CN1452660A - 植物稳定转化的方法 - Google Patents

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Abstract

从植物组织(例如人工培养基中的芽尖或腋芽)诱导多芽结构，以产生多芽培养物。然后利用已知的转化方法，转化这些多芽培养物。随后从转化细胞再生植物。利用该方法可能有效转化的作物包括通常难以转化的植物，例如糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、烟草、番茄、花生、甜瓜、西瓜、南瓜、芸苔属(Brassica)和胡椒。

Description

植物稳定转化的方法
本发明涉及转化植物的转化和再生。本发明尤其涉及转化通常难以转化的植物。
通过基因转化改良植物品种对于现代植物育种已变得日益重要。具有潜在商业利益的基因，例如赋予抗病性、抗虫性或品质改善的植物性状的基因，可能通过各种基因转移技术引入作物物种。
分析植物基因表达必需开发有效的转化***。这种***的必要条件包括，使植物有效再生的适当植物靶组织、有效传送外源DNA进入植物靶细胞的基因运载工具、以及选择转化细胞的有效方法。例如在双子叶物种的基因转化中，利用细菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的转化***常常用于基因传送的载体。目前供土壤杆菌介导转化的优选靶组织包括子叶、叶片组织和下胚轴。高速微粒轰击提供了将基因传送给植物的另一方法。
尽管基因转化以及其后再生基本上是现今许多植物品种的常规事件，众多现有方法中大部分仍然难以转化某些具有商业意义的作物，例如糖用甜菜、南瓜、向日葵、大豆和棉花。
例如，甜菜(Beta vulgaris)(包括糖用甜菜、饲料甜菜、食用甜菜和唐莴苣(Swiss chard))尽管在某些细胞中瞬时表达并偶尔成功获得特定基因型，但是没有可利用的生产转基因植物的简单、常规方法。糖用甜菜原生质体难以转化，其有详细记述。例如参见国际专利申请NO.WO91/13159以及K.D’Halluin等人，Bio/Technology，10 309-314(1992))。关于土壤杆菌介导的基因转移，″糖用甜菜以困难闻名″，并且″报导的制备转基因糖用甜菜植物的大部分技术需要研究它们的实验室的技术专家，并(已经)证明不容易被他人重复″，F.A.Krens等人，Plant Sci.116，97-106(1996)，引述M.C.Elliot等人Physiology and Biochemistry of Cytokinins inPlants，329-334页(SPB Publishing，The Hague，1992)；K.Lindsey等人，J.Exp.Bot.41，529-536(1990)；以及上述D’Halluin等人。Krens等人的文章另外描述，″选择方法...利用子叶作为外植体***，其只被在表面上进行了描述″。以上Krens等人引述J.E.Fry等人，Molecular Biology of Plant Growth andDevelopment，Third International Congress of theInternational Society for Plant Molecular Biology摘要#384(R.B.Hallick，editor，Tuscon，Arizona，USA 1991)。然而，该方法效率不高；例如，一研究人员报告从15,000个培植的外植体仅仅获得21个转基因芽，包括若干嵌合体。U.Sander，Transformation von Beta vulgaris L.，(Ph.D.论文，University of Hanover，Germany 1994)。Krens等人的文章自己报告，利用子叶节以及卡那霉素选择技术，糖用甜菜的转化频率为0.9％。上述Krens等人，103页。
文献中有有关从糖用甜菜的表皮细胞制备愈伤组织(参见Kotowska等人，Bull.of the Polish Acad.Sci.32，11-12(1984)；Kotowska，Beitr.Biol.Pflanz.67，209-223(1992))的简述，以及描述在糖用甜菜叶柄表皮上制备不定芽的若干报告。例如参见Harms等人，Plant Cell Tissue Organ Culture 2，93-102(1983)；Schneider等人，Biochem.Physiol.Pflanz.182，485-490(1987))。然而，这些报告没有提供证据，证明利用这些方法能够转化糖用甜菜植物。
已经报告利用糖用甜菜原生质体转化糖用甜菜。例如参见R.Hall等人，Nature Biotechnology 14，1133-1138(1996)；R.Hall等人，Plant Physiol.107，1379-1386(1995)；R.Sevenier等人，Nature Biotechnology 16，843-846(1998)；以及欧洲专利EP0 723 393 B1。然而，从糖用甜菜叶子分离的原生质体大小和形态不同，反映来源组织内部在生理及细胞遗传水平的高度细胞不均一性。因此，利用原生质体的转化技术需要研究特定方法的实验室的专业技术人员，而且结果不容易重复。
总之，糖用甜菜的转化技术迄今非常依赖于外植体来源、植物基因型以及所用选择条件，并难以获得高效转化。例如参见K.Lindsey等人，J.Experimental Botany41，529-536(1990)；K.Lindsey等人，″Transformation in Sugar Beet(Beta vulgarisL.)，″Biotechnology in Agriculture and Forestry，Vol.23，Plant Protoplasts and Genetic Engineering IV(Y.P.S.Bajaj，Ed.，Springer-Verlag，Berlin，1993)。糖用甜菜是温带气候区域的重要作物。世界食糖消费超过30％来自糖用甜菜。因此一直需要适于迄今难以转化的甜菜和其它植物的简单、高效的转化方法。
需要简单、高效转化方法的其它难以转化的植物包括各种品种的南瓜。在一项研究中，利用从种子切离的子叶，通过体细胞胚胎发生再生夏季南瓜栽培品种。C.Gonsalves，HortScience 30，1295-1297(1995)。然而，计算该方法的再生效率为每个原始Id外植体0.3个小植株。其它报告报道了制备转基因南瓜，但是没有描述或不能公开获得用于得到再生植物的转化方法。例如参见D.Tricoli等人，Bio/Technology 13，1458-1465，1464(1995)。
已经描述了利用幼苗(非切离的)芽尖或切离的芽尖的转化方法。参见Smith等人，美国专利NO.5,164,310(在此全文引入供参考)；P.Chee等人，Plant Physiol.91，1212-1218(1989)；F.J.L.Aragao等人，Int.J.Plant Sci.158，157-163(1997)；以及P.Christou等人，Plant J.8，275-281(1992)。在这些方法中，芽尖或者转化时仍然附着于幼苗或萌芽种子，或者从幼苗切离。在后一种情况下，每个切离的芽尖最终只产生一个芽。
也已描述了利用芽尖分生培养物的转化方法。例如参见Zhong等人，美国专利NO.5,767,368(在此全文引入供参考)；H.Zhong等人，Plant Physiol.110，1097-1107(1996)；以及S.Zhang等人，Plant Cell Reports 18，959-966(1999)。然而，已经证明这些方法只对少数单子叶植物(即玉米、大麦和燕麦)有效，而且利用该方法尝试转化以后，转化的双子叶植物植物没有成功再生。此外，一般通过微粒轰击(即一般不通过根癌土壤杆菌介导)，如上述文献所述，利用芽尖分生培养物实现单子叶植物的转化。
本发明人已经发现从植物组织(例如在人工培养基上的芽尖或腋芽)诱导多芽结构的方法，产生多芽培养物。然后用根癌土壤杆菌、DNA包被的微粒高速轰击或已知的其它转化方法转化这些多芽培养物。转化以后，多芽培养物可能转移到选择培养基，以区分转化和未转化细胞。随后转到再生培养基和/或生根培养基中，从转化细胞再生植物。本发明可能应用于经济作物，包括糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、花生、甜瓜、西瓜、南瓜、芸苔属(Brassica)、烟草、番茄和胡椒。本发明提供相比现有方法的某些优点，因为其可用于转化通常难以高效转化的植物。本发明也用于转化植物、特别是双子叶植物的质体(plastid)基因组。
本发明提供：
产生转化的双子叶植物的方法，包含：(a)在培养基中培养难以转化的双子叶植物的组织，以从该组织产生多芽培养物；(b)将核酸引入多芽培养物的细胞中，从而产生包含该核酸的转化细胞；以及(c)从转化细胞再生转化植物。组织优选分生组织，优选从芽尖、腋芽或花分生组织切离，或者该组织是愈伤组织。优选实施方案中，该植物是葫芦(Cucurbitaceae)科或藜科(Chenopodiacea)的一员。另一优选实施方案中，该植物选自糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、甜瓜、西瓜和南瓜。该植物优选糖用甜菜、南瓜、甜瓜或西瓜。另一优选方案中，该组织切离自植物幼苗的芽尖。另一优选实施方案中，培养基包含至少一种植物生长调节剂，优选细胞***素。另一优选实施方案中，该生长调节剂选自6-糠基氨基嘌呤(激动素)、6-苄基-氨基嘌呤(6-BAP)、6-二甲丙烯基氨基-嘌呤(2ip)、反-6-(4-羟基-3-甲基丁-2-烯基)(trans-6-(4-hydroxzy-3-methlbut-2-enyl))氨基尿(玉米素)、TDZ、赤霉酸(GA)、IAA、NAA、dicamba、2，3，5-T和2，4-D。培养基中生长调节剂的浓度优选介于大约0.01mg/L至大约25mg/L，更优选介于大约0.01mg/L至大约10mg/L，更优选介于大约0.01mg/L至大约5mg/L，更优选介于大约0.05mg/L至大约8mg/L。另一优选实施方案中，通过微粒轰击、电泳或电穿孔，或者利用属于土壤杆菌属的细菌，将核酸引入细胞。另一优选实施方案中，该核酸包含与双子叶植物异源的核酸。该核酸优选包含编码具有PPO活性的多肽的基因、编码具有磷酸甘露糖异构酶(PMI)活性的多肽的基因、编码具有木糖异构酶(xylA)活性的多肽的基因、或者编码具有GUS活性的多肽的基因。核酸优选为包含核酸的载体，核酸包含与该植物异源的基因。
另一优选方案中，该方法的步骤(c)包含：选择包含转化细胞的多芽培养物；该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化芽；至少一个转化芽然后生长为成熟的转化植物。优选地，将该至少一个转化芽在促进根形成的培养基中生长以后，该至少一个转化芽生长为成熟的转化植物。
另一优选方案中，该方法的步骤(c)包含：选择包含转化细胞的多芽培养物；该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化芽；克隆该至少一个转化芽；以及使该克隆的芽成熟为转化植物。优选地，将克隆芽在促进根形成的培养基中生长以后，该克隆芽生长为成熟的转化植物。
本发明另外提供：
通过上述任一方法产生的转化的植物细胞。
通过上述任一方法产生的多芽培养物。
通过上述任一方法产生的转化的植物。优选实施方案中，该转化植物是表达具有PMI活性的多肽的南瓜植物、甜瓜植物或者西瓜植物。另一优选实施方案中，该转化植物是表达具有PPO活性的多肽的糖用甜菜。
本发明另外提供：
上述转化植物产生的种子(其中该种子包含转化到多芽培养物的核酸)以及由该种子长成的植物。
本发明另外提供：
产生包含转化的质体基因组的植物的方法，包含：(a)在培养基中培养植物组织，从该组织产生多芽培养物；(b)将核酸引入多芽培养物细胞的质体基因组中，从而产生包含该核酸的所述细胞转化的质体基因组；以及(c)从转化细胞再生转化植物。优选实施方案中，该组织是分生组织，优选从芽尖、腋芽、花分生组织或叶子组织切离，或者该组织是愈伤组织。优选实施方案中，该转化细胞与转化的质体基因组同质。另一优选实施方案中，该植物与转化的质体基因组同质。另一优选实施方案中，该植物是双子叶植物。优选地，该植物是葫芦科或藜科的一员。另一优选实施方案中，该植物选自糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、花生、甜瓜、西瓜、烟草、番茄、南瓜、芸苔属和胡椒。优选地，该植物是糖用甜菜、烟草和番茄。另一优选实施方案中，该组织切离或者来源于植物幼苗的芽尖。另一优选实施方案中，该培养基包含至少一种植物生长调节剂，优选细胞***素。另一优选实施方案中，该生长调节剂选自6-糠基氨基嘌呤(激动素)、6-苄基-氨基嘌呤(6-BAP)、6-二甲丙烯基氨基-嘌呤(2ip)、反-6-(4-羟基-3-甲基丁-2-烯基)氨基尿(玉米素)、TDZ、赤霉酸(GA)、IAA、NAA、dicamba、2，3，5-T和2，4-D。优选地，培养基中生长调节剂的浓度介于大约0.01mg/L至大约25mg/L，更优选介于大约0.01mg/L至大约10mg/L，更优选介于大约0.01mg/L至大约5mg/L，更优选介于大约0.05mg/L至大约8mg/L。优选通过微粒轰击、电泳或电穿孔将核酸引入细胞。优选地，该核酸包含与双子叶植物异源的核酸。优选地，该核酸为包含核酸的载体，该核酸包含与该双子叶植物异源的基因。另一优选实施方案中，该方法的步骤(c)包含：选择包含转化细胞的多芽培养物；该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化芽；然后至少一个转化芽然后生长为成熟的转化植物。优选实施方案中，将该至少一个转化芽在促进根形成的培养基中生长以后，该至少一个转化芽生长为成熟的转化植物。
另一优选实施方案中，该方法的步骤(c)包含：选择包含转化细胞的多芽培养物；该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化芽；克隆该至少一个转化芽；以及使克隆的芽成熟为转化植物。优选地，将该克隆芽在促进根形成的培养基中生长以后，该克隆芽生长为成熟的转化植物。
本发明另外提供：
通过上述任一方法产生的转化的质体基因组。
通过上述任一方法产生的包含转化的质体基因组的质体。
通过上述任一方法产生的转化的植物细胞。优选地，该植物细胞与转化的质体基因组同质。
通过上述任一方法产生的多芽培养物。
通过上述任一方法产生转化的植物。优选地，该植物与转化的质体基因组同质。
本发明另外提供：
上述转化植物产生的种子(其中该种子包含转化到多芽培养物的核酸)以及由种子长成的植物。
下述说明书详细说明了本发明上述及其它方面。
现在，下文将参考所附说明书，更充分地描述本发明，其中描述了本发明的优选实施方案。然而，本发明可能包含于不同形式，并不应理解为限于此处所述实施方案。更确切而言，提供这些实施方案，以使本公开全面而完整，并将本发明范围完全传达给本领域技术人员。此处发明说明书中所用术语只用于描述特定实施方案目的，并非意在限制本发明。用于发明说明书和所附权利要求时，除非上下文另外清楚指明，单数形式″一个″(″a″、″an″)以及″这个″(″the″)也用于包括复数形式。
除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语，其含义与本发明所属领域的一个普通技术人员通常所理解的相同。所有出版物、专利申请、专利及此处提及的其它参考文献，均全文引入以供参考。
除非另外指明，可能使用标准方法产生本发明克隆的基因、表达盒、载体(例如质粒)、蛋白质和蛋白质片段、以及转化的细胞和植物。除非另外指明，可能使用标准方法产生本发明克隆的基因、表达盒、载体(例如质粒)、蛋白质和蛋白质片段。这些技术为本领域技术人员所知。例如参见J.Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual Second Edition(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989)，以及F.M.Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology(GreenPublishing  Associates，Inc.and  Wiley-lnterscience，NewYork，1991)；J.Draper等人，eds.，Plant GeneticTransformation And Gene Expression：A Laboratory Manual，(Blackwell Scientific Publications，1988)；以及S.B.Gelvin& R.A.Schilperoort，eds.，Introduction，Expression，AndAnalysis Of Gene Production In Plants。本发明的方法用于产生转化的植物。首先在培养基中培养植物组织，从该组织产生多芽培养物，从而产生本发明的转化植物。然后将核酸引入多芽培养物的细胞中，从而产生包含该核酸的转化细胞。最后从转化细胞再生转化植物。
本发明优选实施方案中，被转化的植物细胞通常难以转化。特别优选实施方案中，被转化的植物细胞是双子叶植物细胞，最优选如此处定义难以转化的双子叶植物细胞。此处所用″植物细胞″或″植物″包括整个植物、植物细胞、或植物组织中的植物亚细胞细胞器(即质体)，或者培养中的植物组织、植物细胞、植物细胞悬液、植物亚细胞细胞器和原生质体。植物组织包括分化和未分化的植物组织，包括而不限于根、芽、叶、花粉、种子、瘤组织、配子体、孢子体、小孢子以及各种形式的培养细胞，例如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可能位于植物、或器官、组织或细胞培养物。
双子叶植物一般是具有双子叶胚、叶子有网状叶脉、茎中维管束环形围绕中央木髓的开花植物。如上所述，本发明可能转化的双子叶植物优选那些难以转化的双子叶植物。难以转化的植物，通常其细胞不能利用当前已知的转化方法(即微粒轰击或生物弹转化、土壤杆菌介导转化、电穿孔、电泳等)转化，或者利用这些方法的转化效率低(即低于1.0％、或低于0.5％、或甚至低于0.1％)。其细胞、组织、原生质体或愈伤组织可能通过已知方法转化，但是转化的细胞、组织、原生质体或愈伤组织不能再生为成熟的转基因植物，这些植物也是难以转化的植物。
本发明优选实施方案中，该双子叶植物是葫芦科的一员。本发明另一优选实施方案中，该双子叶植物是藜科的一员。更优选实施方案中，该双子叶植物选自甜菜(即糖用甜菜、饲料甜菜、食用甜菜和唐莴苣)、向日葵、大豆、棉花、花生、甜瓜、西瓜、南瓜、烟草、番茄、芸苔属和胡椒。最优选实施方案中，该双子叶植物是糖用甜菜或南瓜。
本发明通过首先从植物组织产生多芽培养物，而转化植物。此处所用术语″多芽培养物″可能也互指″外植体″。本发明可能利用的组织包括而不限于分生组织、根尖组织、芽尖组织(包括叶原基、顶区、腋区、下胚轴和有子叶的叶子)、幼苗芽尖(可能包括分生组织、叶片、叶柄或叶片-叶柄过渡区组织)以及愈伤组织。优选实施方案中，从芽尖、腋芽或花分生组织切离的分生组织，产生多芽培养物的组织。
本发明实施方案中，首先在种子发芽培养基中，优选无菌培养条件下萌芽种子，可能获得多芽培养物。种子发芽技术为本领域技术人员所知。本发明优选实施方案中，种子发芽培养基(GM)包含Murashige和Skoog(MS)盐(商品供应自Sigma Chemicals，St.Louis，Mo)。GM可能另外包括碳水化合物源，例如优选蔗糖。碳水化合物存在的量可能为约20-40g/L(约2-4％w/v)，优选约30g/L(约3％w/v)。GM任选并优选包括维生素B5、肌醇(100mg)、泛酸和植物组织培养胶凝剂，例如PHYTAGELTM(也得自SigmaChemical)。具有细胞***素样功能的植物生长调节剂(如下所述)，也可能(并优选)加入种子发芽培养基中。具有细胞***素样功能的合适植物生长调节剂，包括而不限于6-苄基-氨基嘌呤(6-BAP或BA)、6-糠基氨基嘌呤(激动素)、6-二甲丙烯基氨基-嘌呤(2ip)、反-6-(4-羟基-3-甲基丁-2-烯基)氨基尿(玉米素)等。加入GM中的植物生长调节剂浓度可能低到约0.5mg/L、或约0.1mg/L、或约0.05mg/L、乃至更低；另外，加入的植物生长调节剂浓度可能高达约1.0mg/L、或约2.0mg/L、或约5mg/L、乃至更高。加入酪蛋白水解产物、脯氨酸和/或谷氨酰胺也可能有益。某些双子叶作物，例如糖用甜菜，GM中加入植物生长素抑制剂，例如2，3，5-三碘苯甲酸(TIBA)，可能有益。
种子在GM中约7-14天发芽(即变成幼苗)后，切下幼苗的芽尖，培养(即铺板)于此处所述芽增殖培养基(SMM)。优选地，芽尖包含顶生和腋生分生组织区、叶原基、下胚轴的3-4mm以及子叶，其可能修剪，以减少进一步延长。用于本发明产生多芽培养物的其它植物组织当然也可能铺板于SMM。本发明优选实施方案中，SMM包含MS盐、碳水化合物源(优选蔗糖)、维生素B5以及胶凝剂，例如PHYTAGELTM。此外，SMM包含至少一种细胞***素样生长调节剂，例如BA、激动素、2ip、玉米素等。BA是在包含蔗糖的培养基中，从糖用甜菜或其它双子叶品种的顶生或腋生分生组织诱导芽分生组织培养物的优选生长调节剂。存在于SMM中的细胞***素样生长调节剂浓度可能低到约2.0mg/L、或约1.0mg/L、或约0.05mg/L、或约0.01mg/L、乃至更低；另外，存在于SMM中的细胞***素样生长调节剂浓度可能高达约5mg/L、或约8mg/L、或10mg/L、或约25或约100mg/L、乃至更高；一个实施方案中，存在于SMM中的细胞***素样生长调节剂介于大约0.05mg/L至大约25mg/L，更优选从0.1mg/L至大约10mg/L，最优选从大约0.5至大约8mg/L。SMM中可能加入另外的生长调节剂，以诱导芽分生组织培养物。这种生长调节剂包括赤霉酸(GA)以及具有植物生长素样功能的生长调节剂，例如吲哚-3-乙酸(IAA)、α-萘乙酸(NAA)、赛苯隆(thidiazuron)(TDZ)、3，6-二氯-氧-对甲氧基苯甲酸(DICAMBA)、2，4，5-三氯苯氧基乙酸(2，4，5-T)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及本领域技术人员已知的其它生长调节剂。
在SMM中生长的多芽培养物，于温度15-35℃、亮或暗的条件下培养，优选于约20℃、日长约12-16小时、低照度(大约10至约30μEinsteins)条件下培养。大约4-6周以后。多芽培养物类似紧密的花结，就可以转化了。
可能利用许多已知转化方法中任何一种转化多芽培养物。此处所用术语″转化″是指将核酸片段(一般为异源核酸序列或基因)稳定引入预先不包含该基因的植物、植物组织、植物细胞器(即质体或叶绿体)、或植物细胞。优选地，转化导致该核酸序列稳定整合到植物基因组中。此处所用术语″基因组″包含细胞核基因组、质体基因组以及线粒体基因组。本发明的发明人也发现，多芽培养物的细胞中存在大量质体。这种培养物因而提供了供质体转化的重要靶组织。因此，另一优选实施方案中，本发明方法用于转化植物细胞的质体基因组。优选地，利用本发明方法转化双子叶植物细胞的质体基因组。另一优选实施方案中，利用本发明方法转化通常难以转化的双子叶植物细胞的质体基因组。
质体转化的主要优点在于，质体一般能够表达没有很多修饰的细菌基因，并能够在单个启动子控制之下表达多个开放阅读框架。质体转化技术描述于美国专利NO.5,451,513；5,545,817和5,545,818；PCT申请NO.WO95/16783及McBride等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305(1994)。叶绿体转化的基本技术涉及利用生物弹或其它原生质体转化方法(例如氯化钙或PEG介导的转化方法)，将侧翼接有选择标志连同目的基因的克隆的质体DNA区域引入合适的靶组织。命名为打靶序列的1-1.5kb侧翼区，促进与质体基因组的同源重组，从而产生该质体组(plastome)的特定区域的置换或者修饰。最初，带来壮观霉素和/或链霉素抗性的叶绿体16S rRNA和rps12基因的点突变，用作转化的选择标志。参见Z.Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530(1990)以及J.M.Staub等人，Plant Cell 4，39-45(1992)。这些标志之间存在克隆位点，能形成供引入外源基因的质体打靶载体。参见J.M.Staub等人，EMBO J.12，601-606(1993)。将隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因置换为显性选择标志，编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺嘌呤转移酶的细菌aadA基因，获得转化频率的大幅度提高。参见Z.Svabet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，913-917(1993)。这些标志先前已经成功用于高频率转化绿藻莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体基因组。M.Goldschmidt-Clermont，Nucl.Acids Res.19，4083-4089(1991)。用于质体转化的其它选择标志为本领域已知。质体表达通过同源重组，将基因***每个植物细胞的数千个拷贝的环状质体基因组，利用优于核表达基因的庞大拷贝数，使得表达水平能够轻易超过可溶性植物蛋白质总数的10％。本发明优选实施方案中，目的核苷酸序列***质体打靶载体，转化目的植物宿主的质体基因组中。优选获得包含目的核苷酸序列质体基因组的同质植物，并优选该核苷酸序列能够高表达。
此处所用术语″异源″是指具有相对于其当前宿主不同的天然来源(即来自不同物种，或者相同物种而不同的染色体定位、方向或拷贝数)核酸序列(例如基因)或蛋白质。″异源″也用于表明，蛋白质中存在的一个或多个结构域，相对于存在的其它结构域而言，其天然来源不同。此处所用术语″核酸″是指以共价键相连的至少两个核苷酸。本发明的核酸一般将包含磷酸二酯键，尽管有些情况下，包括可能具有其它主链的核酸类似物。此外，可能使用天然存在的核酸和类似物以及非天然存在的核酸和类似物的混合物。核酸可能是单链或双链，或者包含双链或单链序列两种成分。核酸可能是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸包含脱氧核糖和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。
用于给定植物品种或特定类型植物组织的转化方法取决于熟练技术人员根据已知方法确定的最适当的方法。如果开发出供外源基因稳定***植物细胞和操作改变的细胞的新方法，熟练技术人员将能从已知的方法中选择，以获得所要求的结果。已知的用于实践本发明的转化技术包括而不限于微粒轰击(Sanford等人的美国专利NO.4,945,050，McCabe等人，Bio/Technology 6，923-926)；直接DNA摄取(J.Paszkowski等人，EMBO J.3，2717(1984))；电穿孔(M.Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985)；显微注射(A.Crossway等人，Mol.Gen.Genet.202，179(1986))；以及土壤杆菌介导的植物组织基因转移。本发明中，优选微粒轰击以及土壤杆菌介导的转化技术，最优选土壤杆菌介导的基因转移。
土壤杆菌介导的基因转移利用细菌根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根病土壤杆菌(A.rhizogenes)转移DNA进入植物染色体的天然能力。土壤杆菌是一种植物病原体，转移分别在根癌土壤杆菌和发根病土壤杆菌的Ti和RI质粒称为T-DNA的区域编码的一组基因进入植物细胞。利用发根病土壤杆菌的转化与根癌土壤杆菌相似。参见Ryals等人，美国专利NO.5,777,200，其公开内容在此全文引入以供参考。Ti质粒转移的典型结果是称作根癌的徒长(tumorous growth)，其中T-DNA稳定整合到宿主染色体中。Ri质粒整合到宿主染色体DNA中，产生称为″毛根病″的形态。通过T-DNA中基因缺失可以消除使宿主植物致病的能力，而不损失其DNA转移和整合作用。为转化目的而转移给植物细胞的核酸(即异源基因)连接至确定所整合的T-DNA末端的边界序列。本发明可能使用供植物转化的任何合适的土壤杆菌载体或载体***。本领域已知多种土壤杆菌株，可能用于本发明方法。典型的土壤杆菌载体***描述于G.An等人EMBO J.4，277(1985)；L.Herrera-Estrella等人，Nature 303，209(1983)；L.Herrera-Estrella等人，EMBO J.2，987(1983)；L.HerreraEstrella等人Plant Genetic Engineering(CambridgeUniversity Press，New York，63页(1985)；Hooykaas，PlantMol.Biol.13，327(1989)；Smith等人，Crop Science 35，301(1995)；Chilton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，3119(1993)；Mollony等人，Monograph Theor.Appl.Genet.NY19，148(1993)；Ishida等人，Nature Biotechnol.14，745(1996)；以及Komari等人，The Plant Journal 10，165(1996)，其公开内容在此全文引入以供参考。
除土壤杆菌T区之外，Ti(或Ri)质粒包含vir区。vir区对于有效转化是重要的，并似乎具有物种特异性。已经发展了双载体***(binary vector system)，其中操作的携带例如异源DNA的空(disarmed)T-DNA以及vir功能存在于分别的质粒上。换言之，缺少vir区的双载体能够携带目的异源核酸序列(即基因或多个基因)和侧翼T-DNA。然后由空的Ti质粒或第二个双质粒提供vir区。照此，在大肠杆菌中复制的小质粒上构建包含异源DNA的改变的T-DNA区。此质粒通过三亲杂交(tri-parental mating)或电穿孔接合转移到包含具有致病性基因序列的相容质粒的根癌土壤杆菌中。反式提供vir功能，转移T-DNA到植物基因组中。作为另一可选方案，通过两次重组事件，用新的T-DNA替换原来的Ti质粒T-DNA，异源核酸序列和T-DNA边界序列可以***Ti质粒的T-DNA位点。可以由Ti质粒或双质粒提供vir区。作为另外的可选方案，如Schilperoort等人，美国专利NO.4,940,838所述，异源核酸序列和侧翼T-DNA可以整合到细菌染色体中，然后可由Ti质粒或双质粒提供vir区。此处所述双载体可能用于实践本发明，并为优选。
另外，本发明其它实施方案中，土壤杆菌方法使用超级双(suyper-binary)土壤杆菌载体或″超毒力″(supervirulent)土壤杆菌载体。例如参见美国专利NO.5,591,615和EP0 604 662，此处引入以供参考。已经构建了这种超级双载体，其包含来源于Ti质粒pTiBo542(Jin等人，J.Bacteriol.169，4417(1987))超毒力区的DNA区，该Ti质粒包含于具有极高转化效率的超毒力根癌土壤杆菌A281(Hood等人，Biotechnol.2，702(1984)；Hood等人，J.Bacteriol.168，1283(1986)；Komari等人，J.Bacteriol.166，88(1986)；Jin等人，J.Bacteriol.169，4417(1987)；Komari，Plant Science 60，223(1987)；ATCC登录号37394。
本领域技术人员已知的代表性超级双载体包括pTOK162(参见日本专利申请(Kokai)NO.4-222527、欧洲专利申请EP504,869和EP604,662以及美国专利NO.5,591,616，在此引入以供参考)和pTOK233(参见Komari，Plant Cell Reports 9，303(1990)以及Ishida等人，Nature Biotechnology 14，745(1996)；在此引入以供参考)。可能利用以上文献所述方法构建其它的超级双载体。超级双载体pTOK162在大肠杆菌(E.coli)和根癌土壤杆菌中均能复制。另外，载体包含pTiBo542毒力区的virB、virC和virG基因。质粒也包含抗生素抗性基因、选择标志基因以及如有需要，要转化入植物的目的核酸。可以构建具有pTOK162上述特性的本发明超级双载体。本发明所用超级双载体及其它载体的T区可能构建为具有供***例如要转移给植物的异源基因的限制性位点。另外，转化的异源核酸可以利用体内同源重组而***载体的T-DNA区。参见Herrera-Esterella等人，EMBO J.2，987(1983)；Horch等人，Science 223，496(1984)。这种同源重组有赖于超级双载体具有与pBR322或其它类似质粒同源的区域。因而，两个质粒放在一起时，目的基因通过同源区域基因重组***超级双载体。
优选地，通过重组核酸技术改变用于本发明方法的土壤杆菌载体和载体***，以包含在转化细胞中表达的异源核酸(例如目的基因或多个目的基因)。″表达″是指异源结构性核酸的转录和翻译，产生编码蛋白质。例如就反义构建体而言，表达也可能只涉及转录。表达的异源核酸优选***T区，并侧翼接有土壤杆菌载体的T-DNA边界序列。
除编码序列以外，本发明的载体也可能任意包含为异源核酸转录和翻译所用或所必需的调节序列。这种调节序列的实例包括而不限于转录起始区(包括启动子)、增强子、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5’和3’非翻译区(即5’前导序列)、终止子序列及本领域技术人员已知的其它调节元件。本领域技术人员熟知可能用来产生本发明所用改变的载体的一般分子生物学技术。
转化后要表达的核酸优选置于合适启动子序列控制之下。术语″启动子″是指位于结构基因或编码序列的5’端，指导转录起始的核苷酸序列。此处所用术语″有效连接″是指通过将启动子与DNA编码区相连，从而由启动子控制和调节DNA编码区转录。启动子与编码序列有效相连的方法为本领域熟知。
对于植物中表达，必须针对宿主细胞选择合适的启动子，本领域技术人员善于选择启动子。用于实践本发明的启动子包括而不限于组成型、诱导型、时间调节型、发育调节型、化学调节型、组织优选型以及组织特异性启动子。
已知或发现许多启动子促进植物细胞中RNA的转录，可用于本发明的DNA构建体。合适启动子的实例包括胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)启动子、来自核酮糖二磷酸羧化酶启动子小亚基的光诱导型启动子、CaMV 35S和19S启动子、玄参(Figwort)花叶病毒的全长转录物启动子、组蛋白启动子、微管蛋白启动子或甘露碱合酶启动子(MAS)。启动子也可能是引起特定组织中的优先表达的启动子，例如叶、茎、根、或分生组织，或者启动子可能是由例如光、热应激、水应激、或者施用或植物产生的化学物质诱导的。典型的绿色组织特异性启动子包括玉蜀黍磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、小亚基核酮糖二羧化酶启动子(ssRUBISCO)以及叶绿素a/b结合蛋白启动子。
其它用于本发明的启动子包括而不限于几种肌动蛋白基因之一(例如稻肌动蛋白)，其已知在大多数细胞类型中表达。用于实践本发明的另一组成型启动子，起源于已知在许多细胞类型中蓄积的另一基因产物--泛素。已经从若干物种中克隆了泛素启动子，用于转基因植物(例如，向日葵(Binet等人，Plant Science 79：87-94(1991))；以及玉蜀黍(Christensen等人，Plant Molec.Biol.12，619-632(1989))。其它有用的启动子有玉蜀黍U2和U5 snRNA启动子(Brown等人，Nucleic Acids Res.17，8991(1989))以及醇脱氢酶启动子(Dennis等人，Nucleic Acids Res.12，3983(1984))。用于本发明的植物的组织特异性或组织优先性启动子是可指导根、髓、叶或花粉中的表达的启动子。这种启动子公开于美国专利NO.5,625,136(在此全文引入以供参考)。也可用赋予种子特异性表达的启动子，例如Schernthaner等人，EMBO J.7：1249(1988)所公开的启动子；花药特异性启动子ant32和ant43D；花药(毡绒层)特异性启动子B6(Huffman等人，J.Cell.Biochem.17B，摘要#D209(1993))；以及雌蕊特异性启动子，例如改变的S13启动子(Dzelkalns等人，Plant Cell5，855，(1993))。
可能获得其它的植物启动子，优选来自植物或植物病毒，只要所选启动子能够引起植物中足够的表达而产生有效量的目的蛋白质，就可能使用。本发明优选实施方案中，启动子是稻肌动蛋白-1启动子。
任何想要在植物中表达的异源基因或核酸适于本发明转化，并可用于本发明方法。
在本发明的植物中转化和表达的异源基因，包括而不限于编码抗病性的基因、编码抗虫性的基因、赋予营养价值的基因、赋予抗真菌、抗细菌或抗病毒活性的基因、赋予除草剂抗性的基因、赋予改善植物或营养特性的基因等。另外，可以在利用本发明方法转化的植物细胞中表达治疗性(例如供兽医或医药用途)或者免疫原性(例如供接种使用)的肽和蛋白质。
优选表达结构基因。此处所用″结构基因″是包含编码蛋白质、多肽或其一部分的DNA片段、不包括驱动转录起始的5’序列的基因部分。结构基因可能是在该细胞中通常存在的基因，或者在引入该基因的细胞位置通常不存在的基因(即异源基因)。异源基因可能完全或部分得自本领域已知的任何来源，包括细菌基因组或附加体、真核生物、细胞核、或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成的DNA。结构基因可能在编码区或非翻译区包含一种或多种改变，可以影响表达产物的生物活性或化学结构、表达速率或者表达控制方式。上述改变包括而不限于突变、***、缺失和置换一个或多个核苷酸。结构基因可能构成连续的编码序列，或者可能包括一个或多个内含子，以合适的拼接接点为界。结构基因可能是来自天然存在、或合成、或两者的多个来源的片段的复合物。为提高宿主细胞中表达而合成基因时，希望设计该基因，以使其密码子使用频率接近宿主细胞优选密码子使用频率。
同样，本发明方法可能用来转移供控制植物基因表达的任何核酸。例如，转移的核酸可以编码反义寡核苷酸。另外，可以用一种或多种基因转化本发明的植物，以复制供化学合成或其它工业过程的酶学途径。用于本发明的异源核酸可能是天然存在，并可能得自原核生物或真核生物(例如细菌、真菌、酵母、病毒、植物、昆虫和哺乳动物)，或者核酸可能是完全或部分合成。
本发明优选实施方案中，转移或转化到双子叶多芽培养物的异源核酸或基因编码具有原卟啉原氧化酶(PPO)活性的多肽。参见例如美国专利NO.5,767,373；5,939,602；6,023,012；和6,084,155，其公开内容在此全文引入以供参考。另一优选实施方案中，转移或转化到双子叶多芽培养物的核酸或基因编码具有磷酸甘露糖异构酶(PMI)活性的多肽。参见例如美国专利NO.5,767,378和5,994,629，在此全文引入以供参考)。另一优选实施方案中，转移或转化到双子叶多芽培养物的核酸或基因编码具有木糖异构酶(xyIA)活性的多肽。再一优选实施方案中，转移或转化到双子叶多芽培养物的核酸或基因编码具有GUS活性的多肽。
异源核酸通过上述任何方法有效转移到受体细胞、质体和/或植物以后，一般通过一种或多种筛选方法鉴定具有异源基因成功表达或提高的表达的细胞和植物，以进一步培养并再生植物。
″筛选″一般是指鉴定具有已经转化植物的异源基因表达的细胞和/或植物。通常进行筛选，来选择转化成功的种子(即转基因种子)，以进一步载培及植物增殖(即生产转基因植物)。为了提高鉴定转化子的能力，选择或筛选标志基因通常与目的异源基因一起转化植物。在这种情况下，人们于是常常通过将细胞、种子、植物或幼苗暴露于一种或多种选择试剂，从而分析可能的转化细胞。例如，可能在选择条件下筛选转基因细胞、种子或植物，例如种子或幼苗在包含选择性试剂(例如甘露糖或抗生素(例如潮霉素、卡那霉素或巴龙菌素)的培养基中生长，成功转化的植物已经转化了编码对上述选择性试剂抗性的基因。另外，使用其它方法(例如将转化了除草剂抗性基因的转化的植物暴露于除草剂，例如上述PPO抑制剂或BASTA)筛选细胞、种子、植物或植物组织的目的标志基因。另外使用阳性选择方法，例如编码具有磷酸甘露糖异构酶(PMI)活性的核酸。本发明优选实施方案中，转化的多个培养物在包含抗生素和/或甘露糖的植物生长培养基中生长，从而选择转化细胞。
为了提高鉴定转化体的能力，人们可能希望利用选择或筛选标志基因，与表达的目的核酸序列同时或以外。″标志基因″是给予表达该标志基因的细胞不同表型的基因，从而使该转化细胞区别于没有该标志的细胞。这种基因可能编码选择或筛选标志，这取决于该标志是否赋予可供化学方法，即利用选择性试剂(例如除草剂、抗生素等)进行‘选择’的特性，或其只不过是可以通过观察或检验，即‘筛选’而鉴定的特性(例如R-座位特性)。合适标志基因的许多实例为本领域所知，可以用于实践本发明。选择性标志基因可能是转化细胞表达的唯一异源基因，或者可能于转化细胞中转化并表达的另一异源基因之外表达。选择性标志基因用于鉴定和选择转化细胞或组织。选择性标志基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)，以及赋予除草剂化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码改变的对除草剂不敏感的靶蛋白质、或者编码在除草剂作用之前使其在植物中降解或解毒的酶，参见DeBlock等人，EMBO J.6，2513(1987)；DeBlock等人，PlantPhysiol.91，691(1989)；Fromm等人，BioTechnology 8，833(1990)；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2，603(1990)。例如，利用编码突变靶酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)、已经获得甘膦(glyphosphate)或磺酰脲类除草剂抗性。利用编码解毒相应除草剂的膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰转移酶、腈水解酶或2，4-二氯苯氧基乙酸单加氧酶的细菌基因，已经获得草胺磷、溴苯腈(bromoxynil)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)抗性。选择性标志基因包括而不限于下列酶的编码基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley等人，CRC Critical Reviews in Plant Science 4，1(1986))；氨氰水合酶(Maier-Greiner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4250(1991))；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(Pert等人，BioTechnology 11，715(1993))；bar基因(Toki等人，PlantPhysiol.100，1503(1992)；Meagher等人，Crop Sci.36，1367(1996))；色氨酸脱羧酶(Goddijn等人，Phant Mol.Biol 22，907(1993))；新霉素磷酸转移酶(NEO；Southern等人，J.Mol.Appl.Gen.1，327(1982))；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG；Shimizu等人，Mol.Cell.Biol.6，1074(1986))；二氢叶酸还原酶(DHFR)；膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock等人，EMBO J.6，2513(1987))；2，2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron等人，J.Cell.Biochem.13D，330(1989))；乙酰羟酸合酶(Anderson等人，美国专利NO.4,761,373；Haughn等人，Mol.Gen.Genet.221，266(1988))；5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA；Comai等人，Nature 317，741(1985))；卤代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Stalker等人，WO87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker等人，Plant Physiol.92，1220(1990))；二氢蝶酸合酶(Sull；Guerineau等人，Plant Mol.Biol.15，127(1990))；以及32kDa光合体系II多肽(psbA；Hirschberg等人，Science 222，1346(1983))。
还包括编码氯霉素(Herrera-Estrella等人，EMBO J.2，987(1983))；氨甲蝶呤(Herrera-Estrella等人，Nature 303，209(1983)；Meijer等人，Plant Mol.Biol.16，807(1991))；潮霉素(Waldron等人，Plant Mol.Biol.5，103(1985)；Zhijian等人，Plant Science 108，219(1995)；Meijer等人，Plant Mol.Bio.16，807(1991))；链霉素(Jones等人，Mol.Gen.Genet.210，86(1987))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人，Transgenic Res.5，131(1996))；博莱霉素(Hille等人，Plant Mol.Biol.7，171(1986))；磺胺(Guerineau等人，Plant Mot.Bio.15，127(1990)；溴苯腈(bromoxynil)(Stalker等人，Science 242，419(1988))；2，4-D(Streber等人，BioiTechnology7，811(1989))；膦丝菌素(DeBlock等人，EMBO J.6，2513(1987))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research 5，131(1996))抗性的基因。
以上所列选择性标志基因并非意在限制。任何选择性标志基因可以用于本发明。
为了另外证实转化植物的种子或者由该种子再生的植物中存在异源核酸或″转基因″，可以进行多种分析。这些分析包括，例如分子生物学分析，诸如Southern和Northern印迹以及PCR；生物化学分析，例如利用免疫学方法(ELISA和Western印迹)或酶的功能，检测蛋白质产物的存在；以及利用植物成分分析，例如叶或根的分析。虽然Southern印迹和PCR可能用来检测所述基因，但并不提供该基因是否正在表达的信息。通过特异性鉴定所引入基因的蛋白质产物，或者评价其表达所致表型变化，可能评价异源基因的表达。分析特定蛋白质的产生和鉴定，可能利用蛋白质的物理-化学、结构、功能或其它性质。独特的物理-化学或结构特性使能利用电泳方法(例如天然或变性凝胶电泳或等电聚焦)或者利用层析技术(例如离子交换或凝胶排阻层析)分离并鉴定蛋白质。各个蛋白质的独特结构使得有可能利用特异性抗体(例如ELISA分析)检测其存在。可能使用特异性更高的方法组合，例如Western印迹，其中使用抗体定位已通过电泳技术分离的各个基因产物。可能使用另外的技术，例如纯化后氨基酸测序，以完全证实目的产物的身份。尽管这些技术使用最为普遍，其它方法为本领域已知，并且可能另外使用。
本发明的一个特殊优势在于，利用多芽培养物或外植体而非单芽培养物进行转化，提高了难以转化的植物的转化效率。效率是指目的异源核酸成功转化的植物或植物细胞的百分比，与异源核酸转化不成功的植物或植物细胞的百分比相比较。本发明优选实施方案中，本发明方法的转化效率高于约1％，更优选高于4％，更加优选高于10％，最优选高于30％。转化效率定义为产生转基因植物的外植体数目与靶外植体数目的比值。
包含本发明的异源核酸(例如包含本发明的异源核酸或本发明的转化细胞)的转基因植物，以及该转基因植物产生的种子和后代，也是本发明的一个方面。将转化细胞培养为有用的栽培品种的方法为本领域技术人员所知。众所周知供植物组织离体培养以及许多情况下再生为整个植株的技术。本发明另一方面为包含上述核酸的转基因植物组织、植物或种子。优选实施方案中，利用本发明产生的转化外植体不是嵌合的，或者只有小部分转化外植体是嵌合的。这优选通过延长高细胞***素处理时间，或提高甘露糖选择的严谨性，或这两种方法而实现。(参见以下实施例5)。因此，本发明的转化细胞通过选择或筛选鉴定，并在此处提供的支持再生的合适培养基中培养，然后可能使成长为植物。植物优选在生长室或温室中成熟。植物取决于初始组织，于转化子鉴定约6周-10个月以后再生。再生期间，细胞可能在组织培养容器的固体培养基中生长。该容器的说明性实施方案为培养皿和Plant Cons。再生植物到达芽和根发育阶段以后，可能转移到温室，进一步生长和检验。如上提供的再生植物的种子和后代植物是本发明的一个方面。因此，术语″种子″是指包含转化植物的种子，以及转化植物的后代产生的种子。本发明的植物不仅包括转化和再生的植物，而且包括本发明产生的转化和再生的植物的后代。
一个实施方案中，首先转化的多芽培养物在选择性培养基中生长，转化培养物成熟时去除所有未转化组织，从而制备本发明再生的转基因植物。选择完成以后，转化培养物产生的芽转入优选包含芽伸长培养基的容器中；这种培养基为本领域已知，并如下所述。如果愿意，在基于MS的克隆培养基中可能克隆转化的芽(例如另外包含甘露糖的上述生长培养基)。另外，将芽或克隆转入如下所述或可能由熟练技术人员确定的合适的生根培养基中，单个芽或克隆则可能成功生根。
利用上述标准方法，可能筛选利用本发明方法产生的转化成功的植物。为了产生改进的植物和种子系，可能不断筛选和选择本发明再生植物的种子和子代植物的转基因和整合的核酸序列的持续存在，这是本发明的另一方面。理想的转基因核酸序列可能因而转入(即基因渗入或近亲交配)其它遗传品系，例如某些原种或具有商业价值的品系或品种。将理想的核酸序列基因渗入植物遗传品系的方法，可能通过本领域已知的多种技术进行，包括传统的繁殖、原生质体融合、核移植以及染色体转移。繁殖方法和技术为本领域已知，并阐述于例如J.R.Welsh，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding(John Wiley and Sons，New York，(1981))；Crop Breeding(D.R.Wood，ed.，American Society of Agronomy，Madison，Wisconsin，(1983))；O.Mayo，The Theory of Plant Breeding，Second Edition(Clarendon Press，Oxford，England(1987))；以及Wricke和Weber，Quantitative Genetics and SelectionPlant Breeding(Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986))。利用这些以及本领域其它技术，本发明获得的转基因植物和近交品系可能用来生产具有商业价值的杂交植物和作物(例如杂交南瓜和糖用甜菜)，其杂交植物也是本发明的一个方面。
提供以下实施例以解释本发明，而不应理解为限制本发明。
实施例1：转化南瓜
种子消毒和发芽
利用镊子从干种子中仔细移开南瓜(西葫芦、Cucurbita pepo.L.)的成熟胚。然后将其置于50ml一次性离心管，15％Clorox溶液(V/V)表面消毒15min。消毒期间，将管子置于旋转器中，200rpm(每分钟200转)摇动。用无菌水漂洗3次后，将胚再浸于无菌水中20min。不时用手摇动管子，以去除围绕胚的薄膜。消毒后，成熟胚在补加4.0mg/L-BA的基于MS(Murashige和Skoog，1962)的培养基中发芽，在培养间于23-26℃暗处生长。
制备外植体
子叶叶柄  发芽3天后，除去发芽幼苗的下胚轴和2/3的子叶。包含子叶节、芽尖以及剩余子叶的子叶叶柄外植体然后转入芽增殖(SM)培养基中，25℃光下生长。SM培养基包含MS盐、维生素B5、2-4mg/L BA-，并用约4g/L(或约0.4％w/v)PhytagelTM凝固。
SM培养基中培养3-10天以后，仔细除去伸长的下胚轴和子叶的过多组织，从芽尖区域分离用来转化的子叶叶柄。子叶叶柄用于转化之前，还可以在SM培养基中另外再培养3-14天。
芽尖  从发芽的幼苗或小植株上切离包含芽原体、叶原体、新叶和部分下胚轴的顶生或腋生分生组织。其于SM培养基中培养，25℃光下生长，每两周继代培养一次。在首次继代培养后，芽尖外植体就可以转化了。继代培养物几次后，其还可以用作供转化的外植体。
土壤杆菌菌株和质粒
根癌土壤杆菌菌株，例如EHA101、LBA4404、GV3101和K6(ATCC# 55964)，用于基因转移，EHA101(Hood等人，1986.JBacteriology 168：129-1301)用作优选菌株。用于转化的质粒pNOV2105包含由修饰的Smas基因启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶(PMI)编码序列(Ni等人，(1995)Plant J.7：661-676)。Smas(甘露碱合酶)启动子来源于根癌土壤杆菌，通过ocs增强子区增殖而增强。基因终止于nos 3’区。它也包含编码β-葡糖醛酸酶(GUS，Jefferson等人(1986)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 83：8447-8451)的大肠杆菌uidA基因。GUS编码序列内已经放置gus内含子(Vancanneyt等人(1990)Mol.Gen.Genet 220(2)：245-250)。基因由Smas启动子驱动，并终止于nos 3’区。用于转化的土壤杆菌于包含合适抗生素(50mg/L卡那霉素、100mg/L壮观霉素以及100mg/L羧苄青霉素)的Bacto琼脂凝固的YP培养基中(5g/L酵母抽提物、10g/L蛋白胨以及5g/L NaCl，pH6.8)培养。细菌保持28℃。
接种和共培养
采用三种方法将土壤杆菌接种到外植体。
方法1  利用接种环从BactoTM琼脂凝固的细菌平板收集2-3日龄的根癌土壤杆菌集落。就在土壤杆菌接种外植体之前或期间，利用外科刀片或针，反复造成子叶叶柄的分生组织区或者顶生及腋生芽尖分生组织培养物的表面创伤。创伤之前在靶区域表面上施加土壤杆菌，或者在创伤处理前将土壤杆菌″粘贴″在刀片或针上，进行细菌接种。创伤之后，液态的土壤杆菌诱导培养基(例如All培养基，其中包含SM培养基加上200-600mg/L乙酰丁香酮(acetosyringone)，取决于外植体的大小，约为1μl-6μl)立刻施加于创面，数量取决于外植体的大小，为1-6μL。利用无菌滤纸除去创伤组织表面上过量的土壤杆菌和All培养基。短时间风干后，感染的外植体转入共培养培养基(例如ACC培养基，其中包含All培养基以及约20g/L蔗糖和30g/L葡萄糖)，22℃黑暗中培育2-4天。
方法2  从YP平板收集2-3日龄根癌土壤杆菌聚集物，与25-50ul All培养基混合。接种前，细菌在室温下放置30min。在创伤前，将少量诱导的根癌土壤杆菌混合物施加给子叶柄的分生组织区、或者顶生和腋生芽尖的分生组织培养物，进行细菌感染。另外，利用涂有土壤杆菌聚集物的刀片或针创伤靶区域，进行细菌感染。短时间风干后，感染的外植体转入ACC共培养培养基。
方法3  在感染当天，将2-3日龄的细菌聚集物悬浮于All培养基中，或者细菌在YP液体培养基中生长过夜，然后在感染前重悬于All培养基中，制备用于感染的根癌土壤杆菌悬浮液。前一种情况下，悬浮液在使用前，于慢速振荡器上摇动或用手轻摇0.5-3小时。根癌土壤杆菌的终浓度调整为0.2-2.0×109cfu(集落形成单位)。为了感染，将外植体浸入根癌土壤杆菌悬浮液中，并用刀片或针创伤靶区域。感染后，用滤纸吸干外植体上过量的液体，外植体风干30-60min，直到表面无可见液体。感染的外植体然后转入ACC培养基共培养。
芽增殖和选择
在ACC培养基中共培养2-4天后，感染的外植体转入芽增殖/选择培养基(MSS)，25℃光下生长两周。每隔两周，进行后续的继代培养和选择。对于每个继代培养，选择甘露糖抗性的绿芽块，切成小块，转入新鲜的MSS培养基。MSS培养基由SM培养基和抗生素组成，有或没有甘露糖。后续选择过程中，MSS培养基中的甘露糖的浓度从0g/L逐渐提高到2g/L、3g/L和4g/L，而蔗糖的浓度从30g/L减少到25g/L、然后到20g/L。
植物再生
培养甘露糖中生长的芽块，在包含2-4g/L甘露糖和0.5-4mg/L6-苄基-氨基嘌呤(BA或6-BAP)的MSS培养基中形成新克隆。为了促进芽的伸长，芽块生长于有或没有0.5mg/L BA的MSS培养基中。芽在不含BA的MSS培养基或含有1mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)的MSS培养基中生根。生根的芽转入土壤，在温室中生长成熟。转基因植物自花传粉和/或与非转基因植物异花传粉，产生T1子代。采集T1转基因子代分析，用于产生T2转基因子代。
植物分析
GUS组织化学分析  按照Jefferson的方法(Plant Mol Bio.Rep.5，387-405(1987))，转基因植物和非转基因对照植物的组织或器官在GUS底物中37℃温育过夜。为有助于观察叶组织中的GUS表达，如果需要，利用70％乙醇从组织中提取叶绿素。对子代的根和未成熟胚进行GUS组织化学分析，筛选包含gus基因的转基因子代。利用卡方检验(Chi square test)进行子代中转基因的分离分析。
ELISA分析  收集转基因和非转基因植物的叶子样本，进行ELISA加/减分析，证实PMI酶的存在。
转基因的整合  分离转基因和非转基因对照植物的总DNA。利用Southern印迹分析，确认转基因在植物基因组中的整合。EHA101(pNOV2105)转化的结果概括于表1。
表1
实验        外植体数目      PMI+和GUS+         ％表达
                                          (GUS+外植体数目)
 1             200              2                 1
 2             50               1                 2
 3             200              3                 1.5
 5             150              4                 2.7
 6             200              21                10.5
 7             100              4                 4
利用本发明所述多芽转化方法转化南瓜的效率介于1％-10.5％。在转基因南瓜植物的叶、叶柄、根、茎、芽、花药、花冠、花萼、花丝、花蜜、花粉粒、柱头、花柱、胚珠、子房表皮以及未成熟胚中观察到强的GUS活性。Southern印迹分析证实pmi基因整合到转基因植物的基因组中。GUS组织化学分析确认，转基因(GUS)在子代中遗传。进行卡方分析检查子代中转基因(GUS)的分离。结果表明，GUS基因在自花传粉子代(T1)中按3∶1比例分离，在与非转基因植物异花传粉的子代中按1∶1比例分离。选择一个自花受粉T1植物的六个T2子代，供进一步分析。从六个T2植物收集了总共136个胚，分析GUS和PMI基因的存在。结果全部阳性，证实恢复纯合事件。
实施例2：转化西瓜
成熟的西瓜种子(西瓜，Citrullus lanatus(Thumb.)Mansf.)发芽，如实施例1所述制备多芽培养物。用于西瓜转化的转化步骤和培养基，包括土壤杆菌感染、共培养、选择再生植物，如实施例1所述进行。携带pNOV2105的根癌土壤杆菌EHA101的转化结果如表2所示。如实施例1所述，在大部分营养性以及繁殖性器官和组织中观察到强的GUS活性。在自花传粉的转基因西瓜植物子代中也观察到GUS活性的表达。
表2
实验        外植体数目       转基因    PMI+/GUS+    ％表达
 1              50            uidA        3            6
实施例3：转化甜瓜
利用镊子除去甜瓜(香瓜，Cucumis melo L)种子的种皮，种子用70％乙醇1min、然后1％盐酸化物10min消毒。种子用无菌水漂洗3-4次，播种在半量无激素的MS培养基中，每平板10粒种子。种子在22-24℃发芽，于3000-4000勒克斯(lux)16小时，黑暗中8小时。7天后，分离幼苗的子叶和叶柄，转入MS30培养基(MS盐、30g/L蔗糖)。转化前1天，在普通管子中将50μl贮存液转移到包含抗生素的5ml LB培养基中，开始根癌土壤杆菌培养。培养物28℃、150rpm培育至少17小时。
转化当天，将1.2-1.5ml土壤杆菌过夜培养物加到包含子叶的平板中(土壤杆菌终浓度：2×108cfu/ml)。在子叶柄的分生组织位点造成小切口(创伤)。土壤杆菌+外植体的平板转入真空干燥器中。通过真空泵施加真空1分钟。维持真空15分钟。15分钟后，缓慢释放真空。土壤杆菌悬浮液浸透平板。平板中加入MS30，用MS30液体洗涤外植体。从平板中吸出MS30，外植体在无菌滤纸上干燥。外植体置于BM4.5+0.5mg/L BAP(BM4.5B)，每平板20-30个外植体。平板于21-23℃、1500-2000lux培育16小时，然后黑暗中8小时，共5天。共培养5天后，外植体转入包含甘露糖、0.5mg/L BA、0.125mg/L嘧啶醇以及1.5mg/L AgNO3的选择培养基，每平板10个外植体。平板置于24℃、2000-2500lux下16小时，然后置于黑暗中8小时，每2-2.5周转入新鲜培养基中。0.5mm及更大的芽转入包含MS盐、0.1mg/L NAA、3mg/L AgNO3以及200mg/L氨噻肟头孢菌素和100mg/L万古霉素的BMM-c培养基。每2-3周将芽转入新鲜的BMM-c培养基中。
实施例4：转化向日葵
向日葵(向日葵，Helianthus annuus L.)种子如实施例1所述发芽。利用实施例1所述培养基，从原始芽尖或未成熟花序制备多芽培养物。未成熟花序取自温室生长的幼植物或者离体培养的芽尖。用携带pNOV2105的根癌土壤杆菌EHA 101转化多芽培养物。感染4周后，在多芽培养物中观察到强的GUS活性。按照实施例1所述选择和芽增殖步骤，再生转基因植物。结果概括于表3。
表3
实验       外植体数目     转基因    PMI+/GUS+    ％表达
 1             7           uidA        7          100
 2             10          uidA        10         100
实施例5：转化糖用甜菜
种子消毒和发芽
糖用甜菜(甜菜，Beta vulgaris L.)的种子利用浓硫酸破皮10分钟。彻底漂洗种子，去除剩余的硫酸以后，种子在水中浸泡过夜。次日利用20％ Clorox(商品供应)边摇边进行表面消毒15分钟。然后，种子用无菌水漂洗5次，风干6小时，然后在无菌培养条件下接种到种子发芽培养基(GM)中。一个实施例中，包含的GM含有Murashige和Skoog(MS)盐(Sigma Chemicals，St.Louis，Mo.)以及30g/L蔗糖。GM中也包含维生素B5(也得自Sigma Chemicals)、肌醇(100mg/L)、泛酸(1mg/L)和3.6g/L Phytagel，作为具有细胞***素样功能的植物生长调节剂。细胞***素水平一般处于0.5mg/L-5mg/L典型范围内，通常介于1.0-2.0mg/L之间。至于糖用甜菜的种子，还加入生长素抑制剂TIBA。
芽分生组织培养物的切离和起始
切下7-14日龄幼苗的芽尖，接种芽增殖培养基(SMM)中。在这种情况下，SMM包含Murashige和Skoog盐、30g/L蔗糖、维生素B5和8g/L Phytagel。此外，SMM包含至少一种细胞***素生长调节剂，例如BA、激动素、2-ip或玉米素，一般位于约1-10mg/L浓度范围内，通常位于2-6mg/L浓度范围内。还加入另外的生长调节剂，例如GA，以及生长素样功能的生长调节剂，例如IAA、NAA和2，4-D。
芽尖由顶生和腋生芽分生组织区、叶原基、下胚轴的3-4mm以及被切断以减少其进一步延长的子叶组成。接种后每7-10天，去除任何新伸长的叶子物质以后，将靶外植体在新鲜SMM中继代培养。多芽靶外植体一般在弱光强度(10-30，μEinsteins)、日长12-16小时、20℃下培养。4-6周后，多芽培养物类似紧密的花结，就可以转化了。
多芽培养物的接种和培育
利用根癌土壤杆菌介导的转化转化多芽培养物。带有质粒pAD1289和pNOV2105(包含PMI选择性标志基因和GUS scorable标志基因)的根癌土壤杆菌菌株EHA101，在由5g/L酵母抽提物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl和15g/L BactoagarTM组成的固体培养基中，28℃生长2-3天。质粒pNOV1508包含pmi基因，其由改变的SMas启动子驱动，终止于nos 3’区。它还包含双突变的鼠耳芥属PPO基因(参见美国专利6,084,155)，其由鼠耳芥属UBQ3(内含子)启动子(参见Norris等人，Plant Molecular Biology 21，895-906(1993))驱动，终止于35S 3’区。转化前一天，除去任何保持伸长的叶子物质，准备供接种的多芽培养物。
为了开始接种，利用无菌环将单个集落的根癌土壤杆菌在原始YP培养平板上收集一起。为了实际接种每个靶外植体，无菌刮刀浸入收集的根癌土壤杆菌集落，并用来在每个目标的顶生和腋生分生组织区作切口。接种步骤之后，某些实验中立即将大约4-6μl MSMG诱导培养基(MS盐、2g/L葡萄糖、MES和200μM乙酰丁香酮)施加于每个目标的创面上。为了引导基因转入产生芽分生组织的细胞中，努力刺穿尽可能多的分生组织区中心。一般依次处理10-20个靶培养物，然后使其在层流净化罩无菌条件下风干10分钟。风干处理之后，处理的靶外植体移到MSCC共培养培养基中(MS盐、维生素B5、2mg/LBA、30g/L蔗糖、200μM乙酰丁香酮)。处理的外植体然后在MSCC培养基中培育，22℃连续黑暗培养2-3天。
靶标培养和选择
接种和共培养后，在施加甘露糖选择压力至少两天以前，多芽外植体转入含有2mg/L BA和合适的抗生素的新鲜SMM培养基中。转化后逐渐提高甘露糖量(2g/L-20g/L)、并降低蔗糖量(26g/L-0g/L)，选择转化的组织。逐步增加甘露糖选择水平，从2g/L甘露糖+26g/L蔗糖到3g/L甘露糖+24g/L蔗糖，然后4g/L甘露糖+22g/L蔗糖，继之以5g/L甘露糖+20g/L蔗糖以及6g/L甘露糖+18g/L蔗糖。多芽培养物大小持续生长，每次继代培养仔细分离，以促进足够的选择压力。转化以后维持BA水平2mg/L一般16-20周，以继续于选择条件下扩增芽分生组织。这期间以后，BA水平降为0.25mg/L，4-6周后撤销，以促进芽伸长。不断从原始靶外植体垂死的非转化部分移开成活的转化组织区域，再仔细分离成活部分，以促进严谨性选择。选择和芽再生一般进行约10-30周的时间。幼芽出现时，将它们分开，并在最有效选择转化芽的选择条件下分离。
转化芽的伸长
一旦幼芽达到大约0.5-1.5cm，将其转入包含芽伸长培养基(降低细胞***素水平，从而增强发育芽的伸长)的GA7’s中，有或没有上述甘露糖选择。芽伸长培养基包含MS盐、维生素B5、30％蔗糖和PhytagelTM(7.5g/L)。伸长培养基中加入低水平细胞***素，一般介于0.1-1.0mg/L。糖用甜菜施用的最适细胞***素为0.5mg/L激动素。
转化植物的再生
在含有5-20g/L甘露糖的基于MS的克隆培养基中克隆转化芽。有时希望多个芽来自于一个原始的转基因芽，为此，在基本MS培养基中联合使用细胞***素和生长素，诱导克隆化。低水平的两种生长调节剂一般介于0.1mg/L-0.5mg/L。对于糖用甜菜，使用MS盐和30g/L蔗糖、0.2mg/L激动素、0.1mg/L NAA以及7g/LPhytagelTM。
将单个芽或克隆转入包含MS基本培养基(其中补加一种或两种生长素，例如0.5mg/L-5mg/L IBA或NAA)的生根培养基，顺利生根。在一个实施例中，生根培养基包含5mg/L IBA、0.5mg/L NAA以及大约5-20g/L甘露糖。发现5g/L PhytagelTM是支持根发育的合适胶凝剂。
转化结果
利用多芽培养物为外植体，获得糖用甜菜的高效转化。
利用包含pNOV2105的根癌土壤杆菌转化糖用甜菜多芽培养物，其结果如表4所示。利用组织化学分析，检测转化的糖用甜菜植物的GUS表达。利用PMI ELISA+/-分析，确定PMI基因的表达。
表4
    实验     外植体数目     GUS+   GUS+或PMI+   ％表达(GUS+或PMI+总数/外植体数目)
    1     20     7     10          50
    2     28     16     16          57
    3     31     14     18          58
    4     21     7     7          33
    5     44     7     17          39
    6     41     17     22          54
    7     31     15     15          48
    8     50     20     23          46
在一个实验中，利用包含pNOV1508(包含PMI选择性标志基因以及突变的鼠耳芥PPO基因的质粒)的根癌土壤杆菌转化糖用甜菜多芽培养物，34个外植体当中的18个产生PMI+植物。利用Northern分析进一步分析该PMI+转基因糖用甜菜植物，表明其中7个还表达突变的鼠耳芥PPO基因。该表达PPO的植物按农田施用水平喷洒PPO抑制剂除草剂，其中若干显示特别高的除草剂抗性。T1种子繁殖选择两个PPO转基因事件。通过PMI ELISA和PMI基因的Southern分析，证实这些是转基因事件。表明每一事件包含PMI基因的多拷贝整合。生根的T0植物转入土壤，于21℃、60％湿度、16小时日长/8小时黑夜的温室条件下生长5-6周。观察到植物正常发育表型以后，T0植物转入春化作用条件下(4℃、16小时白天/8小时黑夜)16周，然后适应14℃ 2周。适应水土后，转基因植物返回温室条件，观察到花的正常发育。转基因植物自花传粉，以及与非转基因植物异花传粉，繁殖种子。顺利产生T1种子，然后采集并在土壤中播种发芽。通过PMI ELISA分析，证实T1幼苗包含PMI基因。通过5个T1植物各个事件的Southern分析，证实PMI和PPO转基因共同整合。
排除嵌合体
采用另外的步骤减少产生嵌合(部分转基因)的转化植物的可能性。一个步骤将延长高浓度细胞***素(2mg/L)处理时间到8-16周，以持续刺激芽分生组织增殖培养物于选择压力下的应答。另一步骤将提高甘露糖选择的严谨性(例如，选择时将甘露糖从5g/L逐步提高到10g/L)。在利用包含pNOV2105的EHA101转化糖用甜菜多芽培养物的一个实验中，分析GUS表达的36个外植体当中的35个(97％)产生了完全转基因的芽(参见下表5)。
表5
靶标数目 45
开始选择/周数 5g/L甘露糖+20g/L蔗糖；2周
后续选择 6g/L甘露糖+18g/L蔗糖；2周7g/L甘露糖+16g/L蔗糖；2周8g/L甘露糖+14g/L蔗糖；2周10g/L甘露糖+10g/L蔗糖；4周
2mg/L BA处理 首先8周
0.25mg/L BA处理 随后4周
组织化学分析的靶标数目(GUS分析) 36
完全转基因芽(即非嵌合的)的靶标数目和靶标百分比 35(97％)
实施例6
利用芽尖、叶或其它植物组织的分生组织培养物转化质体
构建糖用甜菜质体转化载体
扩增并改变甜菜(Beta vulgaris)质体基因组的trnV和rpsl2/7基因间区域，以***嵌合基因。从糖用甜菜质体基因组PCR扩增1559bp区域(1-1560位，GenBank登录号AB032426)，在525位***Pstl位点。利用以下引物对，从甜菜(B.vulgaris)总DNA首先进行536bp的PCR扩增：Bv16-MluI(5’TTC TT A CGC GTT ACT CACCCG 3’，SEQ ID NO：1)具有天然MluI限制性位点(下划线)，以及Bv16S-PstI(5’AAA  CTG CAG AAA GAA GTC CCG GCT CCA AGT 3’，SEQ ID NO：2)引入PstI位点(下划线)。利用以下引物对，进行第二次1049bp的PCR扩增：Bvrpsl2-BHI(5’AAA  GGA TCC AAA TTGACG GGT TAG TGT G 3’，SEQ ID NO：3)引入BamHI限制性位点(下划线)，以及Bvrpsl2-PstI(5’AAA CTG CAG TCG CAC TAT TAC GGATAC GAA 3’，SEQ ID NO：4)引入PstI位点(下划线)。两个PCR反应均利用Pfu热稳定性DNA聚合酶，在Perkin Elmer热循环仪上，按照厂家推荐(Perkin Elmer/Roche，Branchburg，NJ)进行，如下所述：95℃ 5分钟，继之以35个循环95℃ 1分钟/50℃ 1分钟/72℃ 1分钟，然后72℃ 10分钟。利用MluI和PstI消化536bp扩增产物，产生代表糖质体trnV侧翼序列的525bp MluI/PstI片段。利用PstI和BamHI消化1049bp扩增产物，产生代表糖用甜菜rps12/7侧翼序列的1034bp BamHI/PstI片段。
利用MluI和BamHI切割烟草质体转化载体pAT238(PCT WO00/20612 Novartis，国际公开日04/13/00)，分离3.3kbMluI/BamHI载体片段。该片段在三方(three-way)反应中与525bp MluI/PstI片段和1034bp BamHl/PstI连接，产生糖用甜菜转化载体pEBcpSBeet主链。得到的质粒包含嵌合的烟草∷糖用甜菜∷烟草质体trnV和rpsl2/7基因间座位，1559bp糖用甜菜序列的trnV一侧为414bp、rpsl2/7一侧为39bp烟草质体序列。赋予壮观霉素抗性、由烟草psbA启动子驱动的嵌合aadA基因，***糖用甜菜序列先前产生的PstI位点。在rpsl2/7侧翼区方向上具有aadA盒的质粒克隆(pEBSB1)，用于其后的糖用甜菜多芽转化。
糖用甜菜质体转化
如实施例5所述，糖用甜菜的多芽培养物来源于芽尖。轰击前一天，靶外植体或切为4块(由上至下切割外植体)，或保持为完整的目标外植体。
轰击当天，将糖用甜菜靶外植体(整体或切块)转入含12％蔗糖的SMM培养基。将外植体置于靶平板的中心，以最大限度进行基因转移。外植体切块的切面向上，以最大限度将基因转入外植体的内部细胞。消毒的微粒包被前述糖用甜菜质体转化载体pEBSB1。 DNA微粒制备和轰击方法与厂家所述规程相似。
轰击后，将糖用甜菜外植体放回SMM培养基中2天。然后将糖用甜菜转入含250mg/L壮观霉素的SMM培养基中，进行选择。两周以后，将组织转入包含500mg/L壮观霉素的SMM培养基中，连续选择。选择1-2个月以后，在白色组织中出现壮观霉素抗性的绿芽，进行分析。
烟草质体转化
分生组织培养物来源于烟草的叶组织，培养基中包含至少一种细胞***素生长调节剂，例如BAP，浓度范围大约0.5-5mg/L，优选1-2mg/L。分生组织培养物还来源于烟草植物的其它部分。也包括另外的生长调节剂，例如NAA。除植物调节剂以外，培养基包含MS盐、维生素B5、30g/L蔗糖以及3g/L琼脂，pH大约5.8。
轰击当天，将分生组织培养物转入新鲜培养基，置于平板中心，以最大限度进行基因转移。消毒的微粒包被烟草质体转化载体pAt238(参见国际申请NO.PCT WO00/20612)。DNA微粒制备和轰击方法与厂家所述规程相似。
轰击两天后，将培养物转入包含500mg/L壮观霉素的选择性培养基。选择大约4周以后，白色组织中出现抗性绿芽。这些初级的抗性芽组织定期继代培养于包含500mg/L壮观霉素的新鲜培养基中。
选择3个月以后，利用PCR分析两个实验中17个独立事件的aadA基因以及质体整合。证实14个事件包含aadA，并且质粒整合到其质体基因组中。
番茄质体转化
在包含至少一种细胞***素生长调节剂(例如玉米素、BAP)的培养基中培养番茄组织(例如子叶、叶、芽尖等)的各种外植体，以诱导分生组织培养物。细胞***素浓度范围大约0.5-5mg/L，优选1-2mg/L。也包括另外的生长调节剂，例如IAA、NAA。除植物调节剂以外，培养基包含MS盐、维生素B5、30g/L蔗糖以及7.5g/LPhytagar，pH5.8。
轰击当天，将分生组织培养物转入新鲜培养基，置于平板中心，以最大限度进行基因转移。消毒的微粒包被有质体DNA，其中包含侧接选择性标志基因(以及目的基因)的番茄或烟草同源序列。DNA微粒制备和轰击方法与厂家所述规程相似。
轰击两天后，将培养物转入包含500mg/L壮观霉素的选择性培养基。选择几周以后，白色组织中将出现抗性绿芽。获得的芽继续在壮观霉素选择性培养基中生长，并包含转化的质体。
上文说明本发明，不应理解为对其限制。本发明由以下权利要求定义，等效于其中包括的权利要求。
                           序列表<110>Syngenta Participations AG<120>植物稳定转化的方法<130>S-31514A<140><141><150>US 60/224,934<151>2000-08-11<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>1ttcttacgcg ttactcaccc g                                   21<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>2aaactgcaga aagaagtccc ggctccaagt                          30<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>3aaaggatcca aattgacggg ttagtgtg                            28<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>4aaactgcagt cgcactatta cggatacgaa                          30Case S-31514A1

Claims (50)

1.产生转化的双子叶植物的方法，包含：
(a)在培养基中培养难以转化的双子叶植物的组织，以从该组织产生多芽培养物；
(b)将核酸引入多芽培养物的细胞中，从而产生包含该核酸的转化细胞；以及
(c)从转化细胞再生转化植物。
2.权利要求1的方法，其中所述的组织为分生组织。
3.权利要求2的方法，其中所述的分生组织切离自芽尖、腋芽或花分生组织。
4.权利要求1的方法，其中所述的组织为愈伤组织。
5.权利要求1的方法，其中所述的植物是葫芦科或藜科的一员。
6.权利要求1的方法，其中所述的植物选自糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、甜瓜、西瓜、南瓜、芸苔属和胡椒。
7.权利要求1的方法，其中所述的植物为糖用甜菜、南瓜、甜瓜或西瓜。
8.权利要求1的方法，其中所述的组织切自植物幼苗的芽尖。
9.权利要求1的方法，其中所述的培养基包含至少一种植物生长调节剂。
10.权利要求9的方法，其中所述的至少一种植物生长调节剂是细胞***素。
11.权利要求9的方法，其中所述的生长调节剂在培养基中的浓度介于大约0.01mg/L至大约25mg/L。
12.权利要求1的方法，其中所述的核酸通过微粒轰击、或者利用属于土壤杆菌属的细菌而引入细胞。
13.权利要求1的方法，其中所述的核酸包含与该双子叶植物异源的核酸。
14.权利要求1的方法，其中所述的核酸包含编码具有PPO活性的多肽的基因。
15.权利要求1的方法，其中所述的核酸包含编码具有磷酸甘露糖异构酶(PMI)活性的多肽的基因。
16.权利要求1的方法，其中所述的核酸包含编码具有木糖异构酶(xylA)活性的多肽的基因。
17.权利要求1的方法，其中所述的核酸包含编码具有GUS活性的多肽的基因。
18.权利要求1的方法，其中步骤(c)包含：
选择包含转化细胞的多芽培养物；
将该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化芽；然后
将该至少一个转化芽生长为成熟的转化植物。
19.权利要求19的方法，其中所述的至少一个转化芽在促进根形成的培养基中生长以后，该至少一个转化芽生长为成熟的转化植物。
20.权利要求1的方法，其中步骤(c)包含：
选择包含转化细胞的多芽培养物；
将该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化芽；
克隆该至少一个转化芽；以及
使克隆的芽成熟为转化植物。
21.权利要求20的方法，其中所述的克隆的芽在促进根形成的培养基中生长以后，该克隆的芽生长为成熟的转化植物。
22.通过权利要求1-21中任何一项方法产生的转化的植物细胞。
23.通过权利要求1-21中任何一项方法产生的转化的多芽培养物。
24.通过权利要求1-21中任何一项方法产生的转化的植物。
25.权利要求24的转化植物，其中该植物是表达具有PMI活性的多肽的南瓜植物。
26.权利要求24的转化植物，其中该植物是表达具有PMI活性的多肽的甜瓜植物。
27.权利要求24的转化植物，其中该植物是表达具有PMI活性的多肽的西瓜植物。
28.权利要求24的转化植物，其中该植物是表达具有PPO活性的多肽的糖用甜菜植物。
29.权利要求24的转化植物产生的种子，其中该种子包含转化到多芽培养物的核酸。
30.产生包含转化的质体基因组的植物的方法，包含：
(a)在培养基中培养植物组织，从该组织产生多芽培养物；
(b)将核酸引入多芽培养物细胞的质体基因组中，从而产生包含该核酸的所述细胞转化的质体基因组；以及
(c)从转化细胞再生转化植物。
31.权利要求30的方法，其中所述的组织为分生组织。
32.权利要求30的方法，其中所述的分生组织切自或来源于芽尖、腋芽、或花分生组织、或叶组织。
33.权利要求30的方法，其中所述的组织为愈伤组织。
34.权利要求30的方法，其中所述的植物为双子叶植物。
35.权利要求30的方法，其中所述的双子叶植物为糖用甜菜、烟草或番茄。
36.权利要求30的方法，其中所述的组织切自植物幼苗的芽尖。
37.权利要求30的方法，其中所述的培养基包含至少一种植物生长调节剂。
38.权利要求37的方法，其中所述的至少一种植物生长调节剂是细胞***素。
39.权利要求37的方法，其中所述的生长调节剂在培养基中的浓度介于大约0.01mg/L至大约25mg/L。
40.权利要求30的方法，其中所述的核酸通过微粒轰击引入细胞。
41.权利要求30的方法，其中所述的核酸包含与所述的双子叶植物异源的核酸。
42.权利要求30的方法，其中步骤(c)包含：
选择包含转化细胞的多芽培养物；
将该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化的芽；然后
该至少一个转化芽生长为成熟的转化植物。
43.权利要求42的方法，其中所述的至少一个转化芽在促进根形成的培养基中生长以后，该至少一个转化芽生长为成熟的转化植物。
44.权利要求30的方法，其中步骤(c)包含：
选择包含转化细胞的多芽培养物；
该多芽培养物在促进芽伸长的条件下生长，产生至少一个转化的芽；
克隆该至少一个转化芽；以及
使该克隆的芽成熟为转化植物。
45.权利要求44的方法，其中所述的克隆的芽在促进根形成的培养基中生长以后，该克隆的芽生长为成熟的转化植物。
46.通过权利要求30-45中任何一项的方法产生的转化的质体基因组。
47.包含权利要求46的转化的质体基因组的质体。
48.包含权利要求46的质体基因组的转化的植物细胞。
49.包含权利要求48的植物细胞的转化植物。
50.通过权利要求49的转化植物产生的种子，其中该种子包含转化到多芽培养物的核酸。
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