CN115612680A

CN115612680A - 生产苏氨酸的重组微生物、其构建方法及其生产苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN115612680A
Application number: CN202110784728.8A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 康培; 王治权; 赵津津; 李岩
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2023-01-17

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及生产苏氨酸的重组微生物、其构建方法及其生产苏氨酸的方法。本发明发现降低微生物中β‑磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达，能够显著提高苏氨酸等氨基酸的产量和转化率。本发明提供的具有降低的β‑磷酸葡萄糖变位酶YcjU表达的重组微生物的苏氨酸产量和转化率较出发菌株显著提高，有利于降低苏氨酸的发酵生产成本，为苏氨酸高产菌株的选育提供了有效的改造靶点和菌株。

Description

生产苏氨酸的重组微生物、其构建方法及其生产苏氨酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及生产苏氨酸的重组微生物、其构建方法及其生产苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸是一种中间代谢产物，可作为许多氨基酸合成的重要前体，是人体不可缺少的必需氨基酸。苏氨酸被广泛应用于食品、饲料和医药等行业。苏氨酸的生产方法主要有发酵法，蛋白质水解法和化学合成法，目前微生物发酵法已经成为苏氨酸生产的主流生产方法。为了生产L-苏氨酸，使用来源于大肠杆菌(Escherichia.coli)野生型菌株、棒杆菌属(Corynebacteria sp.)、沙雷氏菌属(Seratia sp.)或普罗威登斯菌属(Providenciasp.)等突变菌株。在利用突变菌株生产L-苏氨酸的方法中，日本专利号10037/81公开了利用属于大肠杆菌物种、具有二氨基庚二酸和甲硫氨酸营养缺陷型表型、且通过突变使L-苏氨酸的生物合成不受苏氨酸的反馈抑制影响的微生物的方法。

然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。通过基因编辑的方法对高产菌株进行筛选更具优势，例如：中国专利CN111019878 A通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除L-苏氨酸合成竞争途径关键基因dapA和敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdh从而使苏氨酸的产量达到了120g/L。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。2005年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN1654634A中通过灭活GalR基因使苏氨酸的产量提高了18％-25％。

氨基酸的生产菌株的发酵生产性能是决定氨基酸产量、转化率等的关键因素，因此，提高生产菌株的发酵生产性能对于氨基酸产量和转化率的提升和成本的进一步降低具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产苏氨酸等氨基酸的重组微生物、其构建方法及其生产苏氨酸等氨基酸的方法。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU或其抑制因子、β-磷酸葡萄糖变位酶基因ycjU或其抑制因子、含有所述基因ycjU或所述抑制因子的生物材料的如下任一种应用：

(1)在提高微生物的氨基酸产量和/或转化率中的应用；

(2)在构建氨基酸生产菌株中的应用；

(3)在氨基酸的发酵生产中的应用。

具体地，所述应用为通过降低所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性实现。

本发明发现，通过降低微生物中β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性，能够显著提高氨基酸的产量和转化率。

YcjU是编码β-磷酸葡萄糖变位酶的基因，1-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的相互转化是所有细胞代谢的关键步骤，这一步骤是由磷酸葡萄糖变位酶(E.C.2.7.5.1)完成的(Ray WJ Jr,Peck EJ Jr(1972)Phosphomutases.In:Boyer PD(ed)The Enzymes,vol.6.Academic Press,New York,pp 407-458)。当碳源为半乳糖时，半乳糖代谢产生的1-磷酸葡萄糖被磷酸葡萄糖变位酶转化为6-磷酸葡萄糖。当碳源为除半乳糖之外的其他碳源时，磷酸葡萄糖变位酶的主要功能是将6-磷酸葡萄糖转化为1-磷酸葡萄糖。而6-磷酸葡萄糖是糖酵解、有氧氧化、磷酸戊糖途径以及糖原合成与分解途径的共同中间产物，是各代谢途径的交叉点。

以上应用中，所述抑制因子为能够抑制β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性的蛋白质、DNA或RNA。

以上应用中，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、载体或微生物。

本发明中，β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性的降低可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式的组合实现：

(1)对所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的编码基因进行一个或多个碱基的***、缺失或替换以使得β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达量降低、酶活性降低或失活；

(2)将所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件以使得其表达量降低、酶活性降低或失活。

优选地，通过失活所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU实现其表达和/或酶活性的降低。

作为本发明的一种实施方式，通过缺失所述β-磷酸葡萄糖变位酶基因ycjU实现其表达和/或酶活性的降低。

本发明中，所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或***得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

大肠杆菌(Escherichia coli)中，β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，其编码基因ycjU的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种重组微生物，所述重组微生物与其出发菌株相比，具有降低的β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU或其同源物或其功能变体的表达和/或酶活性。

其中，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式的组合实现：

(2)将所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件以使得其表达量降低、酶活性降低或失活；

本发明所述的出发菌株为在降低β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU或其同源物或其功能变体的表达和/或酶活性之前，用于作为起始的菌株。可通过将出发菌株进行基因工程改造或诱变，使其β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU或其同源物或其功能变体的表达和/或酶活性降低，得到所述重组微生物。

优选地，以上所述的出发菌株为能够积累氨基酸或其衍生物的细菌。能够积累氨基酸或其衍生物的细菌可为野生型菌株或为经基因工程改造、诱变获得的菌株。本发明的出发菌株对于所述氨基酸或其衍生物的产量没有特别限制。

本发明所述的氨基酸优选为L-氨基酸。β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性的降低能够显著提高苏氨酸、甘氨酸或异亮氨酸的产量。基于此，本发明所述的氨基酸优选为苏氨酸、甘氨酸或异亮氨酸。

本发明所述的出发菌株优选含有如下突变中的一种或多种：

(1)强化的pntAB基因的表达；

(2)表达来源于谷氨酸棒杆菌的pyc基因；

(3)表达thrA的突变体thrA*(S345P)；

(4)敲除tdh基因；

(5)增加thrA*(S345P)BC的拷贝数。

本发明所述的出发菌株为选自埃希氏菌属、棒杆菌属、沙雷氏菌属的细菌。

其中，所述埃希氏菌属细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)，所述棒杆菌属细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、产氨棒杆菌(Corynebacterium aminogenes)。

优选地，所述出发菌株为大肠杆菌。

作为本发明的一种优选实施方式，所述出发菌株为MHZ-0215-2，该菌株已公开在中国专利201611250306.8中，其生物保藏信息如下：分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13403。

本发明还提供所述重组微生物的构建方法，该方法包括：通过基因工程或诱变的方法，将所述出发菌株中的所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性降低。

以上所述的基因工程或诱变的方法可采用本领域常用的方法，其中，基因工程方法可采用常规的基因突变、缺失的方法。所述诱变方法可为物理和/或化学诱变。

作为本发明的一种实施方式，所述基因工程方法为CRISPR/Cas9技术。具体地，将含有靶向ycjU基因的sgRNA、ycjU基因的上下游同源臂以及Cas9蛋白的质粒导入出发菌株中，通过同源重组，敲除ycjU基因。

本发明提供的重组微生物的氨基酸(尤其是苏氨酸)或其衍生物的产量和转化率显著提高。

基于此，本发明提供所述重组微生物在氨基酸或其衍生物的生产或在氨基酸生产菌株的选育中的应用。

以上所述的应用中，优选地，所述氨基酸为苏氨酸、甘氨酸或异亮氨酸。

本发明还提供一种提高微生物的氨基酸产量的方法，包括：降低所述微生物的YcjU的表达和/或酶活性。

本发明还提供一种发酵生产氨基酸或其衍生物的方法，该方法包括：培养所述重组微生物，从获得的培养液中回收所述氨基酸或其衍生物。

优选地，所述氨基酸为苏氨酸、甘氨酸或异亮氨酸。更优选为苏氨酸。

对于苏氨酸，用于培养所述重组微生物的发酵培养基优选包括如下组分：葡萄糖70-100g/L，玉米浆5-10g/L，豆粕水解液5-10g/L，七水硫酸镁0.2-0.8g/L，KH₂PO4 0.5-1.5g/L，天冬氨酸5-15g/L，FeSO₄25-35mg/L，MnSO₄ 25-35mg/L，生物素40-60μg/L，硫胺素400-600μg/L，pH 6.8-7.2。

对于苏氨酸，用于培养所述重组微生物的种子培养基优选包括如下组分：葡萄糖20-30g/L，玉米浆20-30g/L，豆粕水解液6-9g/L，酵母膏2-3g/L，KH₂PO₄ 1-2g/L，七水硫酸镁0.2-0.8g/L，FeSO₄ 15-25mg/L，MnSO₄ 15-25mg/L，pH 6.8-7.2。

以上所述的发酵生产氨基酸或其衍生物的方法包括：先将活化的重组微生物在种子培养基中培养，获得成熟的种子液，再将种子液接种至发酵培养基中培养，从获得的培养液中回收所述氨基酸或其衍生物。

本发明的有益效果在于：本发明通过降低微生物中β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达，显著提高了苏氨酸等氨基酸的产量和转化率。本发明提供的具有降低的β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达的重组微生物的苏氨酸产量和转化率较出发菌株显著提高，有利于降低苏氨酸的发酵生产成本，为苏氨酸高产菌株的选育提供了有效的改造靶点和菌株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例以MHZ-0215-2为出发菌株(该菌株已公开在专利申请CN106635945A中，该菌株属于埃希氏菌属(Escherichia)W3110)，在MHZ-0215-2的基因组上进行相关改造，弱化菌株ycjU基因的表达，主要方式为敲除ycjU基因，从而减少6-磷酸葡萄糖转化为1-磷酸葡萄糖。

以下实施例中涉及的大肠杆菌的基因组编辑主要借鉴了Jiang Y等报道的CRISPR-Cas9基因编辑技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)。

以下实施例中，所述卡那霉素(Kanamycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL，所述壮观霉素(spectinomycin)在培养基中的终浓度为50μg/ml。

以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。

以下实施例中所使用的引物序列见表1。

表1实施例中所使用引物序列

以下结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1制备失活ycjU基因的菌株MHZ-0221-12

1、pTargetF-N20(ycjU)质粒及Donor DNA构建

(1)以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA-F/pTF-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(ycjU)，并进行PCR鉴定及测序验证；

(2)以W3110基因组为模板，选用ycjU-UF/ycjU-UR引物对，扩增出上游同源臂①；

(3)以W3110基因组为模板，选用ycjU-DF/ycjU-DR引物对，扩增出下游同源臂②；

(4)以①、②为模板，选用ycjU-UF/ycjU-DR引物对，扩增出up-down全长片段，也称Donor DNA。

2、感受态细胞制备及电转化

(1)将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；

(2)挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM***糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD₆₅₀为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。

(3)将pTargetF-N20(ycjU)质粒和(1)中构建得到的Donor DNA同时电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。

3、重组验证

(1)使用引物对ycjU-F/ycjU-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

(2)用引物对ycjU-F/ycjU-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

4、构建相关质粒丢失

(1)挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

(2)挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(ycjU)质粒已丢失；

(3)挑取pTargetF-N20(ycjU)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

(4)挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到ycjU敲除菌株MHZ-0221-12(表2)。

表2本实施例构建的基因工程菌

菌株编号	基因型
		MHZ-0221-12	MHZ-0215-2-ΔycjU

实施例2产L-苏氨酸基因工程菌的摇瓶发酵验证

对实施例1构建的菌株MHZ-0221-12和出发菌株MHZ-0215-2进行产L-苏氨酸的摇瓶发酵验证，具体如下：

1、从冻存管中取MHZ-0215-2、MHZ-0221-12共2株菌，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；

2、将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(见表3)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD₆₅₀控制在2以内；

3、将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基(见表4)的摇瓶中，往复摇床37℃，100rpm发酵培养直至残糖耗尽，发酵结束后测定样品OD₆₅₀，并用使用HPLC测定L-苏氨酸含量，用生物传感仪方法测定残糖量。为了确保实验的可靠性，对摇瓶发酵进行3次重复实验，其产酸及转化率结果的平均值见表5。

表3种子培养基

表4发酵培养基

成分	浓度
		葡萄糖	85g/L
玉米浆	6g/L
		豆粕水解液	7.7g/L
七水硫酸镁	0.5g/L
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.0g/L
天冬氨酸	10g/L
		FeSO<sub>4</sub>、MnSO<sub>4</sub>	30mg/L
生物素	50μg
		硫胺素	500μg
pH	7.2

表5产苏氨酸基因工程菌生产力比较

由表5可知，MHZ-0221-12菌株的L-苏氨酸产量显著高于出发菌株MHZ-0215-2，MHZ-0215-12的苏氨酸产量为13.83g/L，糖酸转化率为16.4％，产量较出发菌株提高14.3％，转化率提高15.5％。摇瓶发酵实验结果表明，大肠菌株ycjU基因的敲除可以明显提高菌株的苏氨酸生产能力。

实施例3产L-苏氨酸基因工程菌的发酵罐发酵验证

对实施例1构建的菌株MHZ-0221-12和出发菌株MHZ-0215-2进行产L-苏氨酸的1L发酵罐发酵验证，具体如下：

2、将菌体从平板上刮下一环，接种到装有100mL种子培养基(见表3)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD₆₅₀控制在2以内；

3、1L罐发酵准备工作：pH校正，泵校正，原位清洗，溶氧校正。

4、将60mL种子液转接到含360mL发酵培养基(见表4)的1L发酵罐中，在37℃，500rpm-1200rpm发酵培养直至残糖耗尽，发酵结束后测定样品OD₆₅₀，并用使用HPLC测定L-苏氨酸含量，用生物传感仪方法测定残糖量。为了确保实验的可靠性，对发酵罐发酵进行3次重复实验，其产酸及转化率结果的平均值见表6。

表6产苏氨酸基因工程菌生产力比较

由表6可知，MHZ-0221-12菌株的L-苏氨酸产量显著高于出发菌株，MHZ-0215-12菌株的L-苏氨酸产量为19g/L，糖酸转化率为22.3％，产量较出发菌株提高42.8％，转化率提高42.9％。发酵罐发酵实验结果表明，大肠菌株ycjU基因的敲除可以非常显著地提高菌株的苏氨酸生产能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 李岩

<120> 生产苏氨酸的重组微生物、其构建方法及其生产苏氨酸的方法

<130> KHP211117779.6

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Leu Gln Gly Val Ile Phe Asp Leu Asp Gly Val Ile Thr Asp

1 5 10 15

Thr Ala His Leu His Phe Gln Ala Trp Gln Gln Ile Ala Ala Glu Ile

20 25 30

Gly Ile Ser Ile Asp Ala Gln Phe Asn Glu Ser Leu Lys Gly Ile Ser

35 40 45

Arg Asp Glu Ser Leu Arg Arg Ile Leu Gln His Gly Gly Lys Glu Gly

50 55 60

Asp Phe Asn Ser Gln Glu Arg Ala Gln Leu Ala Tyr Arg Lys Asn Leu

65 70 75 80

Leu Tyr Val His Ser Leu Arg Glu Leu Thr Val Asn Ala Val Leu Pro

85 90 95

Gly Ile Arg Ser Leu Leu Ala Asp Leu Arg Ala Gln Gln Ile Ser Val

100 105 110

Gly Leu Ala Ser Val Ser Leu Asn Ala Pro Thr Ile Leu Ala Ala Leu

115 120 125

Glu Leu Arg Glu Phe Phe Thr Phe Cys Ala Asp Ala Ser Gln Leu Lys

130 135 140

Asn Ser Lys Pro Asp Pro Glu Ile Phe Leu Ala Ala Cys Ala Gly Leu

145 150 155 160

Gly Val Pro Pro Gln Ala Cys Ile Gly Ile Glu Asp Ala Gln Ala Gly

165 170 175

Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ser Gly Met Arg Ser Val Gly Ile Gly Ala

180 185 190

Gly Leu Thr Gly Ala Gln Leu Leu Leu Pro Ser Thr Glu Ser Leu Thr

195 200 205

Trp Pro Arg Leu Ser Ala Phe Trp Gln Asn Val

210 215

<210> 2

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaactgc aaggggtaat tttcgatctg gatggtgtaa tcaccgatac cgcgcatctg 60

catttccagg cgtggcagca gattgccgct gaaattggca tcagcattga tgcgcagttt 120

aacgaatccc taaaagggat cagccgcgat gagtctctgc ggcgcattct gcaacacggg 180

ggcaaagagg gcgactttaa ctcgcaggag agggcgcaac tggcgtatcg caaaaatctg 240

ctctatgtcc actcactacg cgagttgacg gtcaacgctg ttctacccgg cattcgctct 300

ttgctggcag atctccgtgc acagcagatc tcggttgggc tggcttctgt ctccctgaat 360

gcgccgacga ttttagcggc gctggagctg cgcgagtttt tcaccttctg cgcggatgct 420

tcccaactta aaaactcgaa accggacccg gaaatctttc tcgccgcctg tgcagggctg 480

ggcgtgccgc cgcaggcatg tatcggcatt gaagatgcgc aggcgggcat tgacgccatt 540

aacgccagcg gtatgcgctc ggtggggatc ggcgcgggct taaccggggc gcaattactg 600

ttgccttcaa cggaatcact cacctggccg cggttatcgg ccttctggca aaacgtatag 660

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtatctttc tcgccgcctg tgcgttttag agctagaaat agcaa 45

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacaggcgg cgagaaagat actagtatta tacctaggac tgagct 46

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accgctacca aacatcagga ggatgacaaa ggaatcaaca tggctcagct tt 52

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcacgcgca gcttggcatc aaggttag 28

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgatgctca attacatgct gccgga 26

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaagctgagc catgttgatt cctttgtcat cctcctgatg tttggtagcg gt 52

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggatgattcg tttatggcta agccgg 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcggcgcacc tacttgctga acaatc 26

Claims

1.β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU或其抑制因子、β-磷酸葡萄糖变位酶基因ycjU或其抑制因子、含有所述基因ycjU或所述抑制因子的生物材料的如下任一种应用：

(1)在提高微生物的氨基酸产量和/或转化率中的应用；

(2)在构建氨基酸生产菌株中的应用；

(3)在氨基酸的发酵生产中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为通过降低所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性实现。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式的组合实现：

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与其出发菌株相比，具有降低的β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU或其同源物或其功能变体的表达和/或酶活性。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式的组合实现：

7.根据权利要求5或6所述的重组微生物，其特征在于，所述出发菌株为能够积累氨基酸或其衍生物的细菌，所述细菌选自埃希氏菌属、棒杆菌属、沙雷氏菌属；

优选地，所述氨基酸为苏氨酸、甘氨酸或异亮氨酸，所述出发菌株为大肠杆菌。

8.权利要求5～7任一项所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，包括：通过基因工程或诱变的方法，将所述出发菌株中的所述β-磷酸葡萄糖变位酶YcjU的表达和/或酶活性降低。

9.权利要求5～7任一项所述的重组微生物在氨基酸或其衍生物的生产或氨基酸生产菌株的选育中的应用；

优选地，所述氨基酸为苏氨酸、甘氨酸或异亮氨酸。

10.一种发酵生产氨基酸或其衍生物的方法，其特征在于，培养权利要求5～7任一项所述的重组微生物，从获得的培养液中回收所述氨基酸或其衍生物。