JP5350246B2 - トランスジェニック植物を作製する方法 - Google Patents
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Description
「カルス」とは、細胞または組織の脱分化した増殖する塊をいう。
「外植片」とは、形質転換し、その後にトランスジェニック植物に再生することができる植物部分をいう。典型的な外植片には、未成熟胚、カルス、子葉、***組織、葉または茎が含まれる。
「組織培養培地」とは、非−土壌環境における植物の増殖および発達を支持するために用いる液体、半固体または固体の培地をいう。好適な植物組織培養培地は、続いて詳細に論じるように、当業者に知られている。培地成分は本明細書中に同定した者以外の供給業者から得ることができ、それらの要件に従って当業者によって使用するために最適化され得る。
「内因性」とは、生物または細胞内に起源を有する材料をいう。
「外因性」とは、生物または細胞の外側に起源を有する材料をいう。それは、形質転換されたまたはトランスジェニック宿主細胞および植物を作製するのに使用する核酸分子をいう。本明細書中で用いるように、外来性とは、同様の核酸がすでにかかる細胞に存在し得るか否かにかかわりなく、受容細胞に導入するいずれの核酸をもいうことを意図する。
「核酸」とは、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)をいう。
「表現型」とは、遺伝子型および環境の相互作用から生じる生物によって示される特性をいう。
「ポリアデニル化シグナル」または「polyAシグナル」とは、コーディング領域から転写されたmRNAの3'末端へのアデニル酸ヌクレオチドの付加を促進する該コーディング領域の3'側に位置する核酸配列。
「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、正確な部位で転写が開始されるのに必要なRNAポリメラーゼまたは他の因子に認識部位を与えることによってメッセンジャーRNA(mRNA)の生成を制御することによってコーディング配列の発現を制御する、通常コーディング配列の5'側に見出される核酸配列をいう。
「再生培地」とは、選択剤を含有することを必要とする植物組織培養培地をいう。
「再生可能なカルス」とは、それから全植物を生成することができるが、その場合の再生の様式(胚形成または器官形成)が決定していないまたは議論にしっくりしていないカルスをいう。
「選択」とは、形質転換した細胞、組織または植物を得るために接種した外植片と選択培地とを接触させることをいう。
「選択培地」とは、選択剤を含有する植物組織培養培地をいう。
「形質転換」とは、外因性核酸配列(ベクターまたは構築物)を細胞またはプロトプラストに導入するプロセスをいい、ここに外因性核酸は核DNA、プラスチドDNAに取り込まれ、自律複製することができる。
「形質転換可能な外植片」とは、形質転換に対して受容的である植物のいずれかの部分をいう。
以下の実施例は本発明の種々の形態を説明する目的で提供するものであって、いかなる場合においても本発明を限定することを意味するものではない。当業者であれば、本発明が前述した目的を行い、目標および利点、ならびにそれらに固有のこれらの目的、目標および利点を得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載した方法とともに本実施例は、好ましい形態の現在の代表であって例示的であり、本発明の範囲に対する制限を意図するものではない。本明細書中の変化および特許請求の範囲によって規定される発明の意図の中に包含される他の使用は、当業者に思い出されるであろう。
外植片源および培養条件
トウモロコシの未成熟胚から得た8日齢カルス(継代培養後8日)をゲル化211V培地(N6基本塩混合物、1mg/Lの2,4-D、1mg/Lの塩酸チアミン、1mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2・6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、0.1mMの硝酸銀、6g/LのPhyta agar)上で培養した。
液体培地は212V(2mg/Lの2,4-D、1mg/LのチアミンHCl、1mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2・6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、0.01mMの硝酸銀からなり、pH5.8に調整し、121℃、105kPaにて20分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ後、250mg/Lまたは500mg/Lおよび100mg/Lまたは200mg/Lの濃度の濾過滅菌したカルベニシリンおよびパロモマイシンを選択剤として培地に添加した。
すべての培養は増殖キャビネット(Percival scientific Series 101US)中、暗所下、27-28℃にてインキュベートした。
活発に増殖した均一なサイズの8日齢カルスを選択し、アグロバクテリウム懸濁液(0.25×109cfu/mL)で30分間感染させた。そのカルスを0.1mMのAgNO3を含有する212V液体培地で線上し、TIS容器または濾紙を含む25×100mmのペトリプレートまたは2層のポリエステル製フェルト(220×220mm)を含む大きな浅底ペトリプレート(240×240mm)に移した。同時培養処理は、暗所下、23℃にて行った。
ABIアグロバクテリウムC58株を用いて植物細胞へのDNAのトランスファーを媒介した。プラスミドpMON30113(図1)には、選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子(NPTII)および35Sプロモーターによって駆動するスクリーニング可能なマーカーとして緑色蛍光タンパク質(GFP)を含ませた。
臨時浸漬系(TIS)
修飾TISは以下のようにして構築した。オートクレーブ可能な250mLフィルターユニット(Nalge Nunc Intl., Rochester, NY)の2のチャンバーを、通常はメンブレンフィルターを保持するために使用する支持プレートの基部にガラス管を挿入することによって連結した。空気の流れは、ポアサイズ0.2μm、50mm直径の疎水性PTFEメンブレンフィルター(Millipore, Billerica, MA)を通過させることによって滅菌した。液体培地を下側のチャンバーに入れ、外植片材料を上側のチャンバー中の支持ディスクに入れた。空気を下側チャンバーにポンプ送給してガラス管を通して液体培地を上側のチャンバーに転置して、カルスを浸漬した。上側チャンバーにポンプ送給された空気は培地に圧力をかけて下側チャンバーに戻した(液体培地の薄いフィルムのみが組織上に残っている)。電子タイマーを用いて、上側または下側のいずれかのチャンバーへの空気の流れを制御するソレノイドを制御した。タイマーは、下側チャンバーへの空気の流れ、上側チャンバーへの空気の流れまたは「空転空気の流れ」のいずれかにプログラムした。空気の流れのタイマーは各々1ないし5分に設計したが、空転時間を変化することはできる。ついで、プログラムを設定して、異なるステージの形質転換プロセスを通した連続サイクルで進めた。このようにして、組織を、設定した間隔でほぼ1-5分間完全に浸漬した。これを浸漬サイクル頻度という。
組織を1分間の水没および4の異なる浸漬サイクル頻度(6時間、8時間、12時間および24時間毎に1回)の各々で組織を培養し、8週間試験した。対照として、同一の穂由来のカルスの半分を選択剤を含む211Vゲル化培地で培養した。
前記したpMON30113をカルスに接種した。接種後、感染したカルスは、0、100、250、500または1000mg/Lのカルベニシリンのいずれかを補充したカルス増殖培地(212V)に移した。アグロバクテリウムの増殖は、TIS装置の下側チャンバー中の液体培地の濁度を観察することによって視覚で判定した。非接種対照処理の別のTISユニットを含めた。非−接種カルスのさらなる対照も、カルベニシリンを補充したゲル化培地(211V)上で培養して、カルス培養物に対するカルベニシリンの効果を実験した。
非−トランスジェニックカルス増殖を阻害するために、ゲル化(対照)および液体培養培地の両方に、選択剤パロモマイシン(25、50、75、100または200mg/L)を補充した。対照処理は、(1)選択培地上の非−接種カルス、(2)選択を含まない培地上の非−接種カルス、および(3)選択を含まない培地上の接種カルスとした。基本培養培地は、211Vまたは212Vのいずれかからなる。この実験については25×100mmの底深ペトリプレートを用いた。液体培養では、2層の60×60mmのフェルトを用いて外植片を保持した。アグロバクテリウム接種培養の選択剤には、カルベニシリンおよびパロモマイシンを含ませた。
発達しているカルスを4の異なる量の液体培地(20mL、30mL、50mLおよび100mL/容器)のうちの1で培養した。
TIS中での同時培養の3日後に、20mLの選択培地212VRT(2mg/Lの2,4-D、1mg/LのチアミンHCL、1mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2 .6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、0.01mMの硝酸銀、500mg/Lのカルベニシリンおよび100mg/Lのパロモマイシンを含むN6基本塩)をTISの下側チャンバーに注入した。カルスは12時間毎に1回1分間浸漬した。2週間のインキュベーション後に、真空ポンプを用いて下側チャンバーから212VRT培地を吸引し、20mLの212RT(硝酸銀を含まない)培地で置換した。カルスはさらに2週間、24時間毎に1回1分間浸漬した。4週間の選択フェーズを完了した後に、選択培地をBAP-プラス217A培地(1mg/LのチアミンHCL、1mg/Lのニコチン酸、3.52mg/LのBAP、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2 .6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、250mg/Lのカルベニシリンを含むN6基本塩)で置換した。カルスは7日間、12時間毎に1回1分間浸漬して217A培地で処理した。
実施例1のようにして得たカルスを0.1mMのAgNO3を含有する212V液体培地で洗浄し、濾紙を含む25×100mmのペトリプレートまたは2層の(220×220mm)アクリル酸製フェルトを含有する25×100mmの大きな浅底ペトリプレート(240×240mm)のいずれかに移した。
マルチウェル・プレートも単一の容器システムとして使用することができる。ペトリプレートの代わりにマルチウェル・プレートを用いる以外は前記と同様にして実験を行った。Costar(Corning Life Sciences, Acton, MA)からのマルチウェル・プレートをTranswell(商標)インサートを含めてまたは含めないで使用した。使用したメンブレンの孔径(0.1μ)により、組織が溢れ出すことなく、培地がメンブレンを横切ってトウモロコシ組織に滴下することが許容される。ピペット先端アクセスポートにより、培地変化のために培地を迅速に除去してウェルに添加することが許容される。培地移動の間に、真空ホースで古い培地を吸引し、新しい培地をピペット操作することによってウェル内の培地を交換した。
単一容器システムのもう1の例は、固体培地を含み、つづいて液体培地を添加して、古い培地を置換することなく単一のプレートで選択および再生を促進する単一のペトリ皿の使用である。トウモロコシカルスは、実施例7に記載するように得て、接種した。
新規な懸濁液培養法を用いたトウモロコシのアグロバクテリウム媒介形質転換
形質転換可能な細胞懸濁液培養物の創製が時間がかかり、非−胚形成細胞の創製をしばしば生じる。この実施例は、非常に胚形成であってアグロバクテリウム−媒介遺伝子形質転換について非常にコンピーテントである迅速な懸濁液培養を作るための非常に再現性の高い方法(本明細書中において「短期懸濁液培養」または「SSC」)を記載する。外植片としてのSSCは、カルス(胚形成および使用の簡便性)および懸濁培養(均一、非常に再生可能およびハイスループット生産への修正余地の望ましい特徴を結合する。この非−限定的な例において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)を選択可能なマーカーとして用い、標準的なバイナリーベクターシステムをトウモロコシにおけるアグロバクテリウム−媒介安定トランスジェニック事象の効率的な選択および再生に用いた。
バイナリーベクターpMON25457を保有する非病原化アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101をこの実験に用いた。pMON25457は、各々強化35Sプロモーター(「e35S」)およびつづく非−翻訳hsp70イントロンによって駆動される、選択可能な遺伝子(nptII)およびレポーター遺伝子(uidA)を含んでいる。uidA遺伝子は、そのコード配列内にさらなるイントロンを有して細菌発現を最小限化する。プラスミドは、2.5kVおよび400オームで操作するBio-Rad Gene Pulserを用いたエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム菌株に導入した。形質転換したコロニーは、各々100mg/Lのカナマイシンおよびゲンタマイシンを含有する固体Luria-Bertani(LB)培地(SambrookおよびRussell,2001)上で選択した。
形質転換に用いたアグロバクテリウム細胞は、ABベースの誘導培地(0.1 M MES、0.5mMのNaH2PO4、2%のグルコース、1g/LのNH4Cl、300mg/LのMgSO4・7H2O、150mg/LのKCl、10mg/Lの無水CaCl2、2.5mg/LのFeSO4・7H2O、NaOHでpHを5.4に調整)中のアセトシリンゴン(200μM)およびグルコース(2%)で予め誘導した。
トウモロコシHi-IIおよびFBLL遺伝子型は温室中、16時間の日照にて成長させた。これらの2の遺伝子型を含む交配を行い、未成熟な胚を、1.0mg/Lの2,4-D、1mg/LのチアミンHCl、0.5mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、100mg/Lのミオ−イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2 .6H20、100mg/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリンおよび20g/Lのスクロースを補充した修飾N6培地(Chuら,1976)上に切り取り;該修飾N6培地を2g/LのGelgro(カタログ番号150180,ICN Biomedicals)で固化し、培地のpHをKOH(予めオートクレーブ処理した)で5.8に調整した。同一の成長条件を選ばれた遺伝子型RBDQ2に用いた。FBLL×Hi-II雑種およびRBDQ2カルス系統は2週間間隔で継代培養し、同一の培地上、暗所下で4ヶ月間28℃に維持した。この継代培養プロトコールを、Hi-IIおよびFBLL-MAB系統でも行った。
カルスからSSCを創製する一般的なプロトコールは以下の通りである。SSC形成を開始するために、約2gのカルス、継代培養後2週間を、2.0mg/Lの2,4-D、20g/Lのスクロース、150mg/LのL-アスパラギン、100mg/Lのミオ−イノシトール、650mg/Lのニコチン酸、125mg/LのピリドキシンHCl、125mg/LのチアミンHClおよび125mg/Lのパントテン酸カルシウム(中性pHをKOHで5.8に調整)を含有する1mLのMS Fromm 1000xビタミンストックを補充したMS Fromm培地を含有する250mL容積のバッフルフラスコに移した。SSCは、178rpmおよび28℃に設定した旋回シェーカー上で創製した。つづく各移行の間に、懸濁液を広口Falcon(商標)滅菌ディスポーザ物ピペットで移す前に、組織をフラスコの底部に簡単に沈ませて望ましくない細胞型を除去した(例えば、細長い、薄い壁、低細胞質含量または無***)。開始後1日目に、フラスコからの組織を80mLの修飾MS培地を含有する新鮮なフラスコに移し、さらに2日間増殖させた;この移行工程は開始後3日目に繰り返した。開始後5日目に、組織を2のフラスコの間に均等に分け、フラスコ当たり約2.5mLのパック細胞体積(PCV)を得た。その後に、3日毎に培地を置換した。開始後14日までに、各フラスコに得られたパック細胞体積は約6mLであった(フラスコ当たりほぼ4g、または2週間にわたる合計PCVにおける約4倍の増加)。これらの細胞(SSC)を開始後14日に新鮮な培地に移し、開始15日後に形質転換を開始した。このSSC工程全体を通しての培地の比較的頻繁な変化は、迅速な組織増殖を許容する。SSC工程のさらに有利な工程とは、各移行工程において組織の目視選択が不要であることであり、このシステムを実践的かつ再現可能にしている。
合した合計約18mLのPCVを含有するこれらのフラスコを、FBLL×Hi-IIハイブリッドSSC外植片の形質転換実験に用いた。先行実験を行い、種々の形質転換工程に含まれるパラメータを高めた。出典明示して本明細書の一部とみなすChengら(2003)によって記載された、修飾した同時培養技術を用いた。アグロバクテリウム感染後、乾燥工程を用い、これはT日NAトランスファーを大幅に増大させ、ならびにトランスジェニック事象の回復を増大させることが判明した。
パロモマイシン選択を用いるnptIIでのSSCの形質転換のプロトコールには選択の間の外植片を移すためのシンプルな濾紙支持体が含まれ、これは労力を最小限化し、アグロバクテリウムの迅速な取り出しを確保し、組織の成長速度を増大し、迅速な選択を生じる。
選択および形質転換の種々の工程でUidA活性をアッセイし、その後に出典明示して本明細書の一部とみなすJefferson(1987)によって記載された組織化学的手法を種々の形質転換および植物の成長の種々の工程で行った。nptIIの検出およびコピー数の分析は、INVADER(登録商標)アッセイ(Third Wave Technologies, Madison, WI)を用いて行った。少なくとも、上記した実験条件下では、選択圧における遅延工程につづく逐次の増大が、SSC外植片からトランスジェニックセクターを回復するために必要であることが判明した。一般的に、トウモロコシ細胞のアグロバクテリウム−媒介形質転換能力は、形質転換を開始する前にカルスを少なくとも短い液体相に付することによって改善されることが見出されている。例えば、FBLLxHI-IIハイブリッドSSC外植片は、形質転換3日後にgusを発現している80%の組織を用いて、SSCの開始後約5ないし14日の間のT日NAトランスファーに対して非常にコンピーテントであることが判明した。より高齢(2月)のSSC培養物も、形質転換3日後にuidA活性についての組織化学的染色を示す約20%の外植片を用いて、形質転換に対してコンピーテントであることが判明した。それに対して、211修飾N6培地に維持したFBLLxHi-IIハイブリッドカルスは、形質転換3日後にUidA活性についての組織化学的染色を示す20%未満の外食片を用いて、ほとんどコンピーテントでないことが判明した。
アグロバクテリウムの凍結グリセロールストックの誘導培地への直接接種による形質転換用のアグロバクテリウムの調製
これは、形質転換用のアグロバクテリウムを調製する1つの方法の非限定的な例である。より詳細には、本実施例は、vir誘導ブロスへのアグロバクテリウムの凍結グリセロールストックの直接接種を記載する。
非限定的形態において、方法は、必要なvir誘導コンポーネントを含むMS誘導培地中の凍結アグロバクテリウムグリセロール・ストックの前誘導を含み得る。前誘導の後に、アグロバクテリウム細胞を形質転換実験に直接的に使用する。
もう1の非限定的な形態において、方法は、必要なvir誘導コンポーネントを含むAB誘導培地中の凍結アグロバクテリウムのグリセロールストックの前−誘導を含む。前−誘導の後、アグロバクテリウム細胞は望ましい密度に調整し、形質転換実験に直接使用した。アグロバクテリウムは、660nmで測定して3.0のアグロバクテリウム光学密度(OD)(最終濃度)で通常のLB凍結ストックから増殖させた。
機械的手段による継代培養用のトウモロコシカルスの調製方法
トウモロコシ形質転換生産システムの最大の人間工学的な負荷であって時間のかかるプロセスは、継代培養の間にカルスを手動によりバラバラにする必要があるアグロバクテリウム媒介形質転換用の胚形成カルスの確立および維持である。さらに、形質転換プロセスの間に、多くの細胞を単一の未熟胚または単一の片のカルスで形質転換する。しかしながら、現在の選択および再生で行っていることは、通常は組織片当たり1の植物を再生する、単一の事象として単一の未熟胚または一片のカルスで形質転換した細胞の各集団を処理している。
形質転換用のアグロバクテリウムで外植片を接種する方法
アグロバクテリウム−媒介形質転換の現在の方法、例えば、トウモロコシ未成熟胚の方法では、穀粒からの時点に1の胚を切断し、それをアグロバクテリウム細胞懸濁液中でインキュベートし、アグロバクテリウム懸濁液を除去し、胚を感染を起こす同時培養プレートに移し、胚を方向付け、ついでそれを胚盤の側方に(side up)置き、最後に、選択および再生のようなさらなる操作のための選択または遅延培地に胚を移した。これらの工程の多くは、人間工学的に馴染まず、切断した胚を損傷する可能性があり、アグロバクテリウムに関連する細胞死の発生を増大させ、それによって形質転換頻度が低下する。したがって、人間工学的に馴染み、かつ、より高い形質転換頻度を生じるような、接種工程を単純化する要望がトウモロコシ形質転換の分野において存在する。
単一の工程による投与接種、同時培養および選択によるトウモロコシのアグロバクテリウム−媒介形質転換
通常、アグロバクテリウム−媒介形質転換法には3の異なる工程が含まれる:アグロバクテリウムによる外植片の接種、抗生物質を含まない培地上での接種した外植片を同時培養させて、アグロバクテリウムを生存させ、外植片の感染を高めること、および、カナマイシンおよびグリホセートのような選択剤を含有する培地上での形質転換した細胞の選択。形質転換法に必要な工程の数を減少させて生産効率を改善する要望が常に存在する。そこで、本発明者らは、トウモロコシのアグロバクテリウム−媒介形質転換の方法を提供し、そこでは、接種した外植片をアグロバクテリウムの増殖を抑制し、非−形質転換外植片細胞を殺すための選択剤を含む培地にプレートすることによって接種、同時培養および選択工程を単一の工程に結合し得、したがって形質転換生産系の効率を改善することができる。
SORBAROD上での形質転換細胞の選択およびハイスループットシステムの開発
カルスおよび未成熟胚のような好適な外植片は、当該技術分野で公知の機械的および手動による切断手段を介して得ることができ、当該技術分野において関心のあるいずれかの遺伝子を含むプラスミドを含むアグロバクテリウムで接種することができる。1の形態において、形質転換細胞の選択は液体培地に置いたフェルト片で行い、再生は液体培地に置いたSorbarod(商標)プラグ(Baumgartner Papiers SA, Crissier-Lausanne, Switzerland)上で行う。フェルトとSorbarodとを組み合わせたもう1の培養においては、幾つかの移行工程が削除される。
例示的な手順または明細書に記載した参考文献を補足する他の詳細を提供する葉にで以下の参考文献は出典明示して本明細書の一部とみなす。
米国特許第 5,159,135号
米国特許第 5,362,865号
米国特許第 5,569,834号
米国特許第 5,106,739号
米国特許第 5,107,065号
米国特許第 5,627,061号
米国特許第 5,633,435号
米国特許第6,506,559号
米国特許出願公開2002/0168707
米国特許出願公開2004/0244075
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Claims (9)
- トランスジェニック・トウモロコシ植物を作製する方法であって、
a)形質転換可能なトウモロコシ外植片を得;
b)該形質転換可能なトウモロコシ外植片を形質転換し;
c)選択培地上で、該形質転換可能なトウモロコシ外植片から形質転換したトウモロコシ細胞を選抜し;ついで
d)該形質転換した細胞を、再生培地上で植物に再生する工程を含み、
ここに、工程b)、c)およびd)を同一の容器で行う該方法。 - 容器が、バイオリアクター、ペトリ皿、マルチウェルプレート、フラスコ、ジャー、ボトル、ジャグ、PlantCon(商標)、Sundaeカップおよびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 容器が、培地を供給および除去する手段と一緒に提供される請求項1記載の方法。
- 外植片がカルス、胚および細胞懸濁液よりなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 培地が液体培地である請求項1記載の方法。
- 選択培地が固体培地であって、再生培地が固体選択培地上にオーバーレイした液体培地である請求項1記載の方法。
- 外植片を一時的に培地と接触させる請求項1記載の方法。
- 外植片を選択培地および再生培地と12ないし24時間毎に1ないし5分間接触させる請求項7記載の方法。
- 工程c)およびd)をマトリクス上で行い、ここに該マトリクスがフェルト、Sorbarodプラグおよびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項1記載の方法。
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