CN105018443A - 一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法，环氧化物水解酶突变体是将如SEQ？ID？NO.1所示氨基酸序列的第8位、第26位、第83位、第90位和第122位的氨基酸进行单点突变或多点突变获得。制备方法：将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET28a(+)中，构建重组质粒pET28a(+)-EH；采用滚环PCR扩增质粒pET28a(+)-EH，得到含有编码环氧化物水解酶突变体的基因序列的开环重组载体；将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。与野生型环氧化物水解酶相比，本发明环氧化物水解酶具有极高的温度稳定性和pH值适应范围，可以大大提高工业化生产中环氧化物水解酶的使用寿命。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法。
背景技术
环氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH，EC 3.3.2.10)是催化水解环氧化物或其盐生成相应邻二醇或其盐的一类酶的总称，催化反应无需任何辅酶、辅基或金属离子的参与。环氧化物水解酶广泛分布于哺乳动物、植物和微生物中。近年来，由于具有立体专一性好、酶促反应快、产物光学纯度和得率高，以及分离纯化产物较简单等优点，微生物来源的环氧化物水解酶受到了广泛关注和具体应用。1977年Miura等人首次成功将环氧化物水解酶应用于L(+)-酒石酸的工业化生产(US Patent4010072)。
L(+)-酒石酸，又名(2R,3R)-2,3-二羟基-1,4-丁二酸，是一种天然存在的有机酸，在食品行业中可以用作酸味剂，酒石酸单(双)酐酯是重要的食品添加剂；在医药行业中，它是最常用的手性药物和中间体的拆分剂；在印染业中作为防染剂、固色剂等；还可以作为金属离子隐蔽剂，用于电镀、制革和制镜等行业。
过去，生产L(+)-酒石酸的主要方法是提取并加工葡萄酒的副产物酒石，也可以以葡萄糖为主要原料通过发酵、转化和提取制备。目前，以顺丁烯二酐为原料，利用含有环氧化物水解酶的微生物转化是主要的生产方式。催化原理如下：先将顺丁烯二酐和过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，再利用微生物环氧化物水解酶将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或盐。
目前报道过的能生产用于L(+)-酒石酸制备的环氧化物水解酶的微生物有根瘤菌属、假单胞菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属、红球菌属、无色杆菌属、醋酸杆菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属和不动杆菌属。工业生产中常用的是具有较高催化效率的红球菌属。2007年Liu等首次报道了红球菌Rhodococcus opacus ML-0004环氧化物水解酶基因，并将其在原核细胞(E.coli)进行了表达。(Appl Microbiol Biotechnol 2007；74:99-106)然而该酶热稳定性极差，对温度特别敏感，在45℃下保存30min则会失去60％活力，在50℃保存30min后完全失活。弱热稳定性限制了生物催化剂的使用寿命，限制了其催化效率，也增加了工业生产中的成本。因此，提高此酶的热稳定性是目前利用生物催化法生产L(+)-酒石酸最重要的问题之一。
目前，通过基因工程手段改造蛋白质一级结构，增强蛋白质三维结构刚性来提高蛋白质热稳定性的手段已经成为主流。按照对蛋白质结构和功能关系的了解程度，蛋白质改造手段主要分为“定向进化”，“理性设计”和“半理性设计”。从上世纪80年代开始，“定向进化”已经成功地被应用到了蛋白质“体外改造”上。由于“定向进化”不需要了解特定蛋白质的结构和其相应的功能，建立起合理的进化筛选机制之后就可以模拟自然进化对目的蛋白质进行改造和筛选，因此大量结构刚性低而且结构信息少的蛋白质由此得到了改造(FEBS Lett.276(2009)1750–1761)。虽然效果显著，“定向进化”还是有着改造方向盲目、工作量大和筛选机制难以建立的缺点。
为了使改造更加具有目的性并减少工作量，研究人员提出了“理性设计”的概念。“理性设计”是指在已知目标蛋白质结构信息和其功能作用机理的前提下，应用计算机模拟运算预测对蛋白质进行改造后可以产生的在结构和功能方面的影响，并通过定点突变的方式将预测结果带到试验中(Appl.Microbiol.Biotechnol.99(2014)1205–1216)。“理性设计”的特点是利用可信度高的由X-ray衍射蛋白质结晶体所得到的蛋白质晶体结构，准确地预测蛋白质替代。尽管在预测蛋白质改造方面“理性设计”确实展现了高效和工作量小的特点。但前期准备蛋白质晶体和解析蛋白质三维结构的过程往往非常复杂艰辛，而且成功率得不到保障。没有现成蛋白质晶体结构的情况下利用“理性设计”改造蛋白质的研究很容易演变成了对目标蛋白的结构研究，偏离了主要研究方向。
因此研究人员又提出了一个将“定向进化”和“理性设计”两者相结合的概念“半理性设计”。此概念涉及一系列的蛋白质工程手段，在允许较大量预测误差的情况下一方面规定“定向进化”突变方向以减小筛选规模，另一方面规避“理性设计”中的蛋白质结构解析过程，大大提高蛋白质工程改造的效率。“半理性设计”主要包括多重序列对比(MSAs)，同源建模，虚拟突变和定点饱和突变(Curr.Opin.Biotechnol.21(2010)734–743.)。
目前，来源于红球菌Rhodococcus opacus ML-0004的环氧化物水解酶的蛋白质结构信息和其功能作用机理尚不清晰。为了得到具有较强热稳定性的环氧化物水解酶突变体，同时尽可能提高工作效率，本发明采用“定向进化”与“半理性设计”相结合的方法对其进行一级结构改造。
发明内容
针对环氧化物水解酶的热稳定性不高的技术问题，本发明提供了一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法。
一种环氧化物水解酶突变体，所述环氧化物水解酶突变体是将如SEQID NO.1所示氨基酸序列的第8位、第26位、第83位、第90位和第122位的氨基酸进行单点突变或多点突变获得。
进一步地，所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：
(1)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸(D8K)；
(2)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸(酸F26V/F26W)；
(3)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸(I83R)；
(4)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第90位的丝氨酸替换为精氨酸(S90R)；(5)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(Q122R)；
(6)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸(D8K&F26V/D8K&F26W)；
(7)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸(D8K&I83R)；
(8)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(D8K&S90R)；
(9)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&Q122R)；(10)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸(F26V&I83R/F26W&I83R)；
(11)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(F26V&S90R/F26W&S90R)；
(12)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(F26V&Q122R/F26W&Q122R)；
(13)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(I83R&S90R)；
(14)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(I83R&Q122R)；
(15)第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(S90R&Q122R)；
(16)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸(D8K&F26V&I83R/D8K&F26W&I83R)；
(17)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(D8K&F26V&S90R/D8K&F26W&S90R)；
(18)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&F26V&Q122R/D8K&F26W&Q122R)；
(19)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(酸D8K&I83R&S90R)；
(20)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&I83R&Q122R)；
(21)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&S90R&Q122R)；
(22)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(S90R&F26V&I83R/S90R&F26W&I83R)；
(23)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(Q122R&F26V&I83R/Q122R&F26W&I83R)；
(24)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(S90R&F26V&Q122R/S90R&F26W&Q122R)；
(25)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(S90R&I83R&Q122R)；
(26)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(D8K&S90R&F26V&I83R/D8K&S90R&F26W&I83R)；
(27)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(Q122R&S90R&F26V&I83R/Q122R&S90R&F26W&I83R)；
(28)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&S90R&I83R&Q122R)；
(29)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&S90R&F26V&Q122R/D8K&S90R&F26W&Q122R)；
(30)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&I83R&F26V&Q122R/D8K&I83R&F26W&Q122R)；
(31)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸(D8K&I83R&F26V&S90R/D8K&I83R&F26W&S90R)；
(32)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸(D8K&I83R&F26V&Q122R&S90R/D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R)。
本发明还提供一种编码所述环氧化物水解酶突变体的基因，其中一种突变体的基因的碱基序列如SEQ ID NO.16。
本发明还提供一种携带所述基因的重组载体或重组细胞。
本发明还提供一种获得所述环氧化物水解酶突变体的方法，包括如下步骤：(1)将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET28a(+)中，构建重组质粒pET28a(+)-EH；(2)设计含有代表突变氨基酸的密码子碱基的互补引物，采用滚环PCR扩增质粒pET28a(+)-EH，得到含有编码环氧化物水解酶突变体的基因序列的开环重组载体；(3)将步骤(2)所得含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变的原质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；(4)将正确的突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。
步骤(1)中编码环氧化物水解酶的基因从红球菌Rhodococcus opacusML-0004中获得。还进一步包括使用HisTrap FF crude 1ml的“镍柱”对环氧化物水解酶进行纯化。
所述诱导表达过程为：将步骤(4)获得的重组菌在含有50μg/L的卡那霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有50μg/L的卡那霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600＝0.6，降温至28℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导8-12h，收获内表达环氧化物水解酶的菌体。
有关于本发明所涉及的环氧化物水解酶的研究还处于初阶阶段，目前只有编码此蛋白质的蛋白质序列(GenBank登录号ABF01020)，其相应的核酸序列(GenBank登录号DQ471957)和此蛋白的催化原理预测得到了报道。因此本发明利用主要利用“半理性设计”的研究思路对此环氧化物水解酶进行改造。由于此环氧化物水解酶催化生成的L(+)-酒石酸及其盐可以用“偏钒酸铵显色法”进行检测，因此本发明设计了针对此环氧化物水解酶的“高通量筛选法”，引入“定向进化”的手段对此环氧化物水解酶进行了一轮筛选。此环氧化物水解酶与属于卤代酸类脱卤水解酶超家族(haloacid dehalogenase-like hydrolases(HAD)superfamily)的四个具有高热稳定性的酶具有保守序列相似性，因此利用MSAs对本发明所涉及的野生型环氧化物水解酶的蛋白质序列和这四个蛋白序列进行对比，预测并得到对热稳定性有利的突变。利用“同源建模”建立本发明所涉及的野生型环氧化物水解酶的蛋白质模型，之后使用“虚拟突变”预测核酸替代方式，得到对热稳定性有利的突变。利用本发明中建立的“高通量筛选法”对已经得到的对蛋白质热稳定性有利的突变点进行饱和突变，进一步提高了该环氧化物水解酶的热稳定性。
通过对对选定位点的定点突变以及组合突变，本发明所得环氧化物水解酶突变体的热稳定性性明显增强，单点突变体D8K、F26V/F26W、I83R、S90R、Q122R，双点组合突变D8K&F26V、D8K&F26W、D8K&I83R、D8K&S90R、F26V&I83R、F26W&I83R、F26V&S90R、F26W&S90R、F26V&Q122R、F26W&Q122R、I83R&S90R、I83R&Q122R、S90R&Q122R，三点组合突变D8K&F26V&I83R、D8K&F26W&I83R、D8K&F26V&S90R、D8K&F26W&S90R、D8K&F26V&Q122R、D8K&F26W&Q122R、D8K&I83R&S90R、D8K&I83R&Q122R、D8K&S90R&Q122R、S90R&F26V&I83R、S90R&F26W&I83R、Q122R&F26V&I83R、Q122R&F26W&I83R、S90R&F26V&Q122R、S90R&F26W&Q122R、S90R&I83R&Q122R、D8K&S90R&F26V&I83RD8K&S90R&F26W&I83R，四点组合突变Q122R&S90R&F26V&I83R、Q122R&S90R&F26W&I83R、D8K&S90R&I83R&Q122R、D8K&S90R&F26V&Q122R、D8K&S90R&F26W&Q122R、D8K&I83R&F26V&Q122R、D8K&I83R&F26W&Q122R、D8K&I83R&F26V&S90R、D8K&I83R&F26W&S90R，和五点组合突变D8K&I83R&F26V&Q122R&S90、D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R的热稳定性均有显著提高，并且突变组合D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R对pH值的适应性也有显著增强。对比原始环氧化物水解酶，突变体D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R经Ni柱纯化后在37℃下的比活力(U/mg)由76.5降为75.1，Km(mmol/L)由25.3升高到29.1，Kcat×103(min-1)从5.82变为6.20。最适反应温度由35-40℃提高到了为55-60℃，在50℃下的半衰期有8.5min提高到了293.2.1min。可见，将在突变型环氧化物水解酶D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R在大大提高热稳定性的基础上并没有显著影响到野生型环氧化物水解酶的催化效能。
附图说明
图1是环氧化物水解酶EH与四个来自卤代酸类脱卤水解酶超家族(haloacid dehalogenase-like hydrolases(HAD)superfamily)的酶的多重序列对比结果。
图2是环氧化物水解酶EH同源性模拟结构示意图。
图3是环氧化物水解酶EH及5种突变体的SDS-PAGE电泳图。W：野生型环氧化物水解酶，1：突变型Q122R。2：突变型F26W。3：突变型I83R。4：突变型D8K。5：突变型S90R。
图4是野生型环氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同温度下的比酶活(U/mg)。
图5是野生型氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同温度下处理后的残余酶活(％)。
图6是野生型环氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同pH值下反应的酶的相对活力(％)。
图7是野生型氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同pH值条件下处理后的残余酶活(％)。
具体实施方式
以下实施例中对应参数的检测方法：
酶活测定方法
将0.9mL 1mol/L的顺式环氧琥珀酸钠底物(pH 8.0)于37℃保温5min后，加入0.1mol酶液并在37℃反应60min，测定反应液中酒石酸的含量。在上述反应条件下，每分钟产生1μmol酒石酸定义为一个酶活单位，以U表示。在上述条件下，每毫克蛋白所含的酶活单位数定义为比活力，用U/mg表示。
酒石酸含量的检测方法
取2.5mL 1％的偏钒酸铵于25mL的容量瓶中，加适量的上述反应液后，再加1mL 1mol/L的硫酸，用蒸馏水定容至25mL，混匀后测530nm处的吸光值，并根据制定的标准曲线计算酒石酸浓度。
蛋白浓度的测定方法
取5mL考马斯亮蓝染色液(0.1g考马斯亮蓝溶于50mL 95％乙醇，加入100mL 85％磷酸，加水定容至1L)，加入适量蛋白液，混匀后测595nm处的吸光值，并根据指定的标准曲线计算蛋白浓度。
Km和Kcat值的测定方法
将等量酶液分别置于终浓度为100mmol/L，70mmol/L，45mmol/L，35mmol/L，25mmol/L，20mmol/L，15mmol/L，10mmol/L的顺式环氧琥珀酸钠(pH 7.5)中，37℃下反应20min，测定反应液中酒石酸的含量，并用Lineweaver-Burk双倒数法，计算酶的Km和Kcat，其单位分别为mmol/L和×103min-1。
对映体过量值的测定方法
取经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导的含有环氧化物水解酶基因的工程菌细胞，溶解于100mL 1mol/L顺式环氧琥珀酸二钠溶液中，30℃振荡反应24h，加入CaCl2水溶液，过滤并水洗沉淀，再经硫酸酸解、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干，分别得到L(+)–酒石酸。将获得的纯品L(+)–酒石酸溶解，使用旋光仪测定其比旋光度。经试验检测，所有野生型环氧化物水解酶所得产品L(+)–酒石酸的光学纯度达到99％以上。
以下实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，均按照常规条件，参照《分子克隆实验指南》(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述条件进行。
实施例1：重组菌的构建
根据美国GenBank数据库中公开的红球菌Ml-0004(Rhodococcusopacus ML-0004)环氧化物水解酶的核酸序列(登录号DQ471957)进行密码子优化，使其更适于在工程菌E.coli中进行复制和表达。将优化后的基因序列(优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示)送上海生工生物工程技术服务有限公司制作重组质粒pUC57-EH，环氧化物水解酶基因(EH)位于限制性内切酶位点Bam H I和Hind III之间。
然后用Bam HⅠ和HindⅢ对pUC57-EH和pET28a(+)分别进行双酶切，并用QIAquick GEL Extraction Kit试剂盒分别进行胶回收小片段和大片段。DNA片段和和质粒片段在T4连接体系中，16℃连接过夜，将目的基因连接到pET28a(+)上，构建重组质粒pET28a(+)-EH。
通过热击转化法将重组质粒转入克隆用菌株E.coli DH5α的感受态细胞之中，进行扩增。挑取LB平板上的单菌落E.coli DH5α-pET28a(+)-EH，在LB培养基中过夜培养，用碱裂解法提取质粒，然后采用热击转化法将重组质粒转入至E.coli BL21(DE3)感受态之中。
实施例2：野生型和突变型环氧化物水解酶的诱导表达和纯化
分别接种野生型基因工程菌和突变型基因工程菌(按实施例1方法制备)至含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，pH7.0)，37℃振荡培养，当菌体浓度(OD600)达到0.6-0.8时，加入0.1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，28℃振荡培养12h。
4℃、5000rpm离心10min收集菌体，生理盐水冲洗三次后，按每克菌体5mL的比例加入裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 7.5)，冰预冷超声破胞，4℃，12000rpm离心5min，取上清液，上样至Ni-NTA亲和柱(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)，用洗杂缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 7.5)洗去杂质成份，用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，200mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脱目的蛋白，将收集的酶液于4℃，10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中充分透析，聚乙二醇浓缩后，用含50％甘油的10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液，于-20℃保存，并通过12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测纯化效果。
纯化后的蛋白条带单一，纯度达99％以上，其分子量约为28kDa，环氧化物水解酶EH及5种突变体的SDS-PAGE电泳图如图3所示。W：野生型环氧化物水解酶，1：突变型Q122R。2：突变型F26W。3：突变型I83R。4：突变型D8K。5：突变型S90R。
实施例3：红球菌ML-0004环氧化物水解酶基因的定向进化突变
提取连接有稀有密码子优化后的野生型环氧化物水解酶基因EH的重组质粒pET-28a(+)(实施例1构建)，以加入二价锰离子的方式向聚合酶链式反应PCR中引入复制错误。
定向进化的PCR反应体系为：1.0ul自制的5mM MnCl2,0.5ul Taq聚合酶(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan),10.0ul供应商提供的buffer(10×),14.0ul 25mM MgCl2,4.0ul dNTP Mixture,1.0ul前引物(SEQ ID NO.3),1.0ul后引物(SEQ ID NO.4),0.5ul模板DNA(50ng/ul)和18.0ul蒸水。
其PCR程序为：98℃ 10s,55℃ 30s,72℃ 60s(30循环)。
纯化PCR产物，使用限制性核酸内切酶BamH I和Hind III在37℃下处理3小时。反应体系为1ul BamH I，1ul Hind III，2ul 10×M Buffer和16ul灭菌水。将“双酶切”处理后的PCR产物使用核酸电泳纯化，割胶回收含有突变位点的较小片段。
将纯化后的突变片段连接到同样方法“双酶切”后得到的pET-28a(+)空质粒，进行酶连：20ul的酶连体系包括1ul T4连接酶，2ul 10×T4连接酶和17ul***片段和载体的混合液，其中***片段和载体的比为5:1。连接反应在16℃下保存过夜。
将连接产物全部用热转化导入事先制备好的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中：将20ul连接产物加入100ul刚刚解冻的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min，42℃下准确热击45s，冰浴10min，然后加入250ul灭菌的LB培养基，在37℃，225rpm的摇床中培养1小时。取预培养后的细胞，将EP管在3000rpm下离心30min，用移液枪移去清液，然后将沉淀的细胞轻轻吸起，使用涂布法完全转移到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下培养10-12h。
构建突变体库后，从突变库中随机挑取单菌落进行蛋白质热稳定性检测试验。挑取疑似突变体单菌落，加入到含有50ug/ml卡那霉素的300ulLB培养基的“浅孔96孔细胞培养皿”中培养6小时。将“浅孔96孔细胞培养皿”命名为“母板”，储存在-80℃冰柜中作为接下来培养和诱导的种子。从母板中提取50ul菌液，加入到含有50ug/ml卡那霉素和0.1M顺式环氧琥珀酸钠的600ul LB培养基中进行培养。将“浅孔96孔细胞培养皿”命名为“子板”。将子板在37℃，225rpm的摇床中培养2.5小时，向板上每个孔中加入50ul 1.2mM IPTG进行诱导。随后子板在28℃，225rpm的摇床中培养10-16小时。将培养和诱导后的细菌在4000rpm下离心5min。取125ul上清液和100ul pH4.8的0.1M乙酸钠缓冲液与25ul纯1％偏钒酸铵进行显色。在530nm下测定上述反应液的吸光度，保留突变体库中显色效果接近野生型的细菌，将其从子板上提取出来，进行热稳定性测定实验。
将选择好的子板上的细胞用300ul 50mM磷酸缓冲液重悬，将重悬液在50℃水浴锅中处理15min，随后立即置于冰上使之恢复室温。向恢复至室温的重悬液中加入300ul含有0.2M顺式环氧琥珀酸钠的50mM磷酸缓冲液，在37℃下反应1小时。再次离心取上清液，偏钒酸铵显色检测残余酶活。将残余酶活百分比高于野生型的突变型筛选出来，提取种子液送去上海生工有限责任公司进行测序，并将含有突变型酶的种子液进行培养和诱导，分离纯化后测定其比酶活，热稳定性，和动力学参数。
通过定向进化筛选得到一株含有高热稳定性的环氧化物水解酶的基因工程菌。经基因测序得知，该基因携带突变体Q122R，即为野生型环氧化物水解酶主体氨基酸链上第122位由谷氨酰胺突变为了精氨酸。
优选地，突变体Q122R经Ni柱纯化后得到的突变酶-1在37℃下的比活力(U/mg)为75.8，其Km(mmol/L)为24.8，其Kcat×103(min-1)为5.72。突变酶-1的最适反应温度为35-40℃，在50℃下的半衰期为31.6min。可见定向进化所引入的将122位上谷氨酰胺换为精氨酸的替代具有提高蛋白质热稳定性的效果，并且没有影响酶的催化特性。
实施例4：红球菌ML-0004环氧化物水解酶基因多重序列对比(MSAs)
尽管被证明有效，但定向进化试验所需要随机筛选的突变体库过于庞大，本发明引入了多重序列对比来加快改造目的环氧化物水解酶的速度。在同一超家族中，热稳定性好的蛋白质之间共享的保守序列上的相同氨基酸残基可能是区分他们与热稳定性差的蛋白质之间的关键。来源于红球菌ML-0004的环氧化物水解酶EH与来自属于卤代酸类脱卤水解酶超家族(haloacid dehalogenase-like hydrolases(HAD)superfamily)的四个具有高热稳定性的酶(GenBank登录号No.HAD_AGRTR:P60527.1,DhlS5I:P60527.1,L-DEX:Q53464.1and PH0459:83753572)具有保守序列相似性(序列对比如附图1所示)。认为在这四个同源蛋白质共享的保守序列会对导致高热稳定性，因此拟通过多重序列对比的方式找到EH和这四个嗜热蛋白的结构相似性，预测可能提高蛋白质热稳定性的氨基酸替换方式。
本发明成功预测了将野生型环氧化物水解酶上第26位点上的苯丙氨酸突变为缬氨酸F26V会提高环氧化物水解酶的热稳定性；以及将野生型型环氧化物水解酶上第83位点上的色氨酸突变为精氨酸S90R(I83R)会提高环氧化物水解酶的热稳定性。
实施例5：红球菌ML-0004环氧化物水解酶同源建模与虚拟突变
由于到目前为止还没有关于红球菌ML-0004环氧化物水解酶的蛋白质三维结构，因此需要通过“同源建模”建立红球菌ML-0004环氧化物水解酶的蛋白质三维结构模型，并使用虚拟突变手段计算单点氨基酸突变对整个蛋白质结构模型造成的影响来判断该突变是否会对蛋白质的结构刚性造成影响，进而改变蛋白质的热稳定性。
利用软件Discovery Studio3.0中的同源建模模块，在整个Protein DataBank数据库中搜索模板，得到结构相似性最高的卤代醇脱卤酶DehIVa(GenBank登录号No.Q51645)，将其作为模板，建立环氧化物水解酶蛋白质模型，使用软件PROCHECK验证模型可用性。经过同源建模和模型可行性分析，本发明建立了以卤代醇脱卤酶DehIVa为模板的蛋白质结构模型(如图2所示)。
利用Discovery Studio3.0软件，模拟将所有蛋白质模型上所有的氨基酸残基全部替换为丙氨酸，结果发现，虚拟突变前后蛋白质结构能量发生最大变化是发生在Asp8,Asp 25,Phe26,Glu32,Gly34,Leu35,Asp 43,Glu48,Asp 52,Asp 60,Asp 63,Leu65,Phe89,Ser90,Asp 91,Glu101,Gly106,Ser112,Asp 152,和Gly161位点上。
考虑到在蛋白质表面loop上的结构改造更容易改变蛋白质的结构稳定性，因此将处在蛋白质表面loop区上的五个氨基酸残基上进行虚拟饱和突变。这五个氨基酸残基分别是Asp 8，Leu65，Ser90，Asp 91，和Gly161。虚拟饱和突变预测到将第8位点的天冬氨酸突变为赖氨酸D8K；将90位点的丝氨酸突变为精氨酸会提高蛋白质的热稳定性S90R。使用定点突变呈现上述预测结果。
实施例6：红球菌ML-0004环氧化物水解酶基因定点突变
在定点突变试验中，将野生型红球菌ML-0004环氧化物水解酶的主体氨基酸序列上第26位的苯丙氨酸残基(Phe，对应密码子为TTC)定点突变为缬氨酸(Val，对应密码子为GTT)，制作相应引物(SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)；将第83位的异亮氨酸(Ile，对应密码子为ATC)定点突变为精氨酸(Arg，对应密码子为CGT、CGC、CGA或CGG)。CGT、CGC、CGA和CGG是同义密码子，本实施例以CGT密码子为例设计引物(SEQID NO.7,SEQ ID NO.8)；将第8位的天冬氨酸残基(Asp，对应密码子为GAC)突变为赖氨酸(Lys，对应密码子为AAA或AAG)。AAA和AAG是同义密码子，它们均编码赖氨酸，本实施例以AAA密码子为例制作引物(SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10)；将第90位的丝氨酸(Ser，密码子为TCT)定点突变为精氨酸(Arg，对应密码子为CGT、CGC、CGA或CGG)。CGT、CGC、CGA和CGG是同义密码子，它们均编码精氨酸，本实施例以CGT密码子为例，设计突变引物(SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12)。
定点突变的PCR反应体系为：双蒸水40μL，10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTPs 1μL，2μL的10mmol/L引物，载体pET28a-EH-x 1μL，Taq酶1μL，共50μL的反应体系。
其PCR程序为：94℃50s，66℃30s，72℃6min，30个循环，最后72℃延伸10min。然后将上述PCR产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，通过上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测序，筛选阳性克隆。将正确突变后的得到的环氧化物水解酶主体核苷酸序列所在的质粒提取出来，转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，按照实例2分离纯化，并测定其热稳定性。
突变体F26V经Ni柱纯化后得在37℃下的比活力(U/mg)为76.2，其Km(mmol/L)为24.4，其Kcat×103(min-1)为5.64，在50℃下的半衰期为29.5min。突变体I83R经Ni柱纯化后得在37℃下的比活力(U/mg)为75.3，其Km(mmol/L)为24.5，其Kcat×103(min-1)为5.81，在50℃下的半衰期为10.3min。突变体D8K经Ni柱纯化后得在37℃下的比活力(U/mg)为76.0，其Km(mmol/L)为24.1，其Kcat×103(min-1)为5.66，在50℃下的半衰期为25.3min。突变体S90R经Ni柱纯化后得在37℃下的比活力(U/mg)为75.3，其Km(mmol/L)为24.4，其Kcat×103(min-1)为5.77，在50℃下的半衰期为11.5min。
实施例7：突变型环氧化物水解酶的定点饱和突变
设计兼并引物定点饱和突变基因表达8，26，83，90，和122位上氨基酸的基因序列。PCR反应体系为：双蒸水40μL，10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTPs 1μL，2μL的10mmol/L引物，载体pET28a-EH-x 1μL，Taq酶1μL，共50μL的反应体系。
其PCR程序为：94℃50s，66℃30s，72℃6min，30个循环，最后72℃延伸10min。成功得到一株含有高热稳定性环氧化物水解酶的工程菌。经过测序发现其携带的重组质粒上连有新的突变基因，该基因将26位编码缬氨酸的密码子替换为色氨酸F26W。26位点饱和突变使用引物序列如(SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.14)所示。
突变体F26W经Ni柱纯化后得在37℃下的比活力(U/mg)为77.1，其Km(mmol/L)为24.8，其Kcat×103(min-1)为5.7，在50℃下的半衰期为37.2min。
实施例8：野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R的比较
将突变型D8K,F26W,I83R,S90R和Q122R1利用定点突变结合在一起，得到了一株具有强热稳定性的突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R，突变型环氧化物水解酶Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码该氨基酸序列的基因如SEQ ID NO.16所示。
对其表现型进行测定：
(1)温度对野生型和突变型环氧化物水解酶活性和稳定性的影响。
纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃按照上述检测方法测定野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的活性。结果显示(参见图4)，野生型环氧化物水解酶在25-60℃(最高酶活的60％以上)、优选为35-50℃(最高酶活的90％以上)有较高的活力，其最高比活力为105U/mg。突变型环氧化物水解酶在25-70℃(最高酶活的60％以上)、优选为40-70℃(最高酶活的80％以上)、更优选为45-65℃(最高酶活的90％以上)有较高的活力，其最高比活力为119U/mg。突变型环氧化物水解酶的最适温度高于野生型环氧化物水解酶，并且突变型环氧化物水解酶的最高比活力也高于野生型环氧化物水解酶。
将实施例2中纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃放置30min后，在37℃的条件下，按照上述检测方法测定野生型和突变型环氧化物水解酶的活性，并根据对照组计算残余活力。对照组实验为：野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶-6不经过30min保温，直接于37℃测酶活，对应的酶活定义为100％。结果显示(参见图5)，野生型环氧化物水解酶在40℃保温30min后，残余活力为90％，45℃保温30min后，只剩40％的活力。然而突变型环氧化物水解酶-6在55℃保温30min后，残余活力仍为100％，60℃保温30min后，还剩40％的活力，远高于野生型环氧化物水解酶。这说明，突变型环氧化物水解酶-6的温度稳定性比野生型环氧化物水解酶有显著提高；
(2)pH值对野生型和突变型环氧化物水解酶活性和稳定性的影响
纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶-5分别于不同酸碱度下，具体为pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0、pH 11.0、pH 12.0、pH 13.0，按照上述检测方法测定野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的活性。结果显示，野生型环氧化物水解酶在pH值小于6和大于10的条件下活力很低(最高酶活的10％以下)；在pH 7.0-9.0时有较高活力，达到最高酶活的80％以上，优选pH 7.0-8.0时，达到最高酶活的90％以上，其最适pH值为8。突变型环氧化物水解酶-5在pH值低于5和高于12时由较低酶活(0％-30％之间)，其催化活力在pH 6.0-11.0之间有较高相对酶活(60％以上)，优选pH 6.0-10(酶活80％)，最优pH 7.0-10.0。这说明野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶-5的最适反应pH值基本相似，而突变型环氧化物水解酶-5的最适pH值范围更广，pH值对突变型环氧化物-5的催化效果影响更小(参见图6)。
纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶分别于pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0、pH 11.0、pH 12.0、pH 13.0在室温下放置60min后，于pH 8.0的条件下，按照上述检测方法测定野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶-6的活性，并根据对照组计算残余活力。对照组实验为：野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶-6不经过60min的pH梯度放置，直接于pH 8.0测酶活，对应的酶活定义为100％。结果显示，野生型环氧化物水解酶在pH值小于6.0和大于9.0时放置1小时后基本失去酶活(残余酶活在10％以下)，在pH 6.0下放置1h后残余酶活低于40％，在pH 9.0下放置1h后残余酶活低于70％，只有在pH 7.0-8.0下放置1h后没有出现明显活力下降。突变型环氧化物水解酶-5在pH 5.0-10.0之间酶活基本保持稳定(残余80％以上)，优选pH 6.0-10(优选90％以上)。很明显，突变型环氧化物水解酶-5对pH的耐受性要远远高于野生型环氧化物水解酶(参见图7)。
(3)野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R的动力学和立体特异性
根据上述检测方法，测定纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的动力学参数(Km和Kcat)和对映体过量值(反映酶的立体特异性)。野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶-6都具有米氏酶的典型特征，Km值分别为25.3mmol/L和29.1mmol/L，Kcat值分别为5.82×103min-1和6.2×103min-1，对映体过量值分别为99.5％和99.6％。
测定结果表明，野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的动力学性质和立体特异性基本一致。
其他未在实施例中具体说明的突变体均参照实施例1～实施例8的方法制备。
Claims (8)
1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位、第26位、第83位、第90位和第122位的氨基酸进行单点突变或多点突变获得。
2.根据权利要求1所述环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：
(1)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸；
(2)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸；
(3)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸；
(4)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(5)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(6)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸；
(7)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸；
(8)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(9)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(10)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸；
(11)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(12)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(13)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(14)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(15)第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(16)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸；
(17)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(18)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(19)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(20)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(21)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(22)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(23)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(24)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(25)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(26)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(27)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(28)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(29)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(30)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸；
(31)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸；
(32)如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸。
3.一种编码如权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因。
4.一种携带如权利要求3所述基因的重组载体或重组细胞。
5.一种获得如权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET28a(+)中，构建重组质粒pET28a(+)-EH；
(2)设计含有与代表突变氨基酸密码子碱基互补的序列的引物，采用滚环PCR扩增质粒pET28a(+)-EH，得到含有编码环氧化物水解酶突变体的基因序列的开环重组载体；
(3)将步骤(2)所得含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变的原质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；
(4)将正确的突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(1)中编码环氧化物水解酶的基因从红球菌Rhodococcus opacus ML-0004中获得。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述诱导表达过程为：将步骤(4)获得的重组菌在含有50μg/L的卡那霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有50μg/L的卡那霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600＝0.6，降温至28℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导8-12h。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，还包括步骤(4)诱导表达所得环氧化物水解酶进行纯化。
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