CN1304840C - 一种治疗血栓闭塞性疾病的注射液的质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法，包括指纹图谱的测定和对总绿原酸和肉桂酸的含量测定。本发明与原质量控制标准比较，能够对注射液进行全面质量控制，因此能更好控制产品质量，提高产品的稳定性和疗效。

Description

一种治疗血栓闭塞性疾病的注射液的质量控制方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种以植物生药牛膝、玄参、石斛、金银花为原料的治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法。
背景技术
目前临床上使用的脉络宁注射液采用的质量控制标准，鉴别方面包括对绿原酸和滨蒿内酯的鉴别，含量测定方面仅用肉桂酸的含量来控制产品的质量，对产品质量控制不够全面。本发明增加了指纹图谱的测定和对总绿原酸的含量测定，对肉桂酸含量测定的条件做了改动，与原质量控制标准比较，能够对注射液进行全面质量控制，因此能更好控制产品质量，提高产品的稳定性和疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能对脉络宁注射液进行整体和全面质量控制的质量控制方法，包括指纹图谱的测定和对总绿原酸和肉桂酸的含量测定。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
牛膝1-4重量份  玄参1-4重量份  石斛1-4重量份  金银花1-4重量份
以上四味药材饮片，加药材4-8倍量水，浸泡1-3小时后，煎煮提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至65℃下相对密度为1.25-1.35，冷却。加乙醇使含醇量至70％-85％，静置；取上清液，回收并除尽乙醇，浓缩至65℃下相对密度为1.05-1.15；用2-4倍量醋酸乙酯逆流萃取，合并酯提液，回收并除尽醋酸乙酯，加全量20％-60％注射用水，煮沸，冷却，过滤，补加适量注射用水，加入吐温-80，搅匀，用20％NaOH溶液调pH至8.5-9.2，加或不加氯化钠搅拌溶解，加全量注射用水，最后用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，灯检，包装。
上述制备过程中，如需调节渗透压，除可用氯化钠外也可使用葡萄糖或者葡萄糖氯化钠溶液，其中葡萄糖氯化钠溶液中葡萄糖和氯化钠的常用比例为：葡萄糖∶氯化钠＝5∶0.9或葡萄糖∶氯化钠＝10∶0.9。
葡萄糖氯化钠溶液具体用法为：
50ml：葡萄糖2.5g与氯化钠0.45g
50ml：葡萄糖5g与氯化钠0.45g
100ml：葡萄糖5g与氯化钠0.9g
100ml：葡萄糖10g与氯化钠0.9g
250ml：葡萄糖12.5g与氯化钠2.25g
250ml：葡萄糖25g与氯化钠2.25g
500ml：葡萄糖25g与氯化钠4.5g
500ml：葡萄糖50g与氯化钠4.5g
另外，灌封前精滤的方法除了使用0.22μm的微孔滤膜滤过外，还可以使用超滤的方法滤过，其分子量截留值为5万～10万。
注射液的质量控制方法：
【指纹图谱】高效液相色谱法测定。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱：0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱；从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；
参照物溶液的制备  取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备  取注射液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法  分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积比值，供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；供试品指纹图谱有10个共有峰；
相对保留时间范围  1号峰：0.340～0.376、2号峰：0.641～0.708、3(S)：1.000、4号峰：1.000～1.098、5号峰：1.032～1.141、6号峰：1.302～1.439、7号峰：1.727～1.909、8号峰：1.763～1.948、9号峰：1.947～2.152、10号峰：2.070～2.288；
相对峰面积比值范围  1号峰：5.409～8.113、2号峰：1.340～2.234、4号峰：1.025～1.708、5号峰：0.709～1.182；
非共有峰面积  不得超过总峰面积的5％；
【含量测定】
肉桂酸  按照高效液相色谱法测定。
色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；甲醇(20～21％)一0.1％磷酸溶液(55～60％)-乙腈(20～24％)为流动相，较为理想的流动相为：21∶55∶24的甲醇-0.1％磷酸溶液-乙腈，其中磷酸溶液也可替换为甲酸溶液、冰醋酸溶液；检测波长为278nm。理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备  取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含2.0μm的溶液；
供试品溶液的制备  精密量取注射液1.0ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
注射液每1ml含玄参以肉桂酸(C9H8O2)计不得少于0.03mg。
总绿原酸
对照品溶液的配制  取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，即得；
标准曲线制备  精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀；以水为空白，照分光光度法，在347nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法  精密量取注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，在347nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中绿原酸重量(μg)，计算，即得；
注射液每1ml含金银花以总绿原酸按绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.80mg。
本发明所称的注射液包括规格为50ml、100ml、250ml、500ml、1ml、2ml、5ml、10ml、20ml的注射液制剂。
建立中药指纹图谱的目的是全面反映中药中所含的内在化学成分的种类、数量和比例关系，从而全面反映中药的质量，尤其是在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方法更能有效的反映中药的内在质量。因此，本质量控制方法中采用的色谱指纹图谱可以对脉络宁注射液的产品质量从总体上进行控制，而不局限于仅对单个成分的含量控制，从而确保了该产品安全有效和质量稳定。原脉络宁注射液的质量控制方法仅采用单一的肉桂酸含量测定方法，可见是有不足之处的。
本质量控制方法中总绿原酸测定方法中采用347nm作为检测波长，避免了常规采用326nm波长处测定时其它成分对总绿原酸的干扰。总绿原酸和肉桂酸在脉络宁注射液总固体物中所占比例大于25％，本测定方法的建立解决了中药静脉注射剂要求可测定成分的总含量不低于总固体量25％的问题，说明总绿原酸和肉桂酸是脉络宁注射液主要成分之一。
下面的实验例和实施例用于进一步说明本发明。
实验例1：指纹图谱的方法学研究
稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在不同时间检测，考察色谱峰保留时间及峰面积比值的一致性，结果见表1和表2，结果表明脉络宁注射液供试品在12h内稳定。
表1脉络宁注射液稳定性试验结果(相对保留时间)
  峰号   0h   2h   4.5h   6h   8h   12h   均值   RSD％
  1   0.364   0.367   0.365   0.365   0.364   0.360   0.364   0.634
  2   0.681   0.683   0.681   0.681   0.681   0.679   0.681   0.182
  3(S)   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   0.000
  4   1.045   1.046   1.046   1.047   1.046   1.044   1.046   0.076
  5   1.087   1.087   1.087   1.087   1.087   1.088   1.087   0.040
  6   1.365   1.364   1.365   1.366   1.365   1.365   1.365   0.044
  7   1.802   1.799   1.803   1.800   1.804   1.812   1.803   0.271
  8   1.838   1.835   1.839   1.836   1.840   1.849   1.840   0.270
  9   2.027   2.024   2.029   2.026   2.031   2.041   2.030   0.286
  10   2.152   2.150   2.156   2.152   2.155   2.163   2.155   0.203
表2脉络宁注射液稳定性试验结果(相对峰面积比值)
  峰号   0h   2h   4.5h   6h   8h   12h   均值   RSD％
  1   6.766   6.791   6.811   6.830   6.976   6.946   6.853   1.261
2 1.871 1.858 1.867 1.868 1.865 1.868 1.866 0.226
  3(S)   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   0.000
  4   1.458   1.451   1.445   1.441   1.411   1.421   1.438   1.258
  5   0.981   0.981   0.981   0.981   0.980   0.980   0.981   0.056
  6   -   -   -   -   -   -   -
  7   -   -   -   -   -   -   -
  8   -   -   -   -   -   -   -
  9   -   -   -   -   -   -   -
  10   -   -   -   -   -   -   -
精密度试验：取同一供试品溶液，连续进样6次，考察色谱峰的相对保留时间及峰面积比值的一致性。结果见表3和表4。规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的相对标准偏差均小于3％。
表3脉络宁注射液精密度试验结果(相对保留时间)
  峰号   1   2   3   4   5   6   均值   RSD％
  1   0.364   0.363   0.367   0.363   0.365   0.365   0.364   0.377
  2   0.681   0.681   0.683   0.681   0.681   0.681   0.681   0.106
  3(S)   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   0.000
  4   1.045   1.045   1.046   1.046   1.046   1.047   1.046   0.065
  5   1.087   1.086   1.087   1.087   1.087   1.087   1.087   0.044
  6   1.365   1.361   1.364   1.365   1.365   1.366   1.364   0.117
  7   1.802   1.796   1.799   1.802   1.803   1.800   1.800   0.144
  8   1.838   1.832   1.835   1.839   1.839   1.836   1.837   0.144
  9   2.027   2.022   2.024   2.029   2.029   2.026   2.026   0.143
  10   2.152   2.147   2.150   2.156   2.156   2.152   2.152   0.160
表4脉络宁注射液精密度试验结果(相对峰面积比值)
峰号 1 2 3 4 5 6 均值 RSD％
  1   6.766   6.779   6.791   6.810   6.811   6.830   6.798   0.345
  2   1.871   1.854   1.858   1.857   1.867   1.868   1.862   0.369
  3(S)   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   0.000
  4   1.458   1.454   1.451   1.448   1.445   1.441   1.449   0.431
  5   0.981   0.981   0.981   0.981   0.981   0.981   0.981   0.026
  6   -   -   -   -   -   -   -   -
  7   -   -   -   -   -   -   -   -
  8   -   -   -   -   -   -   -   -
  9   -   -   -   -   -   -   -   -
  10   -   -   -   -   -   -   -   -
重现性实验：取同一批号的注射液，平行制备供试品6份，并检测。结果见表5和表6。在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其相对峰面积比值的相对标准偏差均小于3％。
表5脉络宁注射液重现性试验结果(相对保留时间)
  峰号   1   2   3   4   5   6   均值   RSD％
  1   0.363   0.363   0.363   0.363   0.362   0.364   0.363   0.201
  2   0.680   0.680   0.680   0.680   0.678   0.681   0.680   0.149
  3(S)   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   0.000
  4   1.046   1.046   1.046   1.025   1.041   1.045   1.041   0.807
  5   1.087   1.087   1.087   1.087   1.083   1.087   1.087   0.163
  6   1.365   1.365   1.365   1.365   1.359   1.364   1.364   0.193
  7   1.804   1.804   1.804   1.805   1.795   1.800   1.802   0.216
  8   1.841   1.840   1.841   1.842   1.831   1.837   1.839   0.223
  9   2.031   2.031   2.031   2.033   2.020   2.026   2.029   0.232
  10   2.156   2.156   2.156   2.158   2.145   2.151   2.154   0.231
表6脉络宁注射液重现性试验结果(相对峰面积比值)
  峰号   1   2   3   4   5   6   均值   RSD％
  1   6.690   6.462   6.672   6.495   6.636   6.529   6.581   1.481
  2   1.870   1.830   1.814   1.815   1.813   1.821   1.827   1.210
  3(S)   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   0.000
  4   1.483   1.461   1.421   1.450   1.424   1.443   1.447   1.603
  5   0.986   0.968   0.965   0.965   0.964   0.965   0.969   0.864
  6   -   -   -   -   -   -   -   -
  7   -   -   -   -   -   -   -   -
  8   -   -   -   -   -   -   -   -
  9   -   -   -   -   -   -   -   -
  10   -   -   -   -   -   -   -   -
实验例2：指纹图谱及各项技术参数的研究
指纹图谱：图1为脉络宁注射液的指纹图谱及各项技术参数，图2为空白基线图谱，图3为参照物图谱，图4为记录2小时的脉络宁注射液的指纹图谱。
共有峰的标定：根据10批次供试品的检测结果，选择了各批样品共有的、保留时间及峰面积相对稳定的10个色谱峰作为脉络宁注射液指纹图谱的共有峰，其峰面积之和占峰面积大于95％。经HPLC/MS分析，初步确定其中4个峰分别为5-羟甲基糠醛(1号峰)、绿原酸(3号峰)、咖啡酸(4号峰)、肉桂酸(10号峰)。
共有峰面积的比值：10批次供试品各共有峰的相对保留时间检测结果见表7，各共有峰面积的比值检测结果见表8。
非共有峰面积：10批次供试品的图谱中各非共有峰面积的百分比检测结果见表9。
表7 10批脉络宁注射液检测结果(相对保留时间)
  峰号  200112081  200112091  200302162   200303061   200303201  200303202  200303211   200304021  200304112  200304121   均值
  1  0.358  0.358  0.355   0.354   0.360  0.360  0.360   0.358  0.358  0.358   0.358
  2  0.674  0.674  0.673   0.671   0.674  0.674  0.675   0.676  0.676  0.676   0.674
  3(S)  1.000  1.000  1.000   1.000   1.000  1.000  1.000   1.000  1.000  1.000   1.000
  4  1.044  1.044  1.045   1.045   1.046  1.046  1.046   1.046  1.046  1.046   1.046
  5  1.087  1.087  1.087   1.087   1.087  1.087  1.087   1.087  1.086  1.086   1.087
  6  1.369  1.369  1.372   1.373   1.373  1.372  1.372   1.371  1.369  1.369   1.371
  7  1.816  1.817  1.821   1.825   1.822  1.820  1.820   1.815  1.811  1.811   1.818
  8  1.854  1.855  1.858   1.862   1.860  1.858  1.859   1.852  1.849  1.848   1.856
  9  2.047  2.048  2.054   2.059   2.054  2.052  2.053   2.047  2.043  2.042   2.050
  10  2.177  2.178  2.185   2.191   2.183  2.182  2.182   2.175  2.170  2.169   2.179
表8 10批脉络宁注射液检测结果(相对峰面积比值)
  峰号  200112081  200112091   200302162   200303061   200303201  200303202  200303211  200304021  200304112  200304121   均值
  1  7.659  7.791   5.993   6.338   6.668  6.756  6.582  6.631  6.735   6.456   6.761
  2  1.757  1.751   1.745   1.849   1.754  1.743  1.753  1.788  1.841   1.887   1.787
  3(S)  1.000  1.000   1.000   1.000   1.000  1.000  1.000  1.000  1.000   1.000   1.000
  4  1.238  1.297   1.195   1.323   1.236  1.154  1.370  1.496  1.689   1.662   1.366
  5  0.950  0.951   0.929   0.950   0.947  0.944  0.956  0.965  0.922   0.941   0.945
  6  0.682  0.714   0.323   0.366   0.338  0.334  0.387  0.364  0.426   0.448   0.438
  7  1.054  1.139   1.025   1.008   0.943  0.970  1.002  1.018  1.064   1.158   1.038
  8  0.478  0.522   0.526   0.533   0.484  0.495  0.522  0.502  0.562   0.614   0.524
  9  0.824  0.885   0.772   0.736   0.697  0.722  0.727  0.752  0.784   0.836   0.773
  10  2.393  2.424   0.917   1.056   0.958  0.940  0.978  0.999  1.213   1.203   1.308
表9 10批脉络宁注射液检测结果(非共有峰面积)
  批号  200112081  200112091   200302162   200303061   200303201  200303202   200303211   200304021   200304112  200304121   均值
  非共有峰面积百分比(％) 4.24 4.52 2.71 2.27 2.39 2.43 2.40 2.20 1.74 1.82 2.67
实验例3：注射液、中间体和中药材指纹图谱的相关性研究
利用HPLC/DAD/MS技术，我们对脉络宁注射液、中间体与药材的相关性进行了考察，结果表明，脉络宁注射液与其中间体之间有较好的相关性，而石斛、牛膝、玄参和金银花四味药材在注射液和中间体里均有相应的体现，结果见表10。
表10脉络宁注射液、中间体和药材指纹图谱的相关性
  tR(min)   m/z   推测结构   源药材   质谱图
  10.37   127[M+H]+，109[M+H-H2O]+   5-羟甲基糠醛   牛膝   图19
  26.97   355[M+H]+，377[M+Na]+   绿原酸   金银花   图20
  28.16   181[M+H]+，163[M+H-H2O]+   咖啡酸   金银花   图21
  29.80   264[M+H]+   石斛碱   石斛   图22
  47.29   515[M-H]-   异绿原酸   金银花   图23
  56.57   149[M+H]+，131[M+H-H2O]+   肉桂酸   玄参   图24
按照注射液制备工艺分别提取制备了只含有单味药材的注射液，分别量取单味药材的注射液1.0ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
测定条件按注射液指纹图谱色谱条件，即流动相为A：0.1％甲酸水溶液，B：甲醇，流速1ml/min；检测波长300nm；参比波长：390nm；柱温：25℃，进样量20ul，记录时间为90min。梯度洗脱程序为：
  A％(V/V)   B％(V/V)
  0min5min60min   959550   5550
检测波长为脉络宁注射液指纹图谱的检测波长300nm和各味药材指纹图谱的检测波长。结果见表11。
表11脉络宁注射液、中间体和药材指纹图谱的相关性
  注射液中共有峰号 牛膝 密花石斛 马鞭石斛 玄参 山银花 忍冬
  1   +   -   -   +   +   +
  2   -   -   -   -   +   +
  3(s)   -   -   -   -   +   +
  4   -   -   -   -   +   +
  5   -   -   -   -   +   +
  6   -   -   -   -   +   +
7 - - - - + +
  8   -   -   -   -   +   +
  9   -   -   -   -   +   +
  10   -   -   -   +   -   -
+：在单味药材供试液的HPLC图中有此峰，-：在单味药材供试液的HPLC图中无此峰
实验例4：肉桂酸含量测定的研究
1.仪器和试剂
515型高效液相色谱仪(美国Waters公司生产)，996型二极管阵列检测器，M32色谱工作站。
甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地公司生产)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
肉桂酸对照品购自中国药品生物制品检定所，批号786-9001。
2.色谱条件
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18柱(4.6×250mm，粒度5μm，Phenomenex公司生产)，流动相为甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液(21∶24∶55)，流速1ml/min，柱温为室温，检测波长278nm，进样量20μl。
3.试验方法
3.1色谱条件选择
脉络宁注射液(10ml)原质量标准中肉桂酸含量测定流动相是甲醇-0.1％磷酸溶液(55∶45)，在此基础上经过调整和优化，确定甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液(21∶24∶55)是测定肉桂酸含量较为理想的流动相。
3.2线性范围
精密称取肉桂酸对照品6.40mg置100ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，分别精密量取0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，制成浓度为0.64μg/ml、1.28μg/ml、2.56μg/ml、3.84μg/ml、5.12μg/ml、6.40μg/ml、9.60μg/ml的肉桂酸对照品溶液，进样20μl，结果见表12。
                                      表12肉桂酸标准曲线
  序号   1   2   3   4   5   6   7
  浓度(μg/ml)峰面积   0.6496346   1.28188979   2.56382978   3.84589017   5.12788208   6.40998991   9.601484455
以对照品浓度为横坐标，以肉桂酸峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝155918X-8750.1，r＝0.9999，表明肉桂酸在0.64-9.60μg/ml的浓度范围具有良好的线性。
3.3***适用性试验
按正文所述制备供试品，进样20μl，计算肉桂酸峰的理论板数和拖尾因子。
3.3.1理论板数
+n＝5.54(tR/Wh/2)2＝5.54×(12.514÷0.267)2＝12169
3.3.2拖尾因子
T＝W0.05h/2d1＝0.521÷(2×0.253)＝1.03
3.4精密度试验
取供试品溶液，连续进样5次，进样量20μl，测定峰面积，计算RSD值，结果见表13。
                        表13精密度试验
  进样次数   1   2   3   4   5
  峰面积RSD   10950520.19％   1098044   1094911   1096006   1099597
结果表明，本方法具有良好的精密度。
3.5重复性试验
取同一批样品，按正文方法制备供试品溶液5份，进样20μl，测定肉桂酸峰面积，计算RSD值，结果见表14。
                             表14重复性试验
序号 峰面积 含量(mg/ml)   平均含量(mg/ml) RSD
  12345   10978021086589108976910848421081195   0.058840.058240.058410.058150.05795 0.05832 0.58％
结果表明本法具有良好的重复性。
3.6稳定性试验
取上述供试品溶液，分别于0、2、4、8、12小时进样，测定峰面积，计算RSD值，结果见表15。
                               表15稳定性试验
  时间(小时)   0   2   4   8   12
  峰面积平均值RSD   10960060.9％   1073610   10851331088430   1090504   1096895
结果表明12小时内测定供试品中肉桂酸含量是较为稳定的。
3.7回收率试验
精密量取已知肉桂酸含量为43.44μg/ml的样品0.5ml置10ml量瓶中，精密加入肉桂酸对照品溶液(6.4μg/ml)4.0ml，加50％甲醇稀释至刻度，测定含量，计算回收率，结果见表16。
                                 表16回收率试验
序号   供试品含量(μg/ml)   对照品加入量(μg/ml)   实测值(μg/ml) 回收率(％) 平均回收率(％) RSD
  12345   2.1722.1722.1722.1722.172   2.5602.5602.5602.5602.560   47.3547.4446.4846.8346.88   100.00100.5096.7298.0898.28 98.72 1.55％
注：
回收率(％)＝(实测值-供试品含量)÷对照品加入量×100％
结果表明本法具有良好的回收率。
3.8检测限
精密量取肉桂酸对照品溶液(64μg/ml)0.05ml置50ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，制成0.064μg/ml的肉桂酸对照品溶液，进样20μl，噪音为0.00012，响应值0.00031，信噪比为2.6，因此确定检测限为15×10-10g，定量限为49×10-10g。
3.9空白试验
按生产工艺制备空白样品(缺玄参)，并按正文所述制备供试品测定，结果未见肉桂酸峰，说明肉桂酸是玄参的专属成分，空白对其没有干扰。
3.10样品测定
按正文所述含量测定方法，测定3批脉络宁注射液(100ml)中肉桂酸含量，结果见表17。
      表17脉络宁注射液(100ml)中肉桂酸含量
  批号   20020306   20020307   20020308
  肉桂酸含量(mg/ml)   0.04420   0.04408   0.04325
结果表明，每瓶脉络宁注射液(100ml)中肉桂酸含量比脉络宁注射液(10ml)中有所增加。
实验例5、总绿原酸含量测定的研究
许多文献报道金银花中富含绿原酸及其异构体(异绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸等)。它们具有相同的母核，因此也具有极其类似的紫外光谱吸收。注射液工艺提取方法能够将该类有机酸有效的提取出来，因此对注射液中总绿原酸进行质量控制研究是非常必要的。
由于绿原酸的异构体含量少、性质不稳定、对照品难以制备，多数质量标准中仅对绿原酸进行了含量测定，并未涉及其他异构体。注射液在指纹图谱研究中，发现有7个色谱峰的紫外吸收曲线与绿原酸一致。经对比，可以确定其中的一个峰为绿原酸。通过对金银花药材的研究发现，这些色谱峰是金银花中绿原酸在提取精制过程中逐步衍变产生的，因此可将这些成分归属为总绿原酸，以绿原酸计测定含量。
经过对样品谱图进行三维紫外扫描，采集所有色谱峰的紫外吸收光谱，发现除了总绿原酸外，其余成分在340nm尤其是347nm以上紫外吸收很少或没有，所以可以选取347nm处测定样品的紫外吸收，用紫外分光光度法测定注射液中总绿原酸，见附图5。
1.专属性考察
1.1色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂AngilentExtentC-18色谱柱(5μm，4.6×250mm)；Waters2690色谱仪；Waters996PDA二极管阵列检测器；Waters M32工作站：流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液-乙腈，梯度洗脱；流速1ml/min；柱温：35℃：检测波长为327nm。
                       表18梯度洗脱流动相配比变化程序
  时间(分钟)   甲醇(％)   0.1％磷酸溶液(％)   乙腈(％)   线性
  030506062   15551   9580756595   41520304 5566
1.2金银花按工艺制备，各步工艺点样品采集：
1.2.1原药材(按中国药典2000年版一部金银花项下方法处理)取山银花和忍冬药材粉末各0.5g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50.0ml，称定重量，超声波提取1小时(250W，40KHz)，放冷后补足重量，过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品。
1.2.2水煎煮
取山银花和忍冬药材粉末各100g，加6倍的水，煎煮二次，每次1.5小时，合并煎煮液，滤过，取续滤液作为供试品。
1.2.3醇沉
取上述滤液浓缩，冷却，加乙醇使含醇量至80％。静置，取上清液作为供试品。
1.2.4醋酸乙酯提取
取上述上清液，用3倍量体积的醋酸乙酯提取，合并酯提液，加热除尽醋酸乙酯，浸膏加水煮沸，冷却，过滤，用20％NaOH溶液调pH至9.0-9.2，转移至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品。
1.2.5制剂
精密量取脉络宁注射液(100ml)5.0ml置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为制剂供试品。
1.3对照品溶液制备
取绿原酸对照品适量，以50％甲醇制成0.05mg/ml对照品溶液。
1.4测定法
精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20ul，按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图。
1.5试验结果
对各供试品溶液的色谱图进行比较，金银花中绿原酸在生产过程中逐渐减少，衍变产生其他成分，而这些成分的紫外吸收光谱几乎与绿原酸相同，参考有关资料可初步确定为绿原酸的异构体或分解产物，其紫外光谱行为是一致的，可以作为一类成分进行测定。
由于所用检测器为二极管阵列检测器，可以对每个色谱峰进行全波长扫描，通过对比发现除了总绿原酸外，其余成分在340nm尤其是347nm以上紫外吸收很少或没有，所以注射液选用347nm处紫外分光光度法测定注射液中总绿原酸。
2.仪器和试剂
岛津UV-1601PC紫外分光光度计，岛津UVPC工作站，1cm石英比色杯。
水为纯水，所用试剂均为分析纯。
绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所，批号0753-9607。
3.线性关系
精密称取绿原酸对照品8.54mg置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1ml中含绿原酸0.3416mg)。
标准曲线制备  精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。制成绿原酸含量为3.416μg/ml、6.832μg/ml、10.248μg/ml、13.664μg/ml、17.080μg/ml、20.496μg/ml的溶液，以水为空白，照分光光度法(中国药典2000年版附录VB)，在347nm处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表19。
                               表19线性关系测定
  浓度(μg/ml)   3.416   6.832   10.248   13.664   17.080   20.496
  吸收值   0.104   0.203   0.299   0.393   0.485   0.583
试验结果统计，绿原酸对照品浓度与紫外吸收度回归方程为A＝0.0279×C+0.011，r＝0.9999。表明绿原酸在3.416～20.496μg/ml浓度范围内与紫外吸收度呈良好的线性关系。
4.精密度试验
取供试品溶液测定紫外吸收度，测定6次，结果见表20。
                            表20精密度试验
  序号   1   2   3   4   5
  测定值平均值RSD   0.3880.3880.21％   0.388   0.387   0.389   0.389
结果表明本方法具有良好的精密度。
5.重复性试验
取同一批样品，按正文方法制备供试品溶液6份，测定紫外吸收度，计算RSD值，结果见表21。
                            表21重复性试验
  序号   紫外吸收度   含量(mg/ml)   平均含量(mg/ml)   RSD
  123456   0.3880.3880.3880.3900.3920.395   1.3511.3511.3511.3581.3651.376 1.359 0.75％
结果表明，本法具有良好的重复性。
6稳定性试验
取上述供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12小时测定紫外吸收度，计算RSD值，结果见表22。
                              表22稳定性试验
 时间(小时) 0 1 2 4 8 12
 测定值平均值RSD   0.3880.3880.27％   0.388   0.389   0.387   0.387   0.386
结果表明，12小时内测定供试品中总绿原酸含量是稳定的。
7回收率试验
精密量取已知含量为1.359mg/ml的样品0.5ml置于100ml量瓶中，分别精密加入绿原酸对照品溶液(0.3416mg/ml)1.5ml、2.0ml、2.5ml，加水稀释至刻度，在347nm处测定紫外吸收，计算回收率，结果见表23。
                            表23回收率试验(n＝6)
序号   供试品含量(μg/ml)   对照品加入量(μg/ml) 实测含量(μg/ml) 回收率(％) 平均值(％) RSD
  123456   6.7956.7956.7956.7956.7956.795   5.1245.1246.8326.8328.5408.540   12.04311.95313.51313.42315.34115.394   101.04100.2999.1698.50100.04100.39 99.90 0.92％
注：
回收率(％)＝(实测值-供试品含量)÷对照品加入量×100％
结果表明本法具有良好的回收率。
8空白试验
按生产工艺制备空白样品(缺金银花)，并按正文所述制备供试品测定347nm紫外吸收为0.004，低于线性范围最低浓度(3.416μg/ml)吸收度的5％，说明空白没有干扰，本方法具有专属性。
9样品测定
按照上述方法测定3批样品中总绿原酸含量，结果见表24。
                    表24总绿原酸含量测定
  批号   20020306   20020307   20020308
  含量(mg/ml)   0.949   0.867   1.153
实验例6、已知成分占总固体物含量的研究
《中药注射剂研究的技术要求》中规定“以净药材为组份配制的注射剂应研究测定有效成分、指标成分或总类成分，选择重现性好的方法，并作方法学考察试验。所测定成分的总含量应不低于总固体量的20％(静脉用不少于25％)。调节渗透压等的附加剂，按实际加入量扣除，不应计算在内。”对3批样品测定总固体量、总绿原酸含量及肉桂酸含量，计算所测定成分的总含量占总固体量的比例，结果见表25。
                  表25已知成分占总固体物的含量(原表20)
  批号   实测总固体量(mg/ml)   扣除附加剂总固体量(mg/ml)   绿原酸类有机酸含量(mg/ml)   肉桂酸含量(mg/ml)   已知成分占总固体物的含量(％)
  200203062002030720020308   11.5611.7813.08   2.352.543.80   0.9490.8671.153   0.044200.044080.04325   42.2635.8731.48
注：
扣除附加剂固体量＝实测总固体量-NaCl含量-吐温80含量-NaOH含量
试验结果可说明注射液中总绿原酸和肉桂酸含量占总固体量的比例已达到25％以上，符合规定。
附图说明：
图1：为本发明脉络宁注射液的指纹图谱及各项技术参数；
图2：为空白基线图谱；
图3：为参照物色谱峰图谱；
图4：为记录2小时的本发明脉络宁注射液的指纹图谱；
图5：为本发明脉络宁注射液紫外图谱。
实施例1：指纹图谱的测定
【指纹图谱】高效液相色谱法(中国药典2000年版附录VID)测定。
色谱条件与***适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱(4.6×250mm，粒度5μm)；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱：0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱，从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；
参照物溶液的制备  取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备  取注射液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积比值，应符合下列要求：
供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；
指纹图谱应有10个共有峰；
相对保留时间  1号峰：0.364、2号峰：0.678、3(S)：1.000、4号峰：1.043、5号峰：1.083、6号峰：1.362、7号峰：1.794、8号峰：1.833、9号峰：2.020、10号峰：2.149；
相对峰面积比值  1号峰：6.780、2号峰：1.363、4号峰：1.220、5号峰：0.932；
非共有峰面积：不得过总峰面积的5％。
实施例2：肉桂酸的含量测定
按照高效液相色谱法(中国药典2000年版附录VID)测定。
色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱(4.6×250mm，粒度5μm)；21∶55∶24的甲醇-0.1％甲酸溶液-乙腈为流动相；检测波长为278nm。理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备  取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含2.0μg的溶液；
供试品溶液的制备  精密量取注射液1.0ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
注射液每1ml含玄参以肉桂酸(C9H8O2)计不得少于0.03mg。
实施例3：总绿原酸的含量测定
对照品溶液的配制  取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，即得。
标准曲线制备  精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。以水为空白，照分光光度法(中国药典2000年版附录VB)，在347nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法  精密量取注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，在347nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中绿原酸重量(μg)，计算，即得。
注射液每1ml含金银花以总绿原酸按绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.80mg。
实施例4：脉络宁注射液的质量控制方法
【指纹图谱】高效液相色谱法(中国药典2000年版附录VID)测定。
色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱(4.6×250mm，粒度5μm)；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱：0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱，从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；
参照物溶液的制备  取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备  取注射液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法  分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值，应符合下列要求：
供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；
指纹图谱应有10个共有峰；
相对保留时间  1号峰：0.364、2号峰：0.678、3(S)：1.000、4号峰：1.043、5号峰：1.083、6号峰：1.362、7号峰：1.794、8号峰：1.833、9号峰：2.020、10号峰：2.149；
相对峰面积比值  1号峰：6.780、2号峰：1.363、4号峰：1.220、5号峰：0.932；
非共有峰面积：不得过总峰面积的5％。
【含量测定】
肉桂酸  按照高效液相色谱法(中国药典2000年版附录VID)测定。
色谱条件与***适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱(4.6×250mm，粒度5μm)；21∶55∶24的甲醇-0.1％磷酸溶液-乙腈为流动相；检测波长为278nm。理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备  取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含2.0μg的溶液；
供试品溶液的制备  精密量取注射液1.0ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
注射液每1ml含玄参以肉桂酸(C9H8O2)计不得少于0.03mg。
总绿原酸
对照品溶液的配制  取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，即得；
标准曲线制备  精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。以水为空白，照分光光度法(中国药典2000年版附录VB)，在347nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法  精密量取注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，在347nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中绿原酸重量(μg)，计算，即得；
注射液每1ml含金银花以总绿原酸按绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.80mg。

Claims (6)

1、一种用于治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中含有指纹图谱的测定，指纹图谱测定的色谱条件为：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱：0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱，从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；
参照物溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取注射液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积比值，供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似。
2、如权利要求1所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中供试品指纹图谱为：
供试品指纹图谱有10个共有峰；
相对保留时间范围  1号峰：0.340～0.376、2号峰：0.641～0.708、3号峰：1.000、4号峰：1.000～1.098、5号峰：1.032～1.141、6号峰：1.302～1.439、7号峰：1.727～1.909、8号峰：1.763～1.948、9号峰：1.947～2.152、10号峰：2.070～2.288；
相对峰面积比值范围  1号峰：5.409～8.113、2号峰：1.340～2.234、4号峰：1.025～1.708、5号峰：0.709～1.182；
非共有峰面积  不得超过总峰面积的5％。
3、如权利要求2所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中供试品指纹图谱为：
供试品指纹图谱有10个共有峰；
相对保留时间  1号峰：0.364、2号峰：0.678、3号峰：1.00、4号峰：1.043、5号峰：1.083、6号峰：1.362、7号峰：1.794、8号峰：1.833、9号峰：2.020、10号峰：2.149；
相对峰面积比值  1号峰：6.780、2号峰：1.363、4号峰：1.220、5号峰：0.932。
4、一种治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法，其特征在于该方法为：
a.指纹图谱的测定
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱：0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱；从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；
参照物溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取注射液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积比值，供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；供试品指纹图谱有10个共有峰；
相对保留时间范围  1号峰：0.340～0.376、2号峰：0.641～0.708、3号峰：1.000、4号峰：1.000～1.098、5号峰：1.032～1.141、6号峰：1.302～1.439、7号峰：1.727～1.909、8号峰：1.763～1.948、9号峰：1.947～2.152、10号峰：2.070～2.288；
相对峰面积比值范围  1号峰：5.409～8.113、2号峰：1.340～2.234、4号峰：1.025～1.708、5号峰：0.709～1.182；
非共有峰面积  不得超过总峰面积的5％；
b.肉桂酸的含量测定
按照高效液相色谱法测定；
色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；20～21％甲醇-55～60％的0.1％磷酸溶液-20～24％乙腈为流动相；检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备  取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含2.0μg的溶液；
供试品溶液的制备  精密量取注射液1.0ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至10ml，摇匀，即得；
测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
c.总绿原酸的含量测定
对照品溶液的配制  取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，即得；
标准曲线制备  精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀；以水为空白，照分光光度法，在347nm的波长处测定吸收度；以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法  精密量取注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加水至100ml，摇匀，在347nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中绿原酸重量，计算，即得。
5、如权利要求4所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中供试品指纹图谱为：
供试品指纹图谱有10个共有峰；
相对保留时间  1号峰：0.364、2号峰：0.678、3号峰：1.000、4号峰：1.043、5号峰：1.083、6号峰：1.362、7号峰：1.794、8号峰：1.833、9号峰：2.020、10号峰：2.149；
相对峰面积比值  1号峰：6.780、2号峰：1.363、4号峰：1.220、5号峰：0.932。
6、如权利要求4所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的脉络宁注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中肉桂酸含量测定的流动相为：21∶55∶24的甲醇-0.1％磷酸溶液-乙腈。
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