CN102203238B

CN102203238B - 鲨肌醇产生细胞和使用该细胞的鲨肌醇制造方法

Info

Publication number: CN102203238B
Application number: CN200980143271.XA
Authority: CN
Inventors: 吉田健一; 芦田均
Original assignee: Kobe University NUC
Current assignee: Kobe University NUC
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2029-10-30
Also published as: EP2357222B1; US8962287B2; JPWO2010050231A1; US20110207188A1; JP5649119B2; EP2357222A4; EP2357222A1; WO2010050231A1; CN102203238A

Abstract

本发明的课题提供能够由肌肉-肌醇有效且简便地制造鲨肌醇的细胞，和使用该细胞的鲨肌醇制造方法。该课题通过以下方式得到解决，即首次发现在枯草杆菌中存在具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质，和具有2-酮肌酮还原酶功能的蛋白质，枯草杆菌中具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能缺失的细胞和使用该细胞制造鲨肌醇。

Description

鲨肌醇产生细胞和使用该细胞的鲨肌醇制造方法

技术领域

本发明涉及鲨肌醇(scyllo-inositol：SI)产生细胞和使用该细胞的鲨肌醇的制造方法。更详细而言，该细胞的特征在于，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低。

本申请要求通过参照而援用的日本申请特愿2008-281348号的优先权。

背景技术

鲨肌醇是肌肉肌醇(myo-inositol：MI)的一个立体异构体，是广泛存在于动物·植物中的化合物。人们期待鲨肌醇作为阿耳茨海默氏病的治疗药、生理活性物质的合成原料、液晶化合物的合成原料的用途。由于鲨肌醇与便宜供给的肌肉肌醇相比是高价的化合物，因此，迄今为止，人们对以肌肉肌醇作为原料的鲨肌醇的制造方法开展了各种研究。

作为鲨肌醇制造方法的化学合成方法，有以下方法，即用铂催化剂氧化肌肉肌醇，获得2-酮肌肉肌醇(2-keto-myo-inositol)(青蟹肌糖(scyllo-inosose))，接着，在酯化后进行还原和水解，获得鲨肌醇的方法等。

此外，作为肌肉肌醇变化为鲨肌醇的方法，公开了使用从自然界分离的假单胞菌属细菌、醋杆菌属细菌的方法。该方法，使用前述菌由肌肉肌醇产生2-酮肌肉肌醇，通过对2-酮肌肉肌醇进行化学还原，获得鲨肌醇(专利文献1)。

由肌肉肌醇少量生产鲨肌醇的菌株由醋杆菌属的细菌等获得(专利文献2)。已知，在这些菌株中，NADPH依赖性地将2-酮肌肉肌醇立体特异地还原为鲨肌醇的酶起作用。

报道了，在芽孢杆菌属的菌中，通过基因改变肌醇代谢系基因簇，获得了由肌肉肌醇有效产生D-手性肌醇的菌株(专利文献3、非专利文献1)。该菌株(YF256株)缺损了肌醇代谢相关的iolE基因和iolR基因。

专利文献1：日本专利第3981597号

专利文献2：国际公开WO2005/035774号小册子

专利文献3：特开2006-141216号公报

非专利文献1：Appl Environ Microbiol.2006Feb；72(2)：1310-5.

发明内容

本发明的课题在于提供能够由肌肉肌醇(myo-inositol)有效且简便地产生鲨肌醇的细胞和使用该细胞的鲨肌醇制造方法。

为了解决上述问题，本发明人进行了积极的研究，结果首次确认了枯草杆菌中存在具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质和具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质，发现通过肌醇产生细胞中具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能缺损的细胞，可以有效地产生鲨肌醇，从而完成了本发明。

也就是说，本发明由以下内容构成。

1.一种鲨肌醇产生细胞，至少具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低。

2.根据前项1所述的细胞，具有2-酮肌肉肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能和肌醇代谢类基因簇的阻遏蛋白的功能发生缺损或降低。

3.根据前项1或2所述的细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能的发生缺损或降低是通过人为破坏编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的基因所致的。

4.根据前项1～3任一项所述的细胞，鲨肌醇脱氢酶活性是将鲨肌醇的2位羟基脱氢的活性。

5.根据前项1～4中任一项所述的细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质是由选自以下的(a)～(c)中的任意一个DNA编码的蛋白质：

(a)由序列号1表示的碱基序列构成的DNA；

(b)由在序列号1表示的碱基序列中取代、缺失、***和/或添加了一个以上的核苷酸的碱基序列构成，且编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA；

(c)与由序列号1表示的碱基序列构成的DNA在严紧条件下杂交，且编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

6.根据前项1～5中任一项所述的细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质是选自以下的(a)～(c)中的任意一个蛋白质：

(a)由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了一个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，且具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质；

(c)由与序列号2表示的氨基酸序列具有40％以上的同源性的氨基酸序列构成，且具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质。

7.根据前项1～6中任一项所述的细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质依赖于NAD⁺发挥作用。

8.根据前项1～7中任一项所述的细胞，具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质发挥作用。

9.根据前项8所述的细胞，具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质是由选自以下的(a)～(c)中的任意一个DNA编码的蛋白质：

(a)由序列号3表示的碱基序列构成的DNA；

(b)由在序列号3表示的碱基序列中取代、缺失、***和/或添加了1个以上的核苷酸的碱基序列构成，且编码具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质的DNA；

(c)与由序列号3表示的碱基序列构成的DNA在严紧条件下杂交，且编码具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质的DNA。

10.根据前项8所述的细胞，具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质是选自以下(a)～(c)中的任意一个蛋白质：

(a)由序列号4表示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由在序列号4表示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了一个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，且具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质；

(c)由与序列号4表示的氨基酸序列具有40％以上的同源性的氨基酸序列构成，且具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质。

11.根据前项1～10中任一项所述的细胞，所述细胞是属于芽孢杆菌属的菌。

12.根据前项1～11中任一项所述的细胞，所述细胞是受領番号为FERMABP-11185(国内受託番号：FERM P-21700、国内保藏日：2008年10月8日)的枯草杆菌TM030株。

13.根据前项1～12中任一项所述的细胞，具有青蟹肌糖异构酶活性的蛋白质的功能也降低或缺损了。

14.鲨肌醇制造方法，包括在肌肉肌醇(myo-inositol)的存在下培养前项1～13中任一项所述的细胞的工序。

15.根据前项14所述的鲨肌醇制造方法，其还包括从进行前述培养的工序中获得的培养滤液中除去细胞的工序，和从除去了细胞的培养滤液中分离鲨肌醇的工序。

本发明的细胞能够以便宜的肌肉肌醇作为原料，在细胞内有效产生可以作为阿耳茨海默氏病的治疗药等使用的鲨肌醇。而且，使用这种细胞的本发明的鲨肌醇的制造方法不需要还原剂等添加物，能够在一个步骤中进行鲨肌醇的生产，十分简便。

附图说明

[图1]是表示枯草杆菌中肌醇的代谢系的图。

[图2]是表示对各种基因进行表达分析的结果的图。(参考例2)

[图3]是表示对yisS基因的表达量进行确认的结果的照片。(参考例2)

[图4]是表示培养yisS基因破坏株的结果的图。(参考例3)

[图5]是表示培养yisS基因破坏株的结果的照片。(参考例3)

[图6]是表示培养TM039株的培养液的分析结果的图。(实施例4)

具体实施方式

本发明的对象为，由于细胞内原本存在的具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低，能够有效产生鲨肌醇的细胞。

本发明中，所谓“蛋白质的功能发生缺损或降低”的细胞，可例示为，与野生型细胞相比，对象蛋白质自身的功能降低或消失，或量减少，或不表达的细胞等。具体的是，所谓“蛋白质的功能发生缺损或降低”的细胞，可例示为，在编码对象蛋白质的基因中导入变异，或者该基因被破坏了的细胞。本发明的细胞可以是天然产生的，也可以是通过人为破坏该基因而制备的细胞。优选的本发明的细胞，是通过人为破坏编码对象蛋白质的基因而制备的。

本发明中所谓“细胞”，可以是具有肌醇代谢系的酶，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低的细胞，微生物、动物细胞、植物细胞等，种类没有限制。优选可以使用肌醇代谢系酶成群存在的(具有肌醇代谢系基因簇或操纵子)微生物。微生物优选是细菌，作为已知形成肌醇代谢系基因簇的细菌，可以列举芽孢杆菌属(Bacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)等。而且，属于隐球菌属(Cryptococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Shinorhizobium)的菌也存在具有肌醇代谢系基因簇的可能性，也可以使用这些菌。尤其是，优选使用属于芽孢杆菌属的菌，更优选使用枯草杆菌(Bacillus subtilis)。

作为肌醇代谢系的酶，至少可例示出鲨肌醇脱氢酶、2-酮肌肉肌醇酮还原酶、肌肉肌醇-2-脱氢酶。还可以列举青蟹肌糖异构酶、2-酮肌肉肌醇脱氢酶等。肌醇代谢系的酶中包括由肌醇代谢系基因簇编码的酶，例如在枯草杆菌中，肌肉肌醇-2-脱氢酶、青蟹肌糖(scyllo-inosose)异构酶、2-酮肌肉肌醇脱氢酶等由肌醇代谢系基因簇编码的酶。

本发明的细胞的特征在于，至少具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低。鲨肌醇脱氢酶催化由鲨肌醇转化为2-酮肌肉肌醇的反应，具有对鲨肌醇的2位羟基脱氢的活性。而且，鲨肌醇脱氢酶活性依赖于NAD⁺。

具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质优选是由选自以下(a)～(c)中任意一个DNA编码的蛋白质：(a)由序列号1表示的碱基序列构成的DNA；(b)由在序列号1表示的碱基序列中取代、缺失、***和/或添加了一个以上的核苷酸的碱基序列构成，且编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA；(c)与由序列号1表示的碱基序列构成的DNA在严紧条件下杂交，且编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA。或者，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质是选自以下(a)～(c)中任意一个蛋白质：(a)由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了一个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，且具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质；(c)由与序列号2表示的氨基酸序列具有40％以上的同源性的氨基酸序列构成，且具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质。

此外，本发明的细胞优选保持具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质的功能。2-酮肌肉肌醇酮还原酶催化由2-酮肌肉肌醇转化为鲨肌醇的反应。此外，2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性依赖于NADPH。

具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质是优选由选自以下的(a)～(c)中的任意一个DNA编码的蛋白质：(a)由序列号3表示的碱基序列构成的DNA；(b)由在序列号3表示的碱基序列中取代、缺失、***和/或添加了1个以上的核苷酸的碱基序列构成，且编码具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质的DNA；(c)与由序列号3表示的碱基序列构成的DNA在严紧条件下杂交，且编码具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质的DNA。或者，具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质是选自以下(a)～(c)中的任意一个蛋白质：(a)由序列号4表示的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由在序列号4表示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了一个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，且具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质；(c)由与序列号4表示的氨基酸序列具有40％以上同源性的氨基酸序列构成，且具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质。

本发明中，所谓在严紧条件下杂交的DNA，是指例如，以具有序列号1或3表示的碱基序列的DNA或其一部分的DNA片段作为探针，使用菌落杂交法、噬斑杂交法或Southern杂交法等而获得的DNA，具体可以列举，通过使用固定了菌落或噬斑来源的DNA的过滤器，在0.7～1.0M的氯化钠存在下，在65℃进行杂交后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠构成)，在65℃条件下清洗过滤器能够鉴定的DNA。杂交可以按照记载于《分子克隆》，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版，1989(以下简称为分子克隆第2版)、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1987-1997(以下，简称Current Protocols in Molecular Biology)、DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，Oxford University (1995)等中记载的方法进行。作为可以杂交的DNA，具体可以列举由与序列号1或3表示的碱基序列至少具有30％以上的同源性的碱基序列构成的DNA、优选具有60％以上、更优选具有80％以上、更为优选具有90％以上、最优选具有98％以上同源性的DNA。

本发明中，由在序列号1或3表示的碱基序列中取代、缺失、***和/或添加了1个以上的核苷酸的碱基序列编码的蛋白质，和由在序列号2或4表示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质可以使用分子克隆第2版，Current Protocols in Molecular Biology、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)，Gene，34，315(1985)，Nucleic Acids Research，13，4431(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci USA，82，488(1985)等中记载的定点诱变法来获得。缺失、取代、***和/或添加的核苷酸或氨基酸的数目在1个以上，其数目并没有特别限制，但是通过上述的定点诱变法等公知技术能够缺失、取代或添加的程度的数目，例如是1～数十个、优选1～20个、更优选1～10个、更优选1～5个。

而且，本发明中，具有鲨肌醇脱氢酶活性或肌肉肌醇-2-脱氢酶活性的功能的蛋白质，在分别用序列号2或4表示的氨基酸序列和BLAST〔J.Mol.Biol.，215，403(1990)〕或FASTA〔Methods in Enzymology，183，63(1990)〕等分析软件进行计算时，具有至少40％以上、优选80％以上、更优选90％以上、特别优选95％以上的同源性。这种由与序列号2或4中记载的氨基酸序列具有40％以上同源性的氨基酸序列构成的蛋白质包括与由序列号2或4中记载的氨基酸序列构成的蛋白质的立体结构类似的蛋白质。

对象蛋白质是否具有鲨肌醇脱氢酶活性或肌肉肌醇-2-脱氢酶活性，对象基因是否编码具有这些活性的蛋白质，可以用本身公知的酶学测试等方法来确认。此外，还可以通过例如，在只以鲨肌醇或只以2-酮肌肉肌醇作为碳源的培养基中使人为使对象蛋白质功能发生缺损的菌株生长来确定。

本发明的细胞优选具有2-酮肌肉肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能和肌醇代谢系基因簇的阻遏蛋白的功能发生缺损或降低。

本发明的细胞更优选具有青蟹肌糖异构酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低。

在本发明的细胞的制作中，作为人为使目的蛋白质的功能发生缺损或降低的方法，例举了破坏编码目的蛋白质的基因的方法，也可以使用通常的通过变异进行的方法。例如，通过物理的和/或化学的诱变处理中，除了UV照射、放射线照射等物理变异方法之外，还例举了通过N亚硝基胍、甲磺酸乙酯、亚硝酸、甲磺酸甲酯、吖啶色素、苯并芘、硫酸二甲酯等变异剂的混合而进行的化学的变异方法。这些变异处理是期待在基因上进行碱基的***、缺失和/或取代的方法。变异处理中，只要基因被破坏，可以***、缺失和/或取代一个碱基，也可以***、缺失、和/或取代多个碱基。

此外，作为从实施了变异处理的细胞获得目的细胞的方法，可以列举以肌肉肌醇的代谢分解能力缺失作为指标的筛选方法、以在添加了葡萄糖的培养基中生长的细胞的肌醇代谢酶活性的高度作为指标的筛选方法。

此外，作为编码目的蛋白质的基因的其它人为的破坏方法，有通过同源重组进行碱基的***、缺失和/或取代的方法。同源重组法，是导入人为实施了碱基的***、缺失和/或取代，且部分具有与目的基因相同序列的碱基序列，通过同源重组进行变异的方法。例如，导入***了作为耐药基因的氯霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、四环素耐性基因、红霉素耐性基因、壮观霉素耐性基因、氨苄西林耐性基因、潮霉素耐性基因等的碱基序列后，用相应的药剂进行筛选，获得存活细胞的方法。而且，还可以通过用PCR等机器确认是否在所期望的部分***，从而获得目的细胞。

而且，所谓“人为破坏目的蛋白质的功能或编码目的蛋白质的基因”是指，例如，通过导入突变、或同源重组，抑制该基因的转录，或破坏该基因编码的蛋白质的功能。

对于肌醇代谢系的酶和肌醇代谢，例示枯草杆菌进行说明(参照图1)。

肌肉肌醇-2-脱氢酶是肌醇代谢系基因簇中的1种、即iolG基因编码的肌肉肌醇代谢的初始酶。肌肉肌醇-2-脱氢酶通过NAD⁺依赖的反应将肌肉肌醇(MI)转化为2-酮肌肉肌醇(2-keto-myo-inositol：2KMI)(也称为“青蟹肌糖”)。而且，肌肉肌醇-2-脱氢酶也催化将D-手性肌醇(D-chiro-inositol：DCI)转化为1-酮基-D-手性肌醇(1-keto-D-chiro-inositol：1KDCI)的反应。

2-酮肌肉肌醇酮还原酶是由yvaA基因(Swiss-Prot：032223)编码的酶。本发明首次确认了在枯草杆菌中存在具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质。2-酮肌肉肌醇酮还原酶将2-酮肌肉肌醇(2KMI)转化为鲨肌醇(SI)。这种反应依赖于NADPH。

鲨肌醇脱氢酶是由yisS基因(Swiss-Prot：P40332)编码的酶。本发明首次确认了在枯草杆菌中存在具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质。鲨肌醇脱氢酶将鲨肌醇(SI)转化为2-酮肌肉肌醇(2KMI)，将鲨肌醇的2位羟基脱氢。转化反应是依赖于NAD⁺的反应。

青蟹肌糖异构酶是由肌醇代谢系基因簇中的一种、即iolI基因编码的酶，是相互转化(异构化)2-酮肌肉肌醇(2KMI)和1-酮基-D-手性肌醇(1KDCI)的酶。

此外，2-酮肌肉肌醇脱氢酶是由肌醇代谢系基因簇中的一种，即iolE基因编码，对2-酮肌肉肌醇(2KMI)进行脱氢，转化为D-2，3-二酮-4-脱氧基-表肌醇(D-2，3-diketo-4-deoxy-epi-inositol：DKDI)的酶。

作为肌醇代谢系基因簇编码的酶，还可以列举还代谢D-2，3-二酮-4-脱氧基-表肌醇(DKDI)的酶。但是，在不生成D-2，3-二酮-4-脱氧基-表肌醇 (DKDI)时(例如，没有2-酮肌肉肌醇脱氢酶活性时)，不进行D-2，3-二酮-4-脱氧基-表肌醇(DKDI)的代谢。

已知在枯草杆菌中，肌醇代谢系基因簇，即使在培养液中含有肌肉肌醇，在同时含有葡萄糖等糖时，也基本不表达(Yoshida，K.et al.，Nucleic Acids Resarch，vol.29，p.683-692(2001))。因此，在通常的含有葡萄糖等的培养条件下，肌醇代谢系基因簇的酶活性非常低，由肌肉肌醇(MI)向鲨肌醇(SI)或D-手性肌醇(DCI)的转化反应也基本不进行。

已知，在肌醇代谢系基因簇的基因上的上游存在转录控制蛋白质。这种转录控制蛋白质是由iolR基因编码的阻遏蛋白，也称为负调控子(Negative regulator)或负的转录调节因子。已知，在这种阻遏蛋白中，肌醇代谢中间体2-脱氧基5-酮基-D-葡糖醛酸6-磷酸起着诱导物的作用，肌醇代谢系基因簇的转录抑制被解除，该代谢系基因簇的酶受到翻译诱导(Yoshida，K.et al.，Journal of Biological Chemistry，Vol.283，p.10415-10424(2008))。而且，实验性地公开了，即使通过破坏iolR基因，肌醇代谢系基因簇的转录抑制被解除，该代谢系基因簇仍组成型表达(Yoshida，K.et al.，Journal of Molecular Biology，Vol.285，917-929(1999))。

例如，在破坏了肌醇代谢系基因簇中的编码具有2-酮肌肉肌醇脱氢酶活性的蛋白质的基因(iolE基因)和肌醇代谢系基因簇的编码阻遏蛋白的基因(iolR基因)的枯草杆菌菌株(YF256株)中，由肌肉肌醇向D-手性肌醇的转化效率上升。这是因为，在解除了转录抑制的状态下，可以使2-酮肌肉肌醇脱氢酶以外的肌醇代谢系基因簇的酶进行生物合成，结果能够不产生肌肉肌醇的不好的代谢分解。

在这种由肌肉肌醇向D-手性肌醇的转化中，尽管与由2-酮肌肉肌醇(2KMI)向1-酮基-D-手性肌醇(1KDCI)的转化反应相关，但该反应由青蟹肌糖异构酶催化。人们报道了枯草杆菌的肌醇代谢系基因簇中，iolI基因编码青蟹肌糖异构酶(Yoshida，K.et al.，Applied andEnvironmental Microbiology，72(2)，1310-5(2006Feb))。

本发明人，首次确认了在枯草杆菌中由yisS基因和yvaA基因编码的蛋白质与鲨肌醇和2-手性-肌肉肌醇之间的转化相关，除了iolE基因和iolR基因之外，还制作了破坏了鲨肌醇的分解所必需的yisS基因(编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的基因)的枯草杆菌(TM030株)。用存在肌肉肌醇的培养液培养枯草杆菌TM030菌株，结果发现与YF256株相比，可以有效地产生鲨肌醇。

通过对iolE基因实施药物变异而使之失活，通过iolR基因与yisS基因的同源重组，分别***耐药标记物(氯霉素耐性基因、例如氯霉素乙酰基转化酶)和整合载体pMUTIN(Vagner，V.et al.，Mirocbilogy，Vol.144，p.3097-3104(1998))，而被破坏的变异枯草杆菌株(名称Bacillus subtilis TM030株)，将其于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)，保藏编号FERM BP-11185(国内保藏号：FERM P-21700、国内保藏日：2008年10月8日)进行国际保藏。基因的破坏方法和筛选的具体方案，参照Yoshida，K.et al.，Microbiology，Vol.150，p.571-580(2004)，进行改变后使用。

本发明人，制作了枯草杆菌中，除了iolE基因、iolR基因、yisS基因(编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的基因)之外，还破坏了iolI基因(编码具有青蟹肌糖异构酶活性的蛋白质的基因)的枯草杆菌(TM039株)。具体的是，在变异枯草杆菌株TM030株中，通过对iolI基因进行同源重组，***壮观霉素耐性基因进行破坏，制作变异枯草杆菌株(名称Bacillus subtilis TM039株)。用存在肌肉肌醇的培养液培养枯草杆菌TM039菌株，结果发现了能够以高纯度产生鲨肌醇。而且，基因的破坏方法和筛选的具体方案，参照Yoshida，K.et al.，Microbiology，Vol.150，p.571-580(2004)和Yoshida，K.et al.，J.Bacteriol.Vol.181，p.6081-6091(1999)，改变后再使用。

本发明还包括鲨肌醇的制造方法。鲨肌醇的制造方法包括在含有肌肉肌醇的培养基中培养至少具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低的本发明的细胞的工序。而且，本申请的鲨肌醇的制造方法优选含有从前述培养工序中获得的培养滤液中除去细胞的工序，和从除去了细胞的培养滤液中分离鲨肌醇的工序。

培养基含有肌肉肌醇，其组成只要能达到目的，就没有特别限制。可以是除了作为原料的肌肉肌醇之外，还含有碳源、氮源、有机营养源、无机盐类等的培养基，可以使用合成培养基或天然培养基中的任意一种。而且，培养基优选是培养液(液体培养基)。

培养基优选使用，例如按如下方式配合的培养基。理想的是，添加相对于培养基整体重量的0.1重量％～40重量％，优选1重量％～30重量％、更优选1重量％～10重量％的肌肉肌醇，作为碳源，添加0.1重量％～20重量％、更优选0.3重量％～5重量％的苹果酸、甘油、蔗糖、麦芽糖或淀粉等，作为氮源，添加0.01重量％～5.0重量％、优选0.5重量％～2.0重量％的大豆胨、酪蛋白氨基酸、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素等。

此外，根据需要，可以在培养基中添加钠、钾、钙、镁、钴、锰、锌、铁、铜、钼、磷酸、硫酸等能够生成离子的无机盐类。本领域技术人员可以任意决定无机盐类的添加量。

培养液中的氢离子浓度不需要特别调整，但可以调整到优选pH5～10、更优选pH6～9，进行培养。

培养条件根据菌的种类而不同，培养温度可以设为12～45℃，更优选设为15～37℃。此外，培养，可以振荡培养液，或在培养液中吹入空气或氧气等需氧进行。培养时间，可以进行到鲨肌醇显示最大或必要量的蓄积量，通常为1～7天，优选1～2天。

细胞培养后的培养液中不仅含有鲨肌醇，还含有肌肉肌醇和D-手性肌醇。例如，在培养TM030菌株时，培养液中可以含有鲨肌醇、肌肉肌醇、D-手性肌醇，在培养TM039菌株时，培养液中不含D-手性肌醇，而含有鲨肌醇和肌肉肌醇。从培养液中分离鲨肌醇的方法，可以使用本身公知的方法或今后开发的方法。而且，鲨肌醇的分离可以按根据目的的纯度进行，也可以作为鲨肌醇和D-手性肌醇的混合物，或鲨肌醇和肌肉肌醇的混合物等被分离。

例如，从培养液中收集鲨肌醇的方法，可以应用一般的方法分离纯化通常的水溶性中性物质。也就是说，从培养液中除去菌体后，通过用活性碳或离子交换树脂等处理培养上清液，就可以基本除去肌醇类以外的杂质。然后，通过使用再结晶等方法，就可以分离目的物质。

具体而言，例如，使蓄积了鲨肌醇的培养上清液通过填充了强酸性阳离子交换树脂、例如Duolite(注册商标)C-20(H⁺型)的柱以除去不希望的成分，收集通过液，然后使脱离子水通过该柱，清洗，收集清洗液，合并获得的通过液和清洗液。使这样获得的溶液通过填充了强碱基性阴离子交换树脂、例如Duolite(注册商标)A116(OH^-型)的柱，收集通过液，然后使脱离子水通过该柱，清洗，收集清洗液，合并获得的通过液和清洗液，获得了含有肌醇类，而基本不含肌醇类以外的杂质的水溶液。在对该水溶液进行浓缩而获得的鲨肌醇的浓溶液中加入适量乙醇，在室温或低温下放置一晚，就可以结晶形成纯的鲨肌醇的结晶。此外，利用鲨肌醇的水溶解性低这一点，浓缩该水溶液，即使只通过过滤，也可以结晶形成纯的鲨肌醇的结晶。此外，在进行柱操作时，以脱色为目的，还可以使用填充了活性碳的柱。

作为其它的纯化方法，例如，通过在培养获得的含有鲨肌醇的溶液中加入硼酸和NaCl，制成鲨肌醇·硼酸复合体，将其过滤后，用酸使硼酸游离，加入甲醇这种有机溶剂使之结晶的方法，也可以获得纯的鲨肌醇结晶(专利文献2)。

实施例

以下，为了加深本发明的理解，通过参考例和实施例具体地说明。参考例中，说明了完成本发明的经过，实施例中尽管具体说明了发明内容，但显然它们并不限定本发明的范围。

(参考例1)枯草杆菌变异株YF256株的培养液的分析

将枯草杆菌变异株(Bacillus subtilis YF256株、保藏编号FERM P-20286)加入到装入了肉汤培养基30ml(1重量％大豆胨、0.5重量％酵母提取物、0.5重量％NaCl、1重量％肌肉肌醇)的500ml广口烧瓶中，在需氧条件下，37℃下培养17小时。收集该培养液，离心分离(10000rpm、15分钟)，回收培养上清液。

通过高效液相色谱法，在前述条件下分析该培养上清液。

柱：Wakosil 5NH₂(4.6×250mm)

柱温度：20℃或40℃

检测器：RI DETECTER L-2490(Hitachi)

注入量：10μl

溶剂：乙腈∶水＝4∶1

流量：2ml/min

洗脱时间：D-手性肌醇，11.6分钟

肌肉肌醇，17.8分钟

鲨肌醇，18.2分钟

其结果是，在紧随肌肉肌醇的峰之后，检测出鲨肌醇的峰，判明了YF256株产生鲨肌醇。

(参考例2)与鲨肌醇代谢功能相关的基因的探索

用数据库SSDB(http://ssdb.genome.jp/ssdb-bin/ssdb_paralog？org_gene＝bsu：BSU39700)，从枯草杆菌的基因组中，检索与iolG基因的序列同源性高的并系同源(paralog)基因，选择出7个(yfil、yhjJ、yisS、yrbE、yteU、yulF、yvaA)。

对于这些基因，就它们在各种肌醇类的存在下(鲨肌醇存在下(SI)、肌肉肌醇存在下(MI)、D-手性肌醇存在下(DCI)、D-松醇的存在下(PI))的表达，进行转录表达分析。各培养操作，使用以0.5％酪蛋白氨基酸作为碳源的合成培养基中添加10％上述肌醇类的培养基，于37℃振荡培养野生型枯草杆菌或变异株Y256株直至对数增殖中期(S6培养基；Yoshida，K.et al.，Journal of Bacteriology，Vol.79，p.4591-4598(1997))。微阵列使用SIGMAGENOSYS公司的Panorama^TM Gene Array，RNA印迹法中，以通过PCR扩增yisS的结构基因区域的一部分的产物作为模板，使用通过整合了³²P磷酸的随机引物法产生的放射活性标识的DNA探针(相当于从yisS结构基因的翻译起始点开始的415bp之后到794bp的380bp)。

结果示于图2、图3。图2上半部分是表示微阵列结果的照片，下半部分是将微阵列结果数值化的表格。图3是表示RNA印迹法结果的照片。

这些结果提示，与其它基因相比，yisS基因和yvaA基因的表达水平高，尤其是，yisS基因在分解利用鲨肌醇的生长条件(SI存在下)下被诱导。由此表明，yisS基因和yvaA基因二者或它们中的一个可能编码以鲨肌醇作为底物的脱氢酶。

(参考例3)yisS基因功能的确认

对于yisS基因的功能，通过制作破坏了yisS基因的菌株，进行确认。yisS基因用pMUTIN4MCS质粒来破坏。使用特异的引物对(被设计成扩增相当于枯草杆菌168株的染色体碱基编号1163917至1164171的区域的引物对)和作为模板的枯草杆菌野生株168的DNA，通过PCR扩增yisS基因的一部分。PCR产物用HindIII和BamHI(或BglII)的酶组合进行消化，连接到pMUTIN4MCS限制性酶臂中(Vegner，V.et al.，1998)。用这样制作的重组质粒pMUTIN4MCS进行野生株168的转化。加入PMUTIN4MCS，就赋予了红霉素抵抗性，这样就可以进行筛选。通过这样的筛选，获得了BSF3018菌株。该菌株包含在通过枯草杆菌基因组功能分析项目制备的变异株库中(Kobayashi，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.100，p.4678-4685(2003))。该变异株库保管于国立遗传学研究所中，作为国家生物资源项目(National Bioresource project)的一环，一般可以公开发放(http://www.nbrp.jp/report/reportProject.jsp；jsessionid＝6C442727811FEDB94CF60031CCDAFE92.lb1？project＝bsub)。而且，BF3018菌株中存在trpC2这样的色氨酸需求性变异。

使BSF3018菌株在葡萄糖存在下(Gluc)、肌肉肌醇存在下(MI)、鲨肌醇存在下(SI)生长，进行观察。作为对照，使用野生型和YF248菌株(由于破坏肌醇代谢系操纵子的启动子，肌醇代谢系酶群所有的表达缺失，因此无法代谢所有肌醇类)。

其结果示于图4、图5。图4是细胞增殖的经时变化的图(纵轴是波长660nm的吸光度)，图5是30小时后的细胞增殖的照片。

BFS3018菌株，在葡萄糖存在下和肌肉肌醇存在下，细胞增殖，但在鲨肌醇存在下，没发现细胞增殖。由此提示yisS基因具有作为代谢鲨肌醇的酶的功能。

(实施例1)鲨肌醇产生变异株的制作

用BFS3018菌株的DNA，以红霉素耐性转化YF256菌株，破坏YF256 菌株的yisS基因。使用感受态细胞法将BFS3018菌株的染色体DNA导入于细胞中，通过与YF256菌株的基因组DNA的同源重组转化YF256菌株。加入了BFS3018菌株中的yisS基因(被pMUTIN4MCS破坏的yisS基因)，被赋予了红霉素抵抗性，因此可以进行筛选。经过这样的筛选，获得了TM030菌株。

(实施例2)鲨肌醇的制造方法

将变异株TM030株加入到装入了肉汤培养基30ml(1重量％大豆胨、0.5重量％酵母抽出物、0.5重量％NaCl、1重量％肌肉肌醇)的500ml广口烧瓶中，需氧条件下，37℃培养17小时。收集该培养液，离心分离(10000rpm、15分钟)，回收培养上清液。

通过高效液相色谱法，在前述条件下分析该培养上清液。

柱：Wakosil 5NH₂(4.6×250mm)

柱温度：20℃

检测器：RI DETECTER L-2490(Hitachi)

注入量：10μl

溶剂：乙腈∶水＝4∶1

流量：2ml/min

洗脱时间：D-手性肌醇，11.6分钟

肌肉肌醇，17.8分钟

鲨肌醇，18.2分钟

按培养上清中的鲨肌醇摩尔数相对于培养前的肌肉肌醇的摩尔数的百分比计算鲨肌醇的转化率。

TM030株产生的肌肉肌醇向鲨肌醇的转化效率为16.1％，肌肉肌醇向D-手性肌醇的转化效率为4.3％。

YF256菌株中，向鲨肌醇和D-手性肌醇的转化效率分别为6.4％和8.3％。

(实施例3)鲨肌醇产生变异株的制作2

制作破坏TM030菌株中的iolI基因的菌株。通过同源重组，***壮观霉素耐性基因，破坏iolI基因，制作变异株TM039株。具体方法，按与记载于文献：Yoshida，K.et al.J.Bacteriol.Vol.181，p.6081-6091(1999)的asnH基因的破坏方法基本相同的方式进行，设法将相当于iolI结构基因的翻译起始点开始的335bp之后到528bp的194bp取代为壮观霉素耐性基因。

以枯草杆菌168株的染色体作为模板，分别用iolI1F：TGCGGTTGAACTTGAAGTGG(序列号5)和iolI2R：TCTTCTGCTCTGTCACAAGC(序列号6)的引物对，和iolI5F：CACTTCCATGCAATGGGTTC(序列号7)与iolI6R：ATATTGATCTTCGCGTGGCC(序列号8)的引物对，通过PCR扩增相当于IolI基因的前半部分(含有从翻译起始点开始直至334bp的部分)、和后半部分(含有529bp之后的部分)的DNA。

另一方面，壮观霉素耐性基因盒的DNA、以FU341株(通过***壮观霉素耐性基因而破坏了asnH基因的枯草杆菌变异株)的染色体作为模板，用

iolI3F：GCTTGTGACAGAGCAGAAGACAATAACGCTATTGGGAG(序列号9)和iolI4R：GAACCCATTGCATGGAAGTGCTATATGCTCCTTCTGGC(序列号10)的引物对，通过PCR扩增。

将相当于IolI基因的前半部分、壮观霉素耐性基因盒、IolI基因的后半部分的上述3类DNA以大体相同的摩尔比混合，用iolI1F：TGCGGTTGAACTTGAAGTGG(序列号5)和iolI6R：ATATTGATCTTCGCGTGGCC(序列号8)的引物，通过PCR扩增，将上述3类DNA按所记载的顺序连接。通过用适量的得到的连接DNA，转化TM030菌株，赋予壮观霉素耐性，从而获得TM039株。

(实施例4)鲨肌醇的制造方法2

用与实施例2相同的方法培养变异株TM039株、TM030株或YF256菌株后，收集培养液，离心分离(10000rpm、15分钟)，回收培养上清液。

用与实施例2相同的方法，用高效液相色谱法分析该培养上清液。

结果示于图6。

TM030株产生的肌肉肌醇向鲨肌醇的转化效率为12％，肌肉肌醇向D-手性肌醇的转化效率为5％。

TM039株产生的肌肉肌醇向鲨肌醇的转化效率为15％，肌肉肌醇向D-手性肌醇的转化效率为0％。

另一方面，YF256菌株中，向鲨肌醇和D-手性肌醇的转化效率分别为10％和5％。

产业上利用的可能性

使用本发明的细胞的鲨肌醇的制造方法便宜地提供无法从天然素材中微量提取的鲨肌醇，能够由肌肉肌醇以良好纯度简便地制造鲨肌醇，是一种有用的方法。

对于鲨肌醇在阿耳茨海默氏病中的治疗效果，迄今为止已经进行了各种研究。例如，据报道，在神经细胞中，鲨肌醇抑制被认为是阿耳茨海默氏病的原因的β淀粉样蛋白的凝集，而且没有发现鲨肌醇对神经细胞有毒性(McLaurin J.et al.，J Biol Chem.Vol.275，p.18495-18502(2000)；Sun Y.，et al.，Bioorg Med Chem.Vol.16，p.7177-7184(2008))。而且，发现，在阿耳茨海默氏病模型小鼠中，通过口服鲨肌醇，脑内的β淀粉样蛋白的凝集被抑制，这表明鲨肌醇使阿耳茨海默氏病中的认知症状得到缓和，抑制寿命的缩短(Fenili D.et al.，J Mol Med.Vol.85，603-611(2007)；Townsend M.et al.，Ann Neurol.Vol.60，p.668-676(2006))。

我们认为鲨肌醇比其它化合物的安全性高，与免疫反应无关，不引发过敏症。而且，由于鲨肌醇容易通过血脑屏障，能够到达脑内，因此可以通过口服给生物体施用，在阿耳茨海默氏病的预防和治疗中是一种实用性极高的物质。本发明的细胞可以高效且高纯度地制作这种鲨肌醇。

Claims

1.一种鲨肌醇产生细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能发生缺损或降低，且具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质发挥作用，其中，编码具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质的基因即yisS基因被破坏，表达由yvaA基因编码的具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质，

并且，具有2-酮肌肉肌醇脱氢酶活性的蛋白质的功能和肌醇代谢类基因簇的阻遏蛋白质的功能发生缺损或降低，其中，编码具有2-酮肌肉肌醇脱氢酶活性的蛋白质的基因即iolE基因和编码肌醇代谢类基因簇的阻遏蛋白质的基因即iolR基因被破坏。

2.根据权利要求1所述的细胞，鲨肌醇脱氢酶活性是将鲨肌醇的2位羟基脱氢的活性。

3.根据权利要求1所述的细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质是由序列号1表示的碱基序列构成的DNA编码的蛋白质。

4.根据权利要求1所述的细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质是由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

5.根据权利要求1所述的细胞，具有鲨肌醇脱氢酶活性的蛋白质依赖于NAD⁺发挥作用。

6.根据权利要求1所述的细胞，具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质是由序列号3表示的碱基序列构成的DNA编码的蛋白质。

7.根据权利要求1所述的细胞，具有2-酮肌肉肌醇酮还原酶活性的蛋白质是由序列号4表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

8.根据权利要求1所述的细胞，所述细胞是枯草杆菌。

9.根据权利要求1所述的细胞，所述细胞是保藏编号为FERMABP-11185的枯草杆菌TM030株，国内保藏编号：FERM P-21700、国内保藏日：2008年10月8日。

10.根据权利要求1所述的细胞，具有青蟹肌糖异构酶活性的蛋白质的功能也降低或缺损，其中，编码具有青蟹肌糖异构酶活性的蛋白质的基因即iolI基因被破坏。

11.一种鲨肌醇制造方法，包括在肌肉肌醇的存在下培养权利要求1～10中任一项所述的细胞的工序，从进行所述培养的工序中获得的培养滤液中除去细胞的工序，和从除去了细胞的培养滤液中分离鲨肌醇的工序。