CN1279714A

CN1279714A - 环氧化物水解酶

Info

Publication number: CN1279714A
Application number: CN98811273A
Authority: CN
Inventors: T·道威里; P·德斯里
Original assignee: Puratos NV
Current assignee: Puratos NV
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2001-01-10
Also published as: DE69834130T2; WO1999021972A1; EP1025213A1; ATE322542T1; US6379938B1; TR200001090T2; EP0911392A1; DE69834130D1; IL135759A; AU9730798A; ES2260851T3; IL135759A0; JP2001520881A; EP1025213B1; CA2306979A1; ZA989705B

Abstract

本发明涉及来源于微生物的一种已分离并纯化的编码环氧化物水解酶的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的载体、用该核苷酸序列转化的重组宿主细胞,以及由该核苷酸序列编码的环氧化物水解酶氨基酸序列和/或由所述重组宿主细胞表达的环氧化物水解酶氨基酸序列。

Description

环氧化物水解酶

发明领域

本发明涉及环氧化物水解酶的核苷酸序列和氨基酸序列，以及它们在环氧化物的对映异构水解中的应用。

发明背景

环氧化物

在精细化合物、特别是对映体纯的化合物的有机合成中，环氧化物被作为手性结构单元。它们是反应活性分子，因为其环能被很容易地打开而生成多种产物。由于这个原因，它们是重要的药物和专用化学品的前体。现存的某些化学方法是由旋光前体来制备这些分子，但是除了仅限于对烯丙基醇使用的、Sharpless环氧化方法外，仍缺乏有效的不对称合成(涉及不对称化作用)和拆分的方法(美国化学学会会志102，P．5974(1980))。利用生物反应来进行环氧化物合成已有研究(参阅例如de BontJ．A．M．的综述，四面体：不对称性4，P．1331(1993))。

由多种工业来源释放到环境中或者在其他合成化学物质的转化过程中形成的另外一些环氧化物，比如卤化的脂族环氧化物，是潜在的污染物。例如表氯醇(3-氯-1，2-环氧丙烷)就是一种用途广泛的工业化学物质，已被确认是诱变剂和致癌剂。

环氧化物水解酶

环氧化物水解酶(EC3．3．2．3．)是这样一些水解酶，它们催化环氧化物环的打开，将其底物转变为相应的二元醇。其最有趣的一个性质是它们通常具有高度的区域选择性和对映体选择性，可用于制备纯的对映体。

各种有机体中的环氧化物水解酶都已得到研究。研究最为透彻的是来源于哺乳动物的环氧化物水解酶。它们主要存在于肝、睾丸、肾、卵巢和肺中。因其参与生物异源物质的代谢(对具细胞毒性、诱变性和致癌性的中间产物的解毒作用)而得到广泛研究(Seidegard等，生物化学和生物物理学学报695，P．251(1983))。

对于存在于其他高等真核生物如植物和昆虫中的环氧化物水解酶也已有描述。

由于其低可获得性上述来源的酶对于大规模加工过程没有实用价值。微生物群体是一个合适的替代选择，因为微生物能够进行大规模的培养。使用完整细胞进行环氧化物的生物转化已得到研究。多种微生物的微生物环氧化物水解酶已有描述。以下对这些描述的一些实例进行概括：

-黑曲霉LPC521和Beauvaria sulfurescens ATCC7159含有对映体互补的环氧化物水解酶，该酶可水解苯乙烯环氧化物的两种外消旋形式(Pedragosa-Moreau等，有机化学杂志：58，P．5533(1993))。

-棉色二孢ATCC16391可催化将外消旋的茚氧化物动力学拆分为1(S)、2(R)茚氧化物。(Zhang等，发酵与生物工程杂志，80，p244(1995))。

-在棒杆菌N-1074菌株中进行研究的环氧化物水解酶可将表氯醇(3-氯-1，2-环氧丙烷)转化为(R)-3-氯-2-丙醇(Nakamura等，细菌学杂志174，P．7613(1992))。从假单胞菌AD1菌株中已纯化到了类似的酶(Jacobs等，欧洲生物化学杂志202，P．1217(1991))。

-从红球菌NCIMB 11216中分离到一种催化手性环氧化物和二元醇中各种外消旋环氧化物进行不对称水解的环氧化物水解酶(Mischitz等，生物技术快讯17，P．893(1995))。

-株黄杆菌能将反式-1-环氧琥珀酸转化为内消旋酒石酸(Martin等，生物化学杂志70，P．405(1955))。

-酒石酸诺卡氏菌的环氧化物水解酶能催化顺式-环氧琥珀酸水解产生L(+)酒石酸(Patentschrift DE 2605921)。其他一些微生物如无色杆菌属、产碱杆菌属(美国专利3957579)、产酒石酸不动杆菌、金色土壤杆菌、粘稠土壤杆菌、健康根瘤菌(Rhizobium validum)、假单胞菌(Offenlegungsschrift DT 2619311)可进行同样的反应。

上述例子的一个共同特点是使用完整细胞或细胞的完整粗提物去完成反应。可以通过物理方法破碎细胞或用去污剂处理使细胞壁和／或细胞膜具有通透性来释放这些酶。

酒石酸

酒石酸在食品工业中有多种用途(软饮料中的添加剂，食品防腐剂，合成乳化剂的原料，…)。可以由马来酸为原料化学合成酒石酸，但该过程会产生包括L(+)形式的酒石酸和D(+)形式的酒石酸的外消旋产物。在食品中，只批准使用L(+)形式的酒石酸，而D(+)形式的酒石酸被认为有害人体健康。

在酒类发酵中，L(+)-酒石酸是一种自然产生的副产物，但各年这种化合物的供应量不定，因为它很大程度上要取决于气候变化。

利用顺式环氧琥珀酸水解酶酶促水解顺式环氧琥珀酸可以只得到L(+)形式的酒石酸。因此这种生物转化可以作为生产L(+)-酒石酸的一种有价值的替代方法。

工艺现状

Rink等人(生物的化学杂志272(23)(1997年6月6日))描述了分离自放射形土壤杆菌AD1菌株的环氧化物水解酶的一级结构和催化机制。

Murdiyatmo等人(生物化学杂志284，pp．87-93(1992年5月))描述了分离自洋葱假单胞菌MBA4的2-卤代酸-卤化物水解酶-IVa的分子生物学。

Mischitz等人(生物技术快讯，No．17(9)，pp．893-898(1995))描述了从一株红球菌中分离一种高度对映体选择性的环氧化物水解酶，该酶分子量为33-35000kD并得自凝胶过滤层析SDS page。这篇文献报道了该环氧化物水解酶的最适温度为30℃。但该文没有描述此酶的氨基酸序列和编码此酶的可能核苷酸序列。

Yamagishi和Cho(纽约科学院年报Vol．799，pp．784-785(1996))描述了使用恶臭假单胞菌MCI3037菌株由顺式环氧琥珀酸生产酒石酸的酶学制备方法。

日本专利申请JP-08245497报道了制备酒石酸的类似方法，是用假单胞菌微生物的培养物来处理顺式环氧酒石酸。

发明概述

本发明涉及得自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，优选保藏号为LMGP-18079的菌株的分离并纯化的编码环氧化物水解酶的核苷酸序列。

根据本发明，所述核苷酸序列(基因组DNA、cDNA、RNA)与下文描述的序列SEQ ID NO 5有50％以上的同源性，优选70％以上的同源性，更优选90％以上的同源性。

根据本发明的优选实施方案，所述分离并纯化的核苷酸序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO 5或其编码具有环氧化物水解酶活性的肽的部分。

“核苷酸序列SEQ ID NO 5的部分”是指所述序列SEQ ID NO 5的一个片段，它有该核苷酸序列中的100多个核苷酸并编码特征在于环氧化物水解酶活性的蛋白质，此活性与完整氨基酸序列SEQ ID NO 6的环氧化物水解酶活性类似。

优选地，所述部分的环氧化物水解酶酶活性是氨基酸序列SEQ ID NO 6的环氧化物水解酶酶活性的80％以上，优选具有与SEQ ID NO 6对应的任何氨基酸序列对应的环氧化物水解酶酶活性。

本发明的另一个方面涉及一种重组核苷酸序列，它包含与本发明的以及上述的核苷酸序列可操纵地连接的一个或多个相邻调控序列，优选来源于同源微生物的调控序列。

但所述相邻调控序列也可能来源于异源的微生物。

这些相邻调控序列是一些特定序列，比如启动子、分泌和终止信号序列。

本发明的另一个方面涉及载体，它包含本发明的核苷酸序列，后者可能与一个或多个来源于同源或异源微生物的相邻调控序列可操纵地连接。

“载体”是指可用于将核苷酸序列(通过转导或转染)导入细胞的任何生化构建体。较有利的是，本发明的载体选自质粒、病毒、噬菌粒、脂质体、阳离子泡囊或其混合物。所述载体可以已包含一个或多个上述相邻调控序列。

优选地，所述载体是保藏号为LMBP-3666的质粒。

本发明还涉及宿主细胞，优选用上述本发明的核苷酸序列或载体转化的重组宿主细胞。

“用本发明的核苷酸序列或载体转化的宿主细胞”是指这样一个细胞，它含有导入其中的所述核苷酸序列或所述载体，但不是天然含有该核苷酸序列或载体。

优选地，该宿主细胞还能表达所述核苷酸序列或载体并能有利地产生由该核苷酸序列或载体所编码的氨基酸序列。本发明的分离并纯化的核苷酸序列可以整合到所选宿主细胞的基因组上或以宿主细胞中的附加型载体的形式存在。

较有利的是，本发明的重组宿主细胞选自微生物群体，优选细菌或真菌，包括酵母。

优选地，将所述重组宿主细胞修饰以便高水平表达环氧化物水解酶。

优选地，通过使用能引导本发明的核苷酸序列在重组宿主细胞中过量表达的相邻调控序列来实现高水平表达。

本发明的另一个方面涉及由分离并纯化的核苷酸序列编码和／或由本发明的重组宿主细胞表达的分离并纯化的(从可能的杂质中)环氧化物水解酶氨基酸序列。

本发明的分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列的特性在于，其有利的pH活性曲线为pH在7．0和10之间时，优选pH在7．5和9．5之间，酶活性极高(是最佳酶活性的80％以上)(见图5)。

较有利的是，所述分离并纯化的环氧化物水解酶分子量在26-30kD之间，优选分子量约为28kD(理论分子量为28，136kD)。

所述环氧化物水解酶氨基酸序列或肽是由本发明的重组宿主细胞在胞外或胞内表达和／或分泌的。

根据本发明的优选实施方案，分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于50％，优选高于70％，更优选高于90％。

根据本发明的另一个优选实施方案，分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列或该氨基酸序列的一小部分(多于50个氨基酸，优选多于100个氨基酸)，此序列至少有完整SEQ ID NO 6氨基酸序列的环氧化物水解酶80％以上的活性，优选95％以上的酶活性。换句话说，本发明的已分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列可以被部分地缺失而保持其酶活，活性可由本领域技术人员所熟知的方法测量。所述分离并纯化的环氧化物水解酶或其部分分子量小于30kD，优选约为28kD或更低的分子量。

通过酶学检测(该方法对于本发明并不重要)，比如在L(+)酒石酸中水解顺式环氧琥珀酸来鉴定目的环氧化物水解酶。将微生物培养在合适的培养基中以产生目的酶来进行检测(例如，通过顺式环氧琥珀酸进行诱导)。对完整细胞或培养基分别检测酶活性。

一旦鉴定到环氧化物水解酶，可以在合适的培养基中培养自然产生该酶的微生物或本发明的重组细胞，诱导其产生目的酶(环氧化物水解酶)，采用已知方法比如柱层析来分离所需环氧化物水解酶，然后确定纯化过的该酶氨基酸序列的“活性部分”，这样可以得到编码该环氧化物水解酶的DNA序列。

从提纯环氧化物水解酶的微生物的基因文库中获得编码此酶的DNA序列。

根据本发明，由以上确定的氨基酸序列的一部分得到寡核苷酸探针。用该寡核苷酸探针筛选提纯目的环氧化物水解酶的微生物的部分基因文库。得到一个作为质粒载体pBlueScript SK(+)中的***片段、包含环氧化物水解酶的编码序列的8kb BamHⅠ-EcoRⅠ基因组DNA片段。所得到的质粒被命名为pREHBE。

用限制酶SphⅠ和XhoⅠ消化并***到质粒载体pBlueScript SK(+)中的适当限制位点，使质粒pREHBE的***片段大小缩小到1．4kb。此时得到的质粒被命名为pREHXS并(在E．coli DH10B中)保藏于LMBP(BCCM／LMBP质粒保藏中心，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Gent，K．L．Ledenganckstraat，35，B-9000 Gent)，保藏号为LMBP-3666。利用本领域技术人员熟知的技术经手工测序来确定***片段的全部序列。

如上所述的表达构建体可以在E．coli宿主中表达。根据本发明，在合适的培养基中(如LB培养基)培养所述含有质粒pREHXS的E．coli宿主，培养基中加入合适的抗生素以保证质粒持续存在于宿主细胞中，然后收集细胞并测定环氧化物水解酶的酶活力。本发明的范围并不将环氧化物水解酶基因的表达局限于E．coli。根据本发明，较为有利的是，在细菌或真菌，包括酵母中表达编码环氧化物水解酶的DNA片段。为了使目的基因能在这些宿主中表达，可最终将编码环氧化物水解酶的DNA序列与允许其在所选宿主中(过量)表达的DNA序列(如启动子、终止子、UAS等序列)可操纵地连接。

优选将编码环氧化物水解酶的DNA序列进行修饰以便使环氧化物水解酶分泌(细胞外表达)到宿主细胞培养基中。这类修饰通常是添加一段编码能被所选宿主的分泌机构识别的前导序列的DNA序列，以便在培养基中回收环氧化物水解酶。

本发明还提供了用于培养所选表达环氧化物水解酶的宿主的条件(培养基、温度、…)。

本发明的最后一个方面涉及本发明的重组宿主细胞或者本发明的分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列用于水解环氧化物的用途，优选水解顺式环氧琥珀酸。

较为有利的是，可以用本发明的新酶水解环氧化物底物中的环氧化物环。已知的环氧化物的例子有苯乙烯环氧化物、辛烯环氧化物、萘环氧化物、菲环氧化物、苯环氧化物、estroxide、雄烯氧化物、表氯醇，和顺式环氧琥珀酸。优选地，本发明的环氧化物水解酶能用来水解顺式环氧琥珀酸，但不能水解环氧化物底物表氯醇。

本发明的酶能以几种方式使用：可培养后直接使用经过或不经通透化处理的细胞，酶也可以以细胞抽提物的形式使用(即经一步或多步离心和抽提步骤处理的宿主细胞部分)或以纯化蛋白质的形式使用。上述任何一种形式都可以和上述任何一种形式的另一种酶联合使用。此外，可以从宿主细胞的培养基中回收该酶，所述细胞能够表达该环氧化物水解酶并将其分泌到胞外。在这种情况下，酶制品能以粗制品或者以部分或完全纯化的制品形式与或不与和一种或多种其它酶结合使用。

可以将完整细胞、细胞提取物、无细胞提取物或纯化的环氧化物水解酶固定化(用常规方法固定在固相支持物如层析柱上)，以便使环氧化物底物能连续水解或者使酶制品(完整细胞、细胞提取物、无细胞提取物，完全或部分纯化的环氧化物水解酶等)能循环使用。

参考附图，在下列实施例中将进一步详细描述本发明，所述实施例并非以任何方式限定本发明要求保护的范围。

附图简述

图1显示了从MonoQ柱上洗脱的各组份的含量及这些组份相应的活性。

图2显示了使用基于顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列的寡核苷酸来探查紫红红球菌LMGP-18079全部基因组DNA的典型Southern印迹实验的结果。

图3显示了紫红红球菌LMGP-18079顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其旁侧区域的核苷酸序列。

图4显示了由紫红红球菌LMGP-18079顺式环氧琥珀酸水解酶基因序列推测的氨基酸序列。通过对该酶进行化学测序得出的氨基酸序列加有下划线。

图5代表本发明酶的相对酶活性。

实施例

实施例1：环氧化物水解酶的部分纯化

菌株

将紫红红球菌LMGP-18079常规保存于含有0．4％葡萄糖、0．4％酵母提取物、1％麦芽提取物和2％琼脂的琼脂斜面上。

顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定

于37℃、在终体积为9．3ml的体系中进行酶促反应，体系中包括以下成分：0．7ml 0．1N Tris．HCl缓冲液(pH 8．0)，2．6ml 1．14％ Triton-X100溶液，5．0ml 30％顺式环氧琥珀酸钠溶液和1．0ml细胞悬浮液。用经H₃PO₄酸化到pH 2．2的水将混合物稀释100-500倍来终止反应。

于室温下在Vydac C18柱子(货号201HS3410)上，经HPLC(流速在400-600μl／min之间，样品体积为20μl)测定反应过程中形成的L-酒石酸。溶剂与稀释样品所用溶剂相同。在210nm处检测顺式环氧琥珀酸和酒石酸。

用1g干细胞在一天中形成的L(+)-酒石酸的数量表示酶活力。

为了对含有酶的可溶性级分进行快速定性分析，酶反应是在37℃，在终体积为1ml的溶液(10mM Tris-HCl(pH 8．0)，0．5ml顺式环氧琥珀酸钠(30％)为底物)中进行的。

菌株培养以及顺式环氧琥珀酸水解酶活力的诱导

标准培养基含有以下组分(g／l)：丙二醇10、酵母抽提物2、KH₂PO₄ 2、Na₂HPO₄·2H₂O 2．2、(NH₄)₂SO₄ 3、CaCl₂·2H₂O 0．03、MnSO₄·H₂O 0．003，MgSO₄·7H₂O 0．1、FeSO₄·7H₂O 0．01将pH调至7．0并于30℃下振荡温育培养物。24小时后添加10g／l的顺式环氧琥珀酸来诱导顺式环氧琥珀酸水解酶活性。离心收集细胞并于-20℃贮存待用。

顺式环氧琥珀酸水解酶的部分纯化

1．无细胞提取物的获得

将约26克的冻存细胞悬浮于含有5mM DTT、0．5mM PMSF、5mM EDTA和2μg／ml胃蛋白酶抑制剂的35ml磷酸钾缓冲液(50mM，pH7．2)中。

在液态CO₂的冷却下，用Braun MSK匀浆机通过玻璃珠破碎细胞。

首先在Sorvall RC5B离心机的SS34转头中以7000 rpm离心匀浆液。用50ml的冷缓冲液重新抽提所得沉淀并再次离心。然后在相同的转头中于4℃，16000rpm下将两次合并的上清液离心20分钟。最后一步是使用Beckman L8-70离心机的A641转头，转速38000rpm离心60分钟，从而得到无细胞提取物。

于4℃将提取物(138ml)对含有1M(NH₄)₂SO₄、2．5mM DTT和2．5mM EDTA的2升钾缓冲液(50mM，pH7．2)透析过夜。

2．Phenyl-Sepharose上层析

透析后，将提取物上样到用透析缓冲液平衡过的30ml Phenyl Sepharose(Pharmacia Biotech)柱上。用相同的缓冲液洗涤后，在相同的缓冲液中用240ml的1M-OM(NH₄)₂SO₄线性梯度在3ml／min下洗脱结合的蛋白质。收集3ml级分并检测其顺式环氧琥珀酸水解酶活力。

将活性级分合并，并对含有2．5mM EDTA和2．5mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH7．2)透析。

3．Q-Sepharose上层析

将步骤2得到的透析液上样到用透析缓冲液平衡过的10ml Q-Sepharose(Pharmacia Biotech)柱上。经相同的缓冲液洗涤后，在相同的缓冲液中用80ml的0-0．5M NaCl线性梯度在1ml／min下从柱上洗脱结合的蛋白质。收集1ml级分并检测其顺式环氧琥珀酸水解酶活力。

4．MonoQ上层析

将步骤3中的活性级分合并，取其中大约1／10用含有2．5mM EDTA和2．5mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH7．2)稀释2．7倍，并上样到MonoQ HR5／5柱(Pharmacia Biotech)上。在相同的缓冲液中用0-0．5M NaCl线性梯度从柱上洗脱蛋白质，流速为0．25ml／min。收集0．25ml的级分并检测其顺式环氧琥珀酸水解酶活力。

5．SDS-PAGE上电泳

将从MonoQ柱上收集的25μl级分加入12．5％的丙烯酰胺SDS凝胶(Mini-PROTEAN Ⅱ Electrophoresis system-Bio-Rad)。用考马斯兰染色将凝胶上的蛋白质显迹。

实施例2：顺式环氧琥珀酸水解酶氨基酸序列的测定

在经SDS-PAGE电泳和PVDF Immobilon-P膜(Millipore)上进行电印迹后，依照一般程序对蛋白质的氨基端测序。测序使用偶联HPLC 120A分析仪的477A蛋白自动测序仪(Applied Biosystem)。

为了测定内部片段的序列，首先在膜上用胰蛋白酶消化蛋白质。在HPLC上经反相层析来分离所得肽，然后如上所述进行氨基端测序。

得到以下序列：

氨基末端： MQLNNANDNTQF SEQ ID NO 1

第一内部肽： SWPDVPSGLEQLR SEQ ID NO 2

第二内部肽： RPLEYGPTGR SEQ ID NO 3

实施例3：顺式环氧琥珀酸水解酶基因的鉴定

1．设计寡核苷酸探针

根据蛋白质的氨基端序列(SEQ ID NO 1)，合成地高辛配基(digoxigenine)标记的寡核苷酸。该寡核苷酸序列如下：

5′AAYAAYGCNAAYGAYAAYAC 3′ SEQ ID NO 4

Y代表C或T，N代表4种碱基中的任何一种碱基。

2．寡核苷酸与紫红红球菌总DNA的杂交

2．1分离基因组DNA

将紫红红球菌LMGP-18079菌株在200ml LBroth中于37℃培养过夜。离心收集后，细胞在80℃用，TE缓冲液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，pH8．0)洗涤30分钟，再次离心，重新悬浮于含120mg溶菌酶的15ml，TSE缓冲液(Tris-HCl 50mM、蔗糖200mM、EDTA 1mM，pH8．0)中，并于37℃保温2小时，然后加入1．5ml 250mM的EDTA(pH8．0)。混合物继续保温60分钟。加入1ml STE(SDS 20％、Tris-HCl50mM、EDTA 20mM，pH8．0)之后，将混合物于55℃保温30分钟。

经酚和酚-氯仿连续抽提以及乙醇沉淀后从杂质中分离出DNA。

2．2 Southern印迹

将大约6μg紫红红球菌DNA用不同的限制酶(EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、PstⅠ)或这些酶的组合(EcoRⅠ+BamHⅠ、EcoRⅠ+PstⅠ、EcoRⅠ+SalⅠ、BamHⅠ+SalⅠ、BamHⅠ+PstⅠ、SalⅠ+PstⅠ)进行消化。将样品加到20×20cm的1％琼脂糖凝胶上，在TAE缓冲液(Tris-乙酸40 mM，EDTA 1mM，pH8．0)中40伏走电泳过夜。

DNA迁移后，按生产商所推荐的在Hybond N+膜(Amersham)上处理并转移凝胶。杂交缓冲液和检测条件依照地高辛配基检测试剂盒(Boehringer Mannheim)的推荐条件。于42℃过夜进行预杂交。杂交于42℃进行6小时。洗涤条件如下：室温下用2×SSC，0．1％ SDS洗2×5分钟，用0．5×SSC，0．1％SDS于42℃洗2×15分钟，用0．1×SSC，0．1％SDS于42℃洗涤2×15分钟。

典型的Southern印迹实验结果见图2。

实施例4：顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆

1．构建部分基因文库

约15μg紫红红球菌的总染色体DNA经限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化。用同样的酶消化质粒pBlueScript SK(+)(Stratagene)。消化过的DNA在TAE缓冲液(见上述)中的1％琼脂糖上分离。通过分析Southern印迹的结果(1600-2200bp)确定出长度合适的琼脂糖片段，切下相应的凝胶条。使用QIAEX Ⅱ凝胶抽提试剂盒(QIAGEN)抽提琼脂糖块中的DNA。在质粒载体和红球菌DNA片段之间进行连接，用连接混合物经电穿孔法的标准操作(Bio-Rad Gene Pulser Ⅱ)来转化大肠杆菌DH10B。

2．顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆

2．1不完整的顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆

将得自步骤1的转化子合并为十个克隆一组。从各组中提取质粒DNA。用限制酶BamHⅠ和salⅠ消化纯化过的DNA并在琼脂糖凝胶中进行电泳以便如实施例2所述进行Southern印迹。

依照同样方法再对阳性组中的各个克隆进行分析。

得到一个阳性克隆(pREHBS)并对其做进一步的分析。它含有大于期望值(约6．8kb)的***片段，是由紫红红球菌菌株染色体DNA经部分消化得到的。

经限制酶消化并连接，使***片段缩小到长度大约1800bp(对应预期的BamHⅠ-SalⅠ片段)。对该***片段的两端进行DNA测序表明它含有对应于筛选文库所用的寡核苷酸的序列。但好象丢失了基因的3′端。

2．2获得完整的基因

根据1中描述的方法来构建部分基因文库，但要使用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ。此文库用同样的寡核苷酸进行筛选。对一个阳性克隆(pREHBE)的BamHⅠ端进行DNA测序以确定其与BamHⅠ-SalⅠ片段的重叠。

pREHBE***片段的大小约为8kb。此***片段的限制性酶切分析显示基因位于1．4kb的SphⅠ-XhoⅠ片段。为了克隆此片段，质粒pREHBE首先用SphⅠ消化，用DNA聚合酶的Klenow片段处理并用XhoⅠ消化。将目的片段经琼脂糖凝胶电泳纯化并通过连接***到pBluescriptSK(+)中，后者已经用BamHⅠ消化、DNA聚合酶的Klenow片段处理并经XhoⅠ消化。得到的质粒命名为pREHXS并加以保藏(在大肠杆菌DH10B中)，保藏号为LMBP-3666。

实施例5：鉴定顺式环氧琥珀酸基因

使用双脱氧核苷酸链终止法(Sanger，F．，Nickelen，S．，Coulson，A．R．，美国自然科学院院报74：5463，(1977))手工测定pREHXS中***片段的DNA序列。测序反应中用特异寡核苷酸作为引物。用PC／GENE程序进行计算机分析。

测定了完整的核苷酸序列，见图3(SEQ ID NO 5)。

所得序列包含1366 bp，5’非编码区有67bp，3’非编码区有543bp。由编码序列得出的多肽长度为253个氨基酸，预期分子量为28kDa。顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列见图4(SEQ ID NO 6)。实施例2中测定出的氨基酸序列片段也存在于此序列中。SEQ ID NO 1对应1到12位氨基酸，SEQ ID NO 2对应112到124位氨基酸，SEQ ID NO 3对应209到218位氨基酸。

实施例6：在大肠杆菌中表达顺式环氧琥珀酸水解酶基因

将含有质粒pREHXS的大肠杆菌DH10B菌株在添加100μg／ml氨苄青霉素的2×LB培养基(酵母提取物1％、Bacto-胰化蛋白胨2％、氯化钠2％)中培养过夜。用含有不带***片段的pBluescriptSK(+)质粒的相同菌株作为对照。

使用实施例1中描述的方法测定从上述两种培养物中收集到的细胞中的顺式环氧琥珀酸水解酶活性。在对照细胞中测不到活性。在表达顺式环氧琥珀酸基因的菌株中活性约为150单位。

实施例7：制备L-酒石酸

1．酶的制备

将含有质粒pREHXS的大肠杆菌菌株在添加100μg／ml氨苄青霉素的100ml LB培养基中于35℃，搅拌培养8小时。将培养物转移到1升相同培养基中并再培养8小时。用所得培养物接种15升Braun Biostat E发酵罐。24小时后，停止培养并于4℃，10000g离心10分钟收集细胞。细胞用10mM的磷酸钾缓冲液(pH7．0)洗涤一次，并再次离心。最后将细胞悬浮于一体积的缓冲液中并于-20℃贮存待用，或者将其用冻干法干燥。也可以用喷雾干燥法来干燥细胞。优选将细胞储存于密闭的袋子或容器中以防潮。储存在更低温度和真空下有助于延长干细胞的保存期。周围温度为25℃时，干细胞在密封的聚乙烯袋子中贮存三个月后能保持原活力的90％。

在pH高于7时，优选在pH 7．0-10之间，更优选在pH 7．5-9．5之间有利地保持恒定的酶活性。

2．顺式环氧琥珀酸的生物转化

在15升Braun Biostat E发酵罐中进行生物转化。将10升20％的顺式环氧琥珀酸与50g干细胞以及625ml 2％(w／v)的Triton-X100溶液混合。用NaOH或HCl使pH维持恒定在8．0。混合物于37℃搅拌下(200rpm)保温40小时。通过HPLC来跟踪顺式环氧琥珀酸的消耗和L-酒石酸的合成(见实施例1)。

根据布达佩斯条约将微生物紫红红球菌保藏在BCCM／LMG质粒保藏中心，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Gent，K．L．Ledenganckstraat，35，B-9000 Gent，保藏号为LMGP-18079。将包含携有本发明序列的质粒的大肠杆菌保藏在BCCM／LMBP质粒保藏中心，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Gent，K．L．Ledenganckstraat，35，B-9000 Gent，保藏号为LMBP-3666。

序列表(1)一般资料：

(ⅰ)申请人：

(A)名称：PURATOS N．V．

(B)街道：Industrialaan 25

(C)城市：Groot-Bijgaarden

(E)国家：比利时

(F)邮政编码(ZIP)：B-1702

(ⅱ)发明题目：环氧化物水解酶

(ⅲ)序列数：11

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作***：PC-DOS／MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1．0，Version #1．25(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：12个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅲ)假设的：非

(ⅲ)反义：非

(ⅴ)片段类型：氨基端

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：

Met Gln Leu Asn Asn Ala Asn Asp Asn Thr Gln Phe

1 5 10

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅲ)假设的：非

(ⅲ)反义：非

(ⅴ)片段类型：内部

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：

Ser Trp Pro Asp Val Pro Ser Gly Leu Glu Gln Leu Arg

1 5 10

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅲ)假设的：非

(ⅲ)反义：非

(ⅴ)片段类型：内部

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3：

Arg Pro Leu Glu Tyr Gly Pro Thr Gly Arg

1 5 10

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假设的：是

(ⅲ)反义：非

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4：

AAYAAYGCNA AYGAYAAYAC 20

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1366个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假设的：非

(ⅲ)反义：非

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：5：

GTCTTATCCT GGTAGCGCCC GTAATTTCGT GGGCTATCTT CGTTCTTCCG AGTGGATTGT 60

GAGCACAATG CAACTGAACA ATGCGAACGA CAACACGCAG TTCCGGGCCC TGCTTTTCGA 120

CGTGCAGGGG ACTCTGACAG ATTTCCGTTC CACACTCATC GAGCACGGCT TATCGATTCT 180

CGGAGACAGA GTGGATCGAG AACTCTGGGA GGAATTGGTC GACCAATGGC GCGGCTGCTA 240

TCGAGACGAG CTCGATTCCT TGGTCAAACA GGAGAAATGG CGCTCGGTCC GCGCCGTGTA 300

CCGAGATTCT CTTATCAATC TTCTCGCAAA ATTCTCTGAC AGTTTCTGCG CCACCTCGGC 360

CGAAGTGGAA TTGCTGACCG ATGGTTGGGA ACGTCTTCGG TCGTGGCCGG ACGTCCCCTC 420

TGGATTGGAA CAGCTGCGGT CTAAGTACCT CGTCGCGGCA CTGACGAATG CGGACTTTTC 480

CCATCGTC AACGTCGGGC GTAGCGCCAA ACTGCAATGG GACGCTGTTC TTTCAGCTCA 540

ACTCTTTGGA GCCTACAAGC CCCACCGGTC AACATATGAG GGAGCCGCGA CACTCCTGGG 600

TATCGCTCCG TCAGAGATCC TCATGGTCGC CTCCCATGCA TACGATCTCG AAGCGGCGCG 660

GGAAGTGGGA GCCGGCACAG CGTACGTCAG ACGGCCACTG GAATACGGAC CGACGGGGCG 720

AACCGAGGAC GTTCCCGATG GACGTTTCGA TTTCTTGGTC GACAGCATCA GTGAACTGGC 780

TGATCAGCTG GGCTGCCCAC GACTCGGTGG AACTGCCGGT ATCGATTGAC ATCGACCGGC 840

GGTTCCACGC GTCCCTTGTT TTCGGTGCCT GCATTCCCCG TGACGGCAAT TCAGTCACGG 900

GGAATGCAGG CTCTGCTCTG TGCCCAGGAT TTCAGGCGCT TCCCAGGCAA CTGGAGTTTT 960

TGCAGCGTAG AGGCGCGCTT CGTTCATGAG TTCCTGTGCG GGGGGTGTGA GATGACTCCG 1020

CCTACAGACA GCGGCGATGT GAAGGTAGGA CTCCGGGACG AACGCGGTGC ACGGTGGCGC l080

CGACCTGCCG TGCCGATGGC GCCCAGGAGG ACGGCATGAC AGCCTGTCCG AATCCGCTGA 1140

GCACCATCGG CAGGATCGAG GTCCGGTGGG CAACTTCGGC GACGATGGTG GCTTCGACAC 1200

CGCTGGCGAG AACCTCGTCG ACCAGCGTTC GCATCAATGA TCCTCGCTGG GAGACAATCA 1260

ATCGGAAGCC GGACAGTTCC GACCGGTAAA TTTCCGGACG GTCCGGCGTC TCTGACCCGG 1320

GCCCGGACAT GAGGATCAGC GGTTGACTTT CCAGTGCCAC AACCTC 1366

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：253个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)假设的：非

(ⅲ)反义：非

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：6：

Met Gln Leu Asn Asn Ala Asn Asp Asn Thr Gln Phe Arg Ala Leu Leu

1 5 10 15

Phe Asp Val Gln Gly Thr Leu Thr Asp Phe Arg Ser Thr Leu Ile Glu

20 25 30

His Gly Leu Ser Ile Leu Gly Asp Arg Val Asp Arg Glu Leu Trp Glu

35 40 45

Glu Leu Val Asp Gln Trp Arg Gly Cys Tyr Arg Asp Glu Leu Asp Ser

50 55 60

Leu Val Lys Gln Glu Lys Trp Arg Ser Val Arg Ala Val Tyr Arg Asp

65 70 75 80

Ser Leu Ile Asn Leu Leu Ala Lys Phe Ser Asp Ser Phe Cys Ala Thr

85 90 95

Ser Ala Glu Val Glu Leu Leu Thr Asp Gly Trp Glu Arg Leu Arg Ser

100 105 110

Trp Pro Asp Val Pro Ser Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ser Lys Tyr Leu

115 120 125

Val Ala Ala Leu Thr Asn Ala Asp Phe Ser Ala Ile Val Asn Val Gly

130 135 140

Arg Ser Ala Lys Leu Gln Trp Asp Ala Val Leu Ser Ala Gln Leu Phe

145 150 155 160

Gly Ala Tyr Lys Pro His Arg Ser Thr Tyr Glu Gly Ala Ala Thr Leu

165 170 175

Leu Gly Ile Ala Pro Ser Glu Ile Leu Met Val Ala Ser His Ala Tyr

180 185 190

Asp Leu Glu Ala Ala Arg Glu Val Gly Ala Gly Thr Ala Tyr Val Arg

195 200 205

Arg Pro Leu Glu Tyr Gly Pro Thr Gly Arg Thr Glu Asp Val Pro Asp

210 215 220

Gly Arg Phe Asp Phe Leu Val Asp Ser Ile Ser Glu Leu Ala Asp Gln

225 230 235 240

Leu Gly Cys Pro Arg Leu Gly Gly Thr Ala Gly Ile Asp

245 250

(2)SEQ ID NO：7的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：7：

CTGCAGAG GAGGAGCACA ATGCAACTG 29

(2)SEQ ID NO：8的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：8：

AAGAATTCCT GGGCACAGAG C 21

(2)SEQ ID NO：9的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：9：

GGGATGCATA GGAGGTAACA TATGTTTAAG 30

(2)SEQ ID NO：10的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：10：

GGGAATTCAA TGGAAGGTGC GTTATAACG 29

(2)SEQ ID NO：11的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：11：

AACTGCAGCA ATGCAACTGA ACAATGCG 28

Claims

1．一种得自红球菌、编码环氧化物水解酶的分离并纯化的核苷酸序列。

2．权利要求1的核苷酸序列，它分离自紫红红球菌，优选分离自保藏号为LMGP-18079的紫红红球菌。

3．权利要求1或2的核苷酸序列，与核苷酸序列SEQ ID NO 5的同源性高于50％。

4．上述权利要求任何一项的核苷酸序列，与核苷酸序列SEQ ID NO 5的同源性高于70％。

5．上述权利要求任何一项的核苷酸序列，与核苷酸序列SEQ ID NO 5的同源性高于90％。

6．一种分离并纯化的核苷酸序列，对应于核苷酸序列SEQ ID NO 5或其编码具有环氧化物水解酶活力的肽的一部分。

7．一种重组核苷酸序列，包含与上述权利要求任何一项的核苷酸序列可操纵地连接的一个或多个相邻调控序列。

8．权利要求7的重组核苷酸序列，包含一个或多个来源于同源微生物的相邻调控序列。

9．含有上述权利要求任何一项的核苷酸序列的载体。

10．权利要求9的载体，它是掺入大肠杆菌中，保藏号为LMBP-3666的质粒。

11．用权利要求1-8任何一项的核苷酸序列或权利要求9或10的载体转化的重组宿主细胞。

12．权利要求11的重组宿主细胞，选自细菌或真菌，含括酵母。

13．由权利要求1-8任何一项的核苷酸序列编码的已分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列，其分子量小于30kD。

14．权利要求13的环氧化物水解酶氨基酸序列，其特征在于pH高于7．0时表现最佳酶活力，在pH 7．5-9．5之间达到最佳酶活力的80％。

15．权利要求13或14的环氧化物水解酶氨基酸序列，其特征在于它是由权利要求11或12的重组宿主细胞胞内表达的。

16．权利要求13或14的环氧化物水解酶氨基酸序列，其特征在于它是由权利要求11或12的重组宿主细胞胞外表达的。

17．权利要求13-16任何一项的环氧化物水解酶氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于50％。

18．权利要求13-17任何一项的环氧化物水解酶氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于70％。

19．权利要求13-18任何一项的环氧化物水解酶氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于90％。

20．一种已分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列，其分子量小于30kD，具有氨基酸序列SEQ ID NO 6或其具有环氧化物水解酶活力的部分。

21．一种固相支持物，它固定一种选自权利要求11或12的细胞、权利要求11或12的细胞的提取物和／或权利要求13-20任何一项的已分离并纯化的环氧化物水解酶氨基酸序列的成分。

22．权利要求11或12的重组宿主细胞或权利要求13-20任何一项的环氧化物水解酶氨基酸序列或权利要求21的固相支持物用于水解环氧化物的用途。

23．权利要求22的用途，用于顺式环氧琥珀酸的水解。