ES2079647T5 - Transformacion genetica y regeneracion de la remolacha azucarera. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO DE TRANSFORMACION DE CELULAS VEGETALES QUE PERTENECEN A LA ESPECIE BETA VULGARIS CARACTERIZADO EN QUE COMPRENDE LA PUESTA EN CONTACTO DE UNA DISPERSION DE CALLOS BLANCOS DESMENUZABLES CON AGROBACTERIUM QUE CONTIENE UN VECTOR QUE LLEVA UN GEN DESTINADO A SER INTRODUCIDO EN LAS CELULAS VEGETALES, SEGUIDA DE COCULTIVO DE LAS CELULAS VEGETALES Y DE LAS BACTERIAS PARA DAR LUGAR A CALLOS DESMENUZABLES TRANSFORMADOS. LOS CALLOS TRANSFORMADOS SON DESPUES REGENERADOS EN PLANTAS TRANSGENICAS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A PLANTAS TRANSGENICAS QUE PERTENECEN A LA ESPECIE BETA VULGARIS Y QUE RESISTEN A LA INFECCION POR EL VIRUS DE LOS NERVIOS AMARILLOS Y LOS NECROTICOS DE LA REMOLACHA AZUCARERA (BNYVV), TRANSFORMANDOSE DICHAS PLANTAS DE UNA MANERA ESTABLE POR UN FRAGMENTO DE ACIDO NUCLEICO, CODIFICANDO DICHO FRAGMENTO AL MENOS UNA PARTE DE LA PROTEINA DE CAPSIDE DEL BNYVV O UN DERIVADO DE ESTA PROTEINA.
Description
Transformación genética y regeneración de la
remolacha azucarera.
La invención se refiere a un procedimiento de
transformación genética de células vegetales que pertenecen a la
especie Beta vulgaris, seguida eventualmente por una etapa
de regeneración de células transformadas en planta entera.
La invención se refiere también a las células
transformadas, a los brotes, a las plantas y las semillas
transgénicas susceptibles de ser producidas por este
procedimiento.
La invención se refiere además, a las plantas
transgénicas que pertenecen a la especie Beta vulgaris,
resistentes a la infección por el virus de las nervaduras amarillas
y necróticas de la remolacha azucarera (BNYW), que expresa la
proteína de la cabeza del BNYVV, o un derivado de esta
proteína.
Las referencias bibliográficas que aparecen en
la descripción de la invención están repertoriadas en forma de
bibliografía.
La obtención de plantas transgénicas utiliza la
transferencia del fragmento de ADN seleccionado en la célula
vegetal, la selección de las células transformadas de forma estable
y la regeneración de plantas enteras a partir de las células
seleccionadas transformadas.
El problema técnico que se planteaba en el
momento de la elaboración de la presente invención era encontrar un
método de transformación de células de remolacha que presentara una
frecuencia de transformación elevada que pudiera ser asociada con
éxito a un método de regeneración de planta transgénica.
Actualmente, dicho método de transformación y de regeneración no ha
sido descrito, impidiendo la producción de remolachas transgénicas
que presentan unas características agronómicamente interesantes, tal
como la resistencia a la rizomanía.
Actualmente, existen dos grandes vías de
transferencia de ADN en las células vegetales.
La primera vía es una vía fisicoquimica
(electroporación, microinyección, policationes, cañón de
partículas). En la remolacha, unas células transformadas de manera
estable han sido seleccionadas después de electroporación de un gen
que codifica para la resistencia a la kanamicina en los
protoplastos (Lindsey et al., 1989).
Sin embargo, este procedimiento no ha podido
conducir nunca a la creación de remolachas transgénicas puesto que
la regeneración de plantas a partir de protoplastos no ha podido
obtenerse en esta especie.
La segunda vía de transferencia de ADN es una
vía biológica que utiliza como vector una bacteria del suelo:
Agrobacterium tumefaciens o rhizogenes.
Diferentes cepas de estas dos especies han sido
utilizadas con éxito para la transformación de células de
remolachas. Estas células transformadas han dado origen o bien a
unos tumores con Agrobacterium tumefaciens (Krens et
al, 1988) o bien a unas raíces con Agrobacterium
rhizogenes (Yacoub et al, 1987). Estos tejidos
transformados (raíces y tumores) no han permitido nunca hasta el
presente la regeneración de plantas en la remolacha. Esto viene del
hecho de que estos dos fenotipos son los resultados de la
integración en el genoma de la célula no solamente del fragmento de
ADN deseado sino también de un fragmento de ADN de la bacteria que
perturba el equilibrio hormonal de la célula (Akiyoshi et al,
1983). Para paliar estos problemas, estos genes han sido
delecionados, dando nuevas cepas de Agrobacterium llamadas
cepas desarmadas.
La utilización de las cepas de
Agrobacterium desarmadas implica la asociación de un sistema
selectivo para la transformación de células vegetales. El éxito en
la obtención de transformantes está estrechamente ligado a la
puesta a punto de un buen sistema selectivo. El gen selectivo más
utilizado en este campo es el que proviene del transposon Tn5 de
Escherichia coli (Rothstein et al, 1981) que codifica
para la neomicina fosfotransferasa (NPT II) que confiere la
resistencia a la kanamicina (An et al, 1985).
La mayor parte de los vectores plasmidicos
utilizados en estas cepas desarmadas contienen en el ADN
transferible, además del gen deseado, el gen NPT II, bajo el control
de señales de transcripción vegetales (Bevan, 1984; An, 1986). El
sistema de selección comprende por una parte el gen que confiere la
resistencia, y por otra parte, el agente selectivo. Esto implica
determinar las concentraciones de agente selectivo que permiten a la
vez matar las células no transformadas y dejar crecer las células
transformadas. Los únicos trabajos publicados que se refieren a la
selección de células de remolacha después de transformación de
explantes pluricelulares por Agrobacterium recurren a otro
sistema selectivo: higromicina B/higromicina B fosfotransferasa
(Harpster et al, 1988).
La transformación por Agrobacterium
necesita en un primer tiempo la elección de un tipo de célula o de
un tipo de explante que constituirá el objeto de la transformación.
Por ejemplo, unos explantes tales como unos hipocótilos, unos
pedazos de hojas (Krens et al, 1988) pueden ser
transformados por Agrobacterium.
La frecuencia de transformación puede variar
según el tipo de célula que haya sido objeto de la transformación,
siendo esta variabilidad a menudo de una naturaleza
imprevisible.
Cuando tiene lugar la producción de una planta
transgénica, la transformación es seguida por un procedimiento de
regeneración.
La eficacia de obtención de las plantas
transgénicas depende de la frecuencia de regeneración de plantas a
partir de células transformadas por una parte, y la frecuencia de
transformación de las células por otra parte.
Por ejemplo, la transformación de porciones de
peciolos de remolacha ha dado unos callos transformados
seleccionados sobre kanamicina. Sin embargo, no ha sido nunca
posible regenerar unas plantas a partir de estos callos
transformados salidos de peciolos, aunque haya sido referida la
regeneración de embriones somáticos y de brotes a partir de este
tipo de callo en estado no transformado (Tetu et al, 1987).
Este fracaso no es sorprendente si se tiene en cuenta la baja
frecuencia de regeneración descrita.
Esto traduce bien los problemas de regeneración,
a partir de explantes, de plantas no transformadas, encontrados
desde hace largo tiempo en la remolacha azucarera (Ritchie et
al, 1989). Varios autores han descrito la regeneración directa
de brotes adventicios a partir de fragmentos de peciolos de plantas
en multiplicación vegetativa (Detrez et al, 1988; Freytag
et al, 1988). Aunque este fenómeno haya resultado
reproducible en unas condiciones aplicadas por los inventores, la
frecuencia ha resultado demasiado baja para estar asociada a la
transformación. Por otra parte, parece que estas neoformaciones
provienen de macizos celulares no accesibles a la bacteria y
aparentemente poco sensibles a un agente selectivo.
Otra técnica de regeneración de plantas no
transformadas a partir de células de remolachas azucareras es la
descrita por Saunders et al (1986). La misma utiliza en un
primer tiempo, la inducción de callos friables independientes de
hormonas e iniciadas probablemente a partir de las células
epidérmicas del limbo, y después en un segundo tiempo, la
regeneración de brotes y de embriones somáticos a partir de estos
callos. Esta técnica ha sido fácilmente reproducible sobre varias
variedades de remolachas azucareras. Uno de los intereses de este
proceso es la posibilidad de obtener fácilmente unas suspensiones
celulares a partir de callos friables cuyo potencial organógeno
puede ser mantenido durante algunos meses.
Los inventores han descubierto que este material
organógeno, es decir los callos friables, puede ser utilizado, en
condiciones precisas, para la transformación por Agrobacterium
turnefaciens.
Hace poco tiempo la transformación de
suspensiones celulares no parecía concebible según el dogma
establecido de que la transferencia de ADN por Agrobacterium
en una célula vegetal necesitaba lesiones celulares. Sin embargo,
unos autores han referido la transformación de células en
suspensión en el tabaco y la zanahoria (AN, 1985; Scott y Draper,
1987). Hasta el presente, la transformación de células en suspensión
en la remolacha no ha sido descrita. Por otra parte, debe
observarse que los métodos de transformación que se aplican con
éxito a una especie vegetal no pueden ser extendidos
sistemáticamente a otras especies. Las condiciones de
transformación, los materiales de partida y los medios de cultivo
son unos parámetros variables específicos de cada especie.
En lo que concierne a la transformación y a la
regeneración de remolachas transgénicas resistentes a la rizomanía,
cualquier progreso ha sido impedido por la falta de un
procedimiento de producción fiable.
El virus de las nervaduras amarillas y
necróticas de la remolacha azucarera (BNYVV) es un virus con
componentes múltiples, constituido por partículas virales de
simetría helicoidal, que contienen cuatro tipos de RNA de rama
simple, de polaridad positiva (Putz, 1987). Este virus es
diseminado por un hongo del suelo, Polymixa betae, que
parasita las células superficiales de las raicillas de
quenopodiáceas, de las cuales forma parte la remolacha azucarera.
Esta quenopodiacea bisanual permanece en estado de roseta el primer
año dando una raíz carnosa y azucarada, y sube a semilla el segundo
año después de vernalización. La persistencia de la enfermedad en
el suelo es debida a los quistes formados por el hongo (Tamada,
Baba, 1973).
Es conocido que el virus se desarrolla
esencialmente en la parte radical (pivote y raíces secundarias). El
síntoma principal de la enfermedad consiste en una proliferación de
la cabellera radical (de lo que proced el nombre de rizomanía). Pero
el nombre del virus proviene de hecho de síntomas mas tardíos
visibles en la parte vegetativa a saber: necrosis y amarilleo de
las nervaduras debidas al hecho de que el virus se desarrolla sobre
todo a nivel de los vasos radicales, perturbando así el metabolismo
de toda la planta (Salle et al, 1986).
Varios autores han referido que el virus es
detectado en la parte aérea sólo muy raramente, mientras que está
presente en gran cantidad a nivel de las raíces y del pivote (Putz,
1977; Ziegler et al., 1985).
El control de las enfermedades virales de los
vegetales resulta problemática, a pesar del advenimiento de la
ingeniería genética vegetal.
Abel et al (1986) han introducido un gen
que codifica para la proteína de cabeza del virus del mosaico del
tabaco (VMT) en el genoma de las plantas naturalmente sensibles a
este virus. Esta manipulación genética ha provocado un retardo del
desarrollo de la enfermedad en las plantas transgénicas. Otras
realizaciones del mismo tipo han sido referidas con otros
virus;
- Alfalfa Mosaic Virus, y Tobacco Rattle Virus,
en el tabaco (Van Dun et al, 1987),
- Alfalfa Mosaic Virus en el tabaco (Loesch
Fries et al, 1987),
- Alfalfa Mosaic Virus sobre tabaco y tomate
(Tumer et al, 1987).
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Dos equipos han creado unas plantas transgénicas
que expresan unos genes que codifican para unos ARN antisentido,
complementarios del ARN que codifica para la proteína de cabeza, y
muestran que la resistencia es mucho menos importante que la
conferida por la proteína de cabeza (Cuozzo et al, 1988;
Hemenway et al, 1988).
Finalmente, otros laboratorios han creado unas
plantas transgénicas que expresan unos genes que codifican para los
ARN satélites. Esta estrategia ha sido adoptada por Gerlach et
al (1987) para el virus de las manchas anulares del tabaco, y
por Harrison et al (1987) para el virus del mosaico del
pepino (CMV).
No siendo conocido ningún satélite para el
BNYVV, los inventores han previsto hacer producir a las células
vegetales transformadas o bien unos ARN antisentido, o bien unos
ARN sentido que codifican para unas proteínas virales normales,
mutada o delecionadas, susceptibles de inhibir el desarrollo del
virus.
El procedimiento de transformación de la
invención implica:
- -
- la transformación de callos friables en dispersión que dan unos callos, unas suspensiones celulares y unas plantas transformadas.
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Más particularmente, la presente invención se
refiere a un procedimiento de transformación de células vegetales
que pertenecen a la especie Beta vulgaris caracterizado
porque comprende la puesta en contacto de una dispersión de callos
blancos friables en un medio de cultivo celular vegetal líquido que
contiene 0 a aproximadamente 3,0 mgL^{-1} de una citoquina, con
Agrobacterium turnefaciens que contiene un vector que lleva
un gen destinado a ser introducido en las células vegetales,
seguida de cocultivo de las células vegetales y de las bacterias
para dar lugar a unos callos friables transformados. Según un modo
de realización preferido de la invención, este procedimiento de
transformación comprende las etapas sucesivas siguientes:
I) inducción de callos blancos friables a partir
de explantes;
II) dispersión de los callos en un medio de
cultivo celular vegetal líquido que contiene de 0 a aproximadamente
3,0 mgl^{-1} de una citoquinina;
III) puesta en contacto de la dispersión con
Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector que lleva
un gen destinado a ser introducido en las células vegetales, seguida
de cocultivo de las células vegetales y de las bacterias;
IV) lavado de las células vegetales para
eliminar las bacterias y selección de las células transformadas
sobre un medio selectivo;
V) cultivo de las células transformadas
seleccionadas para obtener unos callos friables transformados.
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La primera etapa de la transformación es la
inducción de callos blancos friables a partir de explantes de
remolacha. Los explantes que pueden servir en esta etapa pueden ser
por ejemplo unos discos de hojas, unas porciones de peciolos, etc.
Preferentemente, los explantes son unos trozos de hojas jóvenes
extraídos de una planta que tenga una edad de menos de tres
meses.
Por ejemplo, después de germinación de las
semillas de remolacha de aproximadamente un mes, se extraen unas
hojas jóvenes de 3 a 5 cm de longitud de cada planta y se someten a
una etapa de desinfección y aclarado. Cada hoja es a continuación
cortada en pequeñas porciones de 0,25 cm^{2} a 1,0 cm^{2}. Las
hojas pueden ser extraídas de la planta hasta dos meses
aproximadamente después de las primeras extracciones. Después de
este período, la aptitud de regeneración de las hojas disminuye.
Los discos de hojas son a continuación puestos en cultivo sobre un
medio de cultivo celular vegetal que contiene de 0,1 a 5,0
mgl^{-1} de citoquinina. Preferentemente, la citoquinina está
presente a razón de aproximadamente 1,0 mgl^{-1} y puede ser, por
ejemplo, la 6-bencilaminopurina (BAP), la zeatina,
o la kinetina. La BAP es la particularmente preferida. El medio de
cultivo celular vegetal es ventajosamente el medio de Murashige y
Skoog (1962), llamado medio M.S.. Los explantes son cultivados a
30ºC aproximadamente durante 30 días en la oscuridad, y a
continuación son sacados de la cámara de cultivo con un fotoperíodo
de 18/24 H por ejemplo a aproximadamente 25ºC de día y 20ºC por la
noche.
De 4 a 10 semanas después de la puesta en
cultivo, aparecen unos callos blancos friables alrededor, sobre o
debajo de los explantes foliares.
La etapa siguiente del procedimiento de
transformación es la producción de una dispersión de los callos en
un medio de cultivo líquido. Esta dispersión será utilizada
ulteriormente para la transformación.
La producción de una dispersión de los callos se
efectúa por dispersión de los callos aparecidos después de 2 a 6
semanas en los explantes, en un medio de cultivo líquido que
contiene 0 a 3,0 mgl^{-1} de citoquinina, por ejemplo el medio
MSB1. Dos tipos celulares, habituado y noduloso, pueden ser
observados en las dispersiones, en particular:
- -
- tipo habituado (A): suspensión fina, verde con crecimiento rápido, y que regenera puntualmente unas formaciones vitrificadas que se desarrollan difícilmente;
- -
- tipo noduloso (C): suspensión de agregados compactos amarillentos, de crecimiento más lento, regenera más frecuentemente que la primera, desarrollándose bastante bien unas estructuras embrionarias compactas.
Este tipo es asimismo conocido con el nombre
"tipo regenerante". Los callos en dispersión pueden ser
examinados antes de la transformación con el fin de separar los dos
tipos celulares, es decir noduloso y habituado. Un examen visual de
los callos permite detectar los dos tipos que son a continuación
extraídos del medio con una pinza y redispersados. Las suspensiones
celulares cuidadosamente iniciadas a partir de dispersiones de
callos blancos friables nodulosos han resultado ser el material
ideal para optimizar la eficacia de la transformación.
Cada uno de los dos tipos celulares puede ser
sometido a la transformación pero es preferible transformar el tipo
noduloso si se desea ulteriormente la regeneración de la planta.
La dispersión de los callos es a continuación
puesta en contacto con la bacteria Agrobacterium
tumefaciens.
El protocolo de transformación es efectuado
sobre las dispersiones. Una muestra de las bacterias en medio
fresco es adicionada a la dispersión de las células de remolacha. El
cocultivo de las células vegetales y de las bacterias se realiza en
la oscuridad durante tres días aproximadamente, en cámara de
cultivo.
El Agrobacterium tumefaciens utilizado en
la transformación contiene un vector que lleva un gen destinado a
ser introducido en las células de remolacha. Las cepas utilizadas
por los inventores contienen unos vectores binarios que llevan el
gen que interesa. Las tres cepas de Agrobacterium
tumefaciens desarmadas utilizadas en el trabajo descrito aquí
son LBA 4404 (Hoekema et al, 1983); EHA 101 (Hood et
al 1986); C58'3 (Dale et al, 1989). Muy evidentemente,
el gen interesante está colocado bajo el control de las señales
reguladoras apropiadas, por ejemplo un promotor que permite su
expresión en la célula vegetal y, en caso necesario, en la planta
transgénica regenerada. El promotor puede elegirse para permitir la
expresión específica del gen en una cierta parte de la planta, o en
una cierta fase de su desarrollo. En contrapartida, puede ser
utilizado un promotor constitutivo, que de lugar a la expresión
ubicuitaria del gen introducido.
Como gen, se pueden citar unos genes
codificantes para unos caracteres agronómicos interesantes, por
ejemplo la resistencia a los herbicidas, a los insectos y a los
virus, o también un gen que induzca la esterilidad macho. La
resistencia a los herbicidas puede ser conferida, por ejemplo, por
el tipo de gen descrito por De Block et al (1987) y por
Bedbrook et al (1988). Un gen susceptible de conferir una
resistencia a los insectos es el gen de la proteína cristalina de
B. thiuringiensis (Perlak et al)(1990); Vaeck et
al (1987); Fischoff D, et al (1987)). La esterilidad
macho puede ser inducida por un gen codificante para una
ribonucleasa, tal como el descrito por Mariani et al (1990).
La resistencia a los virus puede a veces ser inducida por el gen que
codifica para la proteína de la cabeza del virus en cuestión. Por
ejemplo, la resistencia al virus BWYV puede ser conferida por el gen
descrito por Gielen et al (1990). Por otra parte, una
protección contra el BNYVV, responsable de la rizomanía, puede
también ser inducida por este mismo tipo de gen. Según el
procedimiento de la invención, este gen que codifica para esta
proteína de cabeza puede ser introducido en unas células de
remolachas, confiriendo así la resistencia a la rizomanía. Los
vectores descritos en estos ejemplos pueden ser utilizados para la
introducción de estos genes.
El vector lleva también un gen codificante para
una proteína que permite la selección de los transformantes, por
ejemplo la neomicina fosfotransferasa (NPT II) que confiere la
resistencia a la kanamicina. Además, un gen "informador" puede
ser introducido en el vector a fin de poder confirmar el carácter
transformado del tejido vegetal. Un ejemplo de dicho gen informador
es el gen uid A de E. coli que codifica para la enzima
\beta-glucuronidasa. La dosificación de la
actividad enzimática de esta proteína se realiza fácilmente con unos
substratos cromógenos o fluorescentes.
Después del cocultivo de las células de
remolachas y de las bacterias, se efectúa una etapa de lavado con
un agente bacteriostático para eliminar las bacterias. Como agente
bacteriostático, puede ser utilizada la cefotaxima. El lavado puede
efectuarse en dos etapas, por ejemplo una primera vez con el medio
MSB1 que contiene 600 mgl^{-1} cefotaxima, y después una segunda
vez en medio MSB1 que contiene 300 mgl^{-1}1 cefotaxima.
A continuación, la selección de las células
transformadas se efectúa gracias al gen codificante para la
resistencia al agente selectivo. Las células lavadas son después
puestas en cultivo durante una quincena de días en un medio que
contiene el agente selectivo, por ejemplo la kanamicina y el agente
bacteriostático. Las células vegetales son a continuación
trasplantadas sobre medio fresco.
Tres a ocho semanas después del cocultivo,
aparecen unos callos blancos. Estos callos transformados presentan
los dos tipos celulares, noduloso y habituado.
\newpage
Los callos transformados así obtenidos tienen,
como característica física principal, que pueden ser dispersados en
líquido por una agitación relativamente suave y ello, desde que
tienen un tamaño de 3 a 5 mm. De manera sorprendente, estos callos
transformados conservan la naturaleza blanca, friable y regenerante
que poseían antes de la transformación, y resultan por tanto ser un
material apropiado para la regeneración de plantas transgénicas.
Debe observarse que la transformación efectuada sobre explantes, y
no sobre callos (Harpster et al, 1988), da lugar a unos
callos transformados muy compactos que no presentan carácter
friable y que no son regenerantes.
Cuando están suficientemente desarrollados, los
callos transformados de la invención son trasplantados sobre un
medio MSB1 con cefotaxima y eventualmente kanamicina.
De manera sorprendente, se ha constatado que un
mes después del clonado de los callos transformados, la kanamicina
y la cefotaxima pueden ser suprimidas del medio sin que la bacteria
se desarrolle. Esto puede representar una ventaja para la etapa de
regeneración, no estando ya las células en contacto con los
antibióticos.
Después de la obtención de los callos friables
transformados, puede ser iniciada la regeneración de la planta
transgénica, empezando por la regeneración de brotes y/o de
embriones transgénicos.
El procedimiento de regeneración de brotes y/o
embriones transgénicos según la invención está caracterizado por la
obtención de callos friables transformados según el procedimiento
descrito anteriormente, seguido de un trasplante de los callos
friables transformados sobre un medio de cultivo, por ejemplo el
medio M.S., que contiene 0 a 3,0 mgl^{-1} de una citoquinina y
eventualmente un agente bacteriostático y un agente selectivo. Como
citoquinina, se pueden citar la zeatina, la kinetina y la BAP, por
ejemplo a una concentración de 1 mgl^{-1}. La BAP es la
particularmente preferida.
Unos brotes y/o embriones que regeneran sobre
algunos de los callos después de unos plazos que varían de una
semana a varios meses.
A partir de estos brotes y/o embriones
transgénicos, es posible, según la invención, regenerar unas
plantas por trasplante de los brotes y/o embriones sobre un medio de
cultivo tal como el medio M.S. que contiene una citoquinina a baja
concentración, por ejemplo entre 0,05 y 0,15 mgl^{-1},
preferentemente de 0,1 mgl^{-1}. La BAP es la preferida en esta
etapa. Las estructuras regeneradas empiezan entonces a desarrollar
unas hojas y son puestas de nuevo en multiplicación vegetativa en
macetas o cajas. Los brotes más desarrollados son entonces puestos
en un medio de enraizado tal como el medio MS que contiene ácido
naftalenacético, por ejemplo 1 mgl^{-1}. Las raíces aparecen de 2
a 6 semanas después. Las plantas pueden entonces ser aclimatadas en
invernadero.
La invención se refiere también a la producción
de semillas a partir de las plantas transgénicas por vernalización
de estas plantas transgénicas y recolección de las semillas después
de floración.
La invención se refiere también a los callos
friables transformados, los brotes y/o embriones transformados, las
plantas transgénicas y las semillas transgénicas de estas plantas
susceptibles de ser producidas según los procedimientos descritos
anteriormente.
La invención se refiere también a unas semillas
de plantas transgénicas que comprenden unas semillas
transgénicas.
La presente invención se refiere también a la
transformación genética y la regeneración de la remolacha azucarera
(Beta vulgaris ssp saccharifera) con el fin de crear unas
plantas resistentes a la rizomanía.
Más particularmente, los inventores han
transformado unas células vegetales por unas secuencias que
codifican para la proteína de cabeza del BNYVV, o para unas
variantes de ésta.
La realización de este aspecto de la invención
ha consistido en:
- -
- construir por las técnicas de recombinación genética in vitro, unos genes artificiales, potenciales de resistencia al virus de las nervaduras amarillas y necróticas de la remolacha azucarera (BNYVV: Beet Necrotic Yelow Vein Virus) que provoca la rizomanía,
- -
- transferir de forma estable estos genes de resistencia a las remolachas azucareras.
El gen codificante para la proteína de cabeza de
BNYVV ha sido localizado y secuenciado (Bouzoubaa et al,
1986). Sin embargo, no podía ser previsto que la expresión de esta
proteína en las células de remolacha inhibiera el desarrollo del
virus. Siendo el virus transmitido por el hongo del suelo
Polymixa betae, la vía de infectabilidad no es comparable
con la de los virus para los cuales la proteína de cabeza se ha
mostrado protectora. Por otra parte, la proteína de cabeza del
BNYVV es codificada por el extremo 5' del ARN2, lo que quiere decir
que la proteína puede ser traducida en la célula infectada
inmediatamente después de la infección. Para otros virus, la
proteína de cabeza es codificada por un ARN subgenómico y es por
tanto producida más tarde en el ciclo de la infección. Por estas
razones, el efecto protector presentado por la proteína de cabeza
para otros virus vegetales no podía ser previsto en el BNYVV.
Además, los inventores han constatado varios
fenómenos inesperados: primera- mente, se ha observado que unas
células transformadas por una misma secuencia codificante para la
proteína de cabeza de 22 Kd (nucleótidos 145 a 708) y por lo menos
una parte de la proteína de 75 Kd que está compuesta por la
proteína de 22 Kd fusionada con la proteína 54 Kd (nucleótidos 709
a 2218), da lugar a la expresión de dos proteínas en la misma
célula, es decir la proteína de 22 Kd y una proteína quimérica
compuesta por la proteína de 22 Kd adicionada con la parte de la
proteína de 75 Kd codificada por la secuencia transformante. Esta
expresión es el resultado del fenómeno de "readthrough", siendo
el codón "stop" al final de la proteína de 22 Kd a veces
suprimido en la célula por unos tRNA supresores. Se ha constatado
que el porcentaje de expresión de la proteína quimérica de
"readthrough" es particularmente elevado, y podría desempeñar
una función en la resistencia conferida a la célula que expresa las
dos proteínas a la vez.
En segundo lugar, los inventores han observado
que en unas plantas transgénicas las proteínas expresadas según la
invención son expresadas específicamente en las raíces, y ello a
pesar de la utilización de promotores constitutivos.
Este fenómeno es totalmente inesperado y
presenta varias ventajas para la planta. En principio, las células
blanco del BNYVV están específicamente protegidas. Además, la
ausencia de expresión de la proteína de cabeza y de sus derivados en
las partes aéreas de la planta, parte que no es susceptible de ser
infectada por el BNYVV, representa una economía energética
importante para la planta. Por otra parte, la expresión en las
raíces, con exclusión de cualquier expresión en otras partes de la
planta, es un fenómeno que no habría podido ser obtenido utilizando
un promotor llamado "específico" para las raíces. Este tipo de
promotor conduce, de hecho, a una expresión más importante en las
raíces, y una expresión débil en las otras partes de la planta.
Unas experiencias, efectuadas por los inventores, utilizando un gen
marcador (GUS) han demostrado que la expresión específica no es
debida a un mal funcionamiento del promotor, puesto que el producto
de expresión del gen GUS es expresado en todas las partes de la
planta, cuando está bajo control de estos mismos promotores. La
expresión específica podría ser el resultado de la inestabilidad de
la proteína en las partes aéreas de la planta, o a una mala
traducción. Estas experiencias muestran que el promotor no parece
desempeñar ninguna función en la expresión específica.
Se ha constatado también que el promotor 35S
tiene una eficacia de transcripción de 30 a 50 veces más elevada
que el promotor Nos en unas células de remolacha. La invención se
refiere a unas plantas transgénicas que producen:
- -
- la proteína de cabeza del BNYVV,
- -
- unas proteínas de cabeza modificadas definidas a continuación (ácidos aminados suplementarios, ácidos aminados permutados, ácidos aminados delecionados), que conservan el efecto protector con respecto al BNYVV,
- unos ARN de sentido y unos ARN antisentido de diferentes tamaños y dirigidos contra diferentes regiones del ARN2 del BNYVV.
Más particularmente, este aspecto de la
invención se refiere a una planta transgénica que pertenece a la
especie Beta vulgaris y resistente a la infección por el
virus de las nervaduras amarillas y necróticas de la remolacha
azucarera (BNYVV), siendo dicha planta transformada de una manera
estable por un fragmento de ácido nucléico, cuyo producto de
expresión es capaz de conferir dicha resistencia, siendo dicho
fragmento derivado del extremo 5' del ARN2 genómico o subgenómico
del BNYVV, o del cADN correspondiente, codificando este fragmento
para por lo menos una parte de las proteínas codificadas por los
nucleótidos 145 a 3285 de la secuencia salvaje del ARN2, y estando
bajo el control de un promotor que permite la expresión del
fragmento en las células de la planta y estando en la orientación
sentido o antisentido.
En el contexto de la invención, un fragmento
"derivado del extremo 5' del ARN2 del BNYVV" significa el cADN
correspondiente, o una variante capaz de hibridar con este en unas
condiciones no estringentes, o cuyo producto de expresión presente
por lo menos 80% de homología. Es importante que las variantes
presenten la propiedad de poder inhibir la infección por el BNYVV
en unas células que lo expresan. Por "inhibir", es preciso
comprender una reducción y un retardo significativos de la
aparición de síntomas de la infección y de la multiplicación del
virus. En condiciones óptimas, los síntomas de la multiplicación del
virus son eliminados totalmente.
Como ejemplo de fragmento de ácido nucleotídico
preferido, se citará un fragmento del extremo 5' del ARN2 genómico
del BNYVV o del cDNA correspondiente, que codifica para por lo
menos una parte de la proteína codificada por los nucleótidos 145 a
2218 del ARN2 o para una variante de esta proteína que presenta una
homología de por lo menos 80% y que comprende la inserción, la
sustitución o la deleción de ácido(s) aminado(s) y que
confiere una resistencia a la rizomanía a las células que la
expresan.
Otro ejemplo de una planta transgénica según
este aspecto de la invención es aquélla en el cual dicho fragmento
codifica para la proteína codificada por los nucleótidos 145 a 708
y, además, para una parte de la proteína codificada por los
nucleótidos 709 a 2218 del ARN2 del BNYVV. Dicha planta transgénica
puede comprender, según la invención, un fragmento que codifica
para la proteína codificada por los nucleótidos 145 a 871 del ARN2
del BNYVV, pudiendo este fragmento estar compuesto, por ejemplo, por
los nucleótidos 91 a 871 del ARN2 del BNYVV.
El fragmento transformante puede también
codificar para por lo menos una parte de una variante de la
proteína codificada por los nucleótidos 145 a 2218, distinguiéndose
dicha variante de la secuencia salvaje por la presencia de la
secuencia Glu Asp Leu Pro que reemplaza los ácidos aminados His Ala
codificados por los nucleótidos 253 a 258 de la secuencia salvaje.
Por secuencia salvaje, debe entenderse la secuencia del ARN2
publicada por Bouzoubaa et al (1986), en particular la de la
figura 2 de dicha publicación. Esta figura indica la secuencia
nucleotidica así como la secuencia de ácidos aminados. La numeración
de las bases utilizadas en esta solicitud es la misma que la
aplicada por Bouzoubaa et al.
Como ejemplos de parte de este tipo de variante,
se puede citar un fragmento que está compuesto por los nucleótidos
91 a 871 de la secuencia salvaje, estando los nucleótidos 253 a 258
de la secuencia salvaje reemplazados por los que codifican para Glu
Asp Leu Pro. La parte de la variante puede también corresponder a la
codificada por los nucleótidos 145 a 255 en la secuencia salvaje,
siendo los nucleótidos 253 a 255 de la secuencia salvaje
reemplazados por los que codifican para Glu.
Otro ejemplo aún de una planta transgénica según
este aspecto de la invención es aquélla en la cual dicho fragmento
codifica para por lo menos una parte de una variante de la proteína
codificada por los nucleótidos 145 a 2218, distinguiéndose dicha
variante de la secuencia salvaje por la presencia de la secuencia
Arg Ser Ser Gly en lugar de los ácidos aminados codificados por los
nucleótidos 637 a 651 de la secuencia salvaje, formando la
secuencia Arg Ser Ser Gly el carboxi terminal de la proteína.
Más particularmente, las plantas transgénicas,
según estos aspectos de la invención, expresan unos fragmentos de
ácido nucléico que consisten en los nucleótidos 91 a 871 del ARN2
del BNYVV o de la secuencia cADN correspondiente, en la cual los
nucleótidos 253 a 258 están eventualmente reemplazados por GAA,
GAT, CTT, CCT, o en la cual la secuencia GA AGA TCT TC ha sido
insertada en la posición 638, inmediatamente después del C en
posición 637, o también los fragmentos BglII de estas
secuencias.
Según otro modo de realización de la invención,
el fragmento transformante puede consistir en los nucleótidos 2078
a 2774 del ARN2 subgenómico del BNYVV. La proteína así expresada
corresponde al NH_{2} terminal de la proteína de 42 kDa del
BNYVV.
Unos ejemplos de fragmentos de ácido nucléico
transformantes particularmente preferidos y las proteínas
codificada por estos fragmentos están ilustrados en la tabla I (ver
ejemplo 6).
Entre estas secuencias particularmente
preferidas, se citará la secuencia de bases consecutivas que
codifican para por lo menos una parte de la proteína de cabeza de 22
Kd (codificada por los nucleótidos 145 a 708) y, además, para una
parte de la proteína de 75 Kd (codificada por los nucleótidos 709 a
2218). Un ejemplo de dicha secuencia es la compuesta por los
nucleótidos 91 a 871 del ARN2. Este tipo de secuencia, que incluye
el codón stop del 22 Kd, da lugar al fenómeno de "readthrough"
y la célula expresa así dos proteínas a la vez.
La invención se refiere también a las proteínas
producidas por la expresión de estas secuencias, y en particular la
proteína de 29 Kd que resulta de la expresión de los nucleótidos 91
a 871 del ARN2, que es expresada al mismo tiempo que la proteína de
cabeza de 22 Kd.
Los promotores que pueden ser utilizados en las
plantas transgénicas resistentes a la rizomanía son todos los que
permiten la expresión de la secuencia que confiere la resistencia en
la planta. Los promotores 35S y Nos que son, respectivamente, el
promotor del gran transcrito 35S del virus del mosaico de la
coliflor y el promotor del gen de la nopalina sintasa son los
particularmente preferidos. La utilización de estos promotores
constitutivos, y en particular el p35S, da lugar de una manera
sorprendente a una expresión específica de la proteína protectora
en las raíces.
Otras señales de transcripción a utilizar con el
promotor son unos terminadores, por ejemplo Nos.
Las semillas transgénicas de las plantas
transgénicas resistentes a la rizomanía forman también parte de
este aspecto de la invención.
Las secuencias utilizadas en la transformación
de las plantas de la invención pueden ser utilizadas como sonda
nucléica, en combinación con unos medios que permiten una detección
de la hibridación, para detectar la presencia de las secuencias en
unas células transformadas. Esto puede ser útil para verificar el
estado transformado de las células.
Este aspecto de la invención se refiere también
a un procedimiento de producción de plantas transgénicas que
pertenecen a la especie Beta vulgaris y resistentes a la
infección por el BNYVV, expresando dicha planta, específicamente en
las raíces, una proteína capaz de conferir dicha resistencia,
comprendiendo dicho procedimiento la transformación, por medio de
Agrobacterium tumefaciens, de células que provienen de
Beta vulgaris con uno de los fragmentos tales como los
descritos anteriormente, estando la transcripción de dicho
fragmento bajo el control de un promotor constitutivo tal como el
p35S o el pNos, seguida de la regeneración de una planta
transgénica a partir de las células transformadas.
Los ejemplos no limitativos siguientes ilustran
en particular:
- -
- la producción de fragmentos de mensaje genético modificado o no del virus del BNYVV, por la planta,
- -
- la expresión de estos fragmentos de ADN de origen viral bajo unos promotores constitutivos (35S; Nos),
- -
- la verificación de esta expresión por la puesta en evidencia de los ARN mensajeros correspondientes en unas suspensiones celulares habituadas y transformadas,
- -
- la confirmación de la producción en la misma célula de dos proteínas de tamaños diferentes codificadas por el mismo gen:
- \text{*}
- la proteína de cabeza del BNYVV de 22 Kd (188, ácidos aminados)
- \text{*}
- la proteína quimérica derivada de la proteína de cabeza de 29 Kd (252 ácidos aminados),
- -
- la utilización de las tres cepas desarmadas de Agrobacterium tumefaciens para la transformación de suspensiones celulares y de callos friables de remolacha (comparativo)
- -
- la obtención de suspensiones celulares transformantes, inducidas a partir de callos seleccionados sobre kanamicina después de transformación de suspensiones celulares habituadas(comparativo)
- -
- la utilización de estas suspensiones celulares transformadas como modelo para probar la expresión de cualquier fragmento de ADN dispuesto bajo el control de promotores apropiados (comparativo)
- -
- la utilización de estas suspensiones celulares para probar la inhibición de la multiplicación viral para un gen dado (comparativo)
- -
- la inhibición de la multiplicación del BNYVV en unos protoplasmos salidos de suspensiones celulares transformadas y que producen las dos proteínas de 22 Kd y 29 Kd, sirviendo unos protoplastos como modelo para probar la infectabilidad de la célula, no pudiendo las células ser infectadas directamente por los virus, (comparativo)
- -
- la transformación de callos jóvenes friables organógenos,
- -
- la obtención de callos transformados organógenos seleccionados sobre kanamicina después de transformación de callos jóvenes friables organógenos,
- -
- la posibilidad de suprimir muy pronto a la vez el agente selectivo (kanamicina) y el agente bacteriostático (cefotaxima) del medio de cultivo de los callos,
- -
- el desarrollo de los brotes o embriones iniciados a partir de los callos transformados, en plantas transformadas, enraizadas,
- -
- la expresión en la planta de los genes transferidos,
- -
- la puesta en evidencia de la producción de las proteínas 22 y 29 Kd específicamente en las raíces de remolachas transformadas,
- -
- la ausencia de la producción de proteínas 22 y 29 Kd en la parte aérea de las plantas transformadas,
- -
- la producción de semillas transgénicas a partir de transformantes primarios,
- -
- la puesta en evidencia de la resistencia a la rizomanía de las plántulas salidas de las semillas transgénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1 a 11 y las tablas 1 a 3 ilustran
diferentes aspectos de la invención, en particular:
Figura 1: Organización genética del ARN2 del
BNYVV según Bouzoubaa et al, (1986);
Figura 2: construcción de los vectores de
expresión pBIOS1 y pBIOS3.
pBIOS1 contiene el promotor (pNos) y el
terminador (Nos 3') del gen de la nopalina sintetasa separados por
un puesto de restricción BamHI (B) y encuadrados por dos puestos
EcoRI (E).
pBIOS3 es un derivado de pBIOS1 en el que el
promotor Nos ha sido reemplazado por el promotor del transcrito 35S
(p35S) del Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) aislado del plásmido
PJEA25 (donación de T. Michael).
Abreviaturas: B, BamHI, E, EcoRI - H, Hind III -
Hp, HphI - P, Pst - S, SmaI - Sst, SstI - X, XhoII - T4 DNA poi, T4
DNA polimerasa - K, Klenow polimerasa - E Met, EcoRI Metilasa - Ap,
Ampicilina - bp, par de base.
Figura 3: genes quiméricos que codifican para la
proteína de cabeza del BNYVV y para la proteína quimérica
derivada.
\global\parskip0.900000\baselineskip
A partir del plásmido pBC2 que contiene el ADN
copia del extremo 5' del RNA2, se ha aislado un fragmento
DraI-Bgl I de 780 bp (posición 91 a 871). Este
fragmento ha sido tratado con la T4 DNA polimerasa y han sido
adicionados unos linkers BamHI que permiten su clonado en el puesto
BamHI de los vectores de expresión pBIOS1 y pBIOS3. Los dos
plásmidos pBIOS1-1B y pBIOS3-1B
obtenidos tienen un fragmento del ADN en orientación sentido.
Abreviaturas: B, BamHI, D, Dra I - E, EcoRI - P,
PstI - Sst, Sst 1 - T4 DNA poi, T4 DNA polimerasa - CAP, partida
teórica del transcrito - A+, señal de poliadenilación - ATG, codón
de partida - TGA, TAA, codones stop.
Figura 4: construcción de
pBIO1-2B y pBIO1-5B.
Figura 5: construcción de los vectores de
transferencia.
Las diferentes entidades genéticas funcionales
derivadas de pBIOS1 y pBIOS3 son insertadas en el vector binario
pGA492. Los derivados pBIOS1 son clonados en el puesto EcoRI y
solamente son retenidos los construidos orientados en el sentido de
transcripción idéntico al gen de la neomicina fosfotransferasa
(npt), mientras que los derivados de pBIOS3 son insertados entre el
puesto SstI y el puesto EcoRI, y se encuentran obligatoriamente en
la buena orientación. Se han obtenido 32 plásmidos derivados de
pGA492.
Abreviaturas: E, EcoRI - Sst, SstI - npt,
neomicina fosfotransferasa-cat, cloramfenicol
acetiltransferasa - BR y BL, bordes derecho e izquierdo del
T-DNA - Tet, resistencia a la tetraciclina - Kb,
quilobase.
Figura 6: Vector binario
pGA-\beta-3-1B.
Leyenda: 35S, promotor 35S del Cauliflower
Mosaic Virus - 5'Nos, promotor del gen de la nopalina sintetasa -
Nos, terminador del gen de la nopalina sintetasa. NPT, gen de la
neomicina fosfotransferasa - UID A, gen de la
\beta-glucuronidasa de E. coli - BR y BL,
bordes derecho e izquierdo del T-DNA de pTiT 37 -
amp, gen de resistencia a la ampicilina -tet., gen de resistencia a
la tetraciclina - Kana., gen de resistencia a la kanamicina - E,
EcoRI - H, Hind III - S, Sst I - \medbullet, origen de réplica
del RK2.
Figura 7: análisis por Western blot de las
suspensiones celulares transformadas por el vector binario
pGA-\beta-3-1B.
Leyenda: CP, proteína de cabeza - WT, suspensión
no transformada - 20 ng y 2 ng, reconstrucciones con las cantidades
indicadas de BNYVV-\beta-Glu,
\beta-glucuronidasa-MW, marcador
de peso molecular.
Está representada en un encuadrado, la
estructura del gen quimérico que codifica para la proteína de
cabeza.
p35S, promotor 35S del Cauliflower Mosaic Virus
- Nos, terminador del gen de la nopalina sintetasa; tag, codon de
terminación del BNYVV: readthrough - tag, codon de terminación
situado en el terminador - atg, codon de iniciación.
Figura 8: infección de protoplastos de remolacha
con BNYVV F13 (\boxempty, \medcirc) y S2 (\nabla) por el
método con PEG. (\ding{115}) representa los resultados obtenidos
con virus desactivado.
Figura 9: infección de protoplastos de remolacha
por electroporación en presencia () y en ausencia (\Delta) de
CaCl_{2} 5 mM. Los símbolos abiertos correspondientes representan
el porcentaje de protoplastos viables en presencia (\nabla) y en
ausencia (\boxempty) de CaCl_{2} 5 mM.
Figura 10: perfiles densitométricos de análisis
de RNA extraídos de protoplastos infectados aislados de cepas que
expresan (- - - -) o que no expresan (- -)
la proteína de cabeza de BNYVV.
Figura 11: análisis por Western blot de
extractos proteínicos de 3 remolachas transgénicas con la ayuda de
dos sueros: un suero anti-BNYVV y un suero
anti-\beta-glucuronidasa.
Abreviaturas: L, limbo; P, peciolo; R, raíz; Te,
testigo; S, suspensión celular transformadas; 2ng, 2ng de BNYVV
purificado; 14-3, 22-1 y
68-1 se refieren a 3 remolachas transgénicas
diferentes.
Tabla 1: los 16 genes de resistencia potenciales
al BNYVV con sus productos teóricos.
N.B.: las cifras entre paréntesis se refieren a
la posición de los puestos de restricciones según la secuencia del
BNYVV; \Delta representa el linker BglII adicionado. El tamaño de
los transcritos corresponde a la parte del mensajero complementario
del BNYVV.
Tabla 2: infección por el BNYVV de protoplastos
salidos de las células transformadas y no transformadas. 1 x
10^{6} protoplastos han sido inoculados con 5 \mug de BNYVV (F13
ó S2) salvo para la experiencia 4 en la que el inóculo consistía en
30 \mug de BNYVV, las cifras representan el porcentaje de
protoplastos fluorescentes detectados 30 horas después de la
inoculación. CP+ y CP- son unas cepas celulares transformadas que
expresan y no expresan la proteína de cabeza del BNYVV.
Tabla 3: diferentes medios de cultivo utilizados
en el procedimiento de transformación y de regeneración según la
invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La multiplicación del virus BNYVV se realiza
sobre Chenopodium quinoa después de inoculación manual, y la
extracción se realiza a partir de hojas virosas de ocho días según
la técnica de Putz (1977). La suspensión viral así obtenida es
ajustada con 100 mM de NaCl y después sometida a dos extracciones
con fenol seguidas de dos lavados con éter de la fase acuosa. Los
RNA virales son precipitados por adición de dos volúmenes de etanol
destilado y conservados a -20°C. El número y el tamaño de los RNA
ha sido referido por Richards et al (1985).
\vskip1.000000\baselineskip
Richards et al han mostrado en 1985 que
el RNA2 era un mensajero eficaz para la síntesis de la proteína de
cabeza. Un ADN complementario de una parte del RNA2 ha sido
sintetizado por el método de Van der Werf et al (1981) y
clonado en el puesto Pst 1 del plásmido pBR322 (Bolivar et
al., 1977). El plásmido resultante pBC2 contiene un ADN copia
correspondiente a los 2938 bases del extremo 5' del RNA2 (Richards
et al, 1985).
\vskip1.000000\baselineskip
Gracias a la técnica de Maxam y Gilbert (1980),
y a la de Sanger (1977), la secuencia del clon pBC2 ha sido
determinada. La secuencia detallada es representada en la
publicación de Bouzoubaa et al (1986) con la organización
genética del RNA2 esquematizada. El examen de esta secuencia ha
confirmado la presencia de la proteína de cabeza a nivel del primer
cistrón situado en 5', estando el codon ATG de partida colocado a
144 nucleótidos del extremo 5'. Esta proteína de un peso molecular
de 22 Kd comprende 188 codones y termina por un codon ambar UAG. La
composición de ácidos aminados deducida de la secuencia es idéntica
a la de la proteína de cabeza del BNYVV determinada por C. Putz
(1977). El codon stop (UAG) está inmediatamente seguido de una fase
abierta que tiene una capacidad codificante correspondiente a un
polipéptido de 54 Kd. Por la supresión del codón UAG, se puede por
tanto obtener una fase de lectura abierta capaz de codificar para
una proteína de 75 Kd. Estos datos están de acuerdo con los
resultados obtenidos por Ziegler et al (1985) que muestran
que el RNA2 es un mensajero eficaz para la síntesis de dos
proteínas inmunoprecipitadas con suero anti BNYVV y cuya síntesis
está aumentada en presencia de un t.RNA supresor. Todos estos
resultados son discutidos en la publicación de Bouzoubaa et
al (1986), y se precisa también que una tercera fase de lectura
capaz de codificar in vitro para una proteína se realiza a
partir de un ARN subgenómico del RNA2 que ha sido puesto en
evidencia y que puede ser encapsulado.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, han sido utilizadas las señales
de transcripción del gen de la nopalina sintasa de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens T 37. A partir del plásmido
pNopneo\Delta 18 construido por Bevan (1983) cuya estructura está
representa en la figura 2, éste contiene la secuencia del vector de
clonado pUC9 (Vierra et al., 1982) con un fragmento
EcoRI-BamHI de 260 bp y de un fragmento
HindIII-XhoII (BaHI-BglI) de 310 bp.
Estos dos fragmentos que provienen del plásmido tumorígeno pTiT37
de Agrobacterium tumefacies T 37 contienen respectivamente
la señal de poliadenilación y el promotor del gen de la nopalina
sintasa. Estas dos señales de trascripción encuadran un fragmento
BglII-Bam HI de 1000 bp que contiene el gen que
codifica para la aminoglicósido fosfotransferasa II; a partir de
este plásmido, el fragmento de 1000 bp ha sido extraído por
digestión controlada con el enzima de restricción XhoII, y las
moléculas de tamaño de 3300 bp aproximadamente son recuperadas
después de emigración sobre gel de agarosa. Después de ligado y
transformación en E. coli HB101 (Bolivar et al, 1979)
han sido seleccionados unos transformantes resistentes a la
ampicilina. La mayoría de estas técnicas están descritas en
"Molecular Cloning. A laboratory manual" (Maniatis et
al, 1982). Gracias a la cartografía con la ayuda del enzima de
restricción, los inventores han retenido el plásmido
pNoS\DeltaNeo, que poseía un fragmento
EcoRI-BamHI de 260 bp y un fragmento
BamHI-HindIII de 310 bp. Para comodidad de
utilización de este plásmido, los inventores han reemplazado el
puesto de restricción HindIII por un puesto EcoRI (detalles no
presentados) y así han obtenido el vector de expresión pBIOS1
(figura 2).
Se ha construido otro vector de expresión en el
marco de la invención. Tiene la misma estructura que pBIOS1,
comprendiendo el mismo fragmento la señal de poliadenilación, pero
el fragmento promotor ha sido cambiado. En efecto, el fragmento
PstI-BamHI que comprende el promotor del gen de la
nopalina sintasa ha sido reemplazado por un fragmento
EcoRI-BamHI de 400 bp que contiene el promotor del
gran transcrito 35S del virus del mosaico de la coliflor (Ca.m.v.).
Este fragmento ha sido obtenido a partir del plásmido pUC35S que
derivaba del clonado de un fragmento BamHI-HphI en
el puesto Sma I del vector de clonado pUC13 (Messing, 1983). La
fuente del fragmento BamHI-HphI era el plásmido
pJEA25 construido por T. Michael y que había extraído un fragmento
Dde I que se extiende de la posición 7069 a la posición 7569 del
CaMV aislado de BJ1 descrito por Franck et al (1980).
Después de haber modificado los extremos de este fragmento gracias a
unos linkers BamHI, T. Michael lo había clonado en el puesto BamHI
del plásmido pAT153 (Twigg et al, 1980). En la figura 2,
están esquematizadas las diferentes etapas de la construcción del
vector de expresión pBIOS3. Para los dos vectores de expresión
pBIOS1 y pBlOS3, el puesto de restricción BamHI está presente entre
los dos fragmentos de ADN que contienen el promotor para uno y para
el otro la señal de poliadenilación; esta situación es ideal para
la inserción de cualquier ADN extraño que será un substrato para la
transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pBC2 ha sido digerido por los
enzimas de restricción BglI y DraI y a continuación el extremo
saliente del puesto de BglI ha sido suprimido por la utilización de
la DNA polimerasa del bacteriófago T4. Este fragmento ha sido
purificado por elución a partir de un gel de agarosa, después de
separación electroforética. Unos linkers BamHI han sido adicionados
a los extremos de este fragmento, y después una digestión con un
gran exceso del enzima de restricción BamHI; este fragmento de 780
bp es así incubado con los vectores pBIOS1 y pBIOS3 abierto en el
puesto BamHI. Después de ligado, la mezcla ha servido para
transformar E. coli HB101. Después de una selección efectuada
sobre los clones resistentes a la ampicilina, se han retenido 4
plásmidos. Los plásmidos denominados pBIO1-1B
y pBIO3-1B que tienen el fragmento cDNA que
contiene la secuencia codificante de la proteína de cabeza bajo el
control del promotor Nos para el primero y para el otro bajo el
control del 35S (figura 3).
Estos plásmidos pueden dirigir la fabricación de
RNA mensajeros que, una vez traducidos, producirán a la vez la
proteína de cabeza del BNYVV y una proteína quimérica de 29 Kd que
proviene de la supresión del codón stop (fenómeno de readthrough).
Esta proteína de 252 ácidos aminados está compuesta como sigue:
- -
- los 188 ácidos aminados de la proteína de cabeza,
- -
- 53 ácidos aminados de la proteína de 75 Kd que van de la posición 189 a 241 incluidas,
- -
- de 11 ácidos aminados codificados por la secuencia del terminador de la nopalina sintasa que son respectivamente: treonina, glicina, serina, prolina, isoleucina, leucina, glutamina, treonina, fenilalanina, glicina, glutamina. Se han obtenido otros dos plásmidos, estos plásmidos denominados pBIO1-1A y pBIO3-1A tienen el fragmento cDNA del BNYVV en orientación inversa bajo el control de los dos promotores. Estos plásmidos podrán dirigir la fabricación de RNA mensajeros llamados antisentido, que serán unos mensajeros complementarios de la parte 5' del RNA2.
\vskip1.000000\baselineskip
Han sido construidos dos plásmidos derivados de
pBIO1-1 B, el plásmido pBIO1-2B y
el plásmido pBIO1-5B. Las diferentes etapas de la
construcción de estos plásmidos están representadas en la figura 4.
Brevemente, para la construcción de pBIO1-2B, el
plásmido pBIO1-1B ha sido abierto en el puesto SphI
(posición 256 del RNA2) los extremos "pegajosos" han sido
extraídos por la utilización de la DNA polimerasa del bacteriófago
T4 (deleción de 4 bp) y de los linkers BglII de 10 bp han sido
ligados en los extremos francos así producidos. Después de una
digestión exhaustiva con BglII, el plásmido es religado. Después de
transformación en E. coli, ha sido obtenido el plásmido
pBIO1-2B; éste no contiene ya puesto SpHI y en esta
posición se encuentra ahora el puesto BglII. Esta manipulación ha
permitido dos cosas: primeramente, la obtención de un puesto de
restricción útil para otras construcciones (extremos compatibles
con los producidos por BamHI) y en segundo lugar la obtención de
una secuencia codificante modificada que codifica para una proteína
de cabeza que posee dos ácidos aminados suplementarios y de la que
dos ácidos aminados son cambiados. El plásmido
pBIO1-5B se ha obtenido por el mismo tipo de
manipulación pero en su caso es el puesto SmaI de
pBIO1-1B (posición 637 del RNA2) que ha sido
modificado por unos linkers BglII. Este plásmido codifica para una
proteína de cabeza acortada en 19 ácidos aminados y de los cuales
los 4 últimos están modificados.
Utilizando los puestos BglII y Bam HI de estos
dos plásmidos, los inventores han podido aislar y clonar en los dos
vectores de expresión pBIOS1 y pBIOS3 diferentes porciones de cDNA
que recubren el extremo 3' o el extremo 5' de la proteína de cabeza
y esto en unas longitudes variables. Una familia de genes
susceptibles de hacer resistente al BNYVV una célula o una planta
que fabrica el producto de uno o varios de estos genes se ha
obtenido de esta manera. Todos estos diferentes fragmentos de cDNA
están representados en la tabla 1 con los productos esperados
(transcrito y proteína); refiriendo la letra B una orientación de
sentido y A una orientación antisentido.
N.B.: las cifras entre paréntesis se refieren a
la posición de los puestos de restricciones según la secuencia del
BNYVV; \nabla representa el linker BglII adicionado. El tamaño de
los transcritos corresponde a la parte del mensajero complementario
del BNYVV.
En esta tabla, se ha representado también un
fragmento de cDNA que se extiende de la posición 2078 a 2774; se
trata de un fragmento Sau 3A del RNA2 correspondiente al extremo 5'
del RNA subgenómico que codifica para la proteína de 42 Kd (figura
1b). Los inventores han clonado este fragmento en los vectores de
expresión pBIOS1 y pBIOS3 y esto en las dos orientaciones (8B y
8A).
El vector binario pGA492 elegido ha sido
construido por G. An (1986). Este plásmido tiene un tamaño de 12
Kb, su carta genética está representada en la figura 5. Este
plásmido posee:
- -
- dos fragmentos de ADN que contienen las secuencias del T-DNA del plásmido tumorígeno pTiT37, estas secuencias delimitan la parte trasferida y son indispensables para la transferencia,
- -
- un gen quimérico que contiene la secuencia codificante del gen de la neomicina fosfotransferasa del transposon Tn5 (Rothstein et al, 1981) que es fusionado con un fragmento que contiene el promotor del gen de la nopalina sintasa y los primeros codones de la secuencia codificante de este mismo gen. Este gen quimérico está terminado por la señal de poliadenilación del gen de la nopalina sintasa. Este gen confiere a las células vegetales que lo contienen la capacidad de multiplicarse en presencia de kanamicina, que es normalmente un antibiótico tóxico para éstas,
- -
- varios puestos únicos de restricción que permiten el clonado de genes construidos in vitro,
- -
- un origen de réplica de amplio espectro de huésped que funcionan E. coli y en Agrobacterium turnefaciens,
- -
- un origen de transferencia y los genes mob necesarios para la transferencia por conjugación bacteriana,
- -
- un gen de resistencia a la tetraciclina que permite la selección de bacterias transconjugadas,
- -
- un gen de resistencia a la tetraciclina que permite la selección de bacterias transconjugantes.
En la figura 5, los inventores han ejemplificado
la introducción de dos genes, los genes soportados por
pBIO1-1 B y por pBIO3-1 B. Todos los
fragmentos de cDNA bajo el control del promotor Nos (pBIOS1
derivados) son clonados en el puesto EcoRI de pGA 492 después de
aislamiento de los genes respectivos con EcoRI. Solamente los clones
que presentan los genes en el mismo sentido de transcripción que el
del gen que confiere la resistencia a la kanamicina son retenidos.
Para los genes que contienen el promotor 35S del CaMV (pBIOS3
derivados) el clonado se efectúa entre los puestos Sst I y EcoRI de
pGA 492 después de digestión de los diferentes plásmidos por estas
dos mismas enzimas. Se han obtenido 32 vectores de transferencia,
dos de estos están representados en la figura 5,
pGA-1-1B y
pGA-3-1B.
La confirmación del carácter transformado de un
tejido vegetal se efectúa en numerosos casos por la puesta en
evidencia de las proteínas codificadas por los genes transferidos.
En el caso del vector binario
pGA-3-1B, los inventores han podido
dosificar por técnicas inmunológicas la proteína de cabeza del
BNYVV y por una dosificación enzimática la actividad de la
neomicina fosfotransferasa que confiere la resistencia a la
kanamicina. Sin embargo, estas dosificaciones son largas y
delicadas y necesitan una importante cantidad de material
vegetal.
En 1987, Jefferson et al, utilizan el gen
uid A de E. coli que codifica para la enzima
\beta-glucuronidasa (GUS E.C.3.2.2.31) como gen
informador. Este gen, bajo el control de señales de transcripción
vegetales (promotor 35S de CaMV y terminador Nos), se expresa muy
bien en las células vegetales y la enzima se revela muy estable.
Varios métodos de dosificación de la actividad enzimática de esta
proteína están disponibles puesto que existen diferentes tipos de
substratos; en particular unos substratos que dan productos
cromógenos y unos substratos que dan productos fluorescentes. Se
pueden efectuar de forma simple y con poco material vegetal unas
dosificaciones cuantitativas (intensidad de la fluorescencia) y
unas dosificaciones cualitativas por histoquimia (aparición de un
precipitado azul indigo). Para aprovechar este sistema informador
en las experiencias de transformación, los inventores han
construido el vector binario
pGA-\beta-3-1B. La
estructura génica de este plásmido está representada en la figura
6. El gen que puede inhibir la multiplicación del BNYVV está
encuadrado por el gen que confiere la resistencia a la kanamicina y
por el gen que codifica para la
\beta-glucuronidasa. Para realizar esta
construcción, los inventores han insertado en el puesto EcoRI del
vector binario pGA-3-1B, el plásmido
pBI221 (Jefferson 1987) abierto por su puesto EcoRI. El vector
binario
pGA-\beta-3-1B
resultante (de un tamaño de 19 Kb) ha sido transferido a las cepas
de Agrobacterium desarmadas (LBA 4404, EHA 101, C58'3) por
conjugación triparental según la técnica descrita por Ditta et
al (1980).
Unas semillas de remolacha se han sembrado en
tierra en invernadero. Estas semillas han salido de la variedad
americana "REL 1".
Aproximadamente un mes después de germinación en
invernadero, se han realizado las primeras experiencias de
inducción de callos según el método descrito por Saunders et
al (1986):
- -
- se han extraído unas hojas jóvenes de 3 a 5 cm de longitud de cada planta,
- -
- las mismas son desinfectadas como sigue:
- detergente de la marca Domestos 15% durante 5 minutos
- 3 aclarados con agua estéril
- secado sobre papel filtro estéril
- -
- cada hoja es a continuación cortada en fragmentos de 0,25 cm^{2} aproximadamente,
- -
- los explantes así obtenidos son puestos en cultivo sobre el medio MSB1 (Tabla 3) en cajas de Petri,
- -
- las cajas, después de haber sido selladas con una película plástica de la marca Scello-frais, son puestas a 30ºC que la obscuridad durante 30 días,
- -
- después son sacadas de la cámara de cultivo L:D 18:8, 25ºC:20ºC.
De 4 a 10 semanas después de la puesta en
cultivo, aparecen unos callos blancos friables alrededor, y sobre o
debajo de los explantes foliares.
De 1 a 8 semanas después de la aparición de
callos unos brotes y/o embriones empiezan a regenerar de estos
callos.
De 4 a 6 semanas después de su aparición, los
callos son extraídos (evitando cualquier estructura organizada) y
puestos en cultivo en 100 ml de medio MSB1 líquido, en los
erlenmeyers de 250 ml cerrados con una hoja de celofana mantenida
sobre el cuello por dos elásticos. Los erlenmeyers son agitados a
200 RPM aproximadamente en la cámara de cultivo.
La suspensión celular se establece en 2 ó 3
semanas. Cada suspensión es trasplantada cada 3 semanas
aproximadamente como sigue:
- -
- el contenido de cada erlenmeyer, después de 3 semanas de cultivo, es filtrado sobre una serie de tres tamices apilados (cuyas mallas son de 1 mm, 500 \mum, y 100 \mum). Una parte de cada fracción (> 1 mm, > 500 \mum, > 100 \mum) es puesta de nuevo en suspensión en 100 ml de medio MSB1 fresco en erlenmeyers de 250 ml. Estas nuevas suspensiones son de nuevo agitadas a 200 RPM. La observación de las diferentes suspensiones celulares establecidas a partir de los diferentes genotipos ha permitido distinguir dos tipos celulares:
- \text{*}
- tipo habituado (A): suspensión fina, verde con crecimiento rápido, regenera puntualmente unas formaciones vitrificadas que se desarrollan difícilmente,
- \text{*}
- tipo noduloso (C): suspensión de agregados compactos amarillentos, con crecimiento más lento, regenera más frecuentemente que la primera, se desarrollan bastante bien unas estructuras embrionarias compactas.
La transformación se realiza sobre unas
suspensiones celulares después de 3 semanas de cultivo, sin
trasplante.
En un tubo plástico, estéril y graduado, se
recoge una parte de la suspensión de manera que tenga 5 ml de
células apretadas en 10 ml de medio. Se adicionan 10 ml de medio
MSB1 fresco. La nueva suspensión así obtenida es distribuida en
cuatro cajas de Petri a razón de 5 ml por caja.
Las cepas de Agrobacterium tumefaciens
ensayadas son LBA 4404, EHA 101, C58'3. Cada una de estas cepas
contiene unos vectores binarios que llevan los genes construidos
(ejemplos 5 y 6) y más particularmente el vector
pGA-\beta-3-1b
(ejemplo 8).
Las cepas bacterianas son conservadas a -20ºC en
15% de glicerol. 50 \mul de cada cepa son extraídos y puestos en
cultivo en 2 ml de medio LB + rifampicina + tetraciclina. Los
cultivos son agitados a 200 RPM a 30ºC durante 2 días. Cada cepa es
trasplantada a un medio fresco y cultivada en las condiciones
descritas más arriba durante una noche.
Cuando las bacterias están así preparadas, se
realiza la infección de las células vegetales:
- -
- 50 \mul de cada cepa crecida una noche son extraídos y adicionados a una de las cajas de Petri que contiene las células de remolachas descritas más arriba,
- -
- el cocultivo de las células de remolacha y de las bacterias se realiza en la oscuridad durante 33 días en cámara de cultivo.
Después de estos 3 días, una células vegetales
son lavadas para eliminar la bacteria, una primera vez con MSB1 +
600 mg/l de cefotaxima (bacteriostático que inhibe el crecimiento
de Agrobacterium), y después una segunda vez en medio MSB1 +
300 mg de cefotaxima.
- -
- las células así lavadas son puestas en cultivo sobre un disco de papel Whatman estéril depositado sobre medio MSB1 + CK (tabla 3), en cajas de Petri (la kanamicina es el agente selectivo que permite desarrollarse solamente a las células transformadas). Las cajas son selladas con scello-frais y puestas en cámara de cultivo. 15 días después, los filtros que llevan las células vegetales son trasplantados sobre medio fresco MSB1 + cefotaxima + kanamicina
- -
- 3 a 8 semanas después del cocultivo, aparecen unos callos blancos sobre un lecho de células muertas.
Cuando están suficientemente desarrollados,
estos callos son trasplantados o bien sobre medio MSB1 + CK ó MSB1
+ C; la mayor parte de los callos crecen sobre los dos medios. Un
test histoquímico (Jefferson, 1987) para detectar la actividad de la
proteína codificada por el gen de la
\beta-glucuronidasa en las células de estos
callos, ha permitido evaluar en aproximadamente 80% el porcentaje
de callos positivos para este test. Esto confirma por tanto el
carácter transgénico de la mayor parte de los callos obtenidos.
El hecho de cultivar estos callos sin el agente
selectivo (kanamicina) no parece modificar la expresión del gen
GUS. Además, después de un mes de cultivo sobre medio con
cefotaxima, los callos pueden ser liberados de este antibiótico sin
que la bacteria se desarrolle sobre el medio.
Por tanto, un mes después del clonado de los
callos, se puede prescindir de añadir los dos antibióticos en el
medio de cultivo, sin ningún inconveniente aparente. Esto puede
representar un triunfo para la regeneración.
En lugar de transformar unas suspensiones
celulares inducidas después de varios meses (y que hipotéticamente
han perdido su potencial de regeneración), fueron transformados
unos jóvenes callos recientemente inducidos de explantes foliares
(Saunders et al, 1986). El potencial organógeno de estos
callos transformados podía así ser investigado.
Para ensayar esto, han sido extraídos unos
callos justamente aparecidos después de 2 a 6 semanas sobre hojas
de invernadero. Estos callos han sido dispersados en un medio MSB1
líquido en tubos plásticos estériles, y ha sido aplicado el mismo
protocolo de transformación que para las suspensiones celulares.
Unos callos transformados han sido así seleccionados para esta
vía.
Los inventores han transformado unas
suspensiones celulares habituadas de remolachas con todos los genes
construidos presentados en los ejemplos 5 y 6. Para cada uno de
estos genes varias suspensiones celulares transformadas han sido
iniciadas y cultivadas en presencia de kanamicina 200 mg/l. A
partir de 10 g de células transformadas sometidas a la acción de
celulasas y de peetinasas, o bien los ARN totales, o bien las
proteínas solubles totales han sido aislados.
Para extracción de los ARNs la técnica que
utiliza el isotiocianato de guanidio descrita por Ausubel et
al (1987) ha resultado la más eficaz en estas células con
paredes digeridas. Los ARN totales han sido analizados por Northern
blot según Maniatis et al (1982). Para la hibridación de los
ARN totales que contienen un ARN mensaje derivado del gen de la
proteína de cabeza, los inventores han utilizado como sonda el
fragmento de BamHI de 780 pares de bases del plásmido
pBIO-3B. Para los que expresan un ARN mensajero
derivado de gen codificante para la proteína de 42 Kd, ha sido
utilizado el fragmento EcoRI de 1330 pares de bases del plásmido
pBIO-3-8B como sonda. El marcado
radiactivo de estas 2 sondas gracias al ATP (P32) se realiza por la
técnica llamada del "Oligonucleotide Primed Synthesis"
(Ausubel et al, 1987).
Los resultados obtenidos han permitido a los
inventores verificar la presencia de todos los ARN mensajeros
esperados, lo que mostraba la funcionalidad de los genes quiméricos
construidos. Estos mensajeros tienen un tamaño correspondiente al
indicado en la tabla 1 ampliado en 200 nucleótidos aproximadamente.
Estos nucleótidos suplementarios situados en el extremo 3' del mRNA
se deben a la parte transcrita del terminador Nos hasta la señal de
poliadenilación y a la cola de poli-A. Se ha
observado también que el promotor Nos tiene una eficacia de
transcripción de 30 a 50 veces menor que el promotor 35S en unas
células de remolachas. Estos resultados son comparables con los
obtenidos sobre el tabaco y el tomate por Sanders et al
(1987).
Aunque la transcripción de todos los genes haya
sido verificada, era necesario ver si la traducción y la producción
de la proteína de cabeza y la proteína quimérica de 29 Kd se había
obtenido en el caso del vector binario
pGA-\beta-3-1B.
Para ello se ha realizado un Western blot (Ausubel et al,
(1987)) sobre unas proteínas solubles extraídas a partir de
diferentes suspensiones celulares transformadas (tampón de
extracción: urea, 9M; \beta-mercaptoetanol, 7,5%,
SDS, 4,5%; pH: 6,8). Los resultados están representados en la figura
7; la parte superior del filtro ha sido revelada con unos
anticuerpos policlonales
anti-\beta-glucuronidasa y la
parte inferior por los anticuerpos policlonales
anti-BNYVV. La \beta-glucuronidasa
está presente en la mayoría de las suspensiones transformadas (banda
inmunorreactiva 68 Kd). Diez suspensiones sobre las 11 ensayadas
presentan una banda inmunorreactiva que coemigra con la proteína de
cabeza del BNYVV así como una banda de un peso molecular de
aproximadamente 29 Kd. La expresión de estas dos proteínas es del
orden de 0,05 a 0,01% de las proteínas solubles totales; esta
cantidad demuestra la buena eficacia de traducción del mensajero
producido. Debe observarse que la cantidad de 29 Kd es
particularmente elevada en la mayoría de los transformantes y puede
ser superior a la de la proteína de cabeza. El porcentaje de
readthrough en las suspensiones celulares habituadas parece
superior al observado en unas raíces de remolachas para el RNA2
(Ziegler et al, 1985) y sobre unas remolachas transgénicas
(ejemplo 15).
Cinco días después del trasplante, 2 ml de
suspensión celular apretada son digeridos en 20 ml de enzimas
cailasa. La composición del cóctel enzimático es la siguiente:
0,25%, 345 S; 0,25% T; 0,08% M_{2}L disuelto en manitol 0,7 M que
contiene 0,08 mM NaH_{2}PO_{4}, 0,03 mM MES y 0,68 mM
CaCl_{2}. La presión osmótica es ajustada a 760 mOsmoles/Kg y a pH
5,8. Después de 16 a 18H de suave agitación (30 oscilaciones por
minuto) en la oscuridad y a 24ºC, la suspensión es filtrada sobre
tamiz de 100 y 50 \mum respectivamente. El filtrado es adicionado
con un volumen igual de una solución isoosmótica de KCl a 470 mM y
los protoplastos son sedimentados a 50 g durante 5 minutos. El
residuo es tomado de nuevo en sacarosa isoosmótica a 570 mM y
centrifugado a 50 g durante 15 minutos. El anillo de protoplastos
es extraído, sometido a una segunda centrifugación en sacarosa, que,
sedimentado, es lavado dos veces en manitol a 760 mOsmoles/Kg. La
viabilidad de los protoplastos es cuantificada por coloración al
diacetato de fluoresceína (Widholm, 1972). Se asegura que la
digestión sea completa por la ausencia de coloración de la pared del
calcofluor.
La utilización de gradientes isoosmóticos pero
de densidades diferenciales ha permitido obtener unas preparaciones
de protoplastos de muy alto rendimiento 5 x 10^{6} protoplastos
por ml de células apretadas y completamente desembarazados de restos
celulares. Como mediana, 90% de los protoplastos son viables.
El medio de cultivo de los protoplastos es un
medio de macro y microelementos de Murashige y Skoog (1962) donde
el NH_{4}NO_{3} está disminuido a la mitad y adicionado con:
- 1 g/l hidrolizado de caseína
- 30 g/l sacarosa
- 7,7 mg/l glicina
- 1,3 mg/l de ácido nicotínico
- 0,25 ng/l piridoxina
- 0,25 n/l Tiamina-HCl
- 400 mg/l glutamina
- 25 mg/l glucosamina
- 1 mg/l 6 bencilamino purina
- 1 mg/l ácido indolacético
La presión osmótica es ajustada a 760
mOsmoles/Kg con manitol y el pH a 5,8. El medio de cultivo es
esterilizado por filtración.
Unos protoplastos han sido aislados a partir de
suspensiones celulares transformadas y no transformadas. Han sido
puestos en cultivo en el medio anterior en presencia y en ausencia
de kanamicina a 200 mg/l a fin de calcular la eficacia de extensión.
Los resultados demuestran que los protoplastos aislados a partir de
células no transformadas no sobreviven en medio selectivo que
contiene 200 mg/l de kanamicina. Esto está de acuerdo con la
ausencia de escape en las experiencias de transformación. Ninguna
diferencia significativa ha sido encontrada en las eficacias de
extensión de protoplastos salidos de células transformadas en
presencia y ausencia de kanamicina. Esto confirma pues la ausencia
de células no transformadas en el seno de las cepas transformadas.
Cuando tienen lugar experiencias comparativas que serán descritas a
continuación, los protoplastos salidos de 4 tipos de cepas
celulares (\beta7 y \beta14 que expresan la 22 Kd y la 29 Kd,
WT, no transformadas y \betaD transformada por el vector binario
pGA492) serán puestos en cultivo en ausencia de presión de
selección.
La optimización de la técnica de infección se ha
efectuado sobre unos protoplastos salidos de células no
transformadas. Los inventores se han inspirado en la técnica de
infección por el polietilenglicol descrita por Samac et al
(1983) y en la de electroporación descrita por Watts et al,
(1987). A fin de obtener unos porcentajes elevados de infectividad,
era imperativo utilizar unas preparaciones de protoplastos
desprovistos de restos, que tienen unos porcentajes de viabilidad
superiores a 90%, así como unas preparaciones de virus con la edad
de menos de dos semanas.
La frecuencia de infección ha sido determinada
por inmunofluorescencia por una técnica indirecta descrita por
Maule et al (1980). Los protoplastos infectados tienen una
fluorescencia verde claro característica, dispersada en el
citoplasma; los protoplastos no infectados son marrón claro. La
figura 8 presenta los resultados de 4 experiencias de infección de
protoplastos de remolacha por la técnica al polietilenglicol. Se ha
constatado que después de 24 horas de cultivo aproximadamente 60%
de los protoplastos están infectados. Este porcentaje no evoluciona
de forma significativa para unas duraciones de cultivo superiores a
24 h. La infección se ha realizado por tanto de forma casi sincrona.
Esta figura muestra también que el virus desactivado por
congelaciones y descongelaciones repetidas no se réplica en los
protoplastos de remolacha. En todas las experiencias efectuadas, una
mediana a 50% de los protoplastos están infectados.
Los inventores han conseguido introducir unas
partículas virales del BNYVV utilizando unos impulsos eléctricos
(técnica de electroporación). Los inventores se han inspirado en la
técnica descrita por Watts et al (1987) y han utilizado un
electroporador de descarga de capacidades (Guerche et al,
1987).
La optimización de la técnica se ha realizado
haciendo variar la duración de impulso suministrado por unos
condensadores de diferentes capacidades y la resistividad del medio
de electroporación. Es así que los inventores han visto como dos
impulsos de 100 ms suministrados con 15 segundos de intervalo por
unos condensadores de capacidad de 63 \muF cargados a 220 V a 1 x
10^{6} protoplastos puestos de nuevo en manitol que contiene
CaCl_{2} a 5 mM en presencia de 5 \mug de BNYVV permitían tener
un porcentaje de 55% de protoplastos infectados. La omisión del
CaCl_{2} conduce a una disminución de la infectividad en un
factor 3, aunque la viabilidad de los protoplastos sea aumentada en
un factor 2. Esto está ilustrado en la figura 9.
A fin de determinar si la proteína de cabeza (22
kD) de BNYVV y la proteína derivada (29 kD) producida en las
células de remolacha podía inhibir la multiplicación del virus, los
inventores han inoculado unos protoplastos salidos de células que
expresan o que no expresan estas proteínas por el virus. Las
experiencias se han realizado por las técnicas al PEG y por
electroporación. La infección se ha visualizado por
inmunofluorescencia de las células 30 horas después de cultivo. No
se ha detectado ruido de fondo en inmunofluorescencia en las células
transformadas y que expresan la proteína de cabeza antes de
inoculación.
1 x 10^{6} protoplastos han sido inoculados
con 5 \mug de BNYVV (F13 ó S2) salvo para la experiencia 4 donde
el inóculo consistía en 30 \mug de BNYVV. Las cifras representan
el porcentaje de protoplastos fluorescentes detectados 30 h después
de la inoculación. CP+ y CP- son unas cepas celulares transformadas
que expresan y no expresan la proteína de cabeza del BNYVV.
La tabla 2 resume los resultados obtenidos con
dos cepas celulares (\beta7 y (\beta14) que expresan
fuertemente dos proteínas, y la cepa celular transformada (\betaD)
y la cepa celular no transformada WT. En todos los casos, el
porcentaje de protoplastos infectados aislados de células
transformadas \beta7 y \beta14 es significativamente menor que
el de los protoplastos de células no transformadas. Las
experiencias 7 y 8 prueban bien que la protección es debida a la
presencia de las proteínas 22 Kd y 29 Kd, puesto que el porcentaje
de infección de los protoplastos salidos de las células de la cepa
8D es comparable con el de las células no transformadas. Por tanto
el proceso de transformación en sí mismo no confiere protección a
la infección por los virus. La expresión de proteínas extrañas,
distintas de las del BNYVV no confiere ya la protección a la
infección por este mismo virus. La protección no es abolida cuando
se aumenta la concentración del virus presente en el inóculo. Los
perfiles desitométricos (figura 10) de los RNA totales (aislados de
protoplastos \beta14 y WT infectados) e hibridados con una sonda
cDNA total contra los 4 RNA de BNYVV que muestran que aquéllos no
se réplican en los protoplastos que expresan la proteína de cabeza
del virus. La protección ha sido también observada cuando la
inoculación se ha efectuado por electroporación que indica que la
protección es independiente del método utilizado para la
inoculación.
Estos resultados demuestran por primera vez que
unos protoplastos de remolacha que expresan la proteína de cabeza
viral del BNYVV y la proteína quimérica derivada están protegidos
contra la infección por este mismo virus.
Después de un primer paso de un mes sobre M.SB1
+ C ó MSB1 + CK, los callos transformados son trasplantados cada
mes sobre MSB1. Después de los plazos más o menos largos, que
varían de una semana a varios meses, unos brotes y/o embriones
regeneran sobre algunos de estos callos.
Se ha observado que, después de transformación,
los callos tienen el mismo fenotipo que la suspensión de partida.
Es decir que el tipo noduloso o habituado se encuentra de nuevo
después de la transformación. Además, parece que sean los callos
transformados de tipo noduloso que tengan la mayor aptitud para la
regeneración. Permiten la regeneración de varias estructuras que se
desarrollan bastante bien y rápidamente en planta, mientras que las
estructuras obtenidas sobre los callos habituados transformados son
muy raras, largas y muy difíciles de desarrollarse en planta.
Las estructuras regeneradas son muy heterogéneas
morfológicamente. Las mismas son trasplantadas, y después de haber
sido cortadas por la base con el escalpelo, sobre el medio MSBO.1
en cajas de Petri.
Cuando los brotes empiezan a desarrollar varias
hojas, son puestos de nuevo en multiplicación vegetativa en macetas
o cajas. Los brotes más desarrollados son entonces puestos en
enraizado sobre MS + ANA 1 mg/L (ANA: ácido naftalenacético). Las
raíces aparecen de 2 a 6 semanas después.
En cuanto las raíces están suficientemente
desarrolladas, las plantas son aclimatadas en invernadero en tierra
universal. Al cabo de 3 meses, las plantas están bien desarrolladas
(ver foto) y han perdido la mayor parte de las variaciones
fenotípicas debidas al cultivo in vitro.
Aunque eran conocidas las remolachas
transgénicas, gracias a los tests de detección del gen codificante
para la \beta-glucuronidasa, no era cierto que el
gen interesante, a saber el que codifica para las proteínas de
cabeza del BNYVV, estuviera bien expresado en estas plantas. Para
saberlo, es preciso detectar estas proteínas en los tejidos de
remolachas transformadas. Para detectar las proteínas en las
transformantes, se ha recurrido a la técnica de Western blot
(Ausubel et al, 1987). Esta consiste en hacer emigrar las
proteínas solubles extraídas del triturado de tejidos de los
transformantes, sobre el gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (Laemmli, 1970). Las proteínas así separadas son
transferidas por electrotransferencia sobre una membrana de
nitrocelulosa. Esta membrana es a continuación hibridada con unos
anticuerpos policlonales de conejos dirigidos contra el BNYVV. El
revelado se realiza por adición de anticuerpos anticonejo conjugados
con la fosfatasa alcalina, que constituye unos substratos
cromógenos. La figura 11 muestra el tipo de resultados obtenidos.
Los extractos de remolachas transgénicas que contienen el gen
codificante para las proteínas de cabeza muestran una banda
inmunorreactiva que emigra al mismo nivel que la proteína de cabeza
del virus. Esta banda no está presente en los extractos de plantas
no transformadas. Además, en los extractos de plantas transformadas,
se detecta una banda de 29 Kd correspondiente a la proteína
quimérica derivada de la 22 Kd por adición de 64 ácidos aminados,
debida al "readthrough" (ejemplo 5). Estas dos proteínas de 22
y 29 Kd sólo han podido ser detectadas en unos extractos de raíces
transformantes y no en las hojas. La figura 11 ilustra por tanto la
expresión específica, en las raíces de remolachas transgénicas, de
las proteínas de 22 KD y de 29 KD, a pesar de la utilización de un
promotor constitutivo. La funcionalidad del promotor en las partes
aéreas de la planta está confirmada por la expresión del gen
marcador GUS en todos los tejidos.
El BNYVV se transmite y se desarrolla a nivel de
las raíces, y es por tanto ventajoso que las proteínas susceptibles
de inhibir el virus estén presentes en estos órganos.
Después de 2 a 3 meses de aclimatación en
invernadero de las plantas transgénicas, se ha constatado que eran
fenotípicamente conformes con la planta madre. En esta fase las
plantas poseen de 10 a 15 hojas muy bien desarrolladas, y están
siempre en estado de roseta. Para saber si las plantas obtenidas
son totalmente normales y en particular fértiles, y si el gen
introducido es transmitido a la descendencia, las plantas han sido
vernalizadas para introducir la subida de semilla. Los
transformantes primarios son por tanto puestos entre 2 y 7ºC en la
oscuridad durante 3 meses, y después en el campo en período de día
largo. De un mes a un mes y medio después de la plantación en el
campo, el tallo floral empieza a subir.
La floración tiene lugar tres meses
aproximadamente después de la salida de vernalización, y los frutos
están maduros dos meses después.
En cuanto a los glomérulos están bien secos, son
recolectados y limpiados. Las semillas estarán preparadas para ser
sembradas.
Los métodos de transformación y de regeneración
descritos en los ejemplos 9 a 14, han sido aplicados a unas
suspensiones celulares y a unas dispersiones de callos blancos
friables salidos de plantas que provienen de una variedad
"elite" (variedad parienta de híbridos comerciales).
Se han obtenido unas plantas transgénicas que
expresan la proteína de cabeza del BNYVV. Esta expresión era
específica en las raíces. Teniendo la variedad "elite" un
ambiente genético diferente de las otras variedades transformadas,
la expresión específica parece ser entonces conservada en la
especie Beta vulgaris.
La reproductibilidad de estas técnicas ha sido
verificada aplicando los métodos de transformación y de
regeneración de la invención a otras variedades y en otros puntos
geográficos por otro equipo de experimentadores. En cada caso, se
han obtenido unas plantas transgénicas.
Unas semillas transgénicas se han obtenido a la
vez sobre unas autofecundaciones de las plantas transformadas y
sobre unos cruces de estas mismas plantas con otras tres cepas de
remolachas machos estériles (una cepa macho estéril génica
monogérmen, una cepa macho estéril génica multigérmen y una cepa
macho estéril citoplásmica).
Se ha obtenido la expresión específica de la
proteína de cabeza y de la proteína de 29 kD en las raíces de todas
las plantas transgénicas salidas de autofencundaciones y de
cruces.
Estos resultados atestiguan que esta expresión
específica es mantenida en un ambiente genético diferente que el de
los transformantes primarios.
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Claims (40)
-
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1. Procedimiento de transformación de células vegetales que pertenecen a la especie Beta vulgaris, caracterizado porque comprende la puesta en contacto de una dispersión de callos blancos friables en un medio de cultivo celular vegetal líquido que contiene 0 a aproximadamente 3,0 mgL^{-1} de una citoquina con Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector que lleva un gen destinado a ser introducido en las células vegetales, seguido de cocultivo de las células vegetales y de las bacterias para dar lugar a unos callos friables transformados. - 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas sucesivas siguientes:
- I)
- inducción de callos blancos friables a partir de explantes;
- II)
- dispersión de los callos en un medio de cultivo celular vegetal líquido que contiene 0 a aproximadamente 3,0 mgl^{-1} de una citoquinina;
- III)
- puesta en contacto de la dispersión con Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector que lleva un gen destinado a ser introducido en las células vegetales, seguida de cocultivo de las células vegetales y de las bacterias;
- IV)
- lavado de las células vegetales para eliminar las bacterias y selección de las células transformadas sobre un medio selectivo;
- V)
- cultivo de las células transformadas seleccionadas para obtener unos callos friables transformados.
- 3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los callos blancos friables son inducidos a partir de hojas jóvenes, que tienen por ejemplo una longitud de 3 a 5 cm, extraídas de una planta con una edad de menos de tres meses.
- 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la dispersión de los callos se efectúa en un medio de cultivo celular vegetal que contiene 6-bencilaminopurina (BAP), más particularmente aproximadamente 1 mgl^{-1} BAP.
- 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medio de cultivo celular vegetal es el medio de Murashige y Skoog (1962), llamado medio M.S.
- 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cocultivo de células vegetales y de las bacterias se efectúa durante 3 días en la oscuridad sobre un medio de cultivo celular vegetal tal como el medio MS, eventualmente adicionado con citoquinina, por ejemplo aproximadamente 1 mgl^{-1} BAP.
- 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la eliminación de las bacterias se efectúa por lavado de las células vegetales con un medio de cultivo celular vegetal que contiene un agente bacteriostático que inhibe el crecimiento de Agrobacterium, por ejemplo la cefotaxima.
- 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la selección de las células transformadas se efectúa sobre un medio que contiene kanamicina.
- 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cultivo de las células transformadas seleccionadas se efectúa sobre un medio de cultivo sólido, tal como el medio M.S sólido, adicionado con citoquinina, agente bacteriostático y agente selectivo.
- 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el gen destinado a ser introducido en las células vegetales se elige entre un gen que confiere un carácter de interés agronómico o industrial, por ejemplo un gen de resistencia a la infección por un virus, tal como un gen codificante para la proteína de cabeza del virus BWYV o del virus BNYVV, un gen que confiere una resistencia a un herbicida o a un insecticida, o también un gen cuya expresión confiere la esterilidad macho.
- 11. Procedimiento de regeneración de brotes y/o embriones transgénicos que pertenecen a la especie Beta vulgaris a partir de explantes, caracterizado porque comprende las etapas sucesivas siguientes:
- I)
- obtención de callos friables transformados según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
- II)
- trasplante de los callos transformados sobre un medio de cultivo que contiene 0 a aproximadamente 3 mgl^{-1} de una citoquinina, y eventualmente un agente bacteriostático y un agente selectivo hasta la aparición de brotes y/o embriones transgénicos.
- 12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el medio de cultivo es el medio M.S adicionado con aproximadamente 1 mgl^{-1} BAP y eventualmente aproximadamente 300 mgl^{-1} de cefotaxima y 200 mgl^{-1} de kanamicina.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 13. Procedimiento de regeneración de plantas transgénicas que pertenecen a la especie Beta vulgaris, caracterizado porque comprende las etapas sucesivas siguientes:
- I)
- regeneración de brotes y/o embriones transgénicos según el procedimiento de la reivindicación 11;
- II)
- trasplante de los brotes y/o de los embriones transgénicos sobre un medio de cultivo tal como el medio M.S adicionado con aproximadamente 0,1 mgl^{-1} de citoquinina, por ejemplo de la BAP;
- III)
- puesta de las estructuras regeneradas en multiplicación vegetativa seguida de enraizado sobre un medio de cultivo tal como el medio M.S que contiene ácido naftalenacético, por ejemplo aproximadamente 1 mgl^{-1}.
- 14. Procedimiento de producción de semillas de plantas transgénicas que pertenecen a la especie Beta vulgaris, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- I)
- regeneración de plantas transgénicas según el procedimiento de la reivindicación 13;
- II)
- vernalización de las plantas transgénicas y recolección de las semillas después de floración.
- 15. Callos friables transformados que pertenecen a la especie Beta vulgaris y que pueden ser producidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
- 16. Brotes y/o embriones transgénicos que pertenecen a la especie Beta vulgaris y que pueden ser producidos según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12.
- 17. Plantas transgénicas que pertenecen a la especie Beta vulgaris y que pueden ser producidas según el procedimiento de la reivindicación 13.
- 18. Semillas transgénicas de plantas transgénicas que pertenecen a la especie Beta vulgaris y que pueden ser producidas según la reivindicación 14.
- 19. Planta transgénica que pertenece a la especie Beta vulgaris y resistente a la infección por el virus de las nervaduras amarillas y necróticas de la remolacha azucarera (BNYVV), siendo dicha planta transformada de una manera estable por un fragmento de ácido nucléico, cuyo producto de expresión es capaz de conferir dicha resistencia, siendo dicho fragmento derivado del extremo 5' del ARN2 genómico o subgenómico del BNYVV, o del cADN correspondiente, codificando este fragmento para por lo menos una parte de las proteínas codificadas por los nucleótidos 145 a 3285 de la secuencia salvaje del ARN2, y estando bajo el control de un promotor que permite la expresión del fragmento en las células de la planta y estando en la orientación sentido o antisentido.
- 20. Planta transgénica según la reivindicación 19, en la cual dicho fragmento codifica para por lo menos una parte de la proteína codificada por los nucleótidos 145 a 2218 del ARN2 o para una variante de esta proteína que presenta una
homología de por lo menos 80% y que comprende la inserción, la sustitución o la deleción de ácido(s) aminado(s). - 21. Planta transgénica según la reivindicación 20, en la cual dicho fragmento codifica para la proteína codificada por los nucleótidos 145 a 708 y, además, para una parte de la proteína codificada por los nucleótidos 709 a 2218 del ARN2 del BNYVV.
- 22. Planta transgénica según la reivindicación 21, en la cual dicho fragmento codifica para la proteína codificada por los nucleótidos 145 a 871 del ARN2 del BNYVV.
- 23. Planta transgénica según la reivindicación 22, en la cual dicho fragmento está compuesto por los nucleótidos 91 a 871 del ARN2 del BNYVV.
- 24. Planta transgénica según la reivindicación 20, en la cual dicho fragmento codifica para por lo menos una parte de una variante de la proteína codificada por los nucleótidos 145 de 2218, distinguiéndose dicha variante de la secuencia salvaje por la presencia de la secuencia Glu Asp Leu Pro que reemplaza los ácidos aminados His Ala codificados por los nucleótidos 253 a 258 en la secuencia salvaje.
- 25. Planta transgénica según la reivindicación 24, en la cual dicho fragmento codifica para una parte de la variante y está compuesto por los nucleótidos 91 a 871 de la secuencia salvaje, siendo los nucleótidos 253 a 258 de la secuencia salvaje reemplazados por los que codifican para Glu Asp Leu Pro.
- 26. Planta transgénica según la reivindicación 24, en la cual dicho fragmento codifica para una parte de la variante, correspondiendo dicha parte a la codificada por los nucleótidos 145 a 255 en la secuencia salvaje, estando los nucleótidos 253 a 255 de la secuencia salvaje reemplazados por los que codifican para Glu.
- 27. Planta transgénica según la reivindicación 24, en la cual dicho fragmento codifica para una parte de la variante, correspondiendo dicha parte a la codificada por los nucleótidos 256 a 871 en la secuencia salvaje, estando los nucleótidos 256 a 258 de la secuencia salvaje reemplazados por los que codifican para Asp Leu, Pro.
- 28. Planta transgénica según la reivindicación 20, en la cual dicho fragmento codifica para por lo menos una parte de una variante de la proteína codificada por los nucleótidos 145 a 2218, distinguiéndose dicha variante de la secuencia salvaje por la presencia de la secuencia Arg Ser Ser Gly en lugar de los ácidos aminados codificados por los nucleótidos 637 a 651 de la secuencia salvaje, formando la secuencia Arg Ser Ser Gly el carboxi terminal de la proteína.
- 29. Planta transgénica según la reivindicación 28, en la cual dicho fragmento codifica para una parte de la variante y está compuesto por los nucleótidos 91 a 871 de la secuencia salvaje, estando los nucleótidos 637 a 654 de la secuencia salvaje reemplazados por los que codifican para Arg Ser Ser Gly Stop.
- 30. Planta transgénica según la reivindicación 29, en la cual dicho fragmento codifica para una parte de la variante, correspondiendo dicha parte a la codificada por los nucleótidos 144 a 640 de la secuencia salvaje.
- 31. Planta transgénica según la reivindicación 29, en la cual dicho fragmento codifica para una parte de la variante y está compuesto por los nucleótidos 641 a 871 de la secuencia salvaje, estando los nucleótidos 641 y 642 de la secuencia salvaje reemplazados por GA y estando los nucleótidos 643 a 654 reemplazados por los que codifican para Ser Ser Gly Stop.
- 32. Planta transgénica según la reivindicación 19, que comprende un fragmento del extremo 5' del ARN2 subgenómico del BNYVV, o del cADN correspondiente, codificando dicho fragmento para por lo menos una parte de la proteína codificada por los nucleótidos 2133 a 3285 del ARN2, o para una variante de esta proteína que presenta por lo menos 80% de homología y que comprende la inserción, la sustitución o la deleción de ácido(s) aminado(s).
- 33. Planta transgénica según la reivindicación 32, en la cual dicho fragmento codifica para la proteína codificada por los nucleótidos 2133 a 2774 del ARN2 del BNYVV.
- 34. Planta transgénica según la reivindicación 33, en la cual dicho fragmento está compuesto por los nucleótidos 2078 a 2774 del ARN2 del BNYVV.
- 35. Planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 34, caracterizada porque expresa la proteína que confiere la resistencia, y codificada por dicho fragmento, únicamente en las raíces.
- 36. Planta transgénica según la reivindicación 35, caracterizada porque el promotor que controla la expresión de dicha proteína es un promotor constitutivo, por ejemplo el pNos ó el p35S.
- 37. Planta transgénica según la reivindicación 35, susceptible de ser obtenida por el procedimiento de la reivindicación 13.
- 38. Semillas transgénicas de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 37.
- 39. Semillas de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 17 o 19 a 37, que comprende unas semillas transgénicas según la reivindicación 38.
- 40. Procedimiento de producción de plantas transgénicas que pertenecen a la especie Beta vulgaris y que resisten la infección por el BNYVV, expresando dicha planta, específicamente en las raíces, una proteína capaz de conferir dicha resistencia, comprendiendo dicho procedimiento la transformación, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 por medio de Agrobacterium turnefaciens, de células que provienen de Beta vulgaris con uno de los fragmentos de ácido nucléico tales como los descritos en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 34, estando la transcripción de dicho fragmento bajo el control de un promotor constitutivo tal como el p35S o el pNos, seguido de la regeneración de una planta transgénica a partir de las células transformadas.
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