CN102282262B - 用于转化植物的营养缺陷型农杆菌和其方法 - Google Patents

Abstract

提供了营养缺陷型农杆菌和使用营养缺陷型农杆菌的方法。营养缺陷型农杆菌可以用于多种方法中，包括以生物学方式防范包含转基因的农杆菌并在不使用农杆菌反选择剂的情况下转化植物细胞。利用胸苷营养缺陷型农杆菌转化玉米未成熟胚，导致与利用原养型农杆菌所获得的转化相当的转化效率。公开了产生农杆菌胸苷营养缺陷体和在转化方法中利用营养缺陷体的方法。还提供了利用本发明的方法所产生的转化的组织和植物。

Description

用于转化植物的营养缺陷型农杆菌和其方法

相关申请的交叉引用 

根据35U.S.C.§119，本申请要求2008年12月31日提交的临时申请序列第61/141,967号的优先权，通过引用将该申请整体并入本文。 

发明领域

本申请涉及营养缺陷型农杆菌(Agrobacterium)和农杆菌营养缺陷体在植物细胞稳定的基因转化中的用途。 

发明背景 

农杆菌是土壤革兰氏阴性细菌的一个属，其广泛用于将外源DNA引入植物中。农杆菌种类用于DNA转移的用途基于它们将DNA序列转移到植物基因组的天然能力。最广泛使用的农杆菌种类是根癌农杆菌(A.tumefaciens)，其是植物中肿瘤疾病冠瘿病的病原体。密切相关的种类即发根农杆菌(A.rhizogenes)诱发毛根病，也用于将DNA转移到植物基因组，但是程度较小。这些细菌将DNA转移到植物的能力取决于细胞中大质粒(＞100kb)的存在。这些质粒在根癌农杆菌和发根农杆菌中分别称为Ti(肿瘤诱发)或Ri(根诱发)。第三个种类即放射形农杆菌(A.radiobacter)的不同在于缺少Ti或Ri质粒。DNA从细菌转移到植物基因组的机制涉及使特定T-DNA(转移DNA)分子从Ti质粒移动到宿主细胞。T-DNA区的轮廓为称为左右边界的25bp。在致病农杆菌细胞中，用于过量产生表现冠瘿病症状的生长素和细胞***素的基因位于T-DNA元件内。致病农杆菌菌株的T-DNA元件还含有用于产生被该细菌用作氮源的冠瘿碱的基因。 

农杆菌介导的向植物基因组的DNA转移通常用“无害的”(将生长素、细胞***素以及冠瘿碱基因从T-DNA元件中去除)的菌株进行。在转化研究中，将目的序列引入“无害的”农杆菌菌株的T-DNA区。该嵌合T-DNA元件可以被称为二元载体的单独的、较小的、宿主广泛的质粒携 带，或者被直接引入固有的“无害的”Ti质粒中。在基本的农杆菌介导的转化方案中，第一步需要用在嵌合的T-DNA元件中携带目的基因的“无害的”农杆菌细胞的转化结合子接种植物细胞。随后在称为共培养的该方案的步骤中，将细胞培养通常范围为1-7天的时期。共培养期后，在再生培养基中对植物细胞进行传代培养，使植物进一步发育。 

植物的农杆菌转化方法的通常实践是，在共培养后的植物培养基中使用农杆菌反选择剂，如抗生素，作为反选择农杆菌细胞的策略。反选择用于治愈植物农杆菌组织。如果未治愈，农杆菌会快速过量生长并杀死植物组织，由此导致很少的转基因事件或无转基因事件产生。此外，不同的反选择剂差异性地影响不同的农杆菌菌株，参阅例如Ogawa，Y.，et al.，Screening for highly active beta-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens，Arch Microbiol，181(4)：331-6(2004)。有些反选择剂具有杀生作用，而其他的具有生物抑制作用。同样，植物细胞和组织培养物可能对细菌反选择剂具有不同的应答(例如，Ling，H.Q.，et al.，Effect of ticarcillin/potassium clavulanate on callus growth and shoot regeneration in Agrobacterium-mediated transformation of tomato(Lycopersicon esculentum Mill.)Plant Cell Reports，17：843(1998.)；Tang，H.，et al.，An evaluation of antibiotics for the elimination of Agrobacterium tumefaciens from walnut somatic embryos and for the effects on the proliferation of somatic embryos and regeneration of transgenic plants，Plant Cell Reports，19：881(2000)；Alsheikh，M.K.，et al.，Appropriate choice of antibiotic and Agrobacterium strain improves transformation of antibiotic-sensitive Fragaria vesca and F.v.semperflorens，Plant Cell Reports，20：1173(2002)。尽管有些细菌抗生素对植物细胞培养物是毒性的，但其他细菌抗生素可能具有植物生长调节剂活性(例如，Borrelli，G.M.，et al.，Effect of cefotaxime on callus culture and plant regeneration in durum wheat，Journal of Plant Physiology，140：372(1992)；Lin，J.J.，et al.，Plant hormone effect of antibiotics on the transformation efficiency of plant tissues by Agrobacterium tumefaciens cells，Plant Science(Limerick)，109：171(1995)。在经由农杆菌的任何植物转化方案的研发中，使用有效杀死农杆菌但是对植物组织无不良影响的反选择 剂，都非常重要(Shackelford，N.J.，et al.，Identification of antibiotics that are effective in eliminating Agrobacterium tumefaciens，Plant Molecular Biology Reporter，14：50(1996)。这耗时且难以确定这些条件，且本领域普通技术人员必须为实现可接受水平的植物转化效率而让步(Ogawa，Y.，et al.，Screening for highly active beta-lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens，Arch Microbiol，181(4)：331-6(2004)；Ogawa，Y.，et al.，Evaluation of 12 beta-lactam antibiotics for Agrobacterium-mediated transformation through in planta antibacterial activities and phytotoxicities，Plant Cell Rep，23(10-11)：736-43(2005)。出于这些和其他原因，需要本发明。 

发明概述 

本发明的目标、特征或优势是，提供了不需要农杆菌反选择剂来治愈植物农杆菌组织的转化和再生植物细胞的方法。 

本发明的另一目标、特征或优势是，提供了有效转化和再生植物细胞的方法。 

本发明的还一目标、特征或优势是，提供了不及传统的转化方法昂贵的转化和再生植物细胞的方法。 

本发明的另一目标、特征或优势是，提供了不使用农杆菌反选择剂同时保持转化频率和效率的转化和再生植物细胞的方法。 

本发明的另一目标、特征或优势是，提供了对植物细胞培养物不具有不良影响的转化和再生植物细胞的方法。 

本发明的另一目标、特征或优势是，提供了有效杀死农杆菌的转化和再生植物细胞的方法。 

本发明的另一目标、特征或优势是，提供了以生物学的方式防范植物的转化和再生中所用的转基因农杆菌的方法。 

本发明的另一目标、特征或优势是，提供了营养缺陷型农杆菌。 

根据说明书和其后的权利要求书，本发明的这些和其他目标、特征或优势中的一个或多个，会变得显而易见。 

根据本发明的一方面，在缺少农杆菌反选择剂的情况下，转化植物 细胞和再生转化的植物细胞的方法包括，在存在营养缺陷型农杆菌的存活、增殖和生长所需的化合物的情况下，使植物细胞与胸苷营养缺陷体农杆菌接触。该营养缺陷体在不存在所述化合物的情况下会表现出不能存活、增殖或生长。合适的化合物包括但不限于胸苷或胸腺嘧啶或其在胸腺嘧啶生物合成途径中的衍生物。 

营养缺陷体可以在例如二元载体中容纳转基因，以便能够将该转基因转移到植物细胞。对于一个或多个参于胸腺嘧啶的生物合成或该途径的调节的基因而言，胸苷营养缺陷体可以是缺陷的或无效的。一方面，胸苷营养缺陷体具有例如由于缺失、部分缺失、敲除、***和/或突变而受到破坏的胸苷酸合酶基因。营养缺陷型农杆菌可以来自根癌农杆菌、发根农杆菌或放射形农杆菌中。根据本发明的另一方面，提供了产生农杆菌胸苷营养缺陷体的方法。 

有利的是，本发明允许在不使用诸如抗生素或除草剂的农杆菌反选择剂的情况下，再生植物细胞、植物部分或植物。常见的反选择剂包括但不限于羧苄青霉素、头孢噻肟、万古霉素、氧哌嗪青霉素、羟基噻吩青霉素、头孢他啶、头孢布宗、头孢米诺、拉氧头孢、氟氧头孢、氨曲南、卡芦莫南或美罗培南。 

转基因的转移可以通过在存在营养缺陷型农杆菌的存活、增殖或生长所需的化合物的情况下共培养植物细胞与胸苷营养缺陷体而促进。可以在缺少农杆菌反选择剂和缺少营养缺陷体生长所需的化合物的情况下，选择并再生表达转基因的转化的植物细胞。在缺少营养缺陷体存活所需的化合物的情况下，营养缺陷体死亡且不需要反选择抗生素来治愈植物污染性农杆菌材料。另外，营养缺陷型农杆菌和其在转化植物细胞中的用途允许携带转基因的农杆菌的生物防范。营养缺陷体显著地使基因工程生物偶然释放的可能性最小化或甚至将其消除。 

根据下述描述，本发明的其他目标、特征、优势以及方面对本领域技术人员将会变得显而易见。然而，应当理解，下述描述和具体实施例，尽管表示本发明的优选方面，但是仅以说明的方式给出。通过阅读下述描述和通过阅读本公开的其他部分，在所公开的本发明的精神和范围内的各种变化和修饰，会毫无困难地对本领域技术人员变得显而易见。 

附图简要说明 

根据下述详细描述和附图，可对本发明获得更全面的理解。 

图1表示根癌农杆菌C58(LBA4404)(SEQ ID NO：11)ThyA基因缺失突变体的核苷酸序列，还参阅Genbank登录号NC003062和AE007869。加下划线的序列是ThyA基因的5’末端。加粗的序列是3′序列(缺失后)。突出的序列表示编码序列。双细线标记(∥)表示ThyA基因受到破坏的位置。 

图2是表示ThyA缺失克隆向根癌农杆菌ThyA区可能的整合的概括图解，具有所示的分析PCR引物结合位点的位置。 

图3是农杆菌胸苷营养缺陷体和野生型农杆菌在非补充条件(unsupplemented condition)下的比较生长。如图3所证明和如实施例3所述，在缺少胸苷的情况下，农杆菌胸苷营养缺陷体与非营养缺陷型的原养型农杆菌菌株LBA4404相比，具有有限的生长。 

图4是本发明方法的一实施方案所用步骤与标准植物转化和产生方法所用步骤的示意性比较。 

图5是比较在具有胸苷营养缺陷型农杆菌和不具有胸苷营养缺陷型农杆菌的情况下，利用转化和再生方法所获得的转化频率的图表。在本文的其他地方，如实施例4中，进一步描述了方法。 

发明的详细描述 

现在，在下文，参考附加的实施例，对本发明进行更全面的描述，其中，显示了本发明的一些但并不是所有的方面。实际上，本发明可以以许多不同的形式体现，并且不应当解释为限于本文所阐述的方面；而是，为了使公开满足可应用的法律要求而提供了这些方面。同样的编号在全文中表示同样的元件。本申请所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献在此通过援引整体并入，如同特意和单独指出每一出版物、专利、专利申请或其他参考文献通过援引并入。 

在获得本文描述和附图所呈现的教导的益处后，本发明所属领域的技术人员会想到本文所阐述的本发明的许多修饰和其他方面。因此，应 当理解，本发明并非限于所公开的具体方面，且修饰和其他方面包括于所附权利要求书的范围内。尽管本文使用了特定术语，但是它们仅以一般性和描述性意义使用，不是出于限制目的而使用。 

冠词“a(一个)”和“an(一个)”在本文中用于表示一个或多个(即至少一个)该冠词的语法对象。作为实例，“元件(an element)”表示一个或多个元件。 

定义： 

如本文所用，术语“选择剂”表示包括作用是可以允许区分用异源序列转化的细胞与在转化过程中未转化的细胞的任何化合物，所述异源序列是，如在转化过程中引入的赋予对该选择剂的抗性的基因。细胞可以是植物细胞或农杆菌细胞。示例性的选择剂包括但不限于：卡那霉素、潮霉素、链霉素、氯霉素、氨苄青霉素、红霉素、壮观霉素、四环素、双丙氨磷、草甘膦、草铵膦、利福平或麦草畏等。 

如本文所用，术语“反选择剂”表示包括作用是杀死植物、植物细胞或植物组织中的农杆菌细胞或降低农杆菌生长、增殖或存活的任何化合物。示例性的反选择剂包括但不限于：羧苄青霉素、头孢噻肟、万古霉素、氧哌嗪青霉素、羟基噻吩青霉素、头孢他啶、头孢布宗、头孢米诺、拉氧头孢、氟氧头孢、氨曲南、卡芦莫南、美罗培南等。 

如本文所用，术语“植物”包括提到未成熟或成熟的完整植物，包括已经去雄或者已经除去种子或谷粒的植物。会产生植物的种子或胚也认为是植物。 

如本文所用，术语“植物部分”包括叶、茎、根、种子、谷粒、胚、花粉、胚珠、花、穗、玉米穗轴、外壳、柄、根尖、花粉囊、果皮、穗丝、组织、细胞等。 

“对照”或“对照农杆菌”提供了测量营养缺陷型农杆菌的存活、生长或增殖中或利用营养缺陷型农杆菌所获得的转化频率中的变化的参照点。 

对照农杆菌可以包括例如：(a)野生型原养型农杆菌，即与作为导致候选营养缺陷型农杆菌的用于基因改变的起始材料的基因型相同的农杆 菌；(b)在原养型条件下的候选营养缺陷型农杆菌自身，其中缺少营养缺陷型农杆菌存活、生长或增殖所需的化合物；或(c)在营养缺陷条件下的候选营养缺陷型农杆菌自身，其中存在营养缺陷型农杆菌的存活、生长或增殖所需的化合物。 

本文所用术语“转基因”指将期望的DNA序列引入植物细胞的基因组中，包括但不限于通常不存在于植物细胞中的基因或DNA序列、存在于给定的基因组中但通常不转录和翻译(“表达”)的基因或期望引入基因组的任何其他基因或DNA序列。这可以包括通常存在于非转基因基因组中但期望其表达改变或期望其以改变的形式或变体形式引入的基因。术语转基因还用于描述已经或即将被人工***植物或植物细胞的基因组的遗传材料。 

本发明涉及营养缺陷型农杆菌在转化植物细胞中的用途。本文描述了新农杆菌营养缺陷体和转化植物细胞的方法。特别是，可用本发明的营养缺陷型农杆菌产生转基因植物，其中营养缺陷型农杆菌在植物或植物组织中的存在受到调节。因此，如果未被除去，则与对照例如原养型、非营养缺陷型农杆菌相比，植物、植物细胞或植物组织中可存活的营养缺陷型农杆菌的水平降低。本发明还提供了利用营养缺陷型农杆菌以生物学的方式防范包含转基因的农杆菌的方法。 

本发明的另一方面部分基于使用本发明的农杆菌胸苷营养缺陷体转化玉米未成熟的胚不需要使用诸如抗生素的反选择剂。因此，本发明还提供了，通过使用营养缺陷型农杆菌在无抗生素反选择的情况下转化植物细胞的方法。该方法还具有降低植物或植物组织中由于利用转基因农杆菌的转化技术而产生的可存活的转基因农杆菌的存在的优势。利用营养缺陷型农杆菌产生的其他优势、利益或作用在本文的其他地方做了描述。 

本发明的营养缺陷型农杆菌包括不能合成一种或多种其生长、增殖或存活所需的化合物或合成其生长、增殖或存活所需的化合物的量的能力受到削弱的农杆菌。营养缺陷型农杆菌的实例包括但不限于氨基酸、核酸、碳水化合物或维生素代谢或其组合缺陷的农杆菌。因此，对于参与代谢途径中维生素、DNA、RNA、氨基酸或碳水化合物的生物合成或 此类生物合成途径的调节的一个或多个基因而言，营养缺陷体是无效的或缺陷的。还包括具有一个或多个不能产生活性蛋白或活性充分的蛋白以致使得农杆菌对于特定化合物而言是营养缺陷体的编码蛋白的基因的营养缺陷型农杆菌，所述蛋白调节代谢途径或参与生物合成途径。这类基因的实例包括但不限于间接或直接产生或调节以下的基因：任何氨基酸，如异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸；任何核酸，如嘌呤碱或嘧啶碱，如胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、腺嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤，以及2-氨基嘌呤，或其任何前体，核苷，如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷；任何维生素，如硫胺和泛酸盐/酯。一方面，农杆菌营养缺陷体是胸苷营养缺陷体。如本文所用，术语“胸苷营养缺陷体”、“农杆菌的胸苷营养缺陷体”、“农杆菌胸苷营养缺陷体”和/或“胸苷营养缺陷型农杆菌”在本文中互换使用并包括但不限于所公开的实例以及基因受到破坏以致通过本文所述测定证明农杆菌对于胸腺嘧啶或胸苷或其衍生物而言是营养缺陷体的营养缺陷体，所述基因调节或参与胸腺嘧啶合成途径，例如导致胸腺嘧啶合成的代谢途径。一种这类基因的实例是thyA，其是编码胸苷酸核酶的基因，胸苷酸核酶是将dUMP转化为dTMP的蛋白。 

一方面，农杆菌营养缺陷体是属于农杆菌属的任何细菌，其对于至少一种特定化合物而言是营养缺陷型的，并且能将一种或多种转基因转移到植物细胞。农杆菌属的任何合适的种类或菌株都可以用于本发明中。一方面，农杆菌是属于发根农杆菌或根癌农杆菌的种类的农杆菌。一方面，农杆菌是菌株LBA4404、EHA101、C58、EHA105、AGL1或GV3101等。本发明的根癌农杆菌LBA4404thy-于2009年12月15日保藏于美国典型培养物保藏中心的专利保藏处(Patent Depository of American Type Culture Collection，ATCC)，其位于10801 University Blvd.，Manassas，Va.，20110-2209，并且指定专利保藏号为PTA-10531。因此，包含ThyA敲除的营养缺陷型农杆菌的组合物，即LBA4404thy-，其作为专利保藏号PTA-10531而保藏。该保藏物会依据布达佩斯条约有关为专利程序的取得国际承认的微生物保藏的规定而维持。进行该保藏仅仅是为了方便本领域技术人员，而不是承认是依据35U.S.C.§112要求的保藏。2009年12月15日保藏于ATCC的LBA4404thy-采集自先锋国际良种公司(Pioneer Hi-Bred International，Inc.，7250 NW 62nd Avenue，Johnston，Iowa 50131-1000)所维持的保藏物。在本申请悬而未决阶段，专利和商标委员和经请求而被所述委员决定授权的人对该保藏物有使用权。 

与本发明的方法一起使用的合适的营养缺陷型农杆菌包括但不限于天然存在营养缺陷型农杆菌即自发的营养缺陷体，和产生的营养缺陷型农杆菌。候选营养缺陷型农杆菌可以通过任何数量的合适的技术和方法产生，包括例如化学诱导突变，例如通过用亚硝基胍或紫外线照射化学处理农杆菌以诱导突变或利用重组DNA技术的基因工程。这类技术包括但不限于转化、转染、结合、定点诱变和其他技术，通过所述其他技术可以将外源核酸分子引入农杆菌并且“敲除”或破坏靶基因或基因产物，例如通过靶基因或部分基因序列的缺失、***和取代，以便破坏表达。优选农杆菌基因组中靶序列或基因的缺失降低回复突变的发生。 

缺失、***或取代靶基因的一方法是，通过使用包含靶基因或其片段敲除的核酸构建体。核酸构建体可以利用本领域技术人员熟知的方法产生，所述方法可见于诸如例如Sambrook et al.Molecular Cloning(分子克隆)，2nd edition(第二版).，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989和Ausubel，et al.Short Protocols in Molecular Biology(精编分子生物学指南)，3rd ed.(第三版)，Wiley&Sons，1995的标准教材中。一方面，核酸构建体包含与全部或部分野生型靶基因同源的至少两个序列，以便能通过同源重组整合。一方面，序列位于所有或部分靶基因的侧翼。一方面，在允许核酸构建体与野生型靶基因之间同源重组的条件下，核酸构建体接触包含靶基因的农杆菌的染色体DNA。取决于所用的同源序列，核酸构建体与野生型靶基因之间的同源重组可以导致核酸构建体整合到邻近或位于野生型基因或基因座内的农杆菌染色体中。作为同源重组和整合的结果，可以从农杆菌染色体中除去所有或部分农杆菌野生型靶基因。破坏LBA4404的ThyA基因的方法详细描述于本文的实施例1中。这些技术很容易地用于破坏其他农杆菌种类和菌株的ThyA基因。 

可选地，一方面，整合到农杆菌染色体DNA中的核酸构建体包含 连接于多核苷酸序列的选择标记基因，所述多核苷酸序列靶向参与代谢途径中维生素、DNA、RNA、氨基酸或碳水化合物的生物合成或这类生物合成途径调节的一个或多个基因。合适的选择标记基因包括赋予农杆菌表型以致可以鉴定具有整合到其DNA中的选择标记基因的转化的农杆菌的任何基因。示例性的选择标记基因包括但不限于报道基因，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶、分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶等的可视标记基因，抗生素抗性基因，如卡那霉素、链霉素、羧苄青霉素、氯霉素、氨苄青霉素、红霉素、四环素或壮观霉素抗性基因。除了筛选以外，选择标记基因还允许维持对转化的农杆菌群的选择压力，以确保引入的核酸构建体被转化的农杆菌保留。因此，候选营养缺陷型农杆菌可以经历允许选择具有整合到农杆菌染色体DNA的选择标记基因的农杆菌的条件。例如，如果选择标记基因编码赋予特定抗生素抗性的肽，则可以使候选农杆菌经历该抗生素。 

一方面，可以使农杆菌经历允许选择营养缺陷型农杆菌的条件。本领域技术人员应当认识到，候选营养缺陷型农杆菌可以利用常规技术评估，包括在支持原养型生长的环境如培养基或土壤中培养候选营养缺陷型农杆菌，并给所述环境补充营养缺陷体存活、生长或增殖所需的化合物。经历了原养型条件的候选营养缺陷型农杆菌的存活、生长或增殖，可以在存在和/或缺少所述化合物的情况下进行测定。参阅例如实施例3，其描述了，检测胸苷酸核酶基因敲除的候选农杆菌胸苷营养缺陷体在存在或缺少胸苷的情况下的生长能力。可以使营养缺陷型农杆菌生长于任何合适的培养基中，如但不限于营养肉汤、AB基本培养液(AB minimal broth)等。可用于检测农杆菌生长的测定包括但不限于细胞计数、细胞活性、细胞质量(cell mass)，例如通过利用光密度或浊度。参阅例如，Pelczar，J.，et al.，Microorganisms-Bacteria，Quantitative Measurement of Growth，in Microbiology.McGraw-Hill Book Company：New York(1986)，通过援引整体并入。在缺少所述化合物的情况下，候选营养缺陷型农杆菌的存活、生长或增殖降低或无，但在存在所述化合物的情况下，所述候选营养缺陷型农杆菌的存活、生长或增殖存在或增加，表示候选者是营养缺陷型的。 

将抗生素用于农杆菌转化方法中以治愈残留农杆菌的靶植物组织培养物。因为细菌比植物细胞生长的更迅速，因此植物材料会快速地被农杆菌杀死。尽管最有效的抗生素杀死或阻止农杆菌生长，但是它们常常对植物生长是毒性的，因此在有效杀死农杆菌的量与对植物组织引起最小量损害的量之间保持根据经验决定的平衡。这经常导致农杆菌的较不完全杀死，从而导致在转化的植物组织和由转化的植物组织再生的植物中存在小量残留的可存活的农杆菌(Mogilner，N.，et al.，The persistence of engineered Agrobacterium tumefaciens in agroinfected plants，Molecular Plant Microbe Interactions，6(5)：673-675(1993)；Landsmann，J.，et al.，Elimination of agrobacteria from transgenic plants，in Methods for risk assessment of transgenic plants：3.Ecological risks and prospects of transgenic plants，where do we go from here？A dialogue between biotech industry and science，K.Ammann，Jacot，Y.，Kjellsson，G.，Simonsen，V.，Editor.Birkhauser Verlag AG：Basel.63-67(1999)。不知道残留的农杆菌被传递给后代(Landsmann，J.，et al.，Elimination of agrobacteria from transgenic plants，in Methods for risk assessment of transgenic plants：3.Ecological risks and prospects of transgenic plants，where do we go from here？A dialogue between biotech industry and science，K.Ammann，Jacot，Y.，Kjellsson，G.，Simonsen，V.，Editor.Birkhauser Verlag AG：Basel.63-67(1999)。据推测，植物组织中残留的农杆菌细胞可以来自幸免于所应用的反选择剂或通过围绕在转化的农杆菌细胞而受到免于所应用的反选择剂的保护的农杆菌。如果直接释放再生的植物，则农杆菌的存在提出了基因工程生物偶然释放到环境中的可能性的忧虑。有利的是，一方面，本发明提供了以生物学方式防范容纳一个或多个目的转基因的农杆菌的方法。 

有利的是，在一实施方案中，本发明包括基因有缺陷且在感染和共培养后无需抗生素就能被除去的营养缺陷型农杆菌。实现这一点的一种方式使通过使用农杆菌的胸苷营养缺陷体。因为胸苷通常不包括于用于农杆菌转化的植物细胞培养基制剂中，因此感染和共培养过程的培养基必须补充有胸苷，以便允许农杆菌进行其基因转移过程。然而，在T-DNA 送递后，可以省略植物培养基中的胸苷，并将剩余的农杆菌排除。 

因此，如图4的步骤3所示，标准方法需要添加反选择剂如抗生素，以便治愈残存农杆菌的植物组织。相反，如图4的步骤3所示，改良的方法，即本发明方法的一实施方案不包括反选择剂如抗生素，因为农杆菌营养缺陷体由于营养缺陷而死亡。 

在某些实施方案中，营养缺陷体含有赋予植物细胞期望的表型的转基因。这类转基因包括但不限于赋予以下性状的转基因：非生物应激耐受，动物饲料所需的性状，昆虫、疾病或除草剂抗性所需的性状，加工、加工产物所需的形状如高油(如U.S.Patent No.6,232,529)、修饰的油(如脂肪酸去饱和酶基因(U.S.Patent No.5,952,544；WO 94/11516)、修饰的淀粉(如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，以及诸如雄性不育、柄强度、开花时间的农艺学性状，或诸如细胞周期调节或基因导向的***技术性状(如WO 99/61619、WO 00/17364、WO 99/25821)。 

因此，一方面，所述方法包括利用包含一个或多个目的转基因的营养缺陷型农杆菌转化植物细胞。一方面，所述方法包括，在存在营养缺陷型农杆菌的生长、增殖或存活所需的化合物的情况下，利用包含一个或多个目的转基因的营养缺陷型农杆菌转化植物细胞。利用营养缺陷体转化植物细胞，通常进行足以将T-DNA从营养缺陷型农杆菌转移到植物细胞的时间。适合与本发明的方法一起使用的营养缺陷型农杆菌的构建，描述于本文的其他地方。 

一方面，植物细胞是未成熟的胚，如玉米的未成熟胚。利用本发明的方法和LBA4404Thy-营养缺陷型农杆菌，转化玉米杂交系和自交系的未成熟的胚，且在利用营养缺陷型农杆菌和原养型LBA4404农杆菌对照的转化实验之间的转化频率未观察到显著差异。待转化的植物细胞可以是双子叶的或单子叶的，包括但不限于高粱、玉米、水稻、小麦、大豆、向日葵、卡诺拉(canola)、苜蓿、大麦或粟细胞。因此，一方面，所述方法包括，在存在营养缺陷型农杆菌的生长、增殖或存活所需的化合物的情况下，使植物细胞与营养缺陷型农杆菌接触足以发生T-DNA向植物细胞的转移的时间。在不希望受限于该理论的情况下，认为该化合物的存在会允许营养缺陷型农杆菌进行其基因转移过程。在经常通过 T-DNA载体的转基因送递后，可以将转化的植物细胞和营养缺陷型农杆菌的混合物暴露于缺少营养缺陷体的生长、增殖和/或存活所需的化合物或缺少足够水平的这样的化合物的环境。例如，可以将转化的植物细胞和营养缺陷型农杆菌暴露于植物培养基中，其中营养缺陷体的生长、增殖和/或存活所需的化合物已经被省略。 

一方面，所述方法不包括利用农杆菌反选择剂杀死或减少植物组织中容纳一种或多种转基因的农杆菌的生长、增殖或存活，这通常在感染和/或共转染步骤之后所使用，例如，在再生阶段。相反，在其方法的一方面，本发明包括将转化的植物细胞暴露于缺少足够数量的营养缺陷型农杆菌的生长、增殖或存活所需的化合物的环境。这允许转化植物细胞并产生表达转基因和基本不含转化过程中所用的可存活的营养缺陷型农杆菌的植物组织或植物。例如，胸苷营养缺陷型农杆菌在缺少外源胸腺嘧啶或胸苷的环境中不可存活。如本文所用，当利用光密度测量时，如果在植物组织或植物中检测不到可存活的农杆菌生长、增殖或存活，则通过本发明的方法转化和再生的植物组织或植物基本不含可存活的营养缺陷型农杆菌，参阅，例如，Pelczar，J.，et al.，Microorganisms-Bacteria，Quantitative Measurement of Growth，in Microbiology.1986，McGraw-Hill Book Company：New York，通过引用将其整体并入。 

有利的是，本发明的方法允许以生物学方式防范包含转基因的营养缺陷型农杆菌。一方面，所述方法包括使植物细胞与选择剂接触，以便选择含有转基因的转化的植物细胞，其是通常在共培养后进行的步骤。一方面，如本文所讨论的，转基因是选择标记基因，或连接于允许通过选择剂选择的选择标记基因。合适的选择标记基因包括，赋予植物细胞表型以便具有选择标记基因的转化的植物细胞可以得到鉴定的任何基因。示例性的选择标记基因包括但不限于报道基因，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶、分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶等的可视的标记基因，以及抗生素抗性基因，如卡那霉素、链霉素、羧苄青霉素、氯霉素、氨苄青霉素、红霉素、四环素或壮观霉素抗性基因。除了筛选以外，选择标记基因还允许维持对转化的细胞群的选择压力，以便确保引入的转基因和任何控制性启动子和/或增强子被转化的植物细胞保留。 因此，可以使植物细胞经历允许选择具有选择标记基因的植物细胞的条件。例如，如果选择标记基因编码赋予特定抗生素抗性的肽，则可以使植物细胞经历该抗生素。 

将转化的植物细胞暴露于缺少营养缺陷型农杆菌的生长、增殖或存活所需的足够数量的特定化合物的环境中达足够的时间量，其结果是营养缺陷型农杆菌的生长或增殖降低或死亡。营养缺陷型农杆菌的生长或增殖降低或死亡可以利用任何数量的测定或技术测定，包括但不限于光密度，参阅，例如，Pelczar，J.，et al.，Microorganisms-Bacteria，Quantitative Measurement of Growth，in Microbiology.1986，McGraw-Hill Book Company：New York。 

在另一方面，所述方法包括，使转化的植物细胞再生成表达转基因的转化的植物。可以稳定地转化或瞬时转化植物细胞。利用任何熟知的方法或本领域技术人员已知的技术，可以使植物细胞生成植物组织或愈伤组织。 

有利的是，本发明的方法不及传统的转化方法昂贵，因为诸如抗生素的反选择剂经常是转化所用的培养基中最昂贵的成分之一。因为除去了抗生素对植物细胞的作用，因此预计更高的转化效率。在不期望受限于该理论的情况下，据信，转化效率的增加来自除去了选择剂对植物细胞生存力的不利影响。 

实施例

下述实施例对本发明做了进一步限定，其中，除非另有说明，部分和百分比按重量计，度数按摄氏度计。本文所述每一参考文献的公开内容在此通过援引整体并入。 

实施例1：胸苷营养缺陷型农杆菌LBA4404thy^-的构建 

胸苷营养缺陷型根癌农杆菌菌株LBA4404(LBA4404thy^-)，通过天然ThyA区和包含工程ThyA缺失的区的PCR产生的克隆之间两次连续同源重组产生。本领域技术人员应当理解，可以通过这种方法和相关方法产生许多可能的缺失、变体等，且突变的准确说明和所述方案的细节，并非意图限制。 

寡核苷酸(本文其他地方所述的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4)获得自Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，其用于PCR扩增预测的989碱基对(bp)区，所述区从根癌农杆菌C58的公开的264个氨基酸的ThyA编码基因的第20个密码子的第2个碱基对的上游开始延伸；并用于扩增从第226个密码子的第一个碱基对的下游开始延伸的预测的883bp区。这两个待扩增的区包括密码子8-20区，融合于密码子226-234区，包括于跨越每次扩增的共有区的寡核苷酸中。根癌农杆菌C58 ThyA CDS的密码子17-19包括用于将两个扩增的区克隆在一起的KspI位点。将每个片段中的共有融合序列添加于分别产生了大小为1013bp和921bp的预测的PCR产物的预测的上游和下游区。PCR反应利用LBA4404(pSB1)(Komari et al，The Plant Journal(1996)10(1)：165-174)总基因组DNA作模板并利用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产生了通过琼脂糖凝胶电泳与预测的大小一致的PCR产物。最初将上游和下游PCR产物克隆到pBluescript SK⁺(Stratagene，Cedar Creek，TX)中，分别作为KspI/EcoRI和KspI/PCR钝末端片段，并测序。与公开的根癌农杆菌C58序列相比，在ThyA附近，上游和下游克隆的测序揭示了许多小差异(包括在上游区的55bp缺失)，但总的同源性分别为约84％和88％。 

将下游克隆在其共有的KspI位点连接于上游克隆，并将所得的ThyA缺失构建体转移到在农杆菌中赋予壮观霉素抗性(Spc^R)的pSB11(Japan Tobacco，Iwata，Japan)的衍生物中。通过电穿孔和在YEM琼脂培养基(0.4g/L酵母提取物、10g/L甘露醇、0.1g/L NaCl、0.2g/L MgSO4七水混合物、0.5g/L KH₂PO₄ pH 7.0+25μg/mL壮观霉素)中选择，将ThyA缺失Spc^R构建体引入根癌农杆菌LBA4404中。用SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：8的寡核苷酸作为PCR引物，来检测位于ThyA上游和下游的非破坏区的存在。ThyA编码区中与引物图谱的同源性来自根癌农杆菌LBA4404ThyA CDS的该部分，所述部分从ThyA缺失克隆中缺失(通过PCR，单独克隆该区)，且与来自侧翼区的引物的同源性是与C58序列的同源性，所述C58序列位于克隆的上游和下游区外，以致PCR扩增不会进行到已经通过同源重组***ThyA缺失衍生物的地方。这是由于伴随ThyA缺失衍生物整合的大载体***导致的，从而以几千个碱基DNA分隔引物结合 位点。检测来自LBA4404转化体候选者中每一个候选者的DNA，并用根癌农杆菌LBA4404 DNA作为对照模板。在每一反应中，对照产生大约期望大小的PCR产物。对于融合构建体整合而言，仅上游PCR反应起作用，这表明融合构建体整合事件发生于ThyA下游。 

将根癌农杆菌LBA4404 Thy缺失共合体菌株从含有50μg/mL胸苷的培养基中的新鲜划线的单一菌落(streaked single colony)接种于3mL AB基本培养液+50μg/mL胸苷+/-甲氧苄氨嘧啶(在平行培养物中0，500和1000μg/mL)，并于28℃、250RPM孵育4天。通过用10μL稳定培养物接种3mL相同类型的新鲜培养液，对所得的可视的浑浊培养物(大约稳定期)进行传代培养。和以前一样，震荡孵育稀释的培养物，从而允许培养物在每次稀释后(通常3天)变得明显浑浊。在10次稀释中，重复稀释和再培养过程。1000μg/mL甲氧苄氨嘧啶的培养物恒定地产生一些表示胁迫应答和细胞裂解的凝集材料。将75μL的500μg/mL甲氧苄氨嘧啶的最终稳定培养物和150μL的1000μg/mL甲氧苄氨嘧啶的培养物的等分试样，接种于AB+50μg/mL胸苷中，用于影印接种，并于28C下孵育3天。影印接种在AB基本培养基、AB+25μg/mL壮观霉素和AB+50μg/mL胸苷上进行。Thy缺失共合体菌株的5个菌落被鉴定为，不能在缺少胸苷的情况下生长，并因此是Thy缺失候选者。在培养基中存在壮观霉素与缺少胸苷结合，产生了更清晰的结果。通过重复悬浮于无菌水并在AB+50μg/mL胸苷上划线，纯化候选ThyA缺失营养缺陷体，以便获得单一菌落。 

对于ThyA缺失候选者中的2个而言，利用SEQ ID NOS：9和10作为引物对基因组DNA进行的PCR反应仅仅展现出一种约508bp的PCR的产物，这在缺少任何野生型ThyA基因DNA的情况下表示纯化的ThyA缺失构建体，而其他候选者产生约1124bp和约508bp的PCR产物，这表示存在天然ThyA序列和缺失ThyA序列两者。与SEQ ID NOS：9和10的同源性位于ThyA周围的上游和下游区，且对于ThyA缺失衍生物而言，预测PCR反应产生约508bp的PCR产物，相比之下，对于根癌农杆菌LBA4404的天然ThyA基因而言，产生约1124bp的PCR产物。证实ThyA缺失候选者不能生长于缺少胸苷的AB基本培养基以及补充有 50μg/mL胸苷+25μg/mL壮观霉素的平板上。当将候选者培养于乳糖琼脂并暴露于班氏试剂(Benedict’s reagent)时，产生酮乳糖的阳性测试也证实了候选者，这是强烈指示农杆菌的检测。 

引物 

GGGGCTAACCGTAAGGACTTAGAGCGG(SEQ ID NO：1) 

引物 

GGGTTGAGGCGCATGGTCGGCAAGTCTCCGCGGTCGGAGCCGGTTTCCAT 

CACATGCCGG(SEQ ID NO：2) 

引物 

CCGGCATGTGATGGAAACCGGCTCCGACCGCGGAGAGCCTTGCCGACCAT 

GCGCCTCAACCC(SEQ ID NO：3) 

引物 

CCCCTGCCCCCATGGGCCGCCACCGCCGCCC(SEQ ID NO：4) 

引物 

GCCGATGCCGTTTGCAAGTCAGC(SEQ ID NO：5) 

引物 

CATGGATGATCGAGCGCAGATGC(SEQ ID NO：6) 

引物 

TTGGTGACGCGCATATCTACGCC(SEQ ID NO：7) 

引物 

ATGATCTCTTCCAGATCGGGCGG(SEQ ID NO：8) 

引物 

TGCGGCAAGAAGCTTGGCGTGACCGATGACAG(SEQ ID NO：9) 

引物 

GTCAGTGGAAAGCTTCCAAGGCATATCGAGGTCG(SEQ ID NO：10) 

实施例2：用于营养缺陷型农杆菌菌株的载体 

利用电穿孔，用超二元载体pSB1(Komari et al，The Plant Journal(1996)10(1)：165-174)转化胸苷营养缺陷型根癌农杆菌菌株LBA4404。将电穿孔的农杆菌细胞接种于补充有50μg/ml胸苷(以支持营养缺陷体)和2.5μg/ml四环素(以选择引入的pSB1质粒)的基本培养基。维持经证实的 转化体，作为植物转化载体的靶菌株。再次利用电穿孔，将一种此类载体(PHP15303)引入LBA4404(thy-)(pSB1)中，该载体携带泛素启动子驱动的GFP筛选标记基因盒和CaMV 35S启动子驱动的BAR基因作为选择标记。通过接种于补充有50μg/ml胸苷和50μg/ml壮观霉素(以选择PHP15303)的基本培养基，鉴定携带PHP15303/pSB1共合体质粒的农杆菌细胞。利用三次诊断限制消化的最小值，证实共合体质粒(PHP30894)。还将PHP15303引入非营养缺陷型LBA4404(pSB1)，作为对照。如上文，证实作为结果而发生的共合体质粒并称为PHP15325。 

实施例3：在非补充条件下野生型和胸苷营养缺陷体的比较生长 

采用标准细菌方案，使LBA4404(PHP15325)和LBA4404(thy^-)(PHP30894)细胞于28℃生长于液体基本AB培养基中。以5mg/l，向基本AB添加胸苷，供营养缺陷体生长。当细菌培养物达到对数中期时，通过离心收集它们，用非补充的基本AB洗涤两次，并以10⁵CFU/ml重悬浮于具有不同胸苷补充的液体基本AB中。通过550nm的光密度，测量细胞随时间的生长。结果显示于图3中，并表明在未补充胸苷的情况下，LBA4404thy^-不能生长。 

实施例4：利用胸苷营养缺陷体的转化实验 

如Zhao and Ranch，Transformation of Maize Via Agrobacterium tumefaciens Using a Binary Co-Integrate Vector System，in Plant Cell Culture Protocols(利用二元共合体载体***，通过根癌农杆菌转化玉米)，V.Loyola-Vargas and F.Vazquez-Flota，Editors，Humana Press：Totowa NJ.p.315-324(2005)所详述，实施玉米转化。使用两种不同的农杆菌菌株；即野生型原养型LBA4404(PHP15325)和相同菌株的胸苷营养缺陷体LBA4404thy^-(PHP30894)。 

如图5所示，用PHWWE胚源材料的10个穗，进行该实验，同时将来自个体穗的胚分配于三个处理中。处理1(Treatment 1)是野生型LBA4404，处理2是没有补充胸苷的LBA4404thy-，处理3是以5mg/l补充了胸苷的LBA4404thy^-。如本实验所示，在缺少胸苷的情况下，营养缺陷体不支持转化。当补充胸苷时，用营养缺陷体的转化的频率等同于原养型LBA4404。不管哪一种农杆菌用于产生转基因事件，单拷贝转基 因事件的频率都是相同的，并且由野生型或营养缺陷型农杆菌所产生的事件的平均种子产量没有区别。 

实施例5：胸苷营养缺陷体不是植物组织的明显污染物 

如Zhao，Z.，et al.，Transformation of Maize Via Agrobacterium tumefaciens Using a Binary Co-Integrate Vector System(利用二元共合体载体***，通过根癌农杆菌转化玉米)，in Plant Cell Culture Protocols，V.Loyola-Vargas and F.Vazquez-Flota，Editors，Humana Press：Totowa NJ.p.315-324(2005)所详述，实施玉米转化，除了使用专有的自交系基因型PHWWE外，并且在感染后不使用反选择抗生素治愈植物组织。野生型根癌农杆菌LBA4404(PHP15325)和根癌农杆菌LBA4404thy-(PHP38094)的胸苷营养缺陷体用于转化。实验方案显示于图4中。在用野生型农杆菌的试验中，在最初暴露于农杆菌后的10天内，通过污染性、无限制的农杆菌的过量生长，吞噬所有处理过的胚。相反，在用营养缺陷型农杆菌感染未成熟的胚后46天，不存在任何剩余的可存活的营养缺陷型农杆菌的细菌生长的证据。在允许野生型农杆菌快速生长的培养基中，且在存在植物组织的情况下，营养缺陷型农杆菌不能增殖并污染植物组织。 

实施例6：利用胸苷营养缺陷体与自交系PHR03玉米未成熟胚的转化实验 

用两种不同的农杆菌菌株，即野生型原养型LBA4404(PHP32269)和相同菌株的胸苷营养缺陷体LBA4404thy^-(PHP38332)，每一菌株都含有T-DNA盒UBI-UBI 5UTR-UBI内含子1::标记::PINII-UBI-UBI 5UTR-UBI内含子1::MO-PAT::ZS-黄色1 N1:PINII，转化玉米自交系PHR03未成熟的胚。 

用PHR03胚源材料的8个穗，进行该实验，同时将来自每个个体穗的胚分配到两个处理中。处理1用原养型LBA4404(PHP32269)转化，处理2用胸苷营养缺陷体LBA4404thy-(PHP38332)转化，同时仅在感染和共培养过程中以50mg/l补充胸苷。通过用从每个处理回收的愈伤组织集落的数量除以所处理的未成熟胚的总数量而测量的转化频率，利用LBA4404时为37.9％(91/240)，且利用LBA4404thyA-时为36.3％(87/240)。卡方检验(Chi-square)表明，这些频率不能分辨为不同。当仅在感染和共培养时补 充胸苷，用营养缺陷体转化的频率等同于原养型LBA4404与自交系PHR03未成熟玉米胚的转化频率。 

实施例7：利用胸苷营养缺陷体与F1杂交种玉米未成熟配的转化实验 

如Zhao and Ranch，Transformation of Maize Via Agrobacterium tumefaciens Using a Binary Co-Integrate Vector System(利用二元共合体载体***，通过根癌农杆菌转化玉米)，in Plant Cell Culture Protocols，V.Loyola-Vargas and F.Vazquez-Flota，Editors，Humana Press：Totowa NJ.p.315-324(2005)和US 7,022,894所详述，用F1杂交种玉米胚实施玉米转化。在本检测中，使用两种不同的农杆菌菌株；即野生型原养型LBA4404(PHP34978)和相同菌株的胸苷营养缺陷体LBA4404thy^-(PHP34979)。选择标记是moPAT，且用双丙氨磷作为选择剂。每一菌株的T-DNA盒都是LTP2 PRO_DS-RED2_PINIITERM∥GZ-W64A PRO_ZM-ODC-22(TR2)_ADH1 INTRON6_ZM-ODC-22(TR2)∥OLE PRO_ZM-ODC-22(TR2)_ADH1 INTRON1(PHI)_ZM-ODC-22(TR2)_NOS TERM∥UBI1ZMPRO_UBI1ZM 5UTR(PHI)_UBI1ZM INTRON1(PHI)_MO-PAT_PINIITERM。 

用High type II X PH17AW胚源材料的12个穗，进行该实验，同时将来自个体穗的胚分配到两个处理中。处理1用原养型LBA4404(PHP34978)转化，处理2用胸苷营养缺陷体LBA4404thy-(PHP34979)转化，同时仅在感染和共培养过程以5mg/l补充胸苷。通过用从每次处理所回收的除草剂抗性愈伤组织集落的数量除以所处理的未成熟胚的总数 量而测量的转化频率，分别为36％(176/480)和33％(151/450)。卡方检验表明，这些频率不能分辨为不同。当仅在感染和共培养时补充胸苷，用营养缺陷体转化的频率等同于原养型LBA4404与F1杂交种未成熟玉米胚的转化频率。 

Claims (31)

1.在无农杆菌(Agrobacterium)反选择剂的情况下转化并再生表达转基因的植物细胞的方法，包括：

在存在胸苷营养缺陷型农杆菌的存活、增殖或生长所需的胸苷或胸腺嘧啶的情况下，使植物细胞与所述胸苷营养缺陷型农杆菌接触，其中所述胸苷营养缺陷型农杆菌包含转基因；

在存在所述胸苷营养缺陷型农杆菌的存活、增殖或生长所需的胸苷或胸腺嘧啶的情况下，共培养所述植物细胞和所述胸苷营养缺陷型农杆菌；

在缺少农杆菌反选择剂和所述胸苷营养缺陷型农杆菌的存活所需化合物的情况下，选择表达所述转基因的转化的植物细胞；以及

在缺少农杆菌反选择剂和所述胸苷营养缺陷型农杆菌的存活所需化合物的情况下，再生表达所述转基因的植物；

其中所述胸苷营养缺陷型农杆菌包含受到破坏的thyA基因，所述thyA基因在受到破坏前编码胸苷酸合酶。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述胸苷营养缺陷型农杆菌包含由于缺失、部分缺失、敲除、***或在thyA基因中引入一个或多个突变而受到破坏的thyA基因。

3.如权利要求2所述的方法，其中通过移码突变、同源重组或其任何组合的方式破坏所述thyA基因。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述农杆菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)或放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述农杆菌是农杆菌菌株LBA4404、EHA101、C58、EHA105、AGL1或GV3101。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是未成熟的胚。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞包括高粱、玉米、水稻、小麦、大豆、向日葵、卡诺拉、苜蓿、大麦或粟细胞。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述反选择剂是抗生素或除草剂。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述反选择剂包括羧苄青霉素、头孢噻肟、硝酸银、万古霉素、氧哌嗪青霉素、羟基噻吩青霉素、头孢他啶、头孢布宗、头孢米诺、拉氧头孢、氟氧头孢、氨曲南、卡芦莫南或美罗培南。

10.在植物再生过程中，以生物学的方式防范转基因农杆菌(Agrobacterium)的方法，所述方法包括：

利用胸苷营养缺陷型农杆菌转化植物细胞，其中在存在所述胸苷营养缺陷型农杆菌的存活、增殖或生长所需的胸苷或胸腺嘧啶的情况下，转化所述植物细胞，并且其中所述胸苷营养缺陷型农杆菌包含转基因；

在缺少农杆菌反选择剂和所述胸苷营养缺陷型农杆菌的存活所需化合物的情况下，使转化的植物细胞再生成表达所述转基因的转化的植物，由此以生物学的方式防范转基因农杆菌；

其中所述胸苷营养缺陷型农杆菌包含受到破坏的thyA基因，所述thyA基因在受到破坏前编码胸苷酸合酶。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述胸苷营养缺陷型农杆菌包含由于缺失、部分缺失、敲除、***或thyA基因中一个或多个突变的引入而受到破坏的thyA基因。

12.如权利要求11所述的方法，其中通过移码突变、同源重组或其任何组合的方法破坏所述thyA基因。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述植物细胞是未成熟的胚。

14.如权利要求10所述的方法，其中所述植物细胞是高粱、玉米、水稻、小麦、大豆、向日葵、卡诺拉、苜蓿、大麦或粟细胞。

15.如权利要求10所述的方法，其中所述反选择剂是抗生素或除草剂。

16.如权利要求10所述的方法，其中所述反选择剂包括羧苄青霉素、头孢噻肟、万古霉素、氧哌嗪青霉素、羟基噻吩青霉素、头孢他啶、头孢布宗、头孢米诺、拉氧头孢、氟氧头孢、氨曲南、卡芦莫南或美罗培南。

17.分离的农杆菌(Agrobacterium)，其中编码胸苷酸合酶的thyA基因已经受到破坏，且所述农杆菌在缺少胸腺嘧啶或胸苷的情况下表现出不能存活、增殖或生长，并且其中所述农杆菌是农杆菌菌株LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1或GV3101。

18.如权利要求17所述的农杆菌，其中所述thyA基因已经由于缺失、部分缺失、敲除、***或在所述基因中引入一个或多个突变而受到破坏。

19.如权利要求18所述的农杆菌，其中通过移码突变、同源重组或其任何组合的方法破坏所述thyA基因。

20.如权利要求17所述的农杆菌，其中所述农杆菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)或放射形农杆菌(Agrobacterium ridiobacter)。

21.产生农杆菌(Agrobacterium)胸苷营养缺陷体的方法，包括：

构建包含thyA基因或其片段敲除的核酸构建体；

在允许所述核酸构建体与野生型thyA基因间同源重组的条件下，使所述核酸构建体与包含所述野生型thyA基因的农杆菌染色体DNA接触；以及

在允许选择具有整合到所述农杆菌染色体DNA的所述核苷酸构建体的农杆菌的条件下，选择所述农杆菌，由此产生在无胸苷或胸腺嘧啶的情况下表现出不能存活、增殖或生长的农杆菌胸苷营养缺陷体。

22.如权利要求21所述的方法，还包括通过将候选营养缺陷型农杆菌暴露于缺少胸腺嘧啶或胸苷的环境，并测定所述候选营养缺陷型农杆菌的生长、增殖或存活，选择为农杆菌胸苷营养缺陷体的农杆菌。

23.如权利要求21所述的方法，其中将所有或部分所述野生型thyA基因通过同源重组从所述农杆菌染色体中除去。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述核酸构建体包含与所有或部分所述野生型thyA基因同源的至少两个序列，以便能通过同源重组整合。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述核酸构建体的至少两个序列位于所有或部分所述野生型thyA基因的侧翼。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述核苷酸构建体的至少两个序列连接于选择标记。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述选择标记赋予抗生素抗性。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述选择标记赋予羧苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、红霉素、壮观霉素或四环素抗性。

29.如权利要求21所述的方法，其中所述农杆菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)或放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)。

30.如权利要求21所述的方法，其中所述农杆菌是农杆菌菌株LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1或GV3101。

31.分离的农杆菌(Agrobacterium)胸苷营养缺陷体，其通过权利要求21所述的方法产生。

Images