CN1324043C - 高纯度罗汉果甜苷v的制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高纯度罗汉果甜苷V的制备方法，其特点是：先将罗汉果粉碎，用乙醇加热回流提取，再将提取物用D101型大孔树脂柱分离，先去离子水和乙醇分别洗脱至无色，再收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，然后用正相硅胶柱分离，加入氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，再用反相硅胶C-18柱分离，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%～98%之间和98%以上的罗汉果甜苷V组分，减压浓缩，即可分别得到纯度在90%～98%之间的罗汉果甜苷V和纯度大于98%的罗汉果甜苷V组分。该生产方法不仅能提高罗汉果甜苷V纯度，而且能降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种罗汉果甜苷V的制备方法，尤其是制备纯度大于98％的罗汉果甜苷V的制备方法。
背景技术
罗汉果，(Momordica grosvenori swingle)，属葫芦科多年生草质藤本植物的果实，是我国南方的特有植物，主要产于广西桂北地区，在长江以南的一些亚热带地区也有少量野生，但以广西桂林地区的罗汉果为最好。过去罗汉果长期作为中药和饮料干果而食用，罗汉果具有止渴生律、消热解暑、止咳化痰、凉血润肺、降低血压等功效，临床可治疗肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性气管炎和急慢性扁桃腺炎等疾病。近年来人们对罗汉果中的强甜昧物质罗汉果甜苷V，不仅作为甜昧剂来研究，而且对它的药理也开始重视。
公开文献报道了许多罗汉果苷的提取方法，如溶剂萃取法、树脂吸附法、微波提取法、微孔滤膜法，如公开文献报道：1.【题名】罗汉果皂甙的提取工艺研究【作者】李雁群王策【刊名】天然产物研究与开发.1995，7(4).【文摘】从罗汉果中提取了具有保健作用的强甜味的皂甙。实验证明Ca(OH)2是一种很好的澄清剂，D280、D290、D61和D151三种国产离交树脂有很好的脱色能力，AB08吸附树脂能有效地分离这种皂甙。以水为溶剂的皂甙得率比乙醇水溶液的得率高，溶剂量以原料重的6倍为合适。Ca(OH)2作澄清剂比明矾、AlCl3效果好，而且不会带来很大的皂甙损失，澄清宜在室温下进行。强碱树脂D290和D280比酸性树脂的脱色效果好，D280比D290的脱色效果好。离交脱色宜在25℃下操作。A8-8吸附树脂吸附罗汉果皂甙的操作宜在20℃左右的室温下以SV2的流速操作。用50％乙醇水溶液可以使罗汉皂甙有效地从AB-8吸附树脂上解吸。2.【题名】用正交法对罗汉果糖甙提取的工艺研究【作者】李俊，陆程，广西师范大学【刊名】化学世界.1999，40(2).-92-94【文摘】采用正交试验设计对罗汉果中罗汉果糖甙的乙醇提取工艺进行了***研究，优选了工艺参数，结果表明；用30倍原料重的30％乙醇，在75-80℃微沸状态下提取3h为最佳条件。3.【题名】罗汉果甙(V)的精制研究【作者】刘钟栋，郑州粮食学院【刊名】离子交换与吸附.1999，15(4).【文摘】利用国产树脂研究了罗汉果甙(V)的精制方法，研究了浓度和pH对精制工艺的影响及产品的物理、化学和光谱性质。4.罗汉果甜甙提取工艺，中国专利：申请(专利)号：02128065.7申请(专利权)人：桂林红野绿色植物制品有限责任公司地址：广西壮族自治区桂林市七星区施家园路6号摘要：本发明是将罗汉果破碎，加入乙醇溶液，在30～60℃温度下，浸泡5～15小时。过滤得滤液，温度降至20～35℃，滤液经压力泵在0.01～0.2MPa工作压力下顺序送入三种膜分离组件；第一级截留分离出浓缩的罗汉果纤维、蛋白质、果胶及杂质，用于制作有机肥料；第二级为浓缩的罗汉果甜甙溶液，经真空干燥，得罗汉果甜甙产品；第三级为浓缩的罗汉果多糖及微量元素，为罗汉果糖膏；剩余滤液回收循环使用。5.一种从罗汉果中提取罗汉果甜甙的方法中国专利：申请(专利)号：03117430.2，申请(专利权)人：桂林莱茵生物制品有限公司地址：广西壮族自治区桂林市兴安县湘江路18号摘要：本发明涉及一种从罗汉果中提取罗汉果甜甙的方法，是以鲜罗汉果为原料，以水为提取溶媒，采用微滤、超滤、纳滤为主要提取工艺，其中微滤膜采用0.05μm～0.3μm孔径的微孔滤膜；超滤膜采用截流相对分子量为20000～80000的中空纤维超滤膜；纳滤采用截流相对分子量为100～400的纳滤膜或RO反渗透设备进行浓缩。由于本方法是在低温的条件下操作，因而产品色泽度、溶解性、澄清度和口味较好，另外，膜分离技术是高精度的分子筛选，避免了活性成分的损失，降低了能耗和成本，提高了产品收率和品质，且本方法集成膜分离的微滤、超滤、纳滤技术，以鲜果为原料，以水为提取溶媒，形成先进的分离纯化工艺流程，完成罗汉果甜甙的分离及浓缩，简化了生产工艺，缩短了生产周期。6.名称：从罗汉果中提取分离多种成份的方法申请(专利)号：02113548.7申请(专利权)人：何伟平地址：广西壮族自治区桂林市八里街经济技术开发区桂林实力公司摘要：一种从罗汉果中提取分离多种成份的方法，是用水之后再用碱水处理破碎的罗汉果得到提取液，再经脂肪醇处理得到沉淀物(I)和溶解液(II)，沉淀物(I)经阴离子树脂柱再结合脂肪醇处理纯化得到罗汉果多糖。溶解液(II)经过聚酰胺树脂柱，从柱中的流出液再经大孔树脂柱结合脂肪醇处理纯化得到罗汉果甜甙。被聚酰胺树脂柱吸附的成份，经碱性脂肪醇洗出后浓缩干燥即得到罗汉果黄酮。三种提取成份均适宜作保健品和食品添加剂。7.【题名】微波辅助提取罗汉果皂甙的研究【作者】黎海彬李琳等【机构】华南理工大学食品与生物工程学院，【刊名】食品科学.2003，24(2).-92-95【关键词】微波辅助提取罗汉果皂甙罗汉果工艺条件药用食用【文摘】以干罗汉果为原料，在微波辐射条件下，以水为溶剂提取罗汉果皂甙，考察了微波功率，微波辐射时间，固液比，浸提时间，提取级数等因素对提取率的影响，确定的最佳提取工艺条件为：微波功率为638W，微波辐射时间为25min，固液比为1∶30，水浴浸提时间为2h，提取级数为二级。在此条件下罗汉果皂甙的提取率为90.35％。8.【题名】大孔吸附树脂提取罗汉果皂甙的研究【作者】黎海彬李琳等【机构】华南理工大学食品与生物工程学院，【刊名】食品工业科技.2003，24(2).-19-21【文摘】研究了大孔吸附树脂提取罗汉果皂甙的方法，包括树脂的筛选、罗汉果皂甙溶液的浓度、pH和盐离子浓度对吸附过程的影响及解吸剂的选择，确定了适宜的吸附和解吸条件。9.【题名】微波技术在鲜罗汉果甜甙提取中的应用【作者】朱晓韵，何超文【机构】广西桂林实力天然食品有限公司，广西大学生物技术与糖业工程学院【刊名】广西轻工业.2002(2).【文摘】采用正交试验法考察了微波技术提取罗汉果甜甙工艺中罗汉果投料物液比、微波输出功率、提取时间对提取效率的影响，优选出微波提取的最佳方案。以此方案为实验组，以常规水煮法为对照组，进行平行实验。结果表明：微波提取罗汉果甜甙的效率明显优于常规水煮法。是一种省时、省能、操作简便的新的提取方法。10.【题名】高效液相色谱法制备罗汉果甜甙V标准品【作者】余丽娟，陈全斌，义祥辉，杨瑞云，张义正【机构】广西师范大学资源与环境学系，四川大学分子生物学与生物技术重点实验室【刊名】色谱.2003(7).【文摘】为深入研究罗汉果中功能成分的药理药效，进一步开发罗汉果中的有效成分，将罗汉果鲜果的水提物以AB-8吸附树脂分离、D-280离子交换树脂脱色后，利用半制备高效液相色谱法得到三萜皂甙类化合物罗汉果甜甙V标准品，纯度达98.5％。色谱柱为Alltech Econosphere NH2柱；流动相为乙腈-水(体积比为68∶32)溶液，流速5mL/min；检测波长203nm；柱温40℃。此方法具有操作简便、重现性好、产品纯度高等优点。
上述这些方法从不同角度论述了罗汉果甜苷(甙)的提取分离，有的分离纯度较高，方法简单，但也有一些操作工艺复杂，无法工业化生产。而且由于罗汉果甜苷的极性大，且与色素不易分离。对于高纯度罗汉果甜苷的制备，目前有半制备高效液相色谱法分离，该方法分离得到的罗汉果甜苷V的纯度虽然很高，但是所用的仪器比较昂贵和生产成分也比较高，不适合于大量的纯度大于90％罗汉果甜苷V的生产。
发明内容
为了克服现有的罗汉果甜苷V纯度低、收率低或生产成本高的不足，本发明提供一种高纯度罗汉果甜苷V的制备方法，该生产方法不仅能提高罗汉果甜苷V纯度，而且能降低生产成本。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
(1)先将罗汉果粉碎，用20％-70％的乙醇加热回流提取8-18h，滤取提取液，药渣再加30％～60％的乙醇加热回流提取4-8h，合并提取液并减压浓缩至膏状，得到A；
(2)将A用D101型大孔树脂柱分离，先去离子水和20％～30％乙醇分别洗脱至无色，再用30％～50％的乙醇洗脱剂洗脱并收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得B；
(3)在正相硅胶柱分离中，利用氯仿-甲醇-水(60∶40∶1～60∶40∶10)为洗脱剂，使所收集到的洗脱液比较容易回收；在反相硅胶C-18柱分离，利用丙酮-水按照25∶75～35∶65为洗脱剂，所用的溶剂毒性比较低，用一般的工业级的丙酮即可，所以生产成本比较低。
以上所述的HPLC检测色谱柱为氨基柱；流动相∶EtCN∶H2O＝75∶25～60∶40；检测波长：203nm；流速：0.6ml/min～1ml/min。
本发明的有益效果是：通过上述方法分离得到罗汉果甜苷标准品，不仅能提高罗汉果甜苷V纯度，而且能降低生产成本，方法简便易行，产品纯度好。这为研究mogroside V单体的活性及体内药物学过程提供了方便，也为制备其他罗汉果三萜甙类标准品提供了有益的参考。同时，测定mogroside V在果实中的含量，对于确定罗汉果品质的好坏、指导罗汉果的收购和罗汉果甜苷产品的生产具有重要的意义。
本发明的高纯度罗汉果甜苷V除了可以作为标准品外，还可以作为高级甜味剂。所含甜度极高的甜味物质是一种低卡路里的理想天然甜味剂。
具体实施方式
实施例一：(1).取罗汉果5kg，粉碎，用20％乙醇5000ml加热回流提取10h，滤取提取液，药渣再加60％乙醇4000ml加热回流提取6h，合并提取液并减压浓缩至膏状，得到A。
(2).将A用D101型大孔树脂柱(内径约15cm，D101型大孔树脂5kg)分离，先去离子水和20％乙醇分别洗脱至无色，再用35％乙醇洗脱剂洗脱并收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得B。
(3).将B用正相硅胶柱(内径约10cm，硅胶4kg，干法装柱，干法上样)分离，以氯仿-甲醇-水(60∶40∶1)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(固定相为正相板，展开剂为正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，减压浓缩，得到C。
(4).将C用反相硅胶C-18柱(内径约5cm，反相硅胶C-180.5kg，湿法装柱，湿法上样)分离，丙酮-水(25∶75)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(正相板，正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，减压浓缩，得到85％～98％之间的罗汉果甜苷V。
实施例二：(1).取罗汉果4kg，粉碎，用30％乙醇5000ml加热回流提取16h，滤取提取液，药渣再加35％乙醇5000ml加热回流提取6h，合并提取液并减压浓缩至膏状，得到A。
(2).将A用D101型大孔树脂柱(内径约15cm，D101型大孔树脂5kg)分离，先去离子水和25％乙醇分别洗脱至无色，再用40％乙醇洗脱剂洗脱并收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得B。
(3).将B用正相硅胶柱(内径约10cm，硅胶4kg，干法装柱，干法上样)分离，以氯仿-甲醇-水(60∶40∶5)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(固定相为正相板，展开剂为正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，减压浓缩，得到C。
(4).将C用反相硅胶C-18柱(内径约5cm，反相硅胶C-18 0.5kg，湿法装柱，湿法上样)分离，丙酮-水(30∶70)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(正相板，正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，减压浓缩，得到85％～98％之间的罗汉果甜苷V。
实施例三：(1).取罗汉果5kg，粉碎，用65％乙醇5000ml加热回流提取10h，滤取提取液，药渣再加55％乙醇5000ml加热回流提取5h，合并提取液并减压浓缩至膏状，得到A。
(2).将A用D101型大孔树脂柱(内径约15cm，D101型大孔树脂5kg)分离，先去离子水和30％乙醇分别洗脱至无色，再用50％乙醇洗脱剂洗脱并收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得B。
(3).将B用正相硅胶柱(内径约10cm，硅胶4kg，干法装柱，干法上样)分离，以氯仿-甲醇-水(60∶40∶3)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(固定相为正相板，展开剂为正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，减压浓缩，得到C。
(4).将C用反相硅胶C-18柱(内径约5cm，反相硅胶C-18 0.5kg，湿法装柱，湿法上样)分离，丙酮-水(30∶70)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(正相板，正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测(色谱柱：氨基柱；流动相：EtCN∶H2O＝75∶25；检测波长：203nm；流速：1ml/min)，合并保留时间相同而且纯度大于98％的罗汉果甜苷V组分，减压浓缩，得到纯度在98％以上的罗汉果甜苷V。
实施例四：(1).取罗汉果4kg，粉碎，用45％乙醇5000ml加热回流提取7h，滤取提取液，药渣再加65％乙醇5000ml加热回流提取7h，合并提取液并减压浓缩至膏状，得到A。
(2).将A用D101型大孔树脂柱(内径约15cm，D101型大孔树脂5kg)分离，先去离子水和20％乙醇分别洗脱至无色，再用40％乙醇洗脱剂洗脱并收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得B。
(3).将B用正相硅胶柱(内径约10cm，硅胶5kg，干法装柱，干法上样)分离，以氯仿-甲醇-水(60∶40∶2)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(固定相为正相板，展开剂为正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，减压浓缩，得到C。
(4).将C用反相硅胶C-18柱(内径约5cm，反相硅胶C-18 0.5kg，湿法装柱，湿法上样)分离，丙酮-水(27∶73)为洗脱剂，收集Rf＝0.23(正相板，正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1)的斑点的洗脱液，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测(色谱柱：氨基柱；流动相：EtCN∶H2O＝60∶40；检测波长：203nm；流速：0.6ml/min)，合并保留时间相同而且纯度大于98％的罗汉果甜苷V组分，减压浓缩，得到纯度在98％以上的罗汉果甜苷V。
Claims (2)
1.一种高纯度罗汉果甜苷V的制备方法，其特征在于：
(1)先将罗汉果粉碎，用20％-70％的乙醇加热回流提取8-18h，滤取提取液，药渣再加30％～60％的乙醇加热回流提取4-8h，合并提取液并减压浓缩至膏状，得到A；
(2)将A用D101型大孔树脂柱分离，先用去离子水和20％～30％乙醇分别洗脱至无色，再用30％～50％的乙醇洗脱剂洗脱并收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得B；
(3)将B用正相硅胶柱分离，以氯仿∶甲醇∶水按照60∶40∶1～60∶40∶10的比例为洗脱剂，收集Rf＝0.23，固定相为正相板，展开剂为正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1的斑点的洗脱液，减压浓缩，得到C；
(4)将C用反相硅胶C-18柱分离，丙酮-水按照25∶75～35∶65的比例为洗脱剂，收集Rf＝0.23，固定相为正相板，展开剂为正丁醇-醋酸-水＝4∶1∶1的斑点的洗脱液，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90％～98％之间或98％以上的罗汉果甜苷V组分，减压浓缩，即可分别得到纯度在90％～98％之间的罗汉果甜苷V或纯度大于98％的罗汉果甜苷V组分。
2.根据权利要求1所述的高纯度罗汉果甜苷V的制备方法，其特征在于：HPLC检测色谱柱为氨基柱；流动相：EtCN∶H2O＝75∶25～60∶40；检测波长：203nm；流速：0.6ml/min～1ml/min；得到纯度在90％～98％之间的罗汉果甜苷V或纯度在98％以上的罗汉果甜苷V。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20051214 Assignee: Guangxi Fanglue Pharmaceutical Group Co., Ltd. Assignor: Guangxi University Of Chinese Medicine Contract record no.: 2009450000023 Denomination of invention: Prepn and use of high-purity momordica glycoside V Granted publication date: 20070704 License type: Exclusive License Record date: 20090702 |
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| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070704 Termination date: 20120526 |