CN1268184A - 改良的农杆菌介导的植物转化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供失去在体外或植物中旺盛繁殖能力的农杆菌菌株以及使用这些农杆菌菌株转化的方法。

Description

改良的农杆菌介导的植物转化
本发明涉及使用失去在体外或植物中旺盛繁殖能力的农杆菌菌株、尤其是使用营养缺陷型农杆菌菌株产生转化植物。
发明背景
近年发展了许多植物遗传转化技术。这些方法的最终目标是获得转基因植物，转基因植物中所有细胞都含有稳定整合入它们的基因组、尤其是核基因组的含有目的基因的外源DNA。
不同的植物转化方法已得到描述并已可分为物理DNA转移方法(例如电穿孔、PEG介导的DNA摄取、biolistics)或农杆菌介导的DNA转移。后者更高效、简单、转基因植物质量更高(一般包括更少量的转基因并有更低的异常转基因发生率)。
农杆菌介导的植物DNA转化的基础是某些农杆菌菌株将它们Ti质粒的部分即T-DNA导入植物细胞并将此T-DNA整合入细胞核基因组的能力。据发现，被转移和整合的Ti质粒的部分的特征是特定DNA序列即所谓的左右T-DNA边界序列并且这些边界序列之间的天然T-DNA序列可被外源DNA(欧洲专利公开“EP”116718；1967 Deblaere等(1987)酶学方法153：277-293)置换。
农杆菌介导的转化方法常需要使用易于再生的离体植物组织、器官或器官的部分如叶盘、节间段、茎段等。选择性地，将体外培养的组织(例如致密的胚发生愈伤组织)、悬浮培养物或单细胞(原生质体)用作转化的起始材料。对于拟南芥，已描述接种种子或完整植物的方法(即所谓的植物中转化方法)。
所有方法的共同特征是将待转化的细胞、组织或植物与农杆菌菌株共培养一定时间，然后运用杀菌剂或抑菌剂如抗生素限制或排除农杆菌菌株的繁殖，尤其是需要进一步体外培养时更是如此。抗生素的使用浓度经常干扰、甚至抑制转化植物细胞的有效再生。实际上已证明具β内酰胺核心结构的某些抗生素如羧苄青霉素在植物培养基中的添加会有细胞***素样效应(WO 97/12512)。目的农杆菌菌株通常包含细菌表达的抗生素抗性基因，例如但不限于β-内酰胺酶，进一步限制合适抗生素的范围。
经常在某些难以转化的植物物种转化时观察到的问题是可再生的细胞层不易进行农杆菌介导的转化。实际上，组织发生分析已证实，例如在番茄中，细胞***素处理诱导的苗可从一些新形成层细胞产生(Monacelli等，1988，原生质体142，156-163)。
另一在农杆菌介导的转化中常遇到的问题是，旺盛繁殖的农杆菌菌株在植物或植物部分上运动的逆境，尤其是在体外培养转化植物或组织时，会导致细胞和外植体的再生抑制或者甚至死亡。
Lippincott等，1965(细菌学杂志90，1155-1156)描述了农杆菌菌株B6的营养缺陷型突变体的侵染性大大降低(＜亲本特异侵染性的1-30％)。
Lippincot和Lippincott(1966，细菌学杂志92，937-945)描述了腺嘌呤、甲硫氨酸或天冬酰胺营养缺陷型农杆菌突变菌株的特性鉴定并提出在用营养缺陷型农杆菌侵染的同时向受侵染的叶提供所需养分可增加侵染性。
Christen等(1984，Z，Pflanzenphyxiol，Bd.，113 S.213-221)证实需亮氨酸和组氨酸的根瘤农杆菌突变体在***的烟草xanthi原生质体存在时生长极弱并建议在有限量的允许农杆菌暂时***的所需养分存在时用这样的营养缺陷型菌株与植物原生质体共培养作为抗生素使用的替代方法。
Chang等(1994，植物杂志5，551-558)描述了针对拟南芥的转化方法，包括在其基部切割顶枝、在切割位点用农杆菌接种并在植物中从切割位点再生枝条以产生稳定转化的后代。
针对拟南芥的植物中转化方法的改进由Bechtold等(1993，C.R.Acad.Sci.Paris.Sciences de la vie 316：1194-9)描述，基于农杆菌细胞悬浮液向拟南芥植物中的真空浸润，接着选择T1种子的转化后代。作者认为转化效率的主要限制因素是从萌发期直至种子形成细菌在植物中的有存留。
发明概述
根据本发明，提供制备包含整合入其至少部分细胞的基因组的外源DNA片段的转基因植物的方法，包括以下步骤：1)提供植物或植物的部分，它们已用营养缺陷型农杆菌菌株、优选地需甲硫氨酸或半胱氨酸或需组氨酸和腺嘌呤的营养缺陷型农杆菌菌株、尤其是LBA4404met或ATHVade，his***侵染，菌株携带与至少一个T-DNA边界序列连接的目的DNA以便能转入到植物细胞中，其中侵染的植物优选地从用所述营养缺陷型农杆菌菌株接种的外植体组织再生；2)从***侵染的植物分离的单细胞或细胞群、优选地通过从***侵染的植物分离的外植体组织、原生质体或小孢子的体外再生或选择性地通过***侵染的植物的转化后代种子萌发产生转基因植物。
此方法可进一步包括在从***侵染的植物产生转化植物之前，向***侵染的植物的至少部分、优选地向***侵染植物的花序分生组织或未成熟花序提供所需养分。
本发明还提供甲硫氨酸或半胱氨酸营养缺陷型或腺嘌呤和组氨酸营养缺陷型农杆菌菌株、尤其是LBA4404met或ATHVade，his以及它们在农杆菌介导的植物转化、尤其是农杆菌介导的玉米原生质体转化或选择性地农杆菌介导的胚发生愈伤组织，尤其是来自黄瓜或甜菜的胚发生愈伤组织转化中的用途。发明详述
本发明基于以下发现：如下所定义的营养缺陷型农杆菌菌株接种于外植体时可以存活并成功建立再生植物的***侵染。即使没有杀菌或抑菌化合物，特定营养缺陷型农杆菌的存在也不影响植物再生。而且，这样的细菌仍能转化细胞，这可以通过检测再生植物中标记基因表达的转化区来证明。最后，来自***侵染的植物的组织外植体可进一步在体外培养，而细菌不在外植体上过度生长。
本发明的营养缺陷型农杆菌菌株允许在植物中及在体外共培养时细菌细胞的可控繁殖，而接种的植物、组织或细胞不再有繁殖细菌的过度生长。本发明的农杆菌菌株因此可用于建立以这样的菌株***侵染的植物。增加与接种的农杆菌菌株的接触时间，使细菌得以穿入内层植物组织并到达和转化适当靶组织如基础可再生细胞。然而，这种延长的接种只有在细菌的旺盛繁殖可以得到控制而又不将它们杀死时才可以实现，而这一点用本发明的营养缺陷型农杆菌菌株可以实现。此方法在产生***侵染植物需体外培养步骤时(例如从组织外植体如茎段再生***侵染植物)尤其有用。
此外，运用营养缺陷型农杆菌菌株产生以这样的菌株***侵染的植物并且同时局部提供所需营养成分允许农杆菌在特定靶组织，例如但不限于花序形成分生组织中局部和受控的生长。
适用于本发明方法的营养缺陷型农杆菌菌株是那些如果不在确定成分培养基中加入特殊要求的养分就不能在该培养基中繁殖的农杆菌菌株。优选地，农杆菌不能在植物组织中或植物组织上旺盛繁殖。
特别优选的营养缺陷型农杆菌菌株是针对仅以有限量存在于植物组织或胞间液中的分子、更具体地针对核苷或核苷酸(嘌呤或嘧啶)或氨基酸的营养缺陷。特别优选的是氨基酸营养缺陷型、尤其是含硫氨基酸营养缺陷型、特别是半胱氨酸或甲硫氨酸营养缺陷型农杆菌菌株。特别优选的是产生缺陷型高半胱氨酸甲基转移酶(EC 2.1.1.14)或不产生高半胱氨酸甲基转移酶的农杆菌菌株。然而，也已知其它基因如编码高丝氨酸琥珀酰转移酶(EC 2.3.1.46)、胱硫醚(γ)合酶(EC 4.2.99.9)或胱硫醚(β)裂合酶(EC 4.4.1.8)的基因中的突变也可导致甲硫氨酸营养缺陷型农杆菌，并且这些菌株可用于相似效应。
另一特别优选的农杆菌菌株是需要两种不同养分、尤其是需要腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型农杆菌菌株如ATHVade，his。
优选的是营养缺陷型农杆菌突变菌株应具有低回复突变率。导至低回复突变率的缺失突变在本领域内已知，并且在细菌中产生缺失的方法为熟练技术人员所知(例如Van Haute等1983，欧洲分子生物学杂志2：411-417)。
根据本发明，所有农杆菌菌株，无论它们属于毛根农杆菌、根瘤农杆菌或放射形农杆菌都可用作宿主以携带将目的基因转移给植物细胞所必须的T-DNA载体和辅助质粒，只要它们带有上述使它们营养缺陷的突变。优选的菌株是营养缺陷的LBA4404菌株，尤其是LBA4404met。
同时应当明确营养缺陷型宿主所携带的T-DNA载体或辅助Ti-质粒的类型对实施本发明并不重要。已证明某些Ti质粒如pTiBO542衍生的pEHA101(Hood等，1986，细菌学杂志168：1291-1301)可提高T-DNA向植物中转移的频率。也已证明，将高毒性Ti质粒如pTiBO542的Vir基因、尤其是VirG或VirG和VirB导入如pTOK47所例示的与固有Ti-辅助质粒相容的复制子(Jin等，1987细菌学杂志169：4417-4425)可提高T-DNA向植物中转移的频率。显然包含这样的质粒的营养缺陷型菌株可用于本发明的植物转化方法。已进一步证明包含高毒性Ti质粒的额外VirG基因、尤其是来自pTiBO542的VirG基因的所谓的超双元载体可提高向某些植物(例如EP0604662)转移的频率并且包含这样的T-DNA载体的营养缺陷型菌株可用于本发明的植物转化方法。
根据本发明，提供
1.一种制备包含整合入其至少部分细胞的基因组的外源DNA片段的转基因植物的方法，包括以下步骤：
1)提供用带有与至少一个T-DNA边界序列可操作连接的目的DNA的营养缺陷型农杆菌菌株***侵染的植物，并且
2)从衍生自***侵染植物的转化单细胞或转化细胞群再生转化植物。
在优选的实施方案中，通过用如此处所述的包含目的DNA的营养缺陷型农杆菌菌株接种外植体组织，然后使外植体和营养缺陷型农杆菌菌株在体外共培养足以建立成功侵染的一段时间而产生***侵染的植物。然后除去过量的细菌并再生***侵染的完整植物。
培养营养缺陷型农杆菌的方法在本领域内众所周知。为了进行成功的***侵染，认为重要的是在接种步骤以前不能完全除去培养基中带有的所需养分。另外，本发明方法中可以包括在接种之前将营养缺陷型农杆菌菌株在诱导vir基因表达的植物酚类化合物如乙酸丁香酮存在的情况下下培养。这种用植物酚类化合物预培养的方法已在可看到的文献中得到详细描述(例如Vernade等，1988，细菌学杂志170：5822-5829)。选择性地，诱导vir的化合物可局部提供给***侵染的植物。
预计所用接种方法无关紧要。优选地，将外植体浸没在密度或OD600范围从0.01到2、优选地0.1到1.5、尤其是约0.1的农杆菌细悬浮液中。而且，其它方法如植物或植物部分中的真空浸润、农杆菌细胞的浸润、等都可用于得到同样效果。
应当明确的是转化外植体组织的细胞不是必须的，只要外植体受到农杆菌菌株侵染以便能再生成农杆菌***侵染的植物。
认为外植体组织的主要限制因素在于其形成完整植物、优选地可育植物的能力。因此，取决于要转化的植物物种，大多数外植体可用作本发明转化方法的起始材料，例如茎段或节间段，愈伤组织、优选地胚发生愈伤组织、尤其是谷类植物的致密胚发生愈伤组织。
在优选的实施方案中，将外植体和农杆菌菌株的体外共培养延长2至5天，但认为此时间间隔也可缩短至不足1天或延长至多达10天。特别是对于延长的培养时间，应注意由于接种时细菌培养基带有的残留所需养分而继续***的农杆菌不完全长满外植体。
粘附在外植体表面的多余细菌可选择性地例如通过冲洗或在无菌纸巾上吸干简单去除。
最后，用目的农杆菌***侵染的植物在体外、在土壤中或同时在体外在土壤中再生。当需体外再生时，此方法尤其有利，因为营养缺陷型农杆菌即使在缺乏抗生素时不能在末补加养分的常用植物培养基(如Murashige和Skoog培养基)上生长。
在从外植体组织再生植物的过程中，通过在含有本领域内众所周知的针对转化植物细胞的选择试剂的培养基上培养可以富集转化的植物细胞。然而，对于本发明方法，重要的是农杆菌可耐受所用的选择试剂。
已知存在于***侵染的再生植物中的营养缺陷型农杆菌具有将目的DNA转移到几种组织中的能力，并且转基因的表达已在至少花药、叶、花原基等组织中得到证明。鉴于观察到的稳定转化组织的多样性，认为农杆菌可进入所有组织中的所有细胞，尤其是可再生细胞和组织。
再生植物将一般由转化和未转化细胞的嵌合体组成，认为转基因细胞的不同块可能源于独立的转化事件。为挑选不同的转化事件，此方法中优选地包括“克隆”步骤。“克隆”是指从单细胞或细胞群开始再生植物的过程。配子发生提供天然发生的克隆过程。因而单倍体克隆植物可例如通过小孢子培养产生。然后很容易得到作为“加倍的单倍体”的带有限量转基因***的纯合植物。然而很显然，配子可用于使或被相应配子受精以产生合子胚。
种子、优选地通过再生植物自交而得到的种子允许在以农杆菌菌株***侵染的再生植物后代中分离含有限量转基因的转化植物株系。显然不必所有后代种子都产生转基因植物，但检测转基因存在的方法(Southern、PCR、报告基因表达)在本领域内众所周知。
应当理解上述克隆方法仅适用于可育植物。不能进行配子发生的植物将需要运用体外克隆方法。本领域有几种可用方法，包括但不限于原生质体法(例如Lijsebettens等，1986，分子生物学杂志188，129-145)、组织机械破碎(Meins和Binns，美国国家科学院院报74，2928-2932)或从外植体如叶盘产生苗。一般认为存在于植物组织中的营养缺陷型农杆菌菌株不能在用于体外培养的植物培养基上生长的特性允许使用体外克隆***而不必不得不求助于杀菌或抑菌化合物，这构成了所述转化方法的主要优点。
通过在无所需养分和杀菌化合物如抗生素存在时培养完整再生植物，可除去再生植物中***扩散的农杆菌。应该注意，在此阶段，不再需要再生，因此可以使用杀菌化合物，尽管它们对再生有潜在的有害影响。一般还认为农杆菌不通过种子传播。因此收获后代种子代表着实现从植物去除农杆菌的可选方法。
根据本发明，提供转化方法，包括局部刺激地方性农杆菌种群的生长，优选地在适当靶组织的位点、尤其是在花序分生组织位点的生长的另一步骤。为此目的，向营养缺陷型农杆菌***侵染的再生植物局部供应所需养分、尤其是所需甲硫氨酸以局部刺激农杆菌***以及目的DNA向目的靶组织的转移。施用方式被认为是不重要的，这些向植物施用化学物质的方法一般可在本领域内得到(例如用70％丙酮中的所需养分溶液喷雾)。
在优选的实施方案中，提供所需养分给产生配子和最终种子的细胞谱系、尤其是花序分生组织或未成熟花序。在另一实施方案中，提供所需养分给特别适于体外再生的组织。
优选的是在进行到克隆步骤以前留出一段时间、具体地至少一天。这一点在花序分生组织或未成熟花序都有所需养分供应的情况下非常清楚。优选的是留出足够时间以允许配子或种子的收获。
很显然，对于本发明方法，并不严格要求整株植物都受营养缺陷型农杆菌侵染。根据本发明方法，其中只有部分如叶片受营养缺陷型农杆菌侵染的植物可用作适当的材料以分离转化细胞用于再生转化植物。
在此方面，重要的是注意，如此处所用的，“***侵染的植物”是其中农杆菌菌株存在于植物的至少某一部分、优选地存在于植物的至少几个部分的植物。
预期所述的使用营养缺陷型农杆菌的植物中转化方法适用于任何植物的转化，只要对于这些植物具备从外植体组织再生的方法。本发明的方法将特别适用于其中转化和再生不能一步实现的植物的转化。植物中转化方法尤其适用于甜胡椒(Capsicum annuum)、黄瓜(CucumisSativus)、向日葵(Heliantus annuum)、韭葱(Allium ampeloprasum)、玉米(Zee mays)、小麦(Triticum属种类，尤其是T.aestivum和T.turgidum)、大麦(Hordeum Vulgare)、黑小麦(Triticosecale属种类)、燕麦(Avena属种类)、黑麦(Secale cereale)和水稻(Oriza Sative)的转化。
很显然，本发明的营养缺陷型农杆菌菌株可用于任何农杆菌介导的植物转化方案，由此排除了用杀菌或抑菌化合物控制农杆菌繁殖的需求。据信本发明的营养缺陷型农杆菌菌株、优选地需甲硫氨酸的农杆菌菌株、尤其是LBA4404met特别适合用于植物原生质体，尤其是胡萝卜叶柄原生质体、甜菜保卫细胞原生质体和玉米原生质体的转化，以及用于愈伤组织、优选地胚发生愈伤组织、尤其是来自甜菜或黄瓜的胚发生愈伤组织的组织转化。预期本发明的营养缺陷型农杆菌可用于转化所有植物，无论双子叶还是单子叶植物，但尤其适用于转化甜胡椒(Capsicumannuum)、黄瓜(Cucumis Sativus)、向日葵(Heliantus annuum)、韭葱(Allium ampeloprasum)、甜菜(Beta属种类)，萝苣(Cichorium属种类)、玉米(Zee mays)、小麦(Triticum属种类，尤其T.aestivum和T.turgidum)、大麦(Hordeum Vulgare)、黑小麦(Triticosecale属种类)、燕麦(Aveta属种类)、黑麦(Secale cereale)和水稻(Oriza Sative)。
尽管不打算将本发明限制于任何一种学说或作用方式，但营养缺陷型细菌在所用的体外培养基中的适合度下降对通过降低由旺盛繁殖和相关病理过程在植物中引起的逆境从而提高转移效率是关键的，而且避免了所加的杀菌或抑菌化合物对植物细胞、尤其是原生质体的消极影响。
以下实施例详细描述了本发明的方法。除非实施例中另外声明，所有重组DNA技术根据Sambrook等(1989)分子克隆：实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约和Ausubel等(1994)分子生物学常用方法，常用方法，美国的第一卷和第二卷进行。植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D.Croy的植物分子生物学实验室传真(1993)，由BIOS科学出版有限公司(UK)和Blackwell科学出版社，UK联合出版。
在本发明的描述和实施例中，参照序列表中的序列。以下都包括在序列表中：
<223>人工序列描述：pGSV71的T-DNA
<223>LB：T-DNA右边界
<223>CaMV35S P3启动子
<223>编码膦丝菌素乙酰转移酶的区域
<223>3’nos：包含农杆菌T-DNA胭脂氨酸合酶基因的多腺苷酸化信号的3’非翻译区。
菌株LBA4404metHV和ATHVade，his已于1998年8月20日保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)，微生物实验室-Bacterienverzameling(LMG)Universiteit Gent.K.L Ledeganckstraat35，B-9000 Gent，比利时并已得到以下保藏号：
LBA4404metHV：LMG P-18486
ATHVade，his：LMG P-18485。实施例实施例1：营养缺陷型农杆菌菌株的选择
将来自新鲜培养的根瘤农杆菌菌株LBA4404的单菌落(补加25μg/ml链霉素的LB培养基)接种于5ml LB培养液中，并于28℃在旋转摇床上培养48小时。用X射线以600千拉德照射2ml此培养物37.5分钟或200千拉德12.5分钟。向1ml经照射的培养物加入2ml补加1g/L水解酪蛋白质氨基酸和25g/ml链霉素的基本M9培养基(60mM K2HPO4，33mM KH2PO4，0.75mM(NH4)2SO4，0.17mM柠檬酸三钠2H2O，0.02％MgSO4，0.2％葡萄糖，0.0005％硫胺素)，于28℃振荡培养48小时。将这些培养物以适当稀释度铺板，在补加和未补加1g/L水解酪蛋白氨基酸的基本培养基(25μg/ml链霉素上)筛选存活的菌落(约106CFU/ml)。分离2个不能在未补加的基本培养基上生长的菌落。然后将这些营养缺陷型菌落用于接种一系列分别补加0.1mM每种氨基酸的2ml液体基本M9培养基培养物并于28℃振荡培养约48小时。第一个营养缺陷型菌种在补加异亮氨酸和苏氨酸的培养基上生长良好并且在天冬酰胺、苯丙氨酸或丙氨酸上生长微弱。第二个营养缺陷型突变菌株仅在补加甲硫氨酸的基本培养基上生长。后一个菌株称为LBA4404met。
LBA4404met不能在含甲硫氨酸、高半胱氨酸的直接前体的培养基上生长。因此可以推测LBA4404met中的突变影响高半胱氨酸甲基转移酶。
通过将LBA4404met的致密培养物在基本培养基平板(不补加甲硫氨酸)上铺板并于28℃培养长时间来评估回复突变率。甚至在两星期之后，也未在以10μl未稀释细菌培养物(1.7×105CFU/ml)接种的平板上观察到菌落，从而估测回复突变率为0.5×10-7以下。实施例2：通过加入源自高毒性辅助Ti质粒的Vir基因提高农杆菌LBA4404met介导的转化效率
使用包含T-DNA载体pNUN25的几乎等基因的菌株LBA4404met和LBA4404met HV评估营养缺陷型农杆菌菌株中的高毒性辅助Ti质粒对转化效率的影响。通过将质粒pTOK47(Jin等，上述)导入LBA4404met(通过电穿孔)得到LBA4404metHV菌株。pUNU25是T-DNA载体，包含在nos启动子控制下且与T-DNA边界之间的nos终止子可操作连接的nptII基因以及T-DNA边界之外细菌表达的nptII基因。它可通过将包含源自Nicotiana sylvestris的谷氨酰胺合酶编码区的(具有录入号X66940下登记的EMBL序列的核苷酸67到核苷酸1363)并已通过PCR扩增在其上改造了XbaI位点(起始密码子的5’端)和EcoRV位点(编码区的3’末端)的DNA片段导入XbaI/Eco1CRI线性化的pUNN5(WO 94/29465)来得到构建。
将烟草叶盘在加有1mg/L BAP(苄基氨基嘌呤)的5ml MS20培养基[补加20g/L蔗糖的Ms盐(Murashige和skoog，1968，植物生理学15，473-497)]中培养2天，而后与LBA4404met(pNUN25)或LBA4404metHV(pNUN25)一起培养至终OD600 0.05。在16小时/8小时光照/黑暗循环周期下于27℃培养2天。接着，将叶盘转移至加有1mg/LBAP和100mg/L卡那霉素的固化MS20培养基上。当卡那霉素抗性苗出现时，将其取出并在选择培养基上进一步培养。当使用LBA4404met(pNUN25)时，从约100个叶盘分离到约60株转化苗；而使用LBA4404metHV(pNUN25)时，从约100个叶盘分离到约223株转化苗。
由此可得出结论，即高毒性Ti质粒的vir基因在营养缺陷型背景下仍发挥与Jin等在原养型背景下所观察到的(上述)相同的作用。实施例3：黄瓜(Cucumis sativa)的植物中转化
基因型Gu1665-M的黄瓜种子通过在70％乙醇溶液中放置1分钟随后在4％次氯酸盐溶液中放置15分钟表面杀菌。种子在无菌H2O中洗3次并在体外培养成植株。从无菌生长的细胞收获24个节间段并将其在10ml液体MS20中培养30分钟，向其中加入LBA4404met(pNUN8)细菌(培养于加有0.1mM甲硫氨酸、100mg/L卡那霉素、25mg/L链霉素和2mg/L四环素的LB中)至终OD600 0.1。pNUN8是与pVDH99(见以下描述)相似的T-DNA载体，其中包含nptII嵌合报告基因的EcoRI/XhoI DNA片段已由包含在CaMV35S衍生的启动子和终止子序列之间的嵌合膦丝菌素乙酰转移酶编码区的DNA片段置换。从细菌悬浮液中取出节间段并通过在滤纸上迅速吸干除去多余的细菌。接着将接种的节间段转移到MS20固体培养基上再生。
然后使用看来健康的再生植物通过组织化学染色证明花中细菌的存在以及花部分中β-葡糖醛酸酶活性的存在。
为证明农杆菌的存在，将来自限菌生长植物的30朵花在1ml LB中培养。在培养2-3天后，在28个样品中观察到细菌生长。
也按照Jefferson(1987)(植物分子生物学报告5(4)：387-405)对花进行β-葡糖醛酸酶活性的组织化学染色。在至少6朵花中，观察到六个表现GUS活性从而表明这些组织中DNA转移的点。使来源于传粉的雌性花的种子在含有膦丝菌素的培养基上发芽以得到转化的植物。实施例4烟草(Nicotiana tabacum)的植物中转化
从无菌生长的烟草植物(SR1)分离节间段并在LBA4404meHV(pVDH8)细菌的悬浮液(OD600 0.05/30ml MS20中)中培养120分钟。接着将节间段转移到补加10μM乙酸丁香酮的固化MS20培养基上。对来自体外再生植物的幼叶进行组织化学GUS染色并在几片叶中观察到不同大小的蓝色部分。染色部分的大小差异可能反映了T-DNA进入细胞谱系中的前身细胞这一时间点的入口。使用再生植物的叶作为起始材料分离叶盘，叶盘在含PPT的培养基上培养以获得转基因苗和最终的转基因植物(根据Horsch等，1984，科学223：496-498描述的方法)。实施例5：番茄(Lycopersium esculentum)的植物中转化
从无菌生长的番茄植物(Moneymaker)分离节间段并在LBA4404metHV(pVDH99)细菌的悬浮液(OD600 0.05/30ml MS20中)中培养15分钟。PVDH99是包含带有如van Canneyt等(1990，Mol.Gen.Genet.220：245-250)所述的35S-GUS-内含子嵌合基因以CaMV35S-nptII嵌合选择基因的T-DNA的质粒。此质粒还包含细菌卡那霉素抗性。接着将节间段转移到补加10μM乙酸丁香酮的固化MS20培养基上。对来自体外再生植物的幼叶进行组织化学GUS染色并在几片叶中观察到不同大小的蓝色部分。染色部分的大小差异可能反映了T-DNA进入细胞谱系中的前身细胞这一时间点的入口。使用再生植物的叶作为起始材料分离叶盘，在含卡那霉素的培养基上培养以获得转基因苗和最终的转基因植物(根据MC Cormick等，1986植物细胞报告5：81-84描述的方法)。实施例6：韭葱(Allium ampeloprasum)的植物中转化
为此目的，使用并收获完全成熟的田间生长植物。让植物干燥3天以减少侵染。收集阳茎基片，切成4片(彻底清除根部)，并且随后通过70％乙醇中浸没1分种，接着用2％NaOCl(商业漂白剂)处理20分钟来灭菌。这样处理之后将外植体用无菌水洗4次，每个冲洗步骤之间有10分钟间隔。
将这些外植体转移至诱导培养基[DS大量元素(Dunstan和Short，1979，Sci Hort 112：37-43)，MS微量元素(Murashige和Skoog，1968，下述)，FeEDTA，硫胺素10mg/L，吡哆醇1mg/L，烟酸1mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30g/L，异戊烯腺嘌呤(2-IP)4mg/L，NAA 1.25mg/L，琼脂8g/L]。在光强度2000至4000勒克斯下于21℃培养3至4周后，开始出现第一个小植株，然后将其用于接种农杆菌LBA4404metHV(pVDH99)。为此目的，从最初的外植体切下幼下植株，在幼小植物的底部进行切割。将此创伤的底部在OD600约0.01的农杆菌悬浮液中浸泡30分钟时间。在转移到诱导培养基之前通过在滤纸吸干迅速除去多余的农杆菌悬浮液。接种的植物发育出一些不定植株，对其中的一些植株通过组织化学GUS染色进行测试以验证推测的转基因部分的存在。将相似的不定小植株转移到允许成熟韭葱植株生长的培养基[与诱导培养基相似，除了NAA减至0.1mg/L并且蔗糖减至20g/L]上。从再生的成熟植物收获种子，并且使种子萌发以获得转基因植物。转基因植物通过它们在含卡那霉素的培养基上的生长能力识别。通过***的T-DNA序列的PCR探测进一步识别转基因植物。实施例7：农杆菌介导的来自黄瓜(Cucumis sativa)的胚发生愈伤组织的转化
来自黄瓜基因型941687-G的胚发生愈伤组织如所述的(Chee，P.(1990)Hortscience 25(7)，792-793)产生。在培养皿中将愈伤组织切成小于1mm小块，置于5ml MS30 2/0.5 2-4D/kin[另加30g/L蔗糖、2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和0.5mg/L细胞***素的MS盐(Murashige和Skoog，1968植物生理学15，473-497)]。向此培养皿加入根瘤农杆菌LBA4404metHV(pTOK47)(pVDH99)悬浮液至0.5终OD600。细菌已于28℃、在补加0.1mM甲硫氨酸、100mg/L卡那霉素、25mg/L链霉素和2mg/L四环素的10ml LB中振荡培养2天。通过离心收集细菌，用MS30 2/052-4D/kin培养基洗并以原始密度重新悬浮。
在黑暗中于27℃共培养4天后，愈伤组织用25ml液体MS30 2/0.5培养基洗2次，铺在加有199mg/L卡那霉素的固化MS30 02/0.5培养基上，并于27C、黑暗中培养。2周后，如Jetterson(1987)(植物分子生物学报告5(4)：387-405)所述对选择的愈伤进行组织化学GUS染色。至少在5个愈伤中可见蓝色部分，意味着细胞已由pVDH99的T-DNA转化。将生长在选择培养基上的看来健康的愈伤部分切下并转移到无卡那霉素的相似培养基上使之再生。实施例8：营养缺陷型农杆菌菌株介导的胡萝卜原生质体的转化
根据Dirks等，1996(R.Dirks，V.Sidorov，C.Tulmens 1996，Theor.Appl.Genet.93：809-815)从Daucus Carrota变种Sytan B142叶柄中分离胡萝卜原生质体，并将其以8×105原生质体/ml的密度重新悬浮于加有0.1mg/L 2，4-D和0.2mg/L玉米素的CPP-CA(CPP培养基根据Dirks等，1996，略去了水解酪蛋白氨基酸)中。使4个装有1.5ml原生质体悬浮液的培养皿与根瘤农杆菌LBA4404met(pUNU20)(加至终OD600 0.05)于27℃共培养2天。原生质体培养基中不加抗生素。在加入原生质体前收集并洗涤细菌以去除甲硫氨酸。
pUNU20是T-DNA载体，包含带有嵌合选择性nptII基因的T-DNA和由CaMV 35S启动子、与启动子可操作连接的H+ATPase β亚基(Shinozaki，k.，Devo，H.，Keto，A.和Suginec，M.(1983)基因24，147-153；EMBL数据库录入号K00507)和随后的胭脂氨酸合酶基因终止子组成的嵌合基因。该质粒进一步包含T-DNA边界之外的细菌卡那霉素抗性基因。
2天后，向每个培养皿加1.5ml藻酸盐，包含原生质体的藻酸盐盘浮在3ml含0.1mg/L 2，4-D和0.2mg/L玉米素的CPP-CA中约12天，而后加100mg/L卡那霉素，继续培养约2周。然后，将藻酸盐盘溶解在40mM柠檬酸钠中，洗涤，重新悬浮于5ml补加0.1mg/L NAA(萘乙酸)和0.2mg/L玉米素的CPP-CA 30/20 S/N中并铺在含75或100mg/L卡那霉素的固体培养基(含0.1mg/L 2，4-D和0.2mg/L玉米素的CPP-CA30/20 S/N)上。当在选择培养基上健康生长的愈伤出现时，将其转移到新鲜选择培养基上。从4.8×106原生质体得到约285个绿色卡那霉素抗性愈伤。将这些愈伤转移到加有200mg/L Calforan和100mg/L卡那霉素的B5-0.1培养基(B5培养基依据Gamborg，O.，Miller，R.，Ojima K.(1968)Experimental Cell Research 50：151-158，含0.1mg/L2，4-D)上以诱导胚发生愈伤组织并且使用无生长调节剂的B5培养基再生植株。实施例9：用营养缺陷型农杆菌菌株转化菊苣(Cichorium属种类)
菊苣的种子经表面灭菌(2％次氯酸钠中)、冲洗，在MS20培养基上萌发并于27℃培养4至8周。将直径约4-6mm的叶盘转移到补加1mg/L BAP、0.2mg/L NAA和0.01mM甲硫氨酸的MSN20培养基[MS盐(Murashige和Skoog，上述)，维生素(根据Nitsch和Nitsch 1965，Ann.Phys.Veg 7，251-266)，甘氨酸2.0mg/L，蔗糖20g/L pH5.8，琼脂8g/L]上，注意将叶盘的远轴面与培养基接触。1天之后，将叶盘浸入包含T-DNA载体pUNU7的根瘤农杆菌LBA4404met细菌悬浮液(OD600在0.01和0.1之间)中20分钟。pUNU7是包含带有如Van Canneyt等(同上)所述的CAMV 35S启动子-GUS-内含子嵌合基因和嵌合选择性nptII基因的T-DNA的质粒。此质粒进一步包括细菌表达的卡那霉素抗性基因。
叶盘进一步在补加1mg/L BAP、0.2mg/L NAA的MSN20上培养2天，而后在液体MS20培养基中洗。将洗过的叶盘在补加1mg/L BAP，0.2mg/L NAA和100mg/L卡那霉素的选择培养基MNS20上进一步培养(每14天转移到新鲜选择培养基上)。5周之后，将选择培养基换成含0.1-1mg/L BAP和100mg/L卡那霉素的MS20。
从48个叶小块产生了约20株卡那霉素抗性转化植物。实施例10：农杆菌介导的DSM6009玉米原生质体的转化
根据EP 0469273A1制备基因型DSM6009的玉米原生质体，将其与包含辅助质粒pAL4404和T-DNA载体pGSV71的根瘤农杆菌LBA4404met共培养2-3天。pGSV71是衍生自pGSC1700(Comelissen和Vandewiele，1989，核酸研究17：833)的T-DNA载体，区别在于其缺乏内酰胺酶基因并含有以SEQ ID No.1的序列为特性的T-DNA。pGSV71包括与CaMV35S可操作连接的选择性嵌合bar标记和胭脂氨酸合酶基因的3’端。2天后，原生质体用W5缓冲液洗并进一步根据EP0469273 A1培养。转化细胞的选择和再生至转化玉米植物按EP 0469273A1中所述的进行。获得膦丝菌素抗性玉米植物并通过聚合酶链式反应和Southern分析证实转基因的存在。实施例11：营养缺陷型农杆菌菌株ATHVade，his的分离和评估
对于两种养分营养缺陷的农杆菌菌株通过以下流程从菌株ATHV(Lazo等描述，1991，生物技术9：963-967，如菌株AGL0)开始选择。
将菌株ATHV在补加100μg/ml利福平(Rif)的LB中培养过夜。用1ml此细胞培养物接种含20ml LB/100μg Rif的培养瓶并使之于30℃(同时振荡)生长4小时。以254mm紫外光照射10ml此细胞培养物2至4小时。将10μl紫外光照射的培养物在用琼脂固化的LB/Rif培养基上铺板并于30℃、黑暗中培养2至3天。将所得菌落平板复制到补加100μg/ml利福平的基本培养基(M9，见实施例1)和LB培养基上。分离不能在基本培养基上生长的克隆并分析其营养需要。鉴定到生长需添加腺嘌呤并在加组氨酸时生长明显更好的一个菌株ATHVade，his。(见表1)。这种对外源补充养分的双重需求允许甚至更好地控制此农杆菌菌株的生长。表1：ATHVade，his在含有不同浓度腺嘌呤(ade)和组氨酸(his)的基本培养基上的生长。这些数值代表生长2天后测定的OD600。
  Ade0mM    Ade0.005mM    Ade0.01mM    Ade0.05 mM    Ade0.1 mM
 His 0 mM   0.019    0.059    0.067    0.111    0.129
 His 0.01 mM   0.034    0.07    0.071    0.111    0.141
 His 0.05 mM   0.04    0.093    0.112    0.144    0.196
 His 0.1 mM   0.035    0.102    0.123    0.163    0.221
为分析菌株ATHVade，his是否仍能进行T-DNA转移，使用含T-DNA载体pNUN7的衍生菌株(见实施例9)侵染烟草和N sylvestris的叶盘，并与含相同T-DNA载体的野生型ATHV菌株比较。在烟草中，用ATHV(pNUN7)接种后从约50个叶片获得约115株转化苗，而用ATHVade，his(pNUN7)接种后从约50个叶片获得约112株转化苗。在N.sylvestris中，以ATHV(pNUN7)接种后，从约50个叶片获得约17株转化苗，而以ATHVade，his(pNUN7)接种后，从约50个叶切片获得约40株转化苗。实施例12：矮牵牛(Petunia hybrida)的植物中转化
从无菌生长植物分离节间段或茎尖(在长有最初3至4mm叶片的节下切割)并与农杆菌LBA4404metHV(pNUN7)细胞悬浮液一起培养约7到10分钟，如前面实施例所述的吸干并在植物培养基上培养。茎尖不是浸入而是将切割端置于含农杆菌的容器中。在不同时间对外植体和再生植物的内部检查揭示GUS表达至少发生在维管束中。
体外培养4周后，评估植物不同部分中的细菌存在。为此目的，摘取不同叶部分，在含100μl LB的试管中研磨。沉淀后，取20μl上清在含利福平的LB培养基上铺板。结果总结于表2。表2侵染的矮牵牛植物的不同部分中测定的细菌数
    被测叶片     20μl来自结节培养物的植物提取物中的细菌数(个体实验)    20μl来自茎尖培养物的植物提取物中的细菌数(个体实验)
    上部尖端         204/92/0    ＞200/＞500/0
    上部中央         271/0/0    ＞500/6/0
    中部尖端   ＞500/5/0＞1000/＞500/26＞1000    200/1/＞200/＞1000/＞500/＞100/0/5＞1000/＞1000
    中部中央         10/0/50     ＞200/19/500
    底部尖端        ＞500/449/3     ＞500/19/1000
    底部中央        ＞500/0/0     ＞2000/＞1000/0
所有被测植物都含有Rif抗性农杆菌，而所有被测样品的约75％含有农杆菌。实施例13：根瘤农杆菌菌株LBA4404metHV与LBA4404HV在欧洲油菜转化中转化效率的比较
将根瘤农杆菌LBA4404metHV衍生物(包含带有嵌合β-葡糖醛酸酶基因的T-DNA载体)在从“Topas”的小孢子培养物获得的胚转化中的转化效率与LBA4404HV和包含相同T-DNA载体的GV3101的转化效率进行比较。在转化中的事件顺序可以总结如下：
a.从欧洲油菜的小孢子建立细胞培养物
b.产生体细胞胚
c.将这些胚与包含T-DNA载体的根瘤农杆菌菌株共培养
d.使共培养的胚生长到下胚轴阶段并诱导次级胚发生
e.对次级胚进行选择
f.对存活的胚进行B-葡糖醛酸酶表达的评估
当使用包含带有嵌合β-葡糖醛酸酶基因的T-DNA载体的LBA4404metHV转化欧洲油菜时，约80％得到的次级胚具有GUS+区，而用包含相似T-DNA载体的LBA4404HV共培养时，仅5％的次级胚表现这样的点。在进一步的定量分析中，比较LBA4404metHV、LBA4404HV和GV3101(都含有带有嵌合β-葡糖醛酸酶基因的T-DNA载体)的转化效率。结果总结于表3中，证明使用LBA4404metHV转化更有效。表3转化效率，通过GUS表达分析
    宿主菌株     有GUS+区的胚的百分数   每个胚的GUS+区的平均数
    LBA4404metHV        82     ＞20
    LBA4404HV        67     5-10
    GV3101        59     ±5
                         序列表<110>Nunhems Zaden BV<120>改良的农杆菌介导的植物转化<130>B3715A<140><141><150>EP 97114654.3<151>1997-08-25<160>2<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>2345<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：pGSV71的T-DNA<220><221>misc_信号<222>(1)..(25)<223>RB：T-DNA右边界<220><221>启动子<222>(53)..(1436)<223>CaMV35S P3启动子<220><221>CDS<222>(1437)..(1988)<223>编码膦丝菌素乙酰转移酶的区域<220><221>3′UTR<222>(2007)..(2266)<223>3′nos：包含农杆菌T-DNA胭脂氨酸合酶基因的多腺苷酸化信号的3′非翻译区。<220><221>misc_信号<222>(2321)..(2345)<223>LB：T-DNA左边界<400>1aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga ccgcggtacc cggaattcca    60atcccaccaa aacctgaacc tagcagttca gttgctcctc tcagagacga atcgggtatt   120caacaccctc ataccaacta ctacgtcgtg tataacggac ctcatgccgg tatatacgat   180gactggggtt gtacaaaggc agcaacaaac ggtgttcccg gagttgcgca taagaagttt   240gccactatta cagaggcaag agcagcagct gacgcgtata caacaagtca gcaaacagat   300aggttgaact tcatccccaa aggagaagct caactcaagc ccaagagctt tgcgaaggcc   360ctaacaagcc caccaaagca aaaagcccac tgctcacgct aggaaccaaa aggcccagca   420gtgatccagc cccaaaagag atctcctttg ccccggagat tacaatggac gatttcctct   480atctttacga tctaggaagg aagttcgaag gtgaaggtga cgacactatg ttcaccactg   540ataatgagaa ggttagcctc ttcaatttca gaaagaatgc tgacccacag atggttagag   600aggcctacgc agcaggtctc atcaagacga tctacccgag taacaatctc caggagatca   660aataccttcc caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaat tgcatcaaga   720acacagagaa agacatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag   780gcttgcttca taaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccta   840ctgaatctaa ggccatgcat ggagtctaag attcaaatcg aggatctaac agaactcgcc   900gtgaagactg gcgaacagtt catacagagt cttttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc   960ttcgtcaaca tggtggagca cgacactctg gtctactcca aaaatgtcaa agatacagtc  1020tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaagga taatttcggg aaacctcctc  1080ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcgaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc  1140tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatca ttcaagatgc ctctgccgac  1200agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca  1260accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gacatctcca ctgacgtaag ggatgacgca  1320caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag  1380aggacacgct gaaatcacca gtctctctct ataaatctat ctctctctct ataacc atg  1439
                                                          Met
                                                            1gac cca gaa cga cgc ccg gcc gac atc cgc cgt gcc acc gag gcg gac    1487Asp Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala Asp
          5                  10                  15atg ccg gcg gtc tgc acc atc gtc aac cac tac atc gag aca agc acg     1535Met Pro Ala Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser Thr
     20                  25                  30gtc aac ttc cgt acc gag ccg cag gaa ccg cag gag tgg acg gac gac     1583Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp Asp
 35                  40                  45ctc gtc cgt ctg cgg gag cgc tat ccc tgg ctc gtc gcc gag gtg gac     1631Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val Asp50                  55                  60                  65ggc gag gtc gcc ggc atc gcc tac gcg ggc ccc tgg aag gca cgc aac     1679Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg Asn
             70                  75                  80gcc tac gac tgg acg gcc gag tcg acc gtg tac gtc tcc ccc cgc cac     1727Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg His
         85                  90                  95cag cgg acg gga ctg ggc tcc acg ctc tac acc cac ctg ctg aag tcc     1775Gln Arg Thr Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys Ser
    100                 105                 110ctg gag gca cag ggc ttc aag agc gtg gtc gct gtc atc ggg ctg ccc     1823Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu Pro
115                 120                 125aac gac ccg agc gtg cgc atg cac gag gcg ctc gga tat gcc ccc cgc     1871Asn Asp Pro Ser Val Arg Met His Glu Ala Leu Gly Tyr Ala Pro Arg130                 135                 140                 145ggc atg ctg cgg gcg gcc ggc ttc aag cac ggg aac tgg cat gac gtg     1919Gly Met Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp Val
            150                 155                 160ggt ttc tgg cag ctg gac ttc agc ctg ccg gta ccg ccc cgt ccg gtc     1967Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro Val
        165                 170                 175ctg ccc gtc acc gag atc tga tctcacgcgt ctaggatccg aagcagatcg        2018Leu Pro Val Thr Glu Ile
    180ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat   2078tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac   2138gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat   2198agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt   2258actagatcgg gaagatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttag atccatggag   2318ccatttacaa ttgaatatat cctgccg                                       2345<210>2<211>183<212>PRT<213>人工序列<400> 2Met Asp Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala1               5                  10                  15Asp Met Pro Ala Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser
         20                  25                  30Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp
     35                  40                  45Asp Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val
 50                  55                  60Asp Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg65                  70                  75                  80Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg
             85                  90                  95His Gln Arg Thr Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys
        100                 105                 110Ser Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Va1 Ala Val Ile Gly Leu
    115                 120                 125Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg Met His Glu Ala Leu Gly Tyr Ala Pro
130                 135                 140Arg Gly Met Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp145                 150                 155                 160Val Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro
            165                 170                 175Val Leu Pro Val Thr Glu Ile
        180

Claims (17)

1.一种制备包含整合入其至少部分细胞的基因组的外源DNA片段的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提供用带有与至少一个T-DNA边界序列可操作连接的目的DNA的营养缺陷型农杆菌菌株***侵染的植物，并且
2)从所述***侵染的植物分离的单细胞或细胞群产生转基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中用所述营养缺陷型农杆菌菌株***侵染的所述植物从用所述营养缺陷型农杆菌菌株接种的外植体组织再生。
3.根据权利要求2所述的方法，其中用所述营养缺陷型农杆菌菌株***侵染的所述植物的再生在植物再生培养基上、不合对所述营养缺陷型农杆菌菌株有杀菌或抑菌效应的化合物的情况下进行。
4.根据权利要求1至3中的任意一项所述的方法，其中所述转基因植物通过从所述***侵染植物分离的原生质体的体外再生来产生。
5.根据权利要求1至3中的任意一项所述的方法，其中所述转基因植物通过从所述***侵染植物分离的外植体组织的体外再生来产生。
6.根据权利要求1至3中的任意一项所述的方法，其中所述转基因植物通过所述***侵染植物的小孢子的体外再生来产生。
7.根据权利要求1至3中的任意一项所述的方法，其中所述转基因植物通过所述***侵染植物的转化后代种子的萌发来产生。
8.根据权利要求1至7中的任意一项所述的方法，它进一步包括在产生转化植物的步骤之前向***侵染的植物的至少部分施用所需养分的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述的所需养分施用给所述***侵染的植物的花序分生组织或未成熟花序。
10.根据权利要求1至9中的任意一项所述的方法，其中所述农杆菌是半胱氨酸或甲硫氨酸或腺嘌呤和组氨酸营养缺陷型。
11.根据权利要求1至9中的任意一项所述的方法，其中所述农杆菌是LBA4404met或ATHVade，his。
12.细菌菌株LBA4404met。
13.细菌菌株ATHVade，his。
14.甲硫氨酸或半胱氨酸或腺嘌呤和组氨酸营养缺陷型农杆菌菌株在农杆菌介导的植物转化中的用途。
15.甲硫氨酸或半胱氨酸或腺嘌呤和组氨酸营养缺陷型农杆菌菌株在农杆菌介导的甜菜愈伤组织转化中的用途。
16.甲硫氨酸或半胱氨酸或腺嘌呤和组氨酸营养缺陷型农杆菌菌株在农杆菌介导的玉米原生质转化中的用途。
17.根据权利要求13至15中的任意一项所述的用途，其中所述营养缺陷型农杆菌选自LBA4404met、ATHVade，his及它们的衍生物。
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