ES2260851T3 - Epoxido hidrolasa. - Google Patents
Epoxido hidrolasa.Info
- Publication number
- ES2260851T3 ES2260851T3 ES98951123T ES98951123T ES2260851T3 ES 2260851 T3 ES2260851 T3 ES 2260851T3 ES 98951123 T ES98951123 T ES 98951123T ES 98951123 T ES98951123 T ES 98951123T ES 2260851 T3 ES2260851 T3 ES 2260851T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- isolated
- sequence
- nucleotide sequence
- purified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
Abstract
Epóxido hidrolasa aislada y purificada que comprende una epóxido hidrolasa inferior a 30 kDa con una secuencia aminoácida que presenta una homología superior al 70% con la secuencia aminoácida SEC ID nº 6, presentando dicha epóxido hidrolasa el 80% de su actividad enzimática óptima a un pH comprendido entre 7, 5 y 9, 5.
Description
Epóxido hidrolasa.
La presente invención se refiere a secuencias
nucleotídicas epóxido hidrolasa y a secuencias aminoácidas, así como
a su utilización en la hidrólisis enantiomérica de epóxidos.
Los epóxidos se utilizan como ladrillos quirales
de construcción en la síntesis orgánica de compuestos químicos
finos, especialmente de compuestos enantioméricamente puros. Son
moléculas reactivas, debido a que su anillo puede abrirse con
facilidad, proporcionando un amplio abanico de productos. Por ello,
ocupan un lugar importante entre los precursores de fármacos y
compuestos químicos especializados. Existen algunos procedimientos
químicos para su preparación a partir de precursores ópticamente
activos, pero no se conocen síntesis asimétricas eficientes que
impliquen procedimientos de asimetrización o de resolución, con la
excepción del procedimiento de epoxidación de Sharpless, que se
encuentra limitado a los alcoholes alílicos (Katsuki et al.,
J. Am. Chem. Soc. 102, página 5974, (1980). También se ha
investigado la utilización de reacciones biológicas para llevar a
cabo la síntesis de epóxidos (ver, por ejemplo, la revisión por de
Bont, J.A.M., Tetrahedron: Asymmetry 4, p. 1331,
(1993).
(1993).
Otros epóxidos, tales como los epóxidos
alifáticos halogenados, son contaminantes potenciales que se liberan
al medio ambiente desde diversas fuentes industriales o que pueden
formarse durante la transformación de otros compuestos químicos
sintéticos. Por ejemplo, la epiclorohidrina
(3-cloro-1,2-epoxipropano)
es un compuesto químico industrial utilizado ampliamente que está
bien reconocido como compuesto mutagénico y carcinogénico.
Las epóxido hidrolasas (EC3.3.2.3.) son enzimas
hidrolíticos que catalizan la apertura de un anillo epóxido,
convirtiendo su sustrato en el diol correspondiente. Una de las
propiedades más interesantes es que generalmente son altamente
regioselectivos y enantioselectivos, permitiendo la preparación de
enantiómeros puros.
Se han estudiado las epóxido hidrolasas en una
diversidad de organismos. Los mejor estudiados son aquéllas de los
mamíferos. Se encuentran principalmente en el hígado, los
testículos, los riñones, los ovarios y los pulmones. Han sido
intensivamente caracterizados debido a su implicación en el
metabolismo de los organismos xenobióticos (destoxificación de
intermediarios citotóxicos, mutagénicos y carcinogénicos) (Seidegard
et al., Biochemica et Biophysica Acta 695, p. 251,
1983).
Las epóxido hidrolasas también han sido
descritas en otros eucariotas, tales como plantas e insectos.
Debido a su baja disponibilidad, los enzimas de
dichas fuentes no resultan de valor práctico para procedimientos a
gran escala. El mundo microbiano representa una alternativa adecuada
debido a la posibilidad de cultivar microorganismos a gran escala.
Se ha investigado la utilización de células completas para llevar a
cabo la biotransformación de epóxidos. Ya se han descrito epóxido
hidrolasas microbianas en una diversidad de microorganismos. A
continuación se resumen algunos ejemplos de estas descripciones:
- -
- Aspergillus niger LPC521 y Beauvaria sulfurescens ATCC7159 poseen epóxido hidrolasas enantiocomplementarias que hidrolizan las dos formas racémicas del epóxido de estireno (Pedragosa-Moreau et al., J. Org. Chem. 58, p. 5533, (1993).
- -
- Diplodia gossipina ATCC16391 cataliza la resolución cinética del óxido de indeno racémico en 1(S),2(R) óxido de indeno (Zhang et al., J. Ferment. Bioeng. 80, p. 244, (1995).
- -
- Se transforma la epiclorohidrina (3-cloro-1,2-epoxipropano) en (R)-3-cloro-2-propanol mediante una epóxido hidrolasa caracterizada en la cepa N-1074 de Corynebacterium sp (Nakamura et al., J. Bact. 174, p. 7613, (1992). Se ha purificado un enzima similar de Pseudomonas sp. cepa AD1 (Jacobs et al., Eur. J. Biochem. 202, p. 1217, (1991).
- -
- Se ha aislado una epóxido hidrolasa que cataliza la hidrólisis asimétrica de diversos epóxidos racémicos en epóxidos quirales y dioles a partir de Rhodococcus sp. NCIMB 11216 (Mischitz et al., Biotechnol. Lett. 17, p. 893, (1995).
- -
- Una cepa de Flavobacterium sp. es capaz de convertir el ácido trans-1-epoxisuccínico en ácido mesotartárico (Martin et al., Biochem. J. 70, p. 405, (1955).
- -
- La epóxido hidrolasa de Nocardia tartaricans cataliza la hidrólisis de cis-epoxisuccinato, proporcionando ácido L(+)-tartárico (Patents chrift DE nº 2605921). Algunos otros microorganismos podrían llevar a cabo la misma reacción, tales como Achromobacter, Alcaligenes (patente US nº 3.957.579), Acinetobacter tartarogenes, Agrobacterium aureum, Agrobacterium viscosum, Rhizobium validum, Pseudomonas sp. (offelegungsschrift DT 2619311).
Una característica común a todos dichos ejemplos
es la utilización de células completas o extractos crudos completos
de las células para llevar a cabo la reacción. El enzima puede
liberarse rompiendo las células mediante rotura física, o mediante
permeabilización de la pared celular y/o membrana celular mediante
la utilización de detergentes.
El ácido tartárico se utiliza en la industria
alimentaria para diversas aplicaciones (aditivo en bebidas gaseosas,
conservante alimentario, materia prima para la síntesis de
emulsionantes, etc.). Resulta posible sintetizar químicamente el
ácido tartárico partiendo del ácido maleico, aunque este
procedimiento proporciona un producto racémico compuesto de ácido
L(+)-tartárico y ácido
D(+)-tartárico. En los alimentos, únicamente la
forma L(+) del ácido tartárico se encuentra autorizada, ya que la
forma D(+) se considera perjudicial para la salud humana.
El ácido L(+)-tartárico se
produce naturalmente como un subproducto durante la fermentación del
vino, pero el suministro de este compuesto varía de año en año y
depende mucho del clima.
La hidrólisis enzimática del
cis-epoxisuccinato mediante una
cis-epoxisuccinato hidrolasa permite la obtención
de únicamente la forma L(+) del ácido tartárico. Esta
biotransformación representaría, de esta manera, una alternativa
valiosa para la producción de ácido
L(+)-tartárico.
Rink et al. (J. of Biological
Chemistry 272(23), (6 de junio de 1997) describen la
estructura primaria y mecanismos catalíticos de la epóxido hidrolasa
de la cepa Agrobacterium radiobacter AD1.
Murdiyatmo et al. (Biochemical
Journal vol. 284, págs. 87-93, (mayo de 1992)
describen la biología molecular de la
2-haloácido-halidohidrolasa-IVa
de Pseudomonas cepacia MBA4.
Mischitz et al. (Biotechnology
Letters nº 17(9), págs. 893-898, (1995)
describen el aislamiento de una epóxido hidrolasa altamente
enantioselectiva de una cepa de Rhodococcus sp. que presenta
un peso molecular de 33-35.000 kD y que se obtiene
por cromatografía de filtración en gel SDS-page.
Dicho documento afirma que la temperatura óptima de la epóxido
hidrolasa es de 30ºC. Sin embargo, dicho documento no describe en
ningún momento la secuencia aminoácida de dicho enzima ni la
posible secuencia nucleótida que codifica dicho enzima.
Yamagishi y Cho (Annals of New York Academy
of Sciences, vol. 799, págs. 784-785, (1996)
describen la preparación enzimática de ácido tartárico a partir del
ácido cis-epoxisuccínico por la cepa Pseudomonas
putida MCI3037.
Se describe una preparación similar de ácido
tartárico en la solicitud de patente japonesa
JP-08245497 mediante el tratamiento del ácido
cis-epoxitartárico con un cultivo de un
microorganismo Pseudomonas.
La presente invención se refiere a una secuencia
nucleótida aislada y purificada a partir de Rhodococcus
rhodochrous, preferentemente una cepa que presenta el número de
depósito LMGP-18079, que codifica una epóxido
hidrolasa.
hidrolasa.
De acuerdo con la invención, dicha secuencia
nucleótida (ADN genómico, ADNc, ARN) presenta más del 90% de
homología con la secuencia SEC ID nº 5 indicada posteriormente.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, dicha secuencia nucleótida
aislada y purificada corresponde a la secuencia nucleótida SEC ID
nº 5 o a una parte de la misma, que codifica un péptido que presenta
una actividad de epóxido hidrolasa.
La expresión "una parte de la secuencia
nucleótida SEC ID nº 5" se refiere a un fragmento de dicha
secuencia SEC ID nº 5 que presenta más de 100 nucleótidos de dicha
secuencia nucleótida y que codifica una proteína caracterizada por
una actividad enzimática de epóxido hidrolasa similar a la actividad
de epóxido hidrolasa de la secuencia aminoácida completa SEC ID nº
6.
Preferentemente, dicha parte presenta una
actividad enzimática de epóxido hidrolasa superior al 80% de la
actividad enzimática de epóxido hidrolasa de la secuencia aminoácida
SEC ID nº 6, preferentemente presenta una actividad enzimática de
epóxido hidrolasa correspondiente a la secuencia aminoácida
correspondiente a la SEC ID nº 5.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una secuencia nucleótida recombinante que comprende, ligada
operablemente a la secuencia nucleótida de acuerdo con la invención
e indicada anteriormente, una o más secuencias reguladoras
contiguas, preferentemente originadas en microorganismos
homólogos.
Sin embargo, dichas secuencias reguladoras
contiguas también pueden originarse a partir de microorganismos
heterólogos.
Estas secuencias reguladoras contiguas son
secuencias específicas, tales como promotores, secuencias de señal
de secreción y de terminación.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al vector que comprende la secuencia o secuencias nucleótidas de
acuerdo con la invención, posiblemente ligadas operablemente a una o
más secuencias reguladoras contiguas originadas de microorganismos
homólogos o de microorganismos heterólogos.
La expresión "un vector" se refiere a
cualquier constructo bioquímico que puede utilizarse para la
introducción de una secuencia nucleótida (mediante transducción o
transfección) en una célula. Ventajosamente, el vector de acuerdo
con la invención se selecciona de entre el grupo que consiste en
plásmidos, virus, fagémidos, liposomas, vesículas catiónicas o una
mezcla de las mismas. Dicho vector puede comprender ya una o más de
las secuencias reguladoras contiguas anteriormente indicadas.
Preferentemente, dicho vector es un plásmido que
presenta el número de depósito LMBP-3666.
La presente invención se refiere asimismo a la
célula huésped, preferentemente una célula huésped recombinante,
transformada con la secuencia nucleótida o el vector de acuerdo con
al invención anteriormente indicado.
La expresión "una célula huésped transformada
con la secuencia nucleótida o el vector de acuerdo con la
invención" se refiere a una célula en la que se ha incorporado
dicha secuencia nucleótida o dicho vector y que no comprende
naturalmente dicha secuencia nucleótida o dicho vector.
Preferentemente, dicha célula huésped también es
capaz de expresar dicha secuencia nucleótida o dicho vector y
permite ventajosamente la producción de una secuencia aminoácida
codificada por dicha secuencia nucleótida o dicho vector. La
secuencia nucléotida aislada y purificada de acuerdo con la
invención puede integrarse en el genoma de la célula huésped
seleccionada o encontrarse presente en un vector episómico en dicha
célula huésped.
Ventajosamente, la célula huésped recombinante
de acuerdo con la invención se selecciona de entre el grupo que
consiste en el mundo microbiano, preferentemente bacterias u hongos,
incluyendo levaduras.
Preferentemente, dicha célula huésped
recombinante se modifica para obtener una expresión del enzima
epóxido hidrolasa a nivel elevado.
Preferentemente, dicha expresión a nivel elevado
se obtiene mediante la utilización de secuencias reguladoras
contiguas capaces de regular la sobreexpresión de la secuencia
nucleótida de acuerdo con la invención en la célula huésped
recombinante.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a la secuencia aminoácida de la epóxido hidrolasa aislada y
purificada (de posibles contaminantes) codificada por la secuencia
nucleótida aislada y purificada y/o expresada por la célula huésped
recombinante de acuerdo con la invención.
La secuencia aminoácida de la epóxido hidrolasa
de acuerdo con la invención aislada y purificada también está
caracterizada por un perfil de actividad en función del pH
ventajoso, presentando una actividad enzimática elevada (más del
80% de la actividad enzimática óptima) entre 7,0 y 10,
preferentemente entre 7,5 y 9,5 (ver la fig. 5).
Ventajosamente, dicha epóxido hidrolasa aislada
y purificada presenta un peso molecular comprendido entre 26 y 30
kD, preferentemente un peso molecular de aproximadamente 28 kD (peso
molecular teórico 28,136 kD).
Dicha secuencia aminoácida o péptido de epóxido
hidrolasa se expresa extracelular o intracelularmente y/o resulta
secretada por la célula huésped recombinante de acuerdo con la
invención.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, la secuencia aminoácida de
epóxido hidrolasa aislada y purificada presenta una homología
superior al 70%, más preferentemente superior al 90% con la
secuencia aminoácida SEC ID nº 6.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida de la presente invención, la secuencia aminoácida de
epóxido hidrolasa aislada y purificada presenta la secuencia
aminoácida de SEC ID nº 6 o una parte más reducida de dicha
secuencia aminoácida (de más de 50 aminoácidos, preferentemente de
más de 100 aminoácidos) que presenta por lo menos más del 80% de la
actividad de epóxido hidrolasa de la secuencia aminoácida completa
SEC ID nº 6, preferentemente más del 95% de la actividad de epóxido
hidrolasa de la secuencia aminoácida completa SEC ID nº 6. En otras
palabras, la secuencia aminoácida de epóxido hidrolasa de acuerdo
con la invención aislada y purificada puede delecionarse
parcialmente manteniendo su actividad enzimática, que puede medirse
mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la
materia. Dicha epóxido hidrolasa aislada y purificada o una parte
de la misma presenta un peso molecular inferior a 30 kD,
preferentemente de aproximadamente 28 kD o menos.
Una epóxido hidrolasa de interés se identifica a
través de un ensayo enzimático no crítico para la presente
invención, tal como la hidrólisis del
cis-epoxisuccinato en ácido
L(+)-tartárico. Para llevar a cabo este ensayo, el
microorganismo se cultiva en un medio apropiado para producir el
enzima de interés (por ejemplo mediante inducción con
cis-epoxisuccinato). Las células completas o el
medio de cultivo se someten a ensayo separadamente para la actividad
enzimática.
Tras la identificación de una epóxido hidrolasa,
la secuencia de ADN que codifica dicha epóxido hidrolasa puede
obtenerse de microorganismos que la producen naturalmente o a partir
de células recombinantes de acuerdo con la invención mediante el
cultivo de dichos microorganismos o de dichas células en el medio
apropiado para la inducción y producción del enzima (epóxido
hidrolasa) de interés, aislando la epóxido hidrolasa deseada
mediante procedimientos conocidos, tales como la cromatografía de
columna, y determinando la "parte activa" de la secuencia
aminoácida del enzima purificado.
La secuencia de ADN que codifica la epóxido
hidrolasa se obtiene a partir de una biblioteca génica del
microorganismo del que se ha purificado la epóxido hidrolasa.
De acuerdo con la presente invención, se derivó
una sonda oligonucleótida de la parte de la secuencia aminoácida
determinada anteriormente. La sonda oligonucleótida se utilizó para
explorar una biblioteca génica parcial del microorganismo del que
se había purificado la epóxido hidrolasa de interés. Se obtuvo un
fragmento de ADN genómico BamHi-EcoRI de 8 kb que
contenía la secuencia codificante de la epóxido hidrolasa, en forma
de inserción en el vector plásmido pBlueScript SK(+). El plásmido
resultante se denominó pREHBE.
El tamaño de la inserción del plásmido pREHBE se
redujo a 1,4 kb mediante digestión con los enzimas de restricción
SphI y XhoI y la inserción en los sitios de restricción apropiados
del vector plásmido pBluescript SK(+). El plásmido resultante se
denominó pREHXS y ha sido depositado (en E. coli DH10B) en el
LMBP (BCCM/LMBP Plasmid Collection, Laboratorium voor Moleculaire
Biologie, Universiteit Gent, K.L. Ledenganckstraat, 35,
B-9000 Gent) bajo el número de acceso
LMBP-3666. La secuencia completa de la inserción se
determinó mediante secuenciación manual utilizando técnicas bien
conocidas por el experto en la materia.
Los constructos de expresión, tales como los
indicados anteriormente, permitían su expresión en un huésped
Escherichia coli. De acuerdo con la presente invención, dicho
huésped Escherichia coli que contiene el plásmido pREHXS se
cultiva en un medio apropiado (por ejemplo medio LB) y que contiene
el antibiótico apropiado para permitir la presencia continua del
plásmido en las células huésped, seguidamente las células se recogen
y se determina la actividad de epóxido hidrolasa. Se encuentra
dentro del alcance de la presente invención no limitar la expresión
del gen de la epóxido hidrolasa a Escherichia coli. De
acuerdo con la presente invención, el fragmento de ADN que codifica
la epóxido hidrolasa podría expresarse ventajosamente en bacterias o
en hongos, incluyendo en levaduras. Para permitir la expresión del
gen de interés en estos huéspedes, la secuencia de ADN que codifica
la epóxido hidrolasa finalmente podría ligarse operablemente a
secuencias de ADN que permitirán la (sobre)expresión en el
huésped seleccionado (por ejemplo secuencias promotoras,
terminadoras, UAS, etc.).
La secuencia de ADN que codifica la epóxido
hidrolasa preferentemente se modifica para permitir la secreción (la
expresión extracelular) de la epóxido hidrolasa en el medio de
cultivo de la célula huésped. Esa modificación habitualmente se
realiza mediante la adición de una secuencia de ADN que codifica una
secuencia líder que resulta reconocida por la maquina de secreción
del huésped seleccionado y permite la recuperación de la epóxido
hidrolasa de su medio de cultivo.
La presente invención también proporciona las
condiciones (medio de cultivo, temperatura, etc.) para el cultivo
del huésped seleccionado para la expresión de la epóxido
hidrolasa.
Un último aspecto de la presente invención se
refiere a la utilización de la célula huésped recombinante de
acuerdo con la invención o la secuencia aminoácida de epóxido
hidrolasa de acuerdo con la invención aislada y purificada, para la
hidrólisis de un epóxido, preferentemente del
cis-epoxisuccinato.
El nuevo enzima de acuerdo con la invención
puede utilizarse ventajosamente para hidrolizar anillos epóxido que
se encuentran en sustratos epóxido. Son ejemplos conocidos de
epóxidos: epóxidos de estireno, epóxidos de octeno, epóxidos de
naftaleno, epóxidos de fenantreno, óxido de benceno, estróxido,
óxido de androsteno, epiclorohidrina y
cis-epoxisuccinato. Preferentemente, la epóxido
hidrolasa de acuerdo con la invención puede utilizarse para la
hidrólisis del cis-epoxisuccinato pero no permite
una hidrólisis del sustrato de epóxido, epiclorohidrina.
El enzima de acuerdo con la invención puede
utilizarse bajo varias formas: las células pueden utilizarse
directamente tras el cultivo con o sin permeabilización, y el
enzima podría utilizarse en forma de extracto celular (es decir,
partes de la célula huésped que se han sometido a una o más etapas
de centrifugación y de extracción) o en forma de proteína
purificada. Cualquiera de las formas anteriormente indicadas puede
utilizarse en combinación con otro enzima bajo cualquiera de las
formas anteriormente indicadas. Además, el enzima puede recuperarse
del medio de cultivo de una célula huésped que expresa y secreta la
epóxido hidrolasa fuera de las células. En este caso, la
preparación enzimática puede utilizarse en forma de preparación
cruda o en forma de preparación parcial o totalmente purificada en
combinación o no con uno o varios otros enzimas.
Estas células completas, extractos celulares,
extractos libres de células o epóxido hidrolasa purificada pueden
fijarse (inmovilizarse mediante cualquier medio convencional sobre
un soporte sólido, tal como una columna de cromatografía) para
permitir una hidrólisis continua del sustrato epóxido o para
permitir un reciclado de la preparación enzimática (células
completas, extractos celulares, extractos libres de células, epóxido
hidrolasa total o parcialmente purificada, etc.).
La invención se describe con mayor detalle en
los ejemplos siguientes haciendo referencia a los dibujos adjuntos,
que en modo alguno pretenden limitar el alcance de la invención
según la reivindicaciones.
La Figura 1 muestra el contenido de fracciones
eluidas de la columna MonoQ y la actividad asociada con estas
fracciones.
La Figura 2 muestra el resultado de un
experimento típico de transferencia southern utilizando un
oligonucleótido basado en la secuencia aminoácida de la
cis-epoxisuccinato hidrolasa para sondear el ADN
genómico total de Rhodococcus rhodochrous
LMGP-18079.
La Figura 3 muestra la secuencia nucleótida
del gen de la cis-epoxisuccinato hidrolasa
LMGP-18079 de Rhodococcus rhodochrous y sus
regiones flanqueantes.
La Figura 4 muestra la secuencia aminoácida
deducida de la secuencia del gen de la
cis-epoxisuccinato hidrolasa de Rhodococcus
rhodochrous LMGP-18079. Las secuencias
aminoácidas obtenidas mediante secuenciación química del enzima se
encuentran subrayadas.
La Figura 5 representa la actividad enzimática
relativa del enzima de acuerdo con la invención.
Rhodococcus rhodochrous
LMGP-18079 rutinariamente se mantiene en tubos de
ágar que contienen agarosa al 0,4%, extracto de levadura al 0,4%,
extracto de malta al 1% y ágar al 2%.
La reacción enzimática se llevó a cabo a 37ºC en
un volumen final de 9,3 ml que contenía los componentes siguientes:
0,7 ml de tampón Tris-HCl 0,1 N, pH 8,0, 2,6 ml de
solución Triton X-100 al 1,14%, 5,0 ml de una
solución de cis-epoxisuccinato sódico al 30% y 1,0
ml de la suspensión celular. La reacción se detuvo mediante dilución
de la mezcla entre 100 y 500 veces con H_{2}O acidificado hasta pH
2,2 con H_{3}PO_{4}.
La cantidad de ácido L-tartárico
formada durante la reacción se determinó mediante HPLC a temperatura
ambiente en una columna Vydac C18 (nº de cat. 201HS3410) con un
caudal de entre 400 y 600 \mul/minuto y un volumen de muestra de
20 \mul. El disolvente era el mismo que el utilizado para diluir
las muestras. La detección del cis-epoxisuccinato y
del ácido tartárico se realiza a 210 nm.
La actividad se expresa como la cantidad de
ácido L(+)-tartárico formada en un día con 1 gramo
de células secas.
Para el análisis cualitativo rápido de las
fracciones solubles que contienen el enzima, la reacción enzimática
se llevó a cabo a 37ºC en un volumen final de 1 ml en
Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, con 0,5 ml de
cis-epoxisuccinato sódico (al 30%) como
sustrato.
El medio estándar presenta la composición
siguiente (en g/l): propilenglicol 10, extracto de levadura 2,
KH_{2}PO_{4} 2, Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O 2,2
(NH_{4})_{2}SO_{4} 3, CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 0,03,
MnSO_{4}\cdotH_{2}O 0,003, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,1,
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,01. El pH se ajustó a 7,0 y el cultivo
se incubó a 30ºC bajo agitación. La actividad de
cis-epoxisuccinato hidrolasa se indujo mediante la
adición tras 24 horas de 10 g/l de
cis-epoxisuccinato. Las células se recogieron
mediante centrifugación y se almacenaron a -20ºC hasta su
utilización.
Se suspendieron aproximadamente 26 g de células
congeladas en 35 ml de tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7,2, que
contenía DTT 5 mM, PMSF 0,5 mM, EDTA 5 mM y 2 \mug/ml de
pepstatina.
Las células se rompieron con perlas de vidrio
utilizando un homogeneizador Braun MSK enfriado con CO_{2}
líquido.
En primer lugar, el homogenado se centrifugó a
7.000 rpm en el rotor SS34 de la centrifugadora Sorvall RC5B. El
pellet resultante se extrajo nuevamente con 50 ml de tampón frío y
se centrifugó nuevamente. Los dos sobrenadantes combinados
seguidamente se centrifugaron durante 20 minutos a 16.000 rpm en el
mismo rotor a 4ºC. Una etapa final de centrifugación de 60 minutos a
38.000 rpm en el rotor A641 de la centrifugadora Beckman
L8-70 proporciona el extracto libre de células.
El extracto (138 ml) se dializó durante la noche
a 4ºC frente a 2 litros de tampón potásico 50 mM, pH 7,2, que
contenía (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, DTT 2,5 mM y EDTA 2,5
mM.
Tras la diálisis, el extracto se cargó en una
columna de 30 ml de fenil-sefarosa (Pharmacia
Biotech) equilibrada con el tampón de diálisis. Tras lavar con el
mismo tampón, las proteínas unidas se eluyeron a 3 ml/minuto con
240 ml de un gradiente lineal 1 M-0 M de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en el mismo tampón. Se recogieron
fracciones de 3 ml y se sometieron a ensayo para la actividad de
cis-epoxisuccinato hidrolasa.
Se agruparon las fracciones activas y se
dializaron frente a tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7,2, que
contenía EDTA 2,5 mM y DTT 2,5 mM.
El dializado de la etapa 2 se aplicó a una
columna de 10 ml de Q-Sepharose (Pharmacia Biotech)
equilibrada con el tampón de dialización. Tras lavar con el mismo
tampón, la proteína unida se eluyó de la columna a 1 ml/minuto con
un gradiente lineal de 80 ml de NaCl (0-0,5 M) en el
mismo tampón. Se recogieron fracciones de 1 ml y se sometieron a
ensayo para la actividad de
cis-epoxisuccinato-hidrolasa.
Aproximadamente 1/10 de las fracciones activas
agrupadas de la etapa 3 se diluyeron 2,7 veces con tampón de fosfato
potásico 50 mM, pH 7,2, que contenía EDTA 2,5 mM y DTT 2,5 mM, y se
cargaron en un columna MonoQ HR 5/5 (Pharmacia Biotech). Las
proteínas se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de NaCl
(0-0,5 M) en el mismo tampón a 0,25 ml/minuto. Se
recogieron fracciones de 0,25 ml y se sometieron a ensayo para la
actividad de
cis-epoxisuccinato-hidrolasa.
Se aplicaron 25 \mul de las fracciones
recogidas de la columna MonoQ en un gel de
acrilamida-SDS al 12,5%
(Mini-PROTEAN II Electrophoresis system,
Bio-Rad). Las proteínas sobre el gel se visualizaron
con azul de Coomassie.
Se siguieron procedimientos generales para
llevar a cabo la secuenciación N-terminal de la
proteína tras la electroforesis en un gel de
SDS-poliacrilamida y la electrotransferencia en una
membrana PVDF Immobilon-P (Millipore). Se utilizó
un secuenciador de proteínas automático 477A acoplado a un
analizador HPLC 120A (Applied Biosystem).
Para la determinación de la secuencia de
fragmentos internos, en primer lugar la proteína se digirió sobre la
membrana con tripsina. Los péptidos resultantes se separaron
mediante cromatografía en fase reversa en HPLC, y se sometieron a
secuenciación N-terminal, tal como
anteriormente.
Se obtuvieron las secuencias siguientes:
| N-terminal: | MQLNNANDNTQF | SEC ID nº 1 |
| 1º péptido interno: | SWPDVPSGLEQLR | SEC ID nº 2 |
| 2º péptido interno: | RPLEYGPTGR | SEC ID nº 3 |
Basándose en la secuencia
N-terminal de la proteína (SEC ID nº 1), se
sintetizó un oligonucleótido marcado con digoxigenina. Este
oligonucleótido presentaba la secuencia siguiente:
SEC ID nº 45'
AAYAAYGCNAAYGAYAAYAC
3'
Y representa C o T, N representa cualquiera de
las cuatro bases.
Se cultivó la cepa LMGP-18079 de
Rhodococcus rhodochrous durante la noche en 200 ml de caldo L
a 37ºC. Tras recoger mediante centrifugación, las células se
lavaron durante 30 minutos a 80ºC con tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), se
centrifugaron nuevamente, se resuspendieron en 15 ml de tampón TSE
(Tris-HCl 50 mM, sacarosa 200 mM, EDTA 1 mM, pH
8,0) con 120 mg de lisozima y se incubaron durante 2 horas a 37ºC
previamente a la adición de 1,5 ml de EDTA 250 mM, pH 8,0. La
mezcla se incubó adicionalmente durante 60 minutos. Tras la adición
de 1 ml de STE (SDS al 20%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 20
mM, pH 8,0), la mezcla se incubó durante 30 minutos a 55ºC.
El ADN se separó del material contaminante
mediante extracciones sucesivas con fenol y fenolcloroformo y
mediante precipitación con etanol.
Se digirieron 6 \mug de ADN de Rhodococcus
rhodochrous con diversos enzimas de restricción (EcoRI, BamHI,
SalI, PstI) o con una combinación de estos enzimas de restricción
(EcoRI + BamHI, EcoRI + PstI, EcoRI + SalI, BamHI + SalI, BamHI +
PstI, SalI + PstI). Las muestras se cargaron en un gel de agarosa al
1% de 20x20 cm y se corrieron durante la noche a 40 voltios en
tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH
8,0).
Tras la migración del ADN, el gel se trató y se
transfirió a una membrana Hybond N (Amersham) según recomendación
del fabricante. Los tampones de hibridación y las condiciones de
detección eran aquéllas recomendadas en el kit de detección de
digoxigenina (Boehringer Mannheim). La prehibridación se llevó a
cabo durante la noche a 42ºC. La hibridación se produjo a 42ºC
durante 6 horas. Las condiciones de lavado fueron las siguientes: 2
x 5 minutos a temperatura ambiente con 2xSSC, SDS al 0,1%, 2 x 15
minutos a 42ºC con 0,5xSSC, SDS al 0,1% y 2 x 15 minutos a 42ºC con
0,1xSSC, SDS al 0,1%.
En la figura 2 se muestra el resultado de un
experimento típico de transferencia southern.
Se digirieron aproximadamente 15 \mug de ADN
cromosómico total de Rhodococcus rhodochrous con los enzimas
de restricción BamHI y SalI. El plásmido pBluescript SK(+)
(Stratagene) se digirió con los mismos enzimas. El ADN digerido se
separó en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE (ver anteriormente).
Se recortaron del gel los fragmentos de agarosa que correspondían a
la longitud apropiada se determinaron mediante análisis de los
resultados de la transferencia southern (1.600-2.200
pb). El ADN de los bloques de agarosa se extrajo con la ayuda de un
kit de extracción de gel QIAEX II (QIAGEN). Se llevó a cabo una
ligación entre el vector plásmido y los fragmentos de ADN de
Rhodococcus y se utilizó la mezcla de ligación para
transformar E. coli DH10B mediante electroporación utilizando
el protocolo estándar (Gene Pulser II de
Bio-Rad).
Los transformantes de la etapa 1 se agruparon en
grupos de diez clones. Se extrajo el ADN de plásmido de estos
grupos. El ADN purificado se digirió con los enzimas de restricción
BamHI y SalI, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa con
el fin de llevar a cabo una transferencia southern tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2.
Los clones individuales de los grupos positivos
se analizaron nuevamente siguiendo el mismo protocolo.
Se retuvo un clon positivo (pREHBS) para
análisis adicionales. Contenía una inserción de un tamaño superior
al esperado (aproximadamente 6,8 kb) que resultaba de una digestión
parcial del ADN cromosómico de la cepa de Rhodococcus
rhodochrous.
Se redujo el tamaño de la inserción mediante
digestión con enzimas de restricción y ligación, hasta una longitud
de aproximadamente 1.800 pb, que corresponde al fragmento
BamHI-SalI esperado. La secuenciación de ADN de
esta inserción demuestra que la presencia de la secuencia
correspondiente al oligonucleótido utilizado para explorar la
biblioteca. Sin embargo, aparentemente faltaba el extremo 3' del
gen.
Se construyó una biblioteca génica parcial
siguiendo el protocolo descrito en 1, pero utilizando los enzimas
de restricción BamHI y EcoRI. Esta biblioteca se exploró con el
mismo oligonucleótido. Se sometió un clon positivo (pREHBE) a
secuenciación de ADN en el lado BamHI para confirmar el solapamiento
con el fragmento BamHI-SalI.
El tamaño de la inserción de pREHBE era de
aproximadamente 8kb. El análisis de restricción de la inserción de
pREHBE demostró que el gen se encontraba situado en un fragmento
SphI-XhoI de 1,4 kb. Para clonar este fragmento, el
plásmido pREHBE se digirió en primer lugar con SphI, se trató con el
fragmento Klenow de ADN polimerasa y se digirió con XhoI. El
fragmento de interés se purificó tras electroforesis en gel de
agarosa y se insertó mediante ligación en pBluescriptSK(+) que había
sido digerido con BamHI, se trató con el fragmento Klenow de ADN
polimerasa y se digirió con XhoI. El plásmido obtenido se denominó
pREHXS y se ha depositado (en E. coli DH10B) bajo el número
de acceso LMBP-3666.
Se determinó manualmente la secuencia de ADN de
la inserción de pREHXS utilizando el procedimiento de terminación de
cadena didesoxinucleótida (Sanger, F., Nickelen, S., Coulson, A.R.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, p. 5463, 1977). Se utilizaron
oligonucleótidos específicos como cebadores en las reacciones de
secuenciación. El análisis de ordenador se realizó con el programa
PC/GENE.
Se determinó la secuencia nucleótida completa y
se proporciona en la figura 3 (SEC ID nº 5).
La secuencia obtenida comprendía 1.366 pb, 67 pb
en la región 5' no codificante y 543 pb en la región 3' no
codificante. El polipéptido derivado de la secuencia codificante era
de 253 aminoácidos de longitud y presentaba un peso molecular
predicho de 28 kDa. Se proporciona en la figura 4 la secuencia
aminoácida de la cis-epoxisuccinato hidrolasa (SEC
ID nº 6). Los fragmentos de la secuencia aminoácida determinada en
el Ejemplo 2 se encuentran presentes en esta secuencia. La SEC ID nº
1 corresponde a los aminoácidos 1 a 12, la SEC ID nº 2 corresponde
a los aminoácidos 112 a 124, y la SEC ID nº 3 corresponde a los
aminoácidos 209 a 218.
Se cultivó durante la noche en medio 2 x LB
(extracto de levadura al 1%, Bacto-triptona al 2%,
NaCl al 2%) suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina, la cepa
DH10B de Escherichia coli que contenía plásmido pREHXS. Se
utilizó como control la misma cepa con el plásmido pBluescripSK(+)
sin inserción.
Se determinó la actividad de la
cis-epoxisuccinato-hidrolasa en las
células recogidas de los dos cultivos utilizando el mismo protocolo
descrito en el Ejemplo 1. No pudo detectarse actividad en el
control. Se encontraban presentes aproximadamente 150 unidades en
la cepa que expresaba el gen de
cis-epoxisuccinato.
Se cultivó la cepa de E. coli que
contenía el plásmido pREHXS durante 8 horas en 100 ml a 35ºC bajo
agitación en medio LB suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina.
Se transfirió el cultivo a 1 litro del mismo medio y se cultivó
nuevamente durante 8 horas. Este cultivo se utilizó para inocular un
fermentador de 15 litros Braun Biostat E. Tras 24 horas, el cultivo
se detuvo y las células se recogieron mediante centrifugación
durante 10 minutos a 10.000 g y 4ºC. Las células se lavaron una vez
con tampón de fosfato potásico 10 mM, pH 7,0, y se centrifugaron
nuevamente. Finalmente, las células se suspendieron en un volumen
del tampón y se almacenaron a -20ºC hasta su utilización o se
secaron mediante liofilización. Las células también pueden secarse
mediante secado por pulverización. Las células preferentemente se
almacenan en bolsas o recipientes cerrados para protegerlas de la
humedad. El almacenamiento a temperaturas inferiores y el
almacenamiento al vacío pueden extender la vida de almacenamiento
de las células secas. En una bolsa de polietileno sellada, las
células secas conservan el 90% de su actividad original tras 3 meses
de almacenamiento a temperatura ambiente (25ºC).
Esta actividad enzimática se mantiene
ventajosamente constante a un pH superior a 7, preferentemente a un
pH comprendido entre 7,0 y 10, más preferentemente a un pH
comprendido entre 7,5 y 9,5.
La bioconversión se llevó a cabo en un
fermentador de 15 litros Braun Biostat E. Se mezclaron 10 litros de
cis-epoxisuccinato al 20% con 50 g de células secas
y 625 ml de una solución al 2% (p/v) de Triton
X-100. El pH se mantuvo constante a 8,0 con NaOH o
con HCl. La mezcla se incubó bajo agitación (200 rpm) a 37ºC durante
40 horas. La desaparición del cis-epoxisuccinato y
la síntesis de ácido L-tartárico se siguió mediante
HPLC (ver el Ejemplo 1).
Se ha efectuado un depósito de acuerdo con el
Tratado de Budapest de los microorganismos Rhodococcus
rhodochrous, bajo el número de depósito
LMGP-18079 en la BCCM/LMG Plasmid collection,
Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Universiteit Gent, K.L.
Ledenganckstraat, 35, B-9000 Gent, y para E.
coli que contiene el plásmido que comprende la secuencia de
acuerdo con la invención bajo el número de depósito
LMBP-3666 en la BCCM/LMBP Plasmid collection,
Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Universiteit Gent, K.L.
Ledenganckstraat, 35, B-9000 Gent.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: PURATOS N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Industrialaan 25
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Groot-Bijgaarden
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): B-1702
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Epóxido hidrolasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn emisión nº 1.0, versión nº 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gln Leu Asn Asn Ala Asn Asp Asn Thr Gln
Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Trp Pro Asp Val Pro Ser Gly Leu Glu Gln
Leu Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Pro Leu Glu Tyr Gly Pro Thr Gly
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAYAAYGCNA AYGAYAAYAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.366 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 253 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCAGAG GAGGAGCACA ATGCAACTG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGAATTCCT GGGCACAGAG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGATGCATA GGAGGTAACA TATGTTTAAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAATTCAA TGGAAGGTGC GTTATAACG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACTGCAGCA ATGCAACTGA ACAATGCG
\hfill28
Claims (18)
1. Epóxido hidrolasa aislada y purificada que
comprende una epóxido hidrolasa inferior a 30 kDa con una secuencia
aminoácida que presenta una homología superior al 70% con la
secuencia aminoácida SEC ID nº 6, presentando dicha epóxido
hidrolasa el 80% de su actividad enzimática óptima a un pH
comprendido entre 7,5 y 9,5.
2. Epóxido hidrolasa aislada y purificada
según la reivindicación 1, que comprende una secuencia aminoácida
que presenta una homología superior al 90% con la secuencia
aminoácida SEC ID nº 6, presentando dicha epóxido hidrolasa el 80%
de su actividad enzimática óptima a un pH comprendido entre 7,5 y
9,5.
3. Secuencia aminoácida de epóxido hidrolasa
aislada y purificada que presenta la secuencia aminoácida de SEC ID
nº 6.
4. Secuencia nucleótida que codifica la
secuencia aminoácida aislada y purificada a partir de epóxido
hidrolasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. Secuencia nucleótida según la
reivindicación 4, que presenta una homología superior al 90% con la
secuencia nucleótida SEC ID nº 5.
6. Secuencia nucleótida aislada y purifica,
que presenta la secuencia nucleótida SEC ID nº 5.
7. Secuencia nucleótida según cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 6, aislada y purificada a partir de una
especie de Rhodococcus.
8. Secuencia nucleótida aislada y purificada
según la reivindicación 7, aislada a partir de Rhodococcus
rhodochrous.
9. Secuencia nucleótida aislada y purificada
según la reivindicación 8, aislada a partir de Rhodococcus
rhodochrous con el número de depósito
LMGP-18079.
10. Secuencia nucleótida recombinante que
comprende, operablemente ligada a la secuencia nucleótida según
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, una o más secuencias
reguladoras contiguas.
11. Secuencia nucleótida recombinante según la
reivindicación 10, que comprende una o más secuencias reguladoras
contiguas originadas en microorganismos.
12. Vector que comprende la secuencia
nucleótida según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11.
13. Vector según la reivindicación 12, que es
un plásmido incorporado en E. coli con el número de depósito
LMBP-3666.
14. Célula huésped recombinante transformada
por la secuencia nucleótida según cualquiera de las reivindicaciones
4 a 11 o el vector según la reivindicación 12 ó 13.
15. Célula huésped recombinante según la
reivindicación 14, que se selecciona de entre el grupo que consiste
en bacterias u hongos, incluyendo las levaduras.
16. Soporte sólido que presenta inmovilizado un
elemento seleccionado de entre el grupo que consiste en la célula
según la reivindicación 14 ó 15, un extracto celular de la célula
según la reivindicación 14 ó 15, y/o la epóxido hidrolasa aislada y
purificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
17. Utilización de la célula huésped
recombinante según la reivindicación 14 ó 15, o de la epóxido
hidrolasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o del
soporte sólido según la reivindicación 16, para la hidrólisis de un
epóxido.
18. Utilización según la reivindicación 17,
para la hidrólisis del cis-epoxisuccinato.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97870168 | 1997-10-24 | ||
| EP97870168A EP0911392A1 (en) | 1997-10-24 | 1997-10-24 | Epoxide hydrolase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2260851T3 true ES2260851T3 (es) | 2006-11-01 |
Family
ID=8231056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98951123T Expired - Lifetime ES2260851T3 (es) | 1997-10-24 | 1998-10-23 | Epoxido hidrolasa. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6379938B1 (es) |
| EP (2) | EP0911392A1 (es) |
| JP (1) | JP2001520881A (es) |
| CN (1) | CN1279714A (es) |
| AT (1) | ATE322542T1 (es) |
| AU (1) | AU9730798A (es) |
| CA (1) | CA2306979A1 (es) |
| DE (1) | DE69834130T2 (es) |
| ES (1) | ES2260851T3 (es) |
| IL (2) | IL135759A0 (es) |
| TR (1) | TR200001090T2 (es) |
| WO (1) | WO1999021972A1 (es) |
| ZA (1) | ZA989705B (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2456229A1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-13 | Diversa Corporation | Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US6943001B2 (en) * | 2001-08-03 | 2005-09-13 | Diversa Corporation | Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| EP1291436A1 (en) * | 2001-09-11 | 2003-03-12 | Bayer Ag | Process for the stereoselective preparation of functionalized vicinal diols |
| CN105087676A (zh) * | 2014-04-21 | 2015-11-25 | 怀来县长城生物化学工程有限公司 | 基于双极膜电渗析技术的l-(+)-酒石酸清洁生产工艺 |
| CN104140984A (zh) * | 2014-08-04 | 2014-11-12 | 杭州宝晶生物股份有限公司 | 一种通过改善细胞通透性生产l(+)-酒石酸的方法 |
| CN105018443B (zh) * | 2015-07-30 | 2018-08-24 | 浙江大学 | 一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法 |
| CN111187792B (zh) * | 2018-11-14 | 2024-02-06 | 南京盛德生物科技研究院有限公司 | 乙基己基甘油的制备方法 |
| CN114657111B (zh) * | 2022-03-19 | 2024-04-09 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系及构建和应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5445956A (en) * | 1993-08-13 | 1995-08-29 | The Regents Of The University Of California | Recombinant soluble epoxide hydrolase |
| JPH08245497A (ja) * | 1995-03-09 | 1996-09-24 | Mitsubishi Chem Corp | Ｄ（−）−酒石酸の製造方法 |
-
1997
- 1997-10-24 EP EP97870168A patent/EP0911392A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-10-23 US US09/530,058 patent/US6379938B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-23 DE DE69834130T patent/DE69834130T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-23 ZA ZA989705A patent/ZA989705B/xx unknown
- 1998-10-23 WO PCT/BE1998/000160 patent/WO1999021972A1/en active IP Right Grant
- 1998-10-23 CN CN98811273A patent/CN1279714A/zh active Pending
- 1998-10-23 ES ES98951123T patent/ES2260851T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-23 CA CA002306979A patent/CA2306979A1/en not_active Abandoned
- 1998-10-23 AU AU97307/98A patent/AU9730798A/en not_active Abandoned
- 1998-10-23 AT AT98951123T patent/ATE322542T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-10-23 TR TR2000/01090T patent/TR200001090T2/xx unknown
- 1998-10-23 JP JP2000518064A patent/JP2001520881A/ja not_active Withdrawn
- 1998-10-23 IL IL13575998A patent/IL135759A0/xx active IP Right Grant
- 1998-10-23 EP EP98951123A patent/EP1025213B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-04-19 IL IL135759A patent/IL135759A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1279714A (zh) | 2001-01-10 |
| DE69834130T2 (de) | 2006-12-21 |
| DE69834130D1 (de) | 2006-05-18 |
| EP1025213B1 (en) | 2006-04-05 |
| IL135759A (en) | 2007-09-20 |
| WO1999021972A1 (en) | 1999-05-06 |
| CA2306979A1 (en) | 1999-05-06 |
| US6379938B1 (en) | 2002-04-30 |
| ZA989705B (en) | 1999-04-26 |
| IL135759A0 (en) | 2001-05-20 |
| TR200001090T2 (tr) | 2000-11-21 |
| EP0911392A1 (en) | 1999-04-28 |
| AU9730798A (en) | 1999-05-17 |
| ATE322542T1 (de) | 2006-04-15 |
| EP1025213A1 (en) | 2000-08-09 |
| JP2001520881A (ja) | 2001-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR960014703B1 (ko) | 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자 및 이 유전자에 의해 코딩된 단백질 | |
| Arand et al. | Cloning and molecular characterization of a soluble epoxide hydrolase from Aspergillus niger that is related to mammalian microsomal epoxide hydrolase | |
| Pohlenz et al. | Purification and properties of an Arthrobacter oxydans P52 carbamate hydrolase specific for the herbicide phenmedipham and nucleotide sequence of the corresponding gene | |
| JP2001505403A (ja) | エステラーゼ | |
| ES2260851T3 (es) | Epoxido hidrolasa. | |
| CN111454998B (zh) | 一种手性羟基酸酯的生物制备方法 | |
| JP3073037B2 (ja) | ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドおよび該プラスミドにより形質転換された微生物 | |
| JP3728045B2 (ja) | ハロヒドリンより光学活性ジオールへの変換を触媒する新規なタンパク質 | |
| ES2333201T3 (es) | Butinol 1 esterasa. | |
| CN109762801B (zh) | 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性药物中间体中的应用 | |
| CN109097315B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| MXPA00003976A (es) | Epoxido hidrolasa | |
| ES2309082T3 (es) | Nueva carbonil reductasa, gen de la misma y metodo para usar la misma. | |
| KR100330359B1 (ko) | 슈도모나스 이어루지노사 유래의 신규 에스터라제, 그유전자 및 이를 이용한 광학활성 카르복실산의 제조방법 | |
| Zekri et al. | Identification and nucleotide sequence of Rhizobium meliloti insertion sequence ISRm6, a small transposable element that belongs to the IS3 family | |
| KR100270508B1 (ko) | 신규세파로스포린디아세틸라아제유전자및이를이용한단백질제조방법 | |
| JP4651203B2 (ja) | 新規グルタミナーゼ及びその製造方法 | |
| KR100468547B1 (ko) | 아시네토박토 종 ｓｙ－０１의 리파제 코딩 유전자 및이로부터 발현되는 리파제 | |
| JPH11313683A (ja) | 新規キシロシダーゼ遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用 | |
| KR101081012B1 (ko) | 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제가수분해 효소 유전자 | |
| KR100310932B1 (ko) | Ｌ62 리파제를 생산하는 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스 Ｌ62(ＫＣＴＣ 8957Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＨＭＬ(ＫＣＴＣ 8956Ｐ)을 이용한 Ｌ62 리파제의 대량생산법 | |
| DE19913741A1 (de) | Rekombinante L-N-Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens, Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren mittels dieser | |
| JPH09505989A (ja) | 菌類からのα‐１，４‐グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物での発現 | |
| US6472189B1 (en) | Esterase gene and its use | |
| EP0845534A2 (en) | Esterase gene and its use |