分野では、省エネルギーや環境問題に関してなお
一層の進歩及び発展が望まれている。しかしながら、現
行の蒸留や化学反応を中心とした精製技術は、もはや成
熟した域に達しており、石油精製技術には、新たな技術
（即ち、バイオテクノロジー）の応用が望まれている。
の精製分野では、省エネルギーや環境問題に関してなお
一層の進歩及び発展が望まれている。しかしながら、現
行の蒸留や化学反応を中心とした精製技術は、もはや成
熟した域に達しており、石油精製技術には、新たな技術
（即ち、バイオテクノロジー）の応用が望まれている。
【０００８】石油精製技術において、バイオテクノロジ
ーの応用により解決すべき課題としては、例えば、高温
・高圧の操作条件を必要とする現行の石油精製プロセス
を常温・常圧で精製が可能なプロセスとすること、有機
硫黄化合物を確実に除去すること等が挙げられる。
ーの応用により解決すべき課題としては、例えば、高温
・高圧の操作条件を必要とする現行の石油精製プロセス
を常温・常圧で精製が可能なプロセスとすること、有機
硫黄化合物を確実に除去すること等が挙げられる。
【０００９】それらの中でも、昨今の地球規模の環境問
題に対応し、微生物による油中からの有機硫黄化合物の
除去方法の確立は大変重要な課題である。
題に対応し、微生物による油中からの有機硫黄化合物の
除去方法の確立は大変重要な課題である。
【００１０】行政サイドにおいても、軽油・灯油の硫黄
分を、現在の０．５％から５年後には０．０５％まで削
減することが検討されている。
分を、現在の０．５％から５年後には０．０５％まで削
減することが検討されている。
【００１１】一般に、石油中には０．０５％〜５％の硫
黄が含有されており、その形態は、元素硫黄に加えて硫
酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸、チオフェン置換基を有する
ベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン及びアルキルベ
ンゾチオフェン等、多種類に及ぶ。これらの中でも、現
行の脱硫プロセスにおいて除去が困難なチオフェン骨格
を有するジベンゾチオフェン及びアルキルジベンゾチオ
フェンが石油の精製工程上、特に問題となっている。
黄が含有されており、その形態は、元素硫黄に加えて硫
酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸、チオフェン置換基を有する
ベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン及びアルキルベ
ンゾチオフェン等、多種類に及ぶ。これらの中でも、現
行の脱硫プロセスにおいて除去が困難なチオフェン骨格
を有するジベンゾチオフェン及びアルキルジベンゾチオ
フェンが石油の精製工程上、特に問題となっている。
【００１２】これら難分解性の有機硫黄化合物を生分解
する微生物としては、窒素置換雰囲気（以下、『微好
気』という。）で成育する、牧野らの報告（牧野ら、
『石油成分中の含硫有機化合物資源化微生物の探索』、
1992年 4月、農芸化学会）があった。
する微生物としては、窒素置換雰囲気（以下、『微好
気』という。）で成育する、牧野らの報告（牧野ら、
『石油成分中の含硫有機化合物資源化微生物の探索』、
1992年 4月、農芸化学会）があった。
【００１３】しかしながら、一般に、微生物は有機溶媒
への耐性を有しておらず、これら微生物を用いて有機硫
黄化合物を生分解する場合、多量の水を必要とし、脱硫
プロセスの規模が巨大なものとなる欠点があった。
への耐性を有しておらず、これら微生物を用いて有機硫
黄化合物を生分解する場合、多量の水を必要とし、脱硫
プロセスの規模が巨大なものとなる欠点があった。
【００１４】これまでにも有機溶媒系に微生物を適用す
る試みとして、自然界より耐有機溶媒耐性菌の取得が検
討されていた（Akira Inoue and Koki Horikoshi, "A P
seudomonas thrives in high concentrations of tolue
ne", Nature p.264-268 Vol.338 16 March 1989 ）。
る試みとして、自然界より耐有機溶媒耐性菌の取得が検
討されていた（Akira Inoue and Koki Horikoshi, "A P
seudomonas thrives in high concentrations of tolue
ne", Nature p.264-268 Vol.338 16 March 1989 ）。
【００１５】しかしながら、耐有機溶媒耐性菌が工業的
にも有用な機能を兼ね備えているとは限らず、多くの場
合には単に耐性のみを示すにすぎないという問題点を持
っていた。
にも有用な機能を兼ね備えているとは限らず、多くの場
合には単に耐性のみを示すにすぎないという問題点を持
っていた。
【００１６】これらの問題点を克服するため、自然界で
親水性ではあるが多くの有用な機能を有した有用微生物
を、その有用な機能を保持したまま親水性から耐有機溶
媒耐性菌に効率良く変換させ取得させ得る方法が開発さ
れれば、工業にとってその波及性及び進歩性は大きいも
のがある。
親水性ではあるが多くの有用な機能を有した有用微生物
を、その有用な機能を保持したまま親水性から耐有機溶
媒耐性菌に効率良く変換させ取得させ得る方法が開発さ
れれば、工業にとってその波及性及び進歩性は大きいも
のがある。
【００１７】さらにまた、従来の有機溶媒耐性微生物の
多くは好気性の微生物であり、これらを用いた生分解で
は、空気（酸素）が稀薄な状態（嫌気的条件及び／又は
微好気的条件）の工程が多い石油工業等には応用が困難
であるという欠点があった。
多くは好気性の微生物であり、これらを用いた生分解で
は、空気（酸素）が稀薄な状態（嫌気的条件及び／又は
微好気的条件）の工程が多い石油工業等には応用が困難
であるという欠点があった。
【００１８】尚、本発明でいう微好気的条件とは、酸素
はわずかに存在するが、それが爆発限界の酸素含有率以
下である条件を意味する。
はわずかに存在するが、それが爆発限界の酸素含有率以
下である条件を意味する。
【００１９】従って、有機溶媒に耐性を有する微生物で
あって、嫌気又は微好気的に、各種の目的反応物に対し
て分解、合成及び／又は変換等の作用活性を有する微生
物の取得が、化学工業等の有機溶媒系の工程を有する各
種産業分野における一つの課題であるといえるが、その
ような微生物は未だ取得されていない。
あって、嫌気又は微好気的に、各種の目的反応物に対し
て分解、合成及び／又は変換等の作用活性を有する微生
物の取得が、化学工業等の有機溶媒系の工程を有する各
種産業分野における一つの課題であるといえるが、その
ような微生物は未だ取得されていない。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる問
題点を顧み、化学工業等においても利用可能な微生物を
取得すべく鋭意検討した結果、微生物の突然変異処理及
び有機溶媒中での選択培養により有機溶媒耐性微生物を
取得できることを見出だし本発明を完成させた。
題点を顧み、化学工業等においても利用可能な微生物を
取得すべく鋭意検討した結果、微生物の突然変異処理及
び有機溶媒中での選択培養により有機溶媒耐性微生物を
取得できることを見出だし本発明を完成させた。
【００２１】即ち、本発明は、有機溶媒耐性微生物の取
得方法であって、親株微生物に変異処理を施し、有機溶
媒を加えて選択培養することを特徴とする前記取得方法
である。
得方法であって、親株微生物に変異処理を施し、有機溶
媒を加えて選択培養することを特徴とする前記取得方法
である。
【００２２】ここで、親株微生物の変異処理としては、
γ線及びＸ線等の放射線を含めた紫外線の照射処理、並
びにニトロソグアニジン及びＥＭＳ（エチルメタンスル
フォネート）等の各種変異誘発物質による変異処理等、
どのような手法であっても良いが、親株微生物の菌体脂
肪酸組成を変えるような処理であることが好ましい。ま
た、菌体脂肪酸組成を変える際は、特に、微生物の菌体
脂肪酸中にトランス型不飽和脂肪酸、分枝脂肪酸又は奇
数炭素数の飽和脂肪酸を多く含有させることが好まし
く、これら脂肪酸の含量を多くすることで、生体膜中の
脂質の流動性を下げることができる。このような脂肪酸
としては、例えば、ヘプタデセン酸、ドデカン酸、及び
ヘプタデカン酸等が挙げられるが、この限りではない。
γ線及びＸ線等の放射線を含めた紫外線の照射処理、並
びにニトロソグアニジン及びＥＭＳ（エチルメタンスル
フォネート）等の各種変異誘発物質による変異処理等、
どのような手法であっても良いが、親株微生物の菌体脂
肪酸組成を変えるような処理であることが好ましい。ま
た、菌体脂肪酸組成を変える際は、特に、微生物の菌体
脂肪酸中にトランス型不飽和脂肪酸、分枝脂肪酸又は奇
数炭素数の飽和脂肪酸を多く含有させることが好まし
く、これら脂肪酸の含量を多くすることで、生体膜中の
脂質の流動性を下げることができる。このような脂肪酸
としては、例えば、ヘプタデセン酸、ドデカン酸、及び
ヘプタデカン酸等が挙げられるが、この限りではない。
【００２３】さらに、変異処理によって微生物に有機溶
媒耐性を付与すべく、親株微生物に対して以下のいずれ
かの性質をもつように変異処理を施す（後述の実施例５
〜７参照）。すなわち、（ａ）菌体内の遊離脂肪酸の全
脂肪酸に対する割合が高い、（ｂ）菌体内リポ多糖の高
分子量部分（Ｏ鎖又はＯ抗原）が大きく減少又は欠除し
ている、（ｃ）ヘプタノール、ノナノールなどの低級直
鎖脂肪アルコールの酸化により菌体内に奇数脂肪酸が増
大している、（ｄ）毒性の強い有機溶媒と接触すること
により菌体内奇数脂肪酸が増大している。
媒耐性を付与すべく、親株微生物に対して以下のいずれ
かの性質をもつように変異処理を施す（後述の実施例５
〜７参照）。すなわち、（ａ）菌体内の遊離脂肪酸の全
脂肪酸に対する割合が高い、（ｂ）菌体内リポ多糖の高
分子量部分（Ｏ鎖又はＯ抗原）が大きく減少又は欠除し
ている、（ｃ）ヘプタノール、ノナノールなどの低級直
鎖脂肪アルコールの酸化により菌体内に奇数脂肪酸が増
大している、（ｄ）毒性の強い有機溶媒と接触すること
により菌体内奇数脂肪酸が増大している。
【００２４】有機溶媒耐性微生物は、このような性質を
もつことによって有機溶媒耐性が付与されていると推定
することができる。理論に拘束されるつもりはないが、
その作用機序については、次のように考えることができ
る。
もつことによって有機溶媒耐性が付与されていると推定
することができる。理論に拘束されるつもりはないが、
その作用機序については、次のように考えることができ
る。
【００２５】毒性の強い有機溶媒とは、ｌｏｇ Ｐが小
さい有機溶媒、すなわち水に溶け易い有機溶媒である、
それ故、バクテリアがこの毒性の強い有機溶媒を排除す
るためには、疎水性となることが重要であると考えられ
る。遊離脂肪酸はグリセロールリン酸を含まない脂肪酸
であるので、脂質に組み込まれた脂肪酸より疎水性が大
きい。ここで重要な点は、遊離脂肪酸の絶対量ではな
く、その割合である。たとえ絶対量が多くても、これに
比例して脂質に組込まれた脂肪酸が多ければ疎水性は打
ち消されてしまう。さらに、リポ多糖の高分子量側は親
水性の糖がたくさん結合したものである。これがはずれ
た、膜に埋め込まれた部分の親水性は非常に小さい。そ
れ故、高分子量側がなくなれば、疎水性となると考えら
れる。
さい有機溶媒、すなわち水に溶け易い有機溶媒である、
それ故、バクテリアがこの毒性の強い有機溶媒を排除す
るためには、疎水性となることが重要であると考えられ
る。遊離脂肪酸はグリセロールリン酸を含まない脂肪酸
であるので、脂質に組み込まれた脂肪酸より疎水性が大
きい。ここで重要な点は、遊離脂肪酸の絶対量ではな
く、その割合である。たとえ絶対量が多くても、これに
比例して脂質に組込まれた脂肪酸が多ければ疎水性は打
ち消されてしまう。さらに、リポ多糖の高分子量側は親
水性の糖がたくさん結合したものである。これがはずれ
た、膜に埋め込まれた部分の親水性は非常に小さい。そ
れ故、高分子量側がなくなれば、疎水性となると考えら
れる。
【００２６】次に、親株微生物としてはいかなる微生物
をも使用し得るが、各種の油・有機溶媒での耐性を獲得
したほうが生産性や反応速度の向上などが期待され、且
つ有機溶媒耐性微生物に変換する効果がより鮮明になる
ので有機溶媒感受性微生物を使用することが好ましい。
その代表的な例としてシュウドモナス属細菌が挙げられ
るが、この限りではない。
をも使用し得るが、各種の油・有機溶媒での耐性を獲得
したほうが生産性や反応速度の向上などが期待され、且
つ有機溶媒耐性微生物に変換する効果がより鮮明になる
ので有機溶媒感受性微生物を使用することが好ましい。
その代表的な例としてシュウドモナス属細菌が挙げられ
るが、この限りではない。
【００２７】また、本発明は、前記取得方法によって得
られ得る有機溶媒耐性微生物にも係わり、該有機溶媒耐
性微生物は、親株微生物の有する性質の一部又は全部が
保存されていることが好ましい。
られ得る有機溶媒耐性微生物にも係わり、該有機溶媒耐
性微生物は、親株微生物の有する性質の一部又は全部が
保存されていることが好ましい。
【００２８】これら有機溶媒耐性微生物に保存される親
株微生物の有する有用な性質（機能）としては、例え
ば、分解活性機能、不斉合成等の合成活性（機能）及び
変換活性機能等が挙げられるが、この限りではない。ま
た、有機溶媒系で行った方が収率及び効率等の点で有利
である種々の反応にも、本発明の微生物を利用すること
が可能である。
株微生物の有する有用な性質（機能）としては、例え
ば、分解活性機能、不斉合成等の合成活性（機能）及び
変換活性機能等が挙げられるが、この限りではない。ま
た、有機溶媒系で行った方が収率及び効率等の点で有利
である種々の反応にも、本発明の微生物を利用すること
が可能である。
【００２９】分解活性機能が保存される例としては、例
えば、前記取得方法において、親株微生物に難除去性の
有機硫黄化合物を分解除去する親水性のバイオ脱硫菌で
あるシュウドモナス・プチダＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３２６２、平成４年１１月６日付きで通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所微生物寄託センターに寄
託、特願平４−３５００７４）を用いて取得した、難除
去性有機硫黄化合物の優れた分解能力が保存された有機
溶媒耐性微生物が挙げられる。即ち、シュウドモナス・
プチダＮｏ．６９−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１９）、
シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５２０）及びシュウドモナス・プチダＮｏ．６９
−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５２１）であり、平成５年１
２月２７日付きで通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所微生物寄託センターに寄託されている。
えば、前記取得方法において、親株微生物に難除去性の
有機硫黄化合物を分解除去する親水性のバイオ脱硫菌で
あるシュウドモナス・プチダＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３２６２、平成４年１１月６日付きで通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所微生物寄託センターに寄
託、特願平４−３５００７４）を用いて取得した、難除
去性有機硫黄化合物の優れた分解能力が保存された有機
溶媒耐性微生物が挙げられる。即ち、シュウドモナス・
プチダＮｏ．６９−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１９）、
シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５２０）及びシュウドモナス・プチダＮｏ．６９
−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５２１）であり、平成５年１
２月２７日付きで通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所微生物寄託センターに寄託されている。
【００３０】これらは、微好気及び有機溶媒存在下で脱
硫能を有する有機溶媒耐性微生物であり、本発明の好ま
しい実施態様の一つである。即ち、これら微生物を石油
精製や石炭の脱硫工程に応用することにより、より効率
の良い、省エネルギーで安全な脱硫プロセスを確立する
ことが可能であろう。
硫能を有する有機溶媒耐性微生物であり、本発明の好ま
しい実施態様の一つである。即ち、これら微生物を石油
精製や石炭の脱硫工程に応用することにより、より効率
の良い、省エネルギーで安全な脱硫プロセスを確立する
ことが可能であろう。
【００３１】また、本発明の方法において、微生物に有
機溶媒を加えて選択培養する工程は、寒天培地上に変異
処理した有機溶媒感受性微生物を塗布した上に有機溶媒
を目的の濃度比率で重層しても良く又は液体培養におい
て変異処理した有機溶媒感受性菌及び目的有機溶媒を一
緒に入れて培養しても良い。また、ｐＨ、温度及び通気
の割合（通気する場合）等の条件も当業者によって容易
に設定され得るが、好ましくは、その微生物が成育する
条件が良いことは言うまでもない。
機溶媒を加えて選択培養する工程は、寒天培地上に変異
処理した有機溶媒感受性微生物を塗布した上に有機溶媒
を目的の濃度比率で重層しても良く又は液体培養におい
て変異処理した有機溶媒感受性菌及び目的有機溶媒を一
緒に入れて培養しても良い。また、ｐＨ、温度及び通気
の割合（通気する場合）等の条件も当業者によって容易
に設定され得るが、好ましくは、その微生物が成育する
条件が良いことは言うまでもない。
【００３２】また、本発明において使用される有機溶媒
は、微生物に耐性を付与しようとする有機溶媒であれば
どのようなものも使用可能である。
は、微生物に耐性を付与しようとする有機溶媒であれば
どのようなものも使用可能である。
【００３３】ところで、微生物に対して極めて毒性（殺
菌力）の高い有機溶媒としては、１−ヘプタノール及び
ベンゼンが挙げられる（Akira Inoue and Koki Horikos
hi,“A Pseudomonas thrives in high concentrations
of toluene ”, Nature p.264-268 Vol.338 16 March 1
989）。この理由で、本発明の実施例では、１−ヘプタ
ノール、１−ノナノール及び１−デカノールを使用して
有機溶媒耐性微生物が得られることを実証した。
菌力）の高い有機溶媒としては、１−ヘプタノール及び
ベンゼンが挙げられる（Akira Inoue and Koki Horikos
hi,“A Pseudomonas thrives in high concentrations
of toluene ”, Nature p.264-268 Vol.338 16 March 1
989）。この理由で、本発明の実施例では、１−ヘプタ
ノール、１−ノナノール及び１−デカノールを使用して
有機溶媒耐性微生物が得られることを実証した。
【００３４】しかしながら、他の有機溶媒に関しても本
発明の方法により有機溶媒耐性微生物が得られることは
当業者にとって自明のことであり、本発明でいう有機溶
媒が、実施例により限定されるものではないと解釈され
たい。
発明の方法により有機溶媒耐性微生物が得られることは
当業者にとって自明のことであり、本発明でいう有機溶
媒が、実施例により限定されるものではないと解釈され
たい。
【００３５】また、本発明の実施例では、親株微生物の
持つ有用な機能の一つとして分解活性機能をとりあげ、
例示するが、他の親株微生物の有用な機能、例えば、リ
パーゼによるエステル不斉合成等の合成活性（機能）又
は長鎖炭化水素からの長鎖脂肪酸等への変換活性機能等
を利用した実施態様も当業者には自明のことであり、容
易に実施することができよう。
持つ有用な機能の一つとして分解活性機能をとりあげ、
例示するが、他の親株微生物の有用な機能、例えば、リ
パーゼによるエステル不斉合成等の合成活性（機能）又
は長鎖炭化水素からの長鎖脂肪酸等への変換活性機能等
を利用した実施態様も当業者には自明のことであり、容
易に実施することができよう。
【００３６】本発明の方法の好適実施態様として以下の
方法を挙げることができるが、これに必ずしもとらわれ
るものではない。
方法を挙げることができるが、これに必ずしもとらわれ
るものではない。
【００３７】１． 親株微生物が嫌気微生物及び／又は
微好気微生物である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
微好気微生物である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
【００３８】２． 親株微生物がシュウドモナス属細菌
である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
【００３９】３． 前記シュウドモナス属細菌が有機溶
媒感受性微生物である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
媒感受性微生物である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
【００４０】４． 前記有機溶媒感受性微生物がシュウ
ドモナス・プチダＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２６
２）である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
ドモナス・プチダＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２６
２）である有機溶媒耐性微生物の取得方法。
【００４１】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。
るが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
（参考例）先ず、シュウドモナス・プチダＮｏ．６９の
取得方法を示す。
取得方法を示す。
【００４３】さまざまな土壌と培養液Ａ（１ｌ中に以下
の物質を含んでいる。硝酸アンモニウム１．０ｇ、リン
酸水素二カリウム２．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．
０ｇ、酵母エキス３０ｍｇ、ペプトン３０ｍｇ、ビーフ
エキス３０ｍｇ、塩化マグネシウム１００ｍｇ、塩化カ
ルシウム１０ｍｇ、塩化鉄（III ）１０ｍｇ、塩化マン
ガン１０ｍｇ及び塩化亜鉛１０ｍｇ。）と１０００ｐｐ
ｍとなるように、難除去性有機硫黄化合物の代表例とし
てジベンゾチオフェンを密栓できる試験官に入れ、９
９．９９％の窒素ガスを十分に培養液に通し、すぐに密
栓し、３０℃で振盪することにより増殖してきた菌株を
得た。これを純化した菌株の一つは、シュウドモナス・
プチダＮｏ．６９と命名され、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１３２６２号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３２６２）として寄託されている。
の物質を含んでいる。硝酸アンモニウム１．０ｇ、リン
酸水素二カリウム２．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．
０ｇ、酵母エキス３０ｍｇ、ペプトン３０ｍｇ、ビーフ
エキス３０ｍｇ、塩化マグネシウム１００ｍｇ、塩化カ
ルシウム１０ｍｇ、塩化鉄（III ）１０ｍｇ、塩化マン
ガン１０ｍｇ及び塩化亜鉛１０ｍｇ。）と１０００ｐｐ
ｍとなるように、難除去性有機硫黄化合物の代表例とし
てジベンゾチオフェンを密栓できる試験官に入れ、９
９．９９％の窒素ガスを十分に培養液に通し、すぐに密
栓し、３０℃で振盪することにより増殖してきた菌株を
得た。これを純化した菌株の一つは、シュウドモナス・
プチダＮｏ．６９と命名され、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１３２６２号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３２６２）として寄託されている。
【００４４】尚、本菌はジベンゾチオフェンの他にもア
ルキルジベンゾチオフェン等、他の難除去性有機硫黄化
合物をも分解するバイオ脱硫菌である。
ルキルジベンゾチオフェン等、他の難除去性有機硫黄化
合物をも分解するバイオ脱硫菌である。
【００４５】（実施例１）シュウドモナス・プチダＮ
ｏ．６９を、紫外線照射し、有機溶媒を加えて選択培養
することにより、難除去性有機硫黄化合物の代表例とし
てジベンゾチオフェンを微好気・有機溶媒の存在下にお
いて分解する菌株を取得した。
ｏ．６９を、紫外線照射し、有機溶媒を加えて選択培養
することにより、難除去性有機硫黄化合物の代表例とし
てジベンゾチオフェンを微好気・有機溶媒の存在下にお
いて分解する菌株を取得した。
【００４６】先ず、シュウドモナス・プチダＮｏ．６９
をバクト社のＮＢ液体培地（１ｌ中にニュートリエント
ブロス８ｇを含む）に懸濁し、３０℃で対数増殖期（６
６０ｎｍの濁度が０．３〜０．４）まで振盪培養した
後、培養液１ｍｌを濃縮後、ＮＢ寒天培地（１ｌ中にニ
ュートリエントブロス８ｇ及びバクトアガー１５ｇを含
む）に塗布した。
をバクト社のＮＢ液体培地（１ｌ中にニュートリエント
ブロス８ｇを含む）に懸濁し、３０℃で対数増殖期（６
６０ｎｍの濁度が０．３〜０．４）まで振盪培養した
後、培養液１ｍｌを濃縮後、ＮＢ寒天培地（１ｌ中にニ
ュートリエントブロス８ｇ及びバクトアガー１５ｇを含
む）に塗布した。
【００４７】この寒天培地を１５Ｗの殺菌灯（２５３．
７ｎｍの紫外線を発する）の直下、６０ｃｍの所に置
き、菌の生存率が１０-3〜１０-4となるように２０〜２
５秒間照射した。すぐに１−ヘプタノールを深さ１ｍｍ
となるように加え、アルミホイルで包んで、３０℃で培
養した。２週間後、成育してきたコロニーを３度、１−
ヘプタノールを重層したＮＢ寒天培地で継代培養するこ
とにより純化した。
７ｎｍの紫外線を発する）の直下、６０ｃｍの所に置
き、菌の生存率が１０-3〜１０-4となるように２０〜２
５秒間照射した。すぐに１−ヘプタノールを深さ１ｍｍ
となるように加え、アルミホイルで包んで、３０℃で培
養した。２週間後、成育してきたコロニーを３度、１−
ヘプタノールを重層したＮＢ寒天培地で継代培養するこ
とにより純化した。
【００４８】上記のようにして得た菌株を、シュウドモ
ナス・プチダＮｏ．６９−１、シュウドモナス・プチダ
Ｎｏ．６９−２及びシュウドモナス・プチダＮｏ．６９
−３と命名し、シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−１
はＦＥＲＭ ＢＰ−４５１９号として、シュウドモナス
・プチダＮｏ．６９−２はＦＥＲＭ ＢＰ−４５２０号
として及びシュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３はＦ
ＥＲＭ ＢＰ−４５２１号として平成５年１２月２７日
付きで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所微生物
寄託センターに寄託した。
ナス・プチダＮｏ．６９−１、シュウドモナス・プチダ
Ｎｏ．６９−２及びシュウドモナス・プチダＮｏ．６９
−３と命名し、シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−１
はＦＥＲＭ ＢＰ−４５１９号として、シュウドモナス
・プチダＮｏ．６９−２はＦＥＲＭ ＢＰ−４５２０号
として及びシュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３はＦ
ＥＲＭ ＢＰ−４５２１号として平成５年１２月２７日
付きで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所微生物
寄託センターに寄託した。
【００４９】（実施例２）（実施例１）で得た菌株の微
好気、有機溶媒存在下でのジベンゾチオフェン分解能を
以下のようにして求めた。
好気、有機溶媒存在下でのジベンゾチオフェン分解能を
以下のようにして求めた。
【００５０】１−ヘプタノールを重層したＮＢ寒天培地
で増殖させたシュウドモナス・プチダＮｏ．６９−１、
シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−２及びシュウドモ
ナス・プチダＮｏ．６９−３を培養液Ｂ（１ｌ中に０．
８ｇのニュートリエントブロスを含んでいる。）２０ｍ
ｌに懸濁し、０．２ｍｌの１−デカノール（又は１−ノ
ナノール）を加え、９９．９９％の窒素ガスで培養液の
上層を置換した。
で増殖させたシュウドモナス・プチダＮｏ．６９−１、
シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−２及びシュウドモ
ナス・プチダＮｏ．６９−３を培養液Ｂ（１ｌ中に０．
８ｇのニュートリエントブロスを含んでいる。）２０ｍ
ｌに懸濁し、０．２ｍｌの１−デカノール（又は１−ノ
ナノール）を加え、９９．９９％の窒素ガスで培養液の
上層を置換した。
【００５１】密栓した後、３０℃で一昼夜振盪培養し
た。この培養液を遠心し、培養液Ｂを除き、沈殿した菌
体を培養液Ａに懸濁し、培養液Ａを２０ｍｌ含むバイア
ルに移した。５％又は１０％（体積／体積）となるよ
う、２０ｍｇのジベンゾチオフェンを含む１．０５ｍｌ
又は２．２２ｍｌの１−デカノール（又は１−ノナノー
ル）を加え、培養液上層の空気を前述と同じ純度の窒素
ガスで置換し、密栓して３０℃で培養した。２０日間
後、塩酸を加えて、ｐＨを２．５にした後、２０ｍｌの
酢酸エチルで残存するジベンゾチオフェンを抽出した。
定量はガスクロマトグラフィーにより行った。ガスクロ
マトグラフィーの装置は島津社製ＧＣ１４Ａを用い、カ
ラムはジーエルサイエンス社製のシリコンＯＶ１７
１．５％ ８０／１００メッシュ クロモソーブ ＷＡ
Ｗ ＤＷＣＳを用いた。分析の条件は、次の通りに行っ
た。まず、インジェクターの温度を２９０℃にし、昇温
は１５５℃から１８５℃まで１分間に１０℃で行い、検
出はＦＩＤ（Ｆｌａｍｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ）を用い、２９０℃で行った。内部標準と
してカルバゾールを用いた。実験結果は２サンプル以上
の平均値とし、表１に示した。数値は分解したジベンゾ
チオフェン（ｐｐｍ）を表している。
た。この培養液を遠心し、培養液Ｂを除き、沈殿した菌
体を培養液Ａに懸濁し、培養液Ａを２０ｍｌ含むバイア
ルに移した。５％又は１０％（体積／体積）となるよ
う、２０ｍｇのジベンゾチオフェンを含む１．０５ｍｌ
又は２．２２ｍｌの１−デカノール（又は１−ノナノー
ル）を加え、培養液上層の空気を前述と同じ純度の窒素
ガスで置換し、密栓して３０℃で培養した。２０日間
後、塩酸を加えて、ｐＨを２．５にした後、２０ｍｌの
酢酸エチルで残存するジベンゾチオフェンを抽出した。
定量はガスクロマトグラフィーにより行った。ガスクロ
マトグラフィーの装置は島津社製ＧＣ１４Ａを用い、カ
ラムはジーエルサイエンス社製のシリコンＯＶ１７
１．５％ ８０／１００メッシュ クロモソーブ ＷＡ
Ｗ ＤＷＣＳを用いた。分析の条件は、次の通りに行っ
た。まず、インジェクターの温度を２９０℃にし、昇温
は１５５℃から１８５℃まで１分間に１０℃で行い、検
出はＦＩＤ（Ｆｌａｍｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ）を用い、２９０℃で行った。内部標準と
してカルバゾールを用いた。実験結果は２サンプル以上
の平均値とし、表１に示した。数値は分解したジベンゾ
チオフェン（ｐｐｍ）を表している。
【００５２】
【表１】 （実施例３）シュウドモナス・プチダＮｏ．６９とシュ
ウドモナス・プチダＮｏ．６９−３を７５ｍｌの終濃度
１０ｍＭの硫酸マグネシウムと５ｍＭの塩化カルシウム
を含むＮＢ液体培地と７５ｍｌの１−ヘプタノールを含
む５００ｍｌの三角フラスコに懸濁し、３０℃で振盪培
養した。一定時間ごとに６６０ｎｍの濁度と生菌数を測
定した。
ウドモナス・プチダＮｏ．６９−３を７５ｍｌの終濃度
１０ｍＭの硫酸マグネシウムと５ｍＭの塩化カルシウム
を含むＮＢ液体培地と７５ｍｌの１−ヘプタノールを含
む５００ｍｌの三角フラスコに懸濁し、３０℃で振盪培
養した。一定時間ごとに６６０ｎｍの濁度と生菌数を測
定した。
【００５３】生菌数の測定は次の通りに行った。培養液
０．１ｍｌを９．９ｍｌの０．９％（重量／体積）塩化
ナトリウム溶液と混ぜ、１００倍希釈液とし、さらにこ
の希釈液を、順次、１０倍づつ希釈して、１０-3、１０
-4、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8希釈液を調製し
た。各希釈液０．１ｍｌをＮＢ寒天培地に塗布して、３
０℃で２日間培養した。生育してきたコロニーを測定
し、もとの培養液１ｍｌ中に生存する菌体数を計算し
た。結果は図１及び２に示した。
０．１ｍｌを９．９ｍｌの０．９％（重量／体積）塩化
ナトリウム溶液と混ぜ、１００倍希釈液とし、さらにこ
の希釈液を、順次、１０倍づつ希釈して、１０-3、１０
-4、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8希釈液を調製し
た。各希釈液０．１ｍｌをＮＢ寒天培地に塗布して、３
０℃で２日間培養した。生育してきたコロニーを測定
し、もとの培養液１ｍｌ中に生存する菌体数を計算し
た。結果は図１及び２に示した。
【００５４】（実施例４）取得した有機溶媒耐性微生物
及び変換する前の有機溶媒感受性微生物の脂肪酸組成の
変化を調べた。
及び変換する前の有機溶媒感受性微生物の脂肪酸組成の
変化を調べた。
【００５５】２００００ｐｐｍの濃度のジベンゾチオフ
ェンを含む１−ヘプタノールを重層した寒天培地Ｃ（培
養液Ａに１ｌ当たり、１５ｇの寒天を含む）に増殖させ
たシュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５２１）を、１０％（体積／体積）１−ヘプタ
ノール、終濃度１０ｍＭの硫酸マグネシウムと５ｍＭの
塩化カルシウムを含む９０％ＮＢ液体培地に懸濁し、３
０℃で一昼夜、振盪培養した。遠心により、菌体を得、
脂質を抽出後、脂肪酸に加水分解して、脂肪酸メチルを
作製、抽出した。
ェンを含む１−ヘプタノールを重層した寒天培地Ｃ（培
養液Ａに１ｌ当たり、１５ｇの寒天を含む）に増殖させ
たシュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５２１）を、１０％（体積／体積）１−ヘプタ
ノール、終濃度１０ｍＭの硫酸マグネシウムと５ｍＭの
塩化カルシウムを含む９０％ＮＢ液体培地に懸濁し、３
０℃で一昼夜、振盪培養した。遠心により、菌体を得、
脂質を抽出後、脂肪酸に加水分解して、脂肪酸メチルを
作製、抽出した。
【００５６】脂質の抽出は、ＢｌｉｇｈとＤｙｅｒの方
法［Ｅ．Ｇ．Ｂｌｉｇｈ， Ｗ．Ｊ．Ｄｙｅｒ， Ｃａ
ｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．
３７，ｐ．９１１（１９５９）］に従い、脂質からの脂
肪酸への加水分解及び脂肪酸メチルの作製はＭｏｒｒｉ
ｓｏｎとＳｍｉｔｈらの方法［Ｗ．Ｒ．Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ，Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏ
ｌ．５，ｐ．６００（１９６４）］に従って行った。
法［Ｅ．Ｇ．Ｂｌｉｇｈ， Ｗ．Ｊ．Ｄｙｅｒ， Ｃａ
ｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．
３７，ｐ．９１１（１９５９）］に従い、脂質からの脂
肪酸への加水分解及び脂肪酸メチルの作製はＭｏｒｒｉ
ｓｏｎとＳｍｉｔｈらの方法［Ｗ．Ｒ．Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ，Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏ
ｌ．５，ｐ．６００（１９６４）］に従って行った。
【００５７】尚、有機溶媒感受性微生物としてはシュウ
ドモナス・プチダＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２６
２）を用い、ＮＢ寒天培地で増殖させ、終濃度１０ｍＭ
の硫酸マグネシウムと５ｍＭの塩化カルシウムを含むＮ
Ｂ液体培地で一晩、３０℃で振盪培養したことを除いて
は、前述と同じ方法で脂肪酸メチルを作製、抽出した。
ドモナス・プチダＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２６
２）を用い、ＮＢ寒天培地で増殖させ、終濃度１０ｍＭ
の硫酸マグネシウムと５ｍＭの塩化カルシウムを含むＮ
Ｂ液体培地で一晩、３０℃で振盪培養したことを除いて
は、前述と同じ方法で脂肪酸メチルを作製、抽出した。
【００５８】次に、抽出した脂肪酸メチルの分析条件を
示す。島津製作所社製のガスクロマトグラフィー分析装
置ＧＣ１５Ａに、信和化工株式会社製のキャピラリーカ
ラム（ＦＦＳ ＵＬＢＯＮ ＨＲ−ＳＳ−１０、口径
０．３２ｍｍ、長さ５０ｍ）を取り付け、インジェクタ
ー温度を２５０℃、昇温は１５０℃から２２０℃まで１
分間に２℃で行った。検出はＦＩＤで行い、ディテクタ
ー温度は２５０℃で行った。この結果を図３及び４に示
す。
示す。島津製作所社製のガスクロマトグラフィー分析装
置ＧＣ１５Ａに、信和化工株式会社製のキャピラリーカ
ラム（ＦＦＳ ＵＬＢＯＮ ＨＲ−ＳＳ−１０、口径
０．３２ｍｍ、長さ５０ｍ）を取り付け、インジェクタ
ー温度を２５０℃、昇温は１５０℃から２２０℃まで１
分間に２℃で行った。検出はＦＩＤで行い、ディテクタ
ー温度は２５０℃で行った。この結果を図３及び４に示
す。
【００５９】これより、取得前の菌株の脂肪酸組成はシ
ュウドモナス・プチダに典型的なものであったのに対し
て、取得した菌株では、不飽和結合や分枝鎖を持つ脂肪
酸（例えば、Ｃ17:1、Ｃ18:0 iso等）が多く含有されて
いることが分かる。
ュウドモナス・プチダに典型的なものであったのに対し
て、取得した菌株では、不飽和結合や分枝鎖を持つ脂肪
酸（例えば、Ｃ17:1、Ｃ18:0 iso等）が多く含有されて
いることが分かる。
【００６０】（実施例５）シュウドモナス・プチダＮ
ｏ．６９−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５２１）をｎ−ヘプ
タノール、２−オクタノン、２−ヘプタノール、エトキ
シベンゼン、ｎ−オクタノール、ｎ−ノナノールに浸さ
れたＮ寒天培地（ニュートリエントブロス８ｇとバクト
アーガー１５ｇを１ｌに含み、５ｍＭ塩化カルシウム、
１０ｍＭ硫酸マグネシウムに調節されている）で約一週
間、３０℃で培養し、増殖してきた菌体をそれぞれ、同
じ有機溶媒を体積で１０％含むＮ液体培地（ニュートリ
エントブロス８ｇを１ｌに含み、５ｍＭ塩化カルシウ
ム、１０ｍＭ硫酸マグネシウムに調節されている）に一
部移し、３０℃で振盪培養した。それぞれの菌が定常期
にはいった頃に集菌した。一部はＢｌｉｇｈとＤｙｅｒ
の方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．， ａｎｄ Ｗ．Ｊ．Ｄ
ｙｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．， ｖｏｌ ３７， Ｐａｇｅ ９１１−９１７，
１９５９年）により、全脂肪酸を抽出し、Ｍｏｒｒｉ
ｓｏｎとＳｍｉｔｈの方法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｗ．
Ｒ．， ａｎｄ Ｌ．Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓ．， ｖｏｌ ５， Ｐａｇｅ ６００−６０
８， １９６４年）によりメチル化を行った。また、残
りの菌の一部を用い、Ｃｏｈｅｎらの方法（Ｃｏｈｅ
ｎ，Ｍ．，Ｒ．Ｇ．Ｈ．Ｍｏｒｇａｎ， ａｎｄ Ａ．
Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，．
ｖｏｌ １０， Ｐａｇｅ ６１４−６１６， １９６
９年）、５％塩酸−メタノール溶液により遊離脂肪酸の
みメチル化した。脂肪酸メチルの検出は島津ＧＣ１５Ａ
によって行った。分析に用いられたカラムは信和化工株
式会社ＦＦＳ ＵＬＢＯＮ ＨＲ−ＳＳ−１０キャピラ
リーカラムで、４０℃から２２０℃まで２℃の昇温で行
った。ピークの同定は市販標準品を用いて行なった。結
果を表２及び表３に示す。
ｏ．６９−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５２１）をｎ−ヘプ
タノール、２−オクタノン、２−ヘプタノール、エトキ
シベンゼン、ｎ−オクタノール、ｎ−ノナノールに浸さ
れたＮ寒天培地（ニュートリエントブロス８ｇとバクト
アーガー１５ｇを１ｌに含み、５ｍＭ塩化カルシウム、
１０ｍＭ硫酸マグネシウムに調節されている）で約一週
間、３０℃で培養し、増殖してきた菌体をそれぞれ、同
じ有機溶媒を体積で１０％含むＮ液体培地（ニュートリ
エントブロス８ｇを１ｌに含み、５ｍＭ塩化カルシウ
ム、１０ｍＭ硫酸マグネシウムに調節されている）に一
部移し、３０℃で振盪培養した。それぞれの菌が定常期
にはいった頃に集菌した。一部はＢｌｉｇｈとＤｙｅｒ
の方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．， ａｎｄ Ｗ．Ｊ．Ｄ
ｙｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．， ｖｏｌ ３７， Ｐａｇｅ ９１１−９１７，
１９５９年）により、全脂肪酸を抽出し、Ｍｏｒｒｉ
ｓｏｎとＳｍｉｔｈの方法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｗ．
Ｒ．， ａｎｄ Ｌ．Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓ．， ｖｏｌ ５， Ｐａｇｅ ６００−６０
８， １９６４年）によりメチル化を行った。また、残
りの菌の一部を用い、Ｃｏｈｅｎらの方法（Ｃｏｈｅ
ｎ，Ｍ．，Ｒ．Ｇ．Ｈ．Ｍｏｒｇａｎ， ａｎｄ Ａ．
Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，．
ｖｏｌ １０， Ｐａｇｅ ６１４−６１６， １９６
９年）、５％塩酸−メタノール溶液により遊離脂肪酸の
みメチル化した。脂肪酸メチルの検出は島津ＧＣ１５Ａ
によって行った。分析に用いられたカラムは信和化工株
式会社ＦＦＳ ＵＬＢＯＮ ＨＲ−ＳＳ−１０キャピラ
リーカラムで、４０℃から２２０℃まで２℃の昇温で行
った。ピークの同定は市販標準品を用いて行なった。結
果を表２及び表３に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】 表２は各有機溶媒中で培養したときに検出される菌体内
の各脂肪酸の全脂肪酸に対する割合を示し、特に菌体内
トランス型脂肪酸と奇数脂肪酸の割合が高いことが分か
る。また表３は遊離脂肪酸の全脂肪酸に対する割合が高
まることを示しており、特にトランス型脂肪酸と奇数脂
肪酸の割合が高い。
の各脂肪酸の全脂肪酸に対する割合を示し、特に菌体内
トランス型脂肪酸と奇数脂肪酸の割合が高いことが分か
る。また表３は遊離脂肪酸の全脂肪酸に対する割合が高
まることを示しており、特にトランス型脂肪酸と奇数脂
肪酸の割合が高い。
【００６３】（実施例６）実施例５と同じ培養条件（た
だし有機溶媒としては、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタ
ノール、ｎ−ノナノール、ｎ−デカノール、ｎ−ウンデ
カノール、ｎ−ドデカノールを用いた）で培養後、遠心
して（１００００ｇ，１０分）上清を用いた。この上清
から酸を５％炭酸水素ナトリウムで抽出し、塩酸でｐＨ
を１として酸性とした後、エーテルで抽出した。ロータ
リーエバポレーターで完全に乾固した後、前述のＭｏｒ
ｒｉｓｏｎとＳｍｉｔｈの方法により、メチル化した。
脂肪酸メチルの検出は実施例５と同様に行った。結果を
図５（横軸：脂肪アルコールの炭素数、縦軸：変換効率
の常用対数）を示した。
だし有機溶媒としては、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタ
ノール、ｎ−ノナノール、ｎ−デカノール、ｎ−ウンデ
カノール、ｎ−ドデカノールを用いた）で培養後、遠心
して（１００００ｇ，１０分）上清を用いた。この上清
から酸を５％炭酸水素ナトリウムで抽出し、塩酸でｐＨ
を１として酸性とした後、エーテルで抽出した。ロータ
リーエバポレーターで完全に乾固した後、前述のＭｏｒ
ｒｉｓｏｎとＳｍｉｔｈの方法により、メチル化した。
脂肪酸メチルの検出は実施例５と同様に行った。結果を
図５（横軸：脂肪アルコールの炭素数、縦軸：変換効率
の常用対数）を示した。
【００６４】図から、奇数炭素数の直鎖脂肪アルコール
の対応奇数脂肪酸への酸化効率がより高いことが分か
る。
の対応奇数脂肪酸への酸化効率がより高いことが分か
る。
【００６５】（実施例７）実施例５と同じ条件で培養
（ただし、リポ多糖のヘプタノール濃度依存を調べる実
験では濃度は体積で０％、０．１％、１．０％、１０．
０％が用いられた。有機溶媒依存を調べる実験ではデカ
リン、ｎ−ドデカノール、ｎ−ウンデカノール、ｎ−デ
カノール、ｎ−ノナノール、ｎ−オクタノール、エトキ
シベンゼン、ｎ−ヘプタノールが用いられた）して得た
菌体を、ＰｒｅｓｔｏｎとＰｅｎｎｅｒの方法（Ｐｒｅ
ｓｔｏｎ，Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｐｅｎｎｅｒ，
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．， ｖｏｌ ５５， Ｐ
ａｇｅ １８０６−１８１２，１９８７年）でタンパク
質分解し、ＬａｅｍｍｌｉとＦａｖｒｅの方法（Ｌａｅ
ｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ． ａｎｄ Ｍ．Ｆａｖｒｅ，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ ８０， Ｐａｇｅ ５７５
−５９９， １９７３年）で電気泳動を行い、Ｔｓａｉ
とＦｒａｓｃｈの方法（Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ． ａｎｄ
Ｃ．Ｅ．Ｆｒａｓｃｈ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．， ｖｏｌ １１９， Ｐａｇｅ １１５−１１
９， １９８２年）によりリポ多糖を検出した。結果を
図６および図７に示した。
（ただし、リポ多糖のヘプタノール濃度依存を調べる実
験では濃度は体積で０％、０．１％、１．０％、１０．
０％が用いられた。有機溶媒依存を調べる実験ではデカ
リン、ｎ−ドデカノール、ｎ−ウンデカノール、ｎ−デ
カノール、ｎ−ノナノール、ｎ−オクタノール、エトキ
シベンゼン、ｎ−ヘプタノールが用いられた）して得た
菌体を、ＰｒｅｓｔｏｎとＰｅｎｎｅｒの方法（Ｐｒｅ
ｓｔｏｎ，Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｐｅｎｎｅｒ，
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．， ｖｏｌ ５５， Ｐ
ａｇｅ １８０６−１８１２，１９８７年）でタンパク
質分解し、ＬａｅｍｍｌｉとＦａｖｒｅの方法（Ｌａｅ
ｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ． ａｎｄ Ｍ．Ｆａｖｒｅ，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ ８０， Ｐａｇｅ ５７５
−５９９， １９７３年）で電気泳動を行い、Ｔｓａｉ
とＦｒａｓｃｈの方法（Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ． ａｎｄ
Ｃ．Ｅ．Ｆｒａｓｃｈ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．， ｖｏｌ １１９， Ｐａｇｅ １１５−１１
９， １９８２年）によりリポ多糖を検出した。結果を
図６および図７に示した。
【００６６】図６はリポ多糖のｎ−ヘプタノール濃度依
存性を示しているが、ヘプタノール濃度が０．１％でも
すでに高分子量側が欠除されており、また有機溶媒がな
いと親株と同じく高分子量側が再生されることが分か
る。また図７はリポ多糖有機溶媒依存性を示している
が、各有機溶媒と培養したときのリポ多糖より、レーン
Ｎｏ．が大きくなるに従い、ｌｏｇ Ｐが小さい有機溶
媒が使われている。従って、高分子量側がだんだん欠除
していることが分かる。
存性を示しているが、ヘプタノール濃度が０．１％でも
すでに高分子量側が欠除されており、また有機溶媒がな
いと親株と同じく高分子量側が再生されることが分か
る。また図７はリポ多糖有機溶媒依存性を示している
が、各有機溶媒と培養したときのリポ多糖より、レーン
Ｎｏ．が大きくなるに従い、ｌｏｇ Ｐが小さい有機溶
媒が使われている。従って、高分子量側がだんだん欠除
していることが分かる。
【００６７】
【発明の効果】有機溶媒中で増殖し、なおかつ親水性の
親株の持つ有用な機能を発現する微生物を元来親水性の
微生物から効果的に変換取得して得ることができた。さ
らに、親株微生物にシュウドモナス属細菌を用いること
で、微好気・有機溶媒中で難除去性有機硫黄化合物を分
解するバイオ脱硫菌を得ることができた。
親株の持つ有用な機能を発現する微生物を元来親水性の
微生物から効果的に変換取得して得ることができた。さ
らに、親株微生物にシュウドモナス属細菌を用いること
で、微好気・有機溶媒中で難除去性有機硫黄化合物を分
解するバイオ脱硫菌を得ることができた。
【図１】シュウドモナス・プチダＮｏ．６９（×）とシ
ュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３（○）を５０％
（体積／体積）の１−ヘプタノール存在下で培養した時
の６６０ｎｍの濁度の経時変化を示す。
ュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３（○）を５０％
（体積／体積）の１−ヘプタノール存在下で培養した時
の６６０ｎｍの濁度の経時変化を示す。
【図２】図１の条件下で培養した時のシュウドモナス・
プチダＮｏ．６９（×）とシュウドモナス・プチダＮ
ｏ．６９−３（○）の生菌数を示す。
プチダＮｏ．６９（×）とシュウドモナス・プチダＮ
ｏ．６９−３（○）の生菌数を示す。
【図３】シュウドモナス・プチダＮｏ．６９の脂肪酸メ
チルの分析結果を示す。
チルの分析結果を示す。
【図４】シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３の脂肪
酸メチルの分析結果を示す。
酸メチルの分析結果を示す。
【図５】炭素数の異なる直鎖脂肪アルコールの、対応す
る脂肪酸への酸化効率の比較を示す。
る脂肪酸への酸化効率の比較を示す。
【図６】リポ多糖のｎ−ヘプタノール濃度依存性を示す
電気泳動写真である。レーンｌはコントロールとして、
有機溶媒を含まないＮ液体培地で培養したＮｏ．６９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２６２）、レーン２は０％、レー
ン３は０．１％、レーン４は１．０％、レーン５は１０
％を示す。
電気泳動写真である。レーンｌはコントロールとして、
有機溶媒を含まないＮ液体培地で培養したＮｏ．６９
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２６２）、レーン２は０％、レー
ン３は０．１％、レーン４は１．０％、レーン５は１０
％を示す。
【図７】リポ多糖有機溶媒依存性を示す電気泳動写真で
ある。レーン１はコントロールの有機溶媒を含まないＮ
液体培地で培養したＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２
６２）、レーン２はデカリン、レーン３はｎ−ドデカノ
ール、レーン４はｎ−ウンデカノール、レーン５はｎ−
デカノール、レーン６はｎ−ノナノール、レーン７はｎ
−オクタノール、レーン８はエトキシベンゼン、レーン
９はヘプタノールを示す。
ある。レーン１はコントロールの有機溶媒を含まないＮ
液体培地で培養したＮｏ．６９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２
６２）、レーン２はデカリン、レーン３はｎ−ドデカノ
ール、レーン４はｎ−ウンデカノール、レーン５はｎ−
デカノール、レーン６はｎ−ノナノール、レーン７はｎ
−オクタノール、レーン８はエトキシベンゼン、レーン
９はヘプタノールを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０２Ｆ 3/34 ＺＡＢ Ｚ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者 津幡 卓一 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (12)
- 【請求項１】 親株微生物に変異処理を施し、有機溶媒
を加えて選択培養することを特徴とする有機溶媒耐性微
生物の取得方法。 - 【請求項２】 変異処理により親株微生物の菌体脂肪酸
組成が変わる請求項１の方法。 - 【請求項３】 変異処理により親株微生物のリポ多糖組
成が変わる請求項１の方法。 - 【請求項４】 変異処理により、菌体脂肪酸組成中のト
ランス型不飽和脂肪酸、分枝脂肪酸及び／又は奇数炭素
数の飽和脂肪酸の含量が増大する請求項２の方法。 - 【請求項５】 変異処理により、菌体内遊離脂肪酸の全
脂肪酸に対する割合を高める請求項１の方法。 - 【請求項６】 変異処理により、低級直鎖脂肪アルコー
ルの酸化をして菌体内に奇数脂肪酸を高める請求項１の
方法。 - 【請求項７】 変異処理により、毒性の強い有機溶媒と
接して奇数脂肪酸を高める請求項１の方法。 - 【請求項８】 変異処理により、菌体内リポ多糖の高分
子側の割合を減少又は欠除させる請求項３の方法。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかの方法により得
られる有機溶媒耐性微生物。 - 【請求項１０】 親株微生物の有する性質の一部又は全
部が保存されている請求項９の微生物。 - 【請求項１１】 有機硫黄化合物の生分解性が保存され
た請求項１０の微生物。 - 【請求項１２】 シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−
１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１９）、シュウドモナス・プ
チダＮｏ．６９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５２０）又は
シュウドモナス・プチダＮｏ．６９−３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５２１）である請求項１１の微生物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6264544A JPH07255462A (ja) | 1994-02-02 | 1994-10-04 | 有機溶媒耐性微生物の取得方法及び該方法により取得した有機溶媒耐性微生物 |
| DE69534954T DE69534954T2 (de) | 1994-02-02 | 1995-02-02 | Methode zur Darstellung von Mikroorganismen welche resistent für organische Lösungsmittel sind, sowie organische Lösungsmittel resistente Mikroorganismen, durch diese Methode erhalten |
| EP95300656A EP0666316B1 (en) | 1994-02-02 | 1995-02-02 | Method for obtaining organic solvent-resistant microorganisms and organic solvent-resistant microorganisms obtainable by the method |
| US08/741,335 US5804435A (en) | 1994-02-02 | 1996-10-29 | Method for obtaining organic solvent-resistant microorganisms and organic solvent-resistant microorganisms obtainable by the method |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-11252 | 1994-02-02 | ||
| JP1125294 | 1994-02-02 | ||
| JP6264544A JPH07255462A (ja) | 1994-02-02 | 1994-10-04 | 有機溶媒耐性微生物の取得方法及び該方法により取得した有機溶媒耐性微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07255462A true JPH07255462A (ja) | 1995-10-09 |
Family
ID=26346667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6264544A Pending JPH07255462A (ja) | 1994-02-02 | 1994-10-04 | 有機溶媒耐性微生物の取得方法及び該方法により取得した有機溶媒耐性微生物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5804435A (ja) |
| EP (1) | EP0666316B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07255462A (ja) |
| DE (1) | DE69534954T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003073680A (ja) * | 2001-09-04 | 2003-03-12 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | 有機性廃棄物のメタン発酵ガスの脱硫装置 |
| JP2017525939A (ja) * | 2014-06-12 | 2017-09-07 | ヒグロス インベスト ゲーエムベーハー | 溶液中の内毒素の脱マスキングの方法 |
| US10697958B2 (en) | 2014-06-12 | 2020-06-30 | Hyglos Invest Gmbh | Unmasking endotoxins in solution |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6020185A (en) * | 1997-05-23 | 2000-02-01 | Geovation Consultants, Inc. | Method and composition for the anaerobic biodegradation of toxic compounds |
| US6077432A (en) * | 1999-03-15 | 2000-06-20 | Applied Research Associates, Inc. | Bio-degradation of ammonium perchlorate, nitrate, hydrolysates and other energetic materials |
| US6365410B1 (en) | 1999-05-19 | 2002-04-02 | Genencor International, Inc. | Directed evolution of microorganisms |
| US7101410B1 (en) | 2004-06-03 | 2006-09-05 | Baugh Clarence L | Method for the microbiological desulfurization of fossil fuels |
| US7998724B2 (en) * | 2007-04-27 | 2011-08-16 | Ut-Battelle Llc | Removal of mercury from coal via a microbial pretreatment process |
| US20110195505A1 (en) * | 2009-10-08 | 2011-08-11 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Bacterial strains for butanol production |
| CN106007242B (zh) * | 2015-07-26 | 2021-10-26 | 重庆新知创科技有限公司 | 一种去除含铬污水污染物的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0218734A1 (en) * | 1985-10-02 | 1987-04-22 | Atlantic Research Corporation | A novel mutant microorganism and its use in removing organic sulfur compounds |
| JPH07100026B2 (ja) * | 1991-09-30 | 1995-11-01 | 海洋科学技術センター | フラボバクテリウム属に属する新規微生物 |
| JPH07103379B2 (ja) * | 1992-11-13 | 1995-11-08 | 工業技術院長 | バイオ脱硫法 |
-
1994
- 1994-10-04 JP JP6264544A patent/JPH07255462A/ja active Pending
-
1995
- 1995-02-02 DE DE69534954T patent/DE69534954T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-02 EP EP95300656A patent/EP0666316B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-10-29 US US08/741,335 patent/US5804435A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003073680A (ja) * | 2001-09-04 | 2003-03-12 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | 有機性廃棄物のメタン発酵ガスの脱硫装置 |
| JP2017525939A (ja) * | 2014-06-12 | 2017-09-07 | ヒグロス インベスト ゲーエムベーハー | 溶液中の内毒素の脱マスキングの方法 |
| US10585086B2 (en) | 2014-06-12 | 2020-03-10 | Hyglos Invest Gmbh | Unmasking endotoxins in solution |
| US10697958B2 (en) | 2014-06-12 | 2020-06-30 | Hyglos Invest Gmbh | Unmasking endotoxins in solution |
| US11092592B2 (en) | 2014-06-12 | 2021-08-17 | Biomérieux Deutschland Gmbh | Unmasking endotoxins in solution |
| US11860158B2 (en) | 2014-06-12 | 2024-01-02 | Biomérieux Deutschland Gmbh | Unmasking endotoxins in solution |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0666316B1 (en) | 2006-04-26 |
| US5804435A (en) | 1998-09-08 |
| DE69534954D1 (de) | 2006-06-01 |
| DE69534954T2 (de) | 2006-12-28 |
| EP0666316A3 (en) | 1998-05-20 |
| EP0666316A2 (en) | 1995-08-09 |
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