CN1251538A - 纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备 - Google Patents

纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备 Download PDF

Info

Publication number
CN1251538A
CN1251538A CN98802715A CN98802715A CN1251538A CN 1251538 A CN1251538 A CN 1251538A CN 98802715 A CN98802715 A CN 98802715A CN 98802715 A CN98802715 A CN 98802715A CN 1251538 A CN1251538 A CN 1251538A
Authority
CN
China
Prior art keywords
flow
equipment
enzyme
isoelectric focusing
purifying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN98802715A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1245246C (zh
Inventor
赫尔本·福佩·德伯尔
奥托·索瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cerberus Development Bv
Original Assignee
Cerberus Development Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cerberus Development Bv filed Critical Cerberus Development Bv
Publication of CN1251538A publication Critical patent/CN1251538A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1245246C publication Critical patent/CN1245246C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44795—Isoelectric focusing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/02—Preparations for cleaning the hair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/46—Treatment of water, waste water, or sewage by electrochemical methods
    • C02F1/469—Treatment of water, waste water, or sewage by electrochemical methods by electrochemical separation, e.g. by electro-osmosis, electrodialysis, electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44769—Continuous electrophoresis, i.e. the sample being continuously introduced, e.g. free flow electrophoresis [FFE]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2301/00—General aspects of water treatment
    • C02F2301/02—Fluid flow conditions
    • C02F2301/022—Laminar

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种通过等电聚焦从溶液或悬浮液中以工业化的规模分离和纯化带电物质的设备和方法。该设备包括分离室,一对放置在分离室中的端部的垂直电极(9),位于每一个电极(9)附近用于将电极空间和设备中央部分分开的阴离子或阳离子选择膜(10),位于室上部的用于分离液体组分的一个或多个流出口(12),位于每个电极空间上部的辅助流出口(11),至少在所述流出口(11,12)高度上在每一个所述的流出口之间的、隔开所述室的一个或多个垂直壁(6),多个保证无对流地向上流动的可渗透的垂直间壁(13)。本发明设备不需额外的两性缓冲溶液以建立合适的pH梯度,能用于纯化多核苷酸、氨基酸、肽、蛋白质、有机溶剂和饮料。

Description

纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备
发明领域
本发明涉及通过连续流动等电聚焦(isoelectric focusing)的新方法(连续聚焦)和设备(连续聚焦器，contifocuser)纯化、离析、浓缩和分离有机或生物物质，一种利用低电导场(electrically low-conductivefield)浓缩或分离带电物质的技术。不必使用离心、过滤、吸附或载体电解质或两性电解质缓冲液以建立合适的pH梯度。
用等电聚焦分离带电分子，如从含蛋白质的混合物中分离蛋白质，是已知技术，其原理是带电两性分子在特定pH，即所谓的等电点(pI值)下净电荷为零。如果经受一电场，物质将迁移到自身等电点的pH，因此得到分离。
静电等电聚焦方法和设备是已知的，例如公开在WO79/00942、EP-A-256552和US 5,256,269中。这种类型设备的缺点是纯化量少，其收集是以批式操作进行的。本发明技术背景描述在US 4,465,582(1982)中的连续流动电泳设备中，在电极室中应用了控制的流体流动，流动是平行的，但独立于“工作”室中的流动。
US 5,160,594公开了一种等电聚焦设备，在每一个槽中具有强制循环，即循环等电聚焦过程。在本发明中不使用循环。美国专利使用一串装置以防止部分纯化的和未纯化的两性物质之间的混合。在每个槽中需要附加冷却来降低电阻的发热。通过离子选择膜，将强酸和强碱，即阴极电解液和阳极电解液限制在电极室中，以抗御带负电或正电的离子，并建立合适的pH梯度。与US 5,160,594不同，本发明使用离子选择膜用于不同的目的，即选择允许低分子物质通过电极空间，并从电极流出口排出。所有现有技术中的装置都需要载体两性电解质用于工作室，它们具有相对低的电导率和缓冲能力。US 5,160594公开的最大电导率高达600μS/cm，比本发明的高达5000μS/cm的电导率低得多。与其它现有技术的装置一样，不是设计用来在工业规模上进行纯化的，此外，US 5,160,594没有提供纯化物质的实施例。
不使用载体两性电解质缓冲溶液，但用于工业规模的连续流动等电聚焦方法和设备公开在匈牙利专利210,584(1992)中。该专利描述了一种通过迁移(gravitation)到分离室达到流出口高度的上流***。该***具有两个非导电溶液室，其中第二室具有两个或多个溶液流出口，以及一个溶液从第一室流入第二室底部的下流通道。一对电极位于第二室。在第二室中设置多个相邻的间壁，间壁延伸穿过该室，以在水平方向上基本上没有溶液的对流和逆流通道。HU 210,584的缺点是在流入溶液室中，可能自身形成梯度。溶液的流入是通过滴加进行的，难以控制。与本发明类似，匈牙利专利中的上流***的固有梯度形成不易受损，但是，两室***复杂，难于构造。此外，有机溶液的分离发生在第二分离室的相对两侧，靠近电极。无机离子容易与要分离的单组分无机或生物物质混合。通过需要第二分离步骤。
发明描述
本发明提供一种在导电溶液中分离物质的连续聚焦器，该设备是由非导电材料制成，包括一个砖块状的分离室，其具有一个液体流入口，两个电极空间流出口，一个或多个工作溶液流出口，以及溶液从底部向上流动到顶部流出口的通道。分离室的高度、宽度和深度的比可以如3∶2∶0.2。沿分离室的两个最窄的相对壁的竖向位置上设置一对电极。它们用于连接外部直流(DC)电源。
设备被两个由离子选择膜制成的间壁分为三部分。这些间壁在设备中靠近电极的两侧垂直定位，以至于它们中的每一个都离开两端约1/25-1/15。两间壁在底部都有开孔，其直径为设备流入管的一半。特别地，包围阴极空间的是阳离子选择膜，而另一个是阴离子选择膜。离子选择膜具有选择允许阳离子或阴离子通过的专一性以从废物流出口清除。
在两端，废物流出孔位于电极附近，与顶边的距离为设备的1/40-1/10。工作流出口用于收集要纯化和物质，位于相同的高度，在中间。有利的是连续聚焦器具有至少三个所述流出口。除电极空间外，在流出口之间是由非导电材料制成的分割间壁，其上部四分之一闭合，从底部向上，如至其高度的四分之三处具有小的开孔。
作为进一步的改进，可以在设备的上述间壁之间的剩余空间内放置多个相邻交替的锯齿形或T形或多T形间壁元件，但电极空间除外。这些也由非导电材料制成，被穿孔或由离子或分子可双向渗透的多孔材料制成，从底部向上延伸至工作流出口最低高度，并延伸跨过室。间壁自由地放置在设备的整个宽度上，是一种新元件，使溶液基本上没有对流，但是，使电解质或两性颗粒在水平方向上未扰动的流动。穿孔膜成相互间隔关系，以至于提供了未扰动的垂直流动。本发明与现有技术的设备相比具有一重要的优点，它可以处理高达3,600L/天的蚯蚓酶(按现有技术HU 210,584：280-300L)，生产80,000-170,000U纯化酶/L/天(HU 210,584：60,000-70,000U)。
本发明的另一优点是溶液或悬浮液可以具有50-5000μS/cm的电导率，而不是现有技术的装置中的50-2000μS/cm(US5,160,594在表中描述的电导率高达600μS/cm)。
在本发明中，溶液沿所述设备中的化学惰性通道流动，垂直向上通过多个由两膜间壁之间的垂直的流路，膜间壁将分开的电极和其间的工作空间分开。少量的溶液水平流动通过这些间壁上的小孔。在电极之间施加一偏压(bias voltage)，使得带电组分在水平方向上分离，并在水平方向上向跨过设备向阴极或阳极移动。当组分通过位于设备上部附近的流出口流出时，被收集。小的低分子量和带电组分，即金属和离子，向电极空间移动。它们经废物流出口从设备中排出，这样，它们与向设备中央移动的较高分子量物质分离。
在本发明中，目标物质至少包括一种以其pI值为特征的两性物质，所述物质被两性杂质所包围。当施加偏压电势时，由所述杂质在设备水平方向上形成pH梯度。在pH梯度上，两性物质被驱动到其pH值与所述物质pI相当的点上，并被中和(neutralised)。因此，物质向设备上部的流出口垂直流动。
为了提高设备的能力，两个连续聚焦器以成对构造的方式靠在一起，由防水壁隔开。这种“成对聚焦器”具有共用的电极空间(2，4)，位于设备的两端，一对电极供两个聚焦室使用。成对聚焦器具有共用的流入口(7)，位于设备的底部中央，入流在两个聚焦器之间等份分配。从两个电极空间可以设置一个或两个电极流出口(11)。成对聚焦器在两侧都有工作流出口(12)，这一点正如最初的连续聚焦器。成对聚焦器的流量增加了一倍，分离能力也增加了一倍，但所需的电能只增加三分之一。
下面描述在工业规模上纯化、分离和浓缩生物物质。不需离心、过滤、吸附步骤或额外载体两性电解质缓冲以建立合适的pH梯度。在设备的整个宽度上垂直设置多个细分和穿孔的、颗粒可以双向穿过的间壁，这是一种新方式，使溶液基本上没有对流，产生了没有扰动的垂直流体流动。
连续聚焦器被设计用来成本有效地纯化如质粒、肽、氨基酸、酶、免疫球蛋白、抗原，用于诊断试剂盒，或者制备病毒或细菌亚单位疫苗、变应素，以及用于分离细胞集合体或在乳汁、血液、或尿中所含的重组体产品。连续聚焦器还可以用于从酵母或细菌发酵过程、抗生素、有机溶剂、饮用水和饮料中除去杂质或有毒物质。
连续聚焦器也可以用于分离或纯化从微生物(包括细菌、真菌、酵母、藻类或其它单细胞或寡细胞(oligocellular)微生物)或动物(包括哺乳动物、昆虫、无脊椎动物)或植物(包括海藻、浮游生物、蘑菇、苔藓植物、草本、或高等动物)或其一部分或其衍生物中表达或提取的产物。这些产物包括微生物表达产品，由转基因哺乳动物—如在其乳汁中生产药用制品的奶牛或猪—生产的物质，从林业和栽培植物中提取的物质。其例子是天然色素、农药、木质素、多元醇如木糖醇、碳水化物、单糖或多聚糖类，如木聚糖和微晶纤维素、饮食的和其它纤维、糖蛋白、脂蛋白。
附图简述
图1是本发明设备的透视图；
图2是从垂直方向看的设备正视图；
图3是沿图2中线3-3垂剖的设备侧视图；
图4是沿图2中线3-3垂剖的成对构造的设备侧剖图；
图5是具有锯齿间壁的设备的顶视图；
图6是具有T形间壁的设备的顶视图；
图7是成对构造的设备的顶视图；
图8是设备中三种间壁的顶视图；
图9是安装了四个间壁的设备的顶视图；
图10是操作时沿着设备宽度方向上的电导率的曲线；
图11是本发明设备的示意侧视图。
优选方案的描述连续流动等电聚焦设备，连续聚焦器
现在参看附图，其中相似的部件用相似的标记表示。参看图1-11，设备1包括一个通常为矩形的电化学惰性容器，具有端壁2，底板3，前壁4和后壁5。在每一个流出口之间，设备1中提供了垂直连接后壁5和前壁4的间壁6，但电极空间的流出口除外。从这些间壁的底部起的三分之一高度上，有孔，或由多孔材料制成。后壁5的底部有一流入口7，底板3的宽度W2大于设备1的宽度W1(参看图2)，两个电极9由间壁10与设备的其它部件分开，间壁10由离子选择膜形成，即阴离子选择膜靠近阳极，阳离子选择膜靠近阴极。在设备顶部的电极流出口，电极空间与其它工作流出口12具有相同的液面。在设备1中的间壁6之间的空间由多个不太优选的C形间壁(10)，或锯齿形穿孔间壁(13)或多个由多孔材料制成的T形间壁(6)分开，它们之间的间距分别为1cm、0.5mm和0.3mm(参看图8)。
如图8所示，本发明使用了要分离的含有有机或生物物质的液体溶液原料，其优选的电导率为50-5,000μS/cm。不使用载体两性电解质来建立适当的pH梯度。来自源14的流量可以通过合适的阀15调节，阀由非导电材料制成。工作流出口12的数目取决于所用分离过程的性质。分离的溶液从出口11中的每一个收集到合适的容器16中，如图11所示。设备1包括一个调整螺旋8，它设置在底板3的外侧端，其中，螺旋8用来调节前壁4上的流出口12的水平高度。
设备1上提供了一对分开的电极9，它们与端壁2相邻。电极9基本上从设备1的底部延伸到顶边，是这样安装的：例如，可以通过多个保持托座容易地***或取出。电极9，它们是阳极或阴极，在端壁2的顶部的电连接线或插头处终止，以利于将电极9连接与外部电源连接，如图2中的“P”。电极9优选是化学惰性的，在处于所施加的偏压条件下，还要能稳定地抵抗阳极和阴极在同一溶液中溶解。使用铂和碳是令人满意的。另外，设备的壁优选由化学和电惰性的材料形成或涂覆，如聚四氟乙烯、丙烯酸酯树脂、陶瓷或玻璃材料。
参看图5、6、7和8，设备1中提供了多个液体可渗透的、C形、锯齿形、或T形垂直间壁元件13，它们从设备1的底部到正好低于流出口11和12的液面的点之间垂直延伸，并沿防水安装的间壁6和10水平延伸，电极空间除外。C形或锯齿形间壁13包括多个直径为0.5-1mm的孔或洞，它们沿垂直方向等距间隔。T形间壁元件13由约50μm的多孔材料制成。垂直间壁6基本上具有与设备1相同的高度。
电极空间的间壁10是防水安装的，它们的作用是低分子阴离子或阳离子可以从工作室向阳极空间或阴极空间通过离子选择膜。间壁基部的小孔允许溶液有限地通过电极空间流动，以洗出浓缩离子。间壁6的上部三分之一是防水安装的。其作用对设备的构造和在最后步骤中—经工作流出口12离开设备之前—流过设备过程中分离的液体组分的良好分离是重要的。穿孔的间壁部件13具有多种作用。第一，小孔或洞允许流体水平流动通过设备1。第二，当在电极9之间建立了电压之时，小孔提供了多个水平的离子逆流通道。此外，多个T形或锯齿形间壁元件13便于在设备1中形成垂直流动通道，允许在图3、4和5所示的设备1中形成从设备1底部向上到上部的连续层流。最后，间壁13在设备1中抑制了电极9之间的扰动和水平对流。
参看图9，设备1具有间壁6，在两个相邻工作流出口12之间，沿间壁的外边沿到前壁4和后壁5之间密封，形成液体不能通过的密封。每个小室的中提供了多个间壁元件13，由间壁6分开，相应于工作流出口12。在操作中，含有要分离物质的混合物分散或溶解在蒸馏水中，起始物质的浓度应使电导率在50-5,000μS/cm之间。然后，以恒定的流速从流入口7向设备1中注入溶液或分散液。当设备1被注入到正好低于出口11-12的高度时，终止溶液的流入，调整螺旋8使流出口11-12水平对齐。然后，将电极9连接到外部电源“P”，在电极9之间加上一直流(DC)电压降，溶液进入设备1。由于电极9之间的低电流，建立了进入设备1的溶液中的化合物水平流动。在连续聚焦过程中，要分离溶液中的组分在设备的水平方向自动形成pH梯度，含有起始物质的各种两性组分在设备中被驱动或聚焦到具有相应于其本身pI或等电点的pH的位置。强烈极化的低分子量杂质聚焦到电极空间，并通过电极空间的废物流出口从设备中清除。一旦组分被分离并在本身的pI下中和，它们在电场中在水平方向就不能移动了，但仍然在间壁13之间的流动通道中向着设备1的上部垂直流动。这些流出物经工作流出口12收集或丢弃。此外，溶液可以循环到原始溶液中，即容器14中，或循环到串联的另一连续聚焦器中。设备1中的流出口12的数目取决于要分离的组分的数目。当具有不同等电点的多种组分要分离时，可以使用更多数量的流出口。为了使连续聚焦器能适应多种不同物质的分离，设备1可以这样构造：在前壁4的内部设置几个带滑动元件的流出口12，通过出口12打开或关闭流出通道。
一般来说，每分钟的流量保持在设备1的室体积的十分之一。流量与设备1的体积之间的关系对设备1是有效的，其中通过增加高度同时保持设备1的宽度不变可以使其体积变大。带电组分在电场中水平迁移所需的时间保持不变。所以增加设备的垂直高度可以允许更高的流量。如果组分的pI值与其它组分的接近，则相应于所形成的pH梯度。需要提高分辨率(resolution)。这可以通过增加设备的水平长度来实现，要求较长的组分水平迁移时间和较低的流量。
确定流量上限的另一因素是在设备的整个工作空间内建立和维持稳定的pH梯度。当溶液内的两性杂质的分子量明显低于目标物质时，则建立pH梯度的时间短于要纯化组分的迁移时间。低分子量组分的移动速度快。此外，具有极端pI值(＜pH2-＞pHl2)的物质经离子选择膜移动到电极空间，关通过废物流出口排出。在其中，设备内的pH梯度首先是基于低分子量的杂质的，此后，由较高分子量的组分维持。
图10说明了稳定操作状态下设备1内的电导率的轮廓，表明了在工作空间电导率最低，在电极空间较高，在该空间内低分子量或带电组分被浓缩。这说明了连续聚焦器在从如水、饮料和有机溶剂中除去杂质中是有用的。
本发明设备使用简单的静电场，可以在无人操纵状态下工作几天，因为没有需要操作人员连续照料的电化学装置或其它装置。对于大多数连续聚焦应用来说，优化操作特征，即在最小电阻发热实现快速分离所需的功率为3-50W。蚯蚓酶的工业纯化
本发明可以用于纯化来自无脊椎动物—如加利福尼亚蚯蚓赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)—的酶，以下将说明几个工业应用的非限制性实例。酶以如下方法生产：蚯蚓在农业残渣中生长，  在整个堆肥中撮取和***，制造了生物腐植土或蠕虫堆肥。诱引剂用于分离蚯蚓和生物腐植土，蚯蚓用自来水洗涤，通过冷冻或在容器中突然降压来杀死，并用蒸馏水匀化。通过存活繁殖(survival breeding)选择蚯蚓用于生产所需高浓度酶。
使用成对构造的连续聚焦器(体积为2×25L)，其流量为2.5L/min(3,600L/天)。每天可以从四个工作流出口(废物流出口在中间)得到总量为2,000L的纯化酶。使用第二连续聚焦操作以进一步纯化。两个连续聚焦操作产生的蛋白质浓度为1g/L。最终产量为约1,200L/天，酶的平均活性为80-170U/ml。与细菌发酵生产的类似制品的酶活性(0.001-0.002U/ml相比，这是有利的。10L的用于蚯蚓酶纯化的连续聚焦器在1997年4月于瑞士日内瓦举办的国际发明展览会上获得了金奖。实施例1-来自赤子爱胜蚓的天然酶的分离和纯化
从赤子爱胜蚓获得五种新的纯化的非细菌酶。这一实施例中的酶按如下方法制备：收集十公斤经遗传选择的赤子爱胜蚓品系。蚯蚓在-18℃下冷冻24小时，然后在含有0.1％乙二醛的4℃冷水中解冻。这一粗悬浮液一部分一部分地在高容量混合机中混合，并在100L蒸馏水中匀化。这一溶液在连续流离心机中离心分离，上清液引入到2L的连续聚焦器中。使用具有四个流出口的设备。使用250V的DC电压，80毫安的电流，建立起100ml/min的最初流量。所有操作在4-10℃下进行。连续聚焦持续16小时。来自各个工作流出口的溶液分别收集，相应的等电点为8.3、7.0、6.5、3.2和2.8。由制备SDS电泳法获得的每一活性酶组分通过无机和消化水解，氨基酸残余物通过自动氨基酸分析仪测定。对三次分析进行计数，计算氨基酸的平均量和百分数。五种酶，按pI值下降的顺序，分别是：
Eisenase-一种具有蛋白水解活性的碱性酶混合物，pI为8.3，pH最优值为6.0，分子量为13.2kDa，偶氮酪蛋白(azocasein)裂解活性为100-120U/mg(在37℃和pH7.5下，每分钟每一个单位可以水解磺胺-偶氮酪蛋白(Merck Catalogue p.142,1992)由Folin-Ciocatteau试剂测得的产生1.0μM(＝181μg)酪氨酸的比色当量)。一个偶氮酪蛋白裂解活性单位(U)是蛋白水解活性的一种度量，定义为每分钟能分解1μM偶氮酪蛋白的酶的量，在370nm下由UV光谱估计(Tomarelli等，J.Lab.Clin.Medicine 34，428，1949)。这种酶称为“eisenase”，作为肽链内切酶以及肽链端解酶与丝氨酸的混合物，具有金属蛋白水解(metalloproteolytic)活性，被描述在“International EnzymeClassification Catalogue”中，具有ECC 3.4.21.1，3.4.21.4，3.4.23.6，3.4.21.14中。它可以用于天然保护，如肉的包装中，以及用于局部皮肤处理。
Fellulase-一种具有纤维素水解活性和蛋白水解活性的酶，pI为7.0，pH最优值为5.9，分子量约为54kDa。这种酶称为“fellulase”，具有ECC 3.2.1.4的特征。纤维素水解活性约10-20U/mg(在pH5.0和37℃下，每小时从纤维素中释放出1.0μM葡萄糖)。Fellulase在低酸性环境中发挥纤维素水解活性。
对纯化的五种酶的样品进行分析，分析其功能和蛋白质的物理特征。数据列于以下的两张表中：
                                    表1
                     E.foetida酶的功能和物理蛋白质特征
  eisenase   fellulase   fetilase   fetipase   wormase
        pIa最优pH范围＞50％b最优温度℃范围≥50％bM.W.kDa(gel)cM.W.kDa(calc.)d氨基酸e碱性a.a.％酸性a.a.％蛋白水解酶活性fα-淀粉酶活性gβ-淀粉酶活性h纤维素酶活性i脂酶活性jMichaelis(mM)k     8.36.04.2-8.15025-601713.2110230+Ser；Asn_1---1.76     7.05.94.4-7.14510-5567±5444647+--+-0.85      6.57.25.8-8.66030-6536±2924065-1++--1.60     3.24.63.6-5.95025-6018±14.5120257+/----+0.88      2.83.62.7-5.3505-7031±252051522+Arg；Trp---0.35
a由连续聚焦测定的等电点。
b≥最大活性50％的范围。
c由SDS-PAGE测定的。
d由氨基酸含量(未糖基化的)计算得到的。
e完全水解所测定的总数。
f通过对聚丝氨酸、聚精氨酸、聚色氨酸以及聚色氨酸精氨酸的活性测定的。
g在37℃和pH6.9下通过对淀粉的活性测定的。
h在20℃和pH4.8下通过对淀粉的活性测定的(在这一研究中，在一个酶催化活性线上，通过制备SDS电泳仅获得了α-淀粉酶。β-淀粉酶的损失可能是由于在SDS中的离解)
i通过对纤维素天青(Cellulose azure)(Merck)Fernley，N.H.，Hiochem.，J.，87，90(1963)的活性测定的。
j通过对甘油三酯No.339(Merck)的活性测定的。
kMichaelis常数是通过每种单一酶对特异底物测定的。
l表示酶的活性为0.1U的数量级。
                          表2
                E.foetida酶的氨基酸组成(值±5％)
   氨基酸   eisenase   fellulase   fetilase   fetipase   wormase
  氨基酸数     110     240     446     120     205
    Ala     4.46    12.3    15.8     2.6     3.3
  β-Ala      0     3.7     0.7     4.1     4.8
    Arg    10.30     2.0     1.0     6.8     3.2
  Asp+Asn    17.24     4.0     0.9     5.8    12.3
    Cys     6.89     4.0     1.2      0     1.7
  Glu+Gln     6.89     5.5     7.6     8.3    12.9
    Gly    13.79    14.5    12.1     7.5     6.5
    His     3.45     4.0     2.9     8.5     8.1
    Ile     2.50     2.0      0      0     1.6
    Leu     3.45    10.2     9.9     6.8     3.2
    Lys    10.34      0      0     8.5     3.2
    Met     3.45      0      0     4.1     4.8
    Phe     3.45     6.2     4.1     2.2     3.2
  羟基-Pro      0      0      0     8.5     8.1
    Pro      0      0    15.2    10.2     9.7
    Ser     3.45    12.0    10.7     5.1     3.2
    Thr      0     3.6     2.4     0.7     1.6
    Trp      0     2.0     2.0     1.7     1.6
    Tyr     6.89      0      0     5.1     4.8
    Val     3.45    14.0    13.6     3.4     1.6
Fetilase-一种具有α-和β-淀粉分解、尤其是蛋白水解活性的酶，pI为6.5，pH最优值为7.2，分子量约为29kDa，分解偶氮酪蛋白的活性为80-100U/mg。这种酶称为“fetilase”，具有ECC 3.2.1.1，3.2.1.2，3.4.22.6的特征。fetilase淀粉分解的活性约为20-40U/mg(每一单位在pH6.9和37℃下，3分钟内从淀粉中释放出1.0mg麦芽糖(P.Bernfeld：“Methods in Enzymology 1，149，1955”))。Fetilase可以用作啤酒酿造过程中的低大麦淀粉酶的替代物，和作为药物中胰腺的酶替代物。
Fetipase-一种具有脂解活性和略微有一些蛋白水解活性的酶，pI为3.2，pH最优值为4.6，分子量约为14.5kDa，分解偶氮酪蛋白的活性为80-100U/mg。这种酶称为“fetipase”，具有ECC 3.1.1.1，3.1.1.3，3.4.2.6的特征。Fetipase的脂解活性约为20U/mg(每一单位在pH7.7和37℃下，一个小时内从甘油三酯内水解出1.0meq脂肪酸)。Fetipase可以用作洗涤组合物中的活性物质。
Wormase-一种具有蛋白水解活性的酸性酶混合物，pI为约2.8，pH最优值为3.6，分子量约为31kDa，分解偶氮酪蛋白的活性为80-100U/mg(在pH7.5和37℃下，测得每分钟每一单位水解酪蛋白产生相当于1.0μM(＝181μg)酪氨酸的比色当量)。这种酶称为“Wormase”，具有ECC 3.4.23.1，3.4.23.6和3.4.22.3的特征。Wormase可以用于洗涤粉，用于食品和饮料工业，特别在相对低的pH下分解不需要的蛋白质；而在果汁、啤酒和酒的应用中，一般其pH的范围为3.9-6.0。该酶能降低约70％的蛋白质含量，可以减少、或者可以取消饮料生产过程中的过滤步骤。实施例2-赤子爱胜蚓酶混合物的工业用途
酶混合物(enzymmix)是多种酶的组合物，由wormase、eisenase、fetipase和fetilase组成，其比率为30∶40∶15∶15，其活性如下：wormase＝65-90U/ml，eisenase＝80-100U/ml，fetilase＝60-90U/ml，fetipase＝60-90U/ml。通过水解，酶混合物主要分解和降解蛋白质，也分解和降低淀粉和脂类。蛋白质残余物(来自啤酒和葡萄酒)、淀粉、肌蛋白(肉和培根中)被部***解或降解，获得改进的味道。酶混合物可以取代废水的细菌纯化，而不需曝气。酶混合物可以用于生物洗涤粉、洗涤粉、清洗产品、肥皂、牙膏、香波等。酶混合物可以与表面活性剂结合使用，请参看下面的描述。酶混合物可以用于将污水中多氯双酚(polychlorobiphenyls)(PCB′s)的浓度从40μg/L降低到5μg/L。酶混合物不会对人体或皮肤引起变应性、湿疹或毒性。与细菌发酵生产的类似产品相比，它含有的总蛋白质少30倍。
Recultol用于补救(remediation)尤其被矿物油污染物污染的土壤。它由酶混合物和一半体积的长链(C23)二羧酸表面活性剂，即所谓的“laurylan”。Recultol可以分两次喷洒到受害的区域而直接施加到土壤上，或者可以加入到下层土壤区域中的强制水循环中。1毫升Recultol可以裂解50毫克污染物。要补救的土壤的平均剂量是300-700L/HA加150-300L laurylan。Recultol可以用于加速垃圾堆场地的分解。其特殊的用途是清理油轮，因为其酶催化活性不受较高的盐浓度的干扰。从海上漏油的补救可以通过将酶混合物附着到载体上来实现，这种载体优选是一种可降解产品，其密度应能浮在油相的上面，还具有憎水-油相的性质。两种制备都包括通过从工厂连续聚焦获得的可降解颜料，红色或白色。上表面的颜色将从白色变到粉红色。在固体表面的情况下，水泥、混凝土、铁路等，用Recultol补救可以在高压下，用在1,000L温水(高达50℃)中的1L酶混合物和1L laurylan的混合物来实现。
Sanamor是一种液体洗涤工具，含有酶混合物、表面活性剂和消毒剂，0.1％的乙二醛。Sanamor可以用于洗涤肉、牛奶和食品工业的管道和设备。Sanamor可以代替需要高温而且必须用大量水洗净的酸和氢氧化物。Sanamor的稀释因子为1∶100-1∶200，工作温度为40℃。仅仅需要在标准时间20分钟洗涤一次即可。Sanamor的另一好处是可以清除隐藏在管道角落的沉积物和污垢。它能裂开有机基质。因此，酶和水解产物可以通过对整个管道***进行一次总的清洗就能洗净。通过向鸡和其排弃物上定期喷洒Sanamor可以减少鸡舍中NH4的排放。因为鸡舍中三分之二的NH4排放是由细菌在排弃物中作用产生的，因此处理排弃物是必须的。
酶预混物(Enzympremix)是同一混合物，但酶被吸附地适当的载体上，如沸石或膨润土上。饲料混合物可以加入到半自动养殖装置的鸡或猪的饲料中，作为生长促进剂以提高饲料的转化率。它还降低了a.o.，动物合成自身酶所需的能量。在用酶预混物进行的试验中，没有在处理的动物和动物饲养者身上观察到副作用或毒性。对小鼠来说，不能确定致死剂量，因为这些材料似乎是作为正常食物被消耗了。
在这一实施例中，为了比较，制备的酶混合物分两组实验，10,000只半自动养殖装置中喂养的鸡(Omega BT Kft.，匈牙利，布达佩斯1078)。在生命的第一周，两组都喂食雏鸡前期饲料，从第二周起，两组都喂带有抗菌素的高能量饲料，在最后一周(第7周)，最终混合物不带抗菌素。水供应不限量。两组的唯一区别是：从生命的第二天起，在混合饲料混合物时，每吨要供应的饲料中混入1升酶混合物。在达到所需的体重后，可以在两组间观察到明显的差别，接受酶混合物的一组是有利的。区别在于：(1)在短时间内生长较快，每只鸡的最终体重高200克(在36天内获得的平均体重为2,000克对42天1,800克)，(2)加酶组的饲料转化率高9.5％，(3)总损失减少52％(总死亡率为5.5％对11.5％)。在饲料混合物中加入酶混合物，和用Sanamor喷洒鸡群和排弃物配合起来进行，在4天的期间内，酶混合物组的鸡舍气味好。明显降低了NH4的排放，但未精确测量。在这种情况下，总的NH4排放量减少了70％。实施例3-溶菌酶的分离
溶菌酶是一存在于眼泪和蛋清中的酶。例如，从2,000只蛋中收集蛋清(约50升)，稀释在冰冷的蒸馏水中，达150升，所有操作在约4℃下进行。溶液过滤，并引入到具有三个流出口(加两个电极流出口)的4升连续聚焦器中。连续聚焦器开始时填充蒸馏水。流量调节到75ml/min，建立1,000V的DC电压，***最初的功率为1.5W。在加入了粗蛋清悬浮液后，功率升高到10.5W。连续聚焦器运行34小时。在最靠近阴电极的工作流出口收集40升这种材料，pH10.5，含有溶菌酶的浓度为200U/ml。这种悬浮液逐渐引入具有三个工作流出口和两个电极流出口的1升的连续聚焦器。蒸馏水的流量调节到10ml/min，1,000V/DC。最初的输出功率为1.6W，在添加了溶菌酶悬浮液后升高到5W。连续聚焦器运行3天。在pH10.5下从最靠近阴极的流出口收集流出物，分析结果是溶菌酶的活性为1,500U/ml。这一组分为12升，此后分四份引入到200×1500mm的色谱柱，柱中填有分子筛凝胶Spheron P-200，收集到25毫升组分。确定蛋白质含量和溶菌酶的活性。观察到五个蛋白质峰。第一个峰含有纯化的溶菌酶，其蛋白质裂解活性为20,000U/g。实施例4-α-淀粉酶的分离
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株在基础科学、医学和工业上具有重要性，由于几个实验室的共同努力，近来已对其整个基因组(genome)进行了测序(Nature 390，p237和p1249，1997)。这一形成孢子的革兰氏阳性菌的顺序提供了革兰氏阳性病原体对抗生素抗药性的线索，对几种在工业上使用的酶进行了编码。
在这一实施例中，枯草芽孢杆菌菌株A-200是在500L的发酵罐中在37℃下培养12小时得到的。当用光谱在550nm下测定得到的值＞0.5时，终止细菌的生长。经分离器从培养基中分离出细菌群。上清液引入10L的连续聚焦器，流量为250ml/min，施加的DC电压为350V。使用带三个工作流出口的连续聚焦器，在两个电极侧具有两个流出口，一个在设备的中间。电极流出口的流出液被丢弃掉，从中间流出口流出的溶液被引入5L的第二连续聚焦器。再使用带三个流出口的设备，纯化的α-淀粉酶从中间收集。流量调节到100ml/min，施加的DC电压为500V。中间流出口产生相对纯化的α-淀粉酶，淀粉水解活性为200U/g。实施例5-胰岛素的分离
在这一实施例中，将市售的胰岛素(NovoNordisk，DK)悬浮在蒸馏水中，浓度为1mg/ml。将3升这种悬浮液引入到1L的连续聚焦器中，该连续聚焦器具有五个流出口(两个电极流出口，三个用于收集工作溶液的流出口)。条件是：流量25ml/min，DC电压400V，功率8W的电流。连续聚焦器运行2小时。在靠近阳极的第一工作流出口，收集800ml纯化的胰岛素。对比PAGE分析显示，对于未处理的胰岛素制剂中，在12-8kB之间有四条泳道。在进行了连续聚焦后，相应于纯化的胰岛素，仅在10kB上观察到二条泳道。如果胰岛素需要进一步纯化，可以进行额外的凝胶色谱分离，使用100×500mm色谱柱，柱中填充Spheron P-20。纯化的胰岛素出现在第一蛋白质峰。实施例6-细胞溶素的纯化
工业级细胞溶素可以从不同的来源获得。可以用作使动物饲料升级的氨基酸原料。如果需要高纯度的细胞溶素，不得不使用多个复杂步骤，而使得最终产品更加昂贵。在这实施例中，用本发明来纯化细胞溶素。工业级的细胞溶素被稀释在蒸馏水中，浓度为3％。电导率为2,000μS/cm。将500升这种溶液引入到3L的连续聚焦器中，该连续聚焦器具有如实施例5设置的五个流出口。从第一流出口收集纯化的细胞溶素，其电导率约500μS/cm，细胞溶素的浓度＞15％。输入蛋白质的损失为约5-10％，但这包括来自原细菌发酵的杂质的损失。实施例7-威士忌酒的纯化
对于大多数酒精馏出物，需要一个或两个蒸馏步骤以除去各种不希望的杂质，如乙酸戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二烷酸乙酯，它们破坏了酒的味道。除去这些不希望组分仅可以通过额外的蒸馏来实现。本发明提供了一种成本有效的纯化方法。在这一实施例中，一种加拿大品牌的威士忌酒被引入到10L的连续聚焦器中。流量为1L/min，DC电压调节到1,000V，电流为10mA，功率为10W。使用三个工作流出口(两个电极流出口和一个在中间的流出口)。从所有流出口获得的威士忌酒经全体专家评判其颜色、气味和味道的差别，只有从第三个流出口收集的样品需要进一步蒸馏。另外两个样品被混合，改进了质量和味道。气相色谱分析说明各组分的变化如下：乙酸戊酯从0.04下降到0.01mg/100ml、己酸乙酯从0.05下降到0.02、辛酸乙酯从0.03下降到0.01、癸酸乙酯从0.025下降到0.001、十二烷酸乙酯从0.01下降到0.005mg/100ml。实施例8-伏特加酒的纯化
在这一实施例中，20升斯洛伐克和荷兰品牌的伏特加酒被引入3升的连续聚焦器中。流量为3L/hr，开始时的DC电压设定在275V，电流为80mA，功率为22W。由于从废物流出口除去了电解质，电导率下降。电源上升到750V，电流下降，功率为12-18W。两个工作流出口对应40％和60％的工作室。在两个工作流出口和废物流出口测定的酒精浓度均为41％。从靠近阴极侧的第一个工作流出口获得的伏特加味道“辛辣”，可以用作“清洗”酒精。第二工作流出口产生的伏特加味道“软(soft)”。多不饱和脂肪酸以及醛的浓度分别下降75％和80％。在1997年4月于瑞士日内瓦举办的第25届国际发明展览会上，该展品获得了金奖。
成对构造的连续聚焦器用于纯化伏特加的流量为5L/min，即7,200L/天。每天总共获得6,800升纯化的伏特加。在这一纯化过程中，多不饱和脂肪酸和醛的含量分别下降68％和88％。实施例9-葡萄酒的纯化
天然葡萄酒含有高浓度的酸性组分。此外，由于过度发酵质量可能变差，或者残留的酵母产品可能引起变坏。使用常用的方法很难除去酸性特征和人为的(artificial)味道。本发明提供了一种在本实施例中展示的改进葡萄酒质量的技术方案：50升带酸味的Tocai葡萄酒，其pH为3.8，被引入到10升的连续聚焦器中，流量调节到200ml/min，在电极间建立250V的DC电压。该设备具有三个工作流出口，包括两个废物流出口。分离进行4小时。流出物由全体葡萄酒品尝专家评判其颜色、气味和味道。从中间的工作流出口和阴极流出口收集到改善了的葡萄酒。样品被混合在一起，得到了改进质量的葡萄酒，pH为5.2。输入量的80％得到了回收。电导率从1,670μS/cm下降到1,200μS/cm，表明不希望的带电低分子被除去了。实施例10-饮用水的纯化
饮用水的纯化和生产取决于水的供应源。最后一个纯化步骤通常是花费最大或最困难的。通过吸附过滤可以除去细菌污染，但化学污染物更难处理，如亚硝酸盐、硝酸盐以及各种金属会产生更大的问题。
本发明提供了一种在相对小的规模上纯化水的工具，如以最小的能量和设备成本用于家庭、车队、农场和工厂。本发明设备能处理的最高盐浓度约为900-1,200mg/L。因此，不能用这种连续聚焦器进行海水脱盐。内部体积为1升的设备，最大生产能力为约150L/天。如果5个设备平行设置，能纯化水约750L/天。
在这一实施例中，向带有一个工作流出口和两个靠近电极的流出口的10L连续聚焦器中引入1L/min的流量。DC电源调节到100V和一个电流值，使功率为25W。分析表明，中间流出口产生纯化的饮用水，而电极流出口的流出物含有大量不希望的离子和元素。水的体积损失为15-20％。这一实验的分析结果如下：
组分  前     后        组分   前    后
铜    8.7    1.6       锌     71.0  12.4
铁    12.3   1.2       砷     0.12  0.04
镍    0.05   痕量      铅     0.71  0.05
铬    3.14   0.8       镉     痕量  无
汞    0.05   痕量
从中间工作流出口获得的饮用水的质量可以通过调节电压、功率和/或流量来调整。室体积或设备的数量可以根据所需条件来布置，例如，对有200头家畜的使用深井饮用水的农场，家畜需要约40,000L/天，或40,000∶24∶60＝28L/min的流量。因此，需要六个10升的连续聚焦器，其流量为5L/min。实施例11-免疫球蛋白的分离
11a.小鼠：在这一实施例中，我们使用300ml用兔IgG(Sevac，Prague)免疫的小鼠的血清库。这一血清用冰冷的蒸馏水按1∶3的比例稀释，1,200ml的这种溶液用于1L的连续聚焦器，该连续聚焦器具有五个预定的流出口。连续聚焦器开始时填充蒸馏水。流量调节到8ml/min，DC电压1,000V，***起始的输出功率为1.6W。在加入了血清后，由于电导率的升高，功率提高到5W。连续聚焦进行约3小时。通过免疫电泳对五个流出口进行免疫球蛋白测试。在阳极侧第二流出口处检测到免疫球蛋白，pH在4至6之间。当用抗兔IgG的抗血清进行被动血凝试验时，这一流出口的抗IgG滴度为1∶128。将180毫升的这一材料引入色谱柱，柱中填充Spheron P-200，用蒸馏水保持平衡。收集10毫升组分，检测免疫球蛋白的存在。证明有四个蛋白质峰。在第一峰中存在半纯化的免疫球蛋白，其浓度为0.5mg/ml。被动血凝试验所得到的结果是抗IgG滴度为1∶1024。收集该峰的所有这些样品，用冷冻干燥进一步浓缩。
11b.人：在这一实施例中，纯化具有抗乙肝病毒抗原(HBsAg)抗体的人血清库。用蒸馏水将2升血清稀释到8升，即稀释因子为1∶4，用尿素饱和到8M；加入0.1％的乙二醛。最后体积为10升，引入具有四个流出口的1升的连续聚焦器中。将流量调节到0.25L/小时，起始的DC输出功率是10W。在加入血清后，功率升高到14W。连续聚焦器运行5小时。从阳极侧第二个流出口收集蛋白质主体，8mg/ml，包括特异抗体，pH为5.6。总共收集2升。在血凝试验中，抗HBsAg免疫球蛋白的滴度为1∶512。HBsAg抗体可以按如下所述进一步通过凝胶色谱来纯化：半纯化的血清样品分成五份，每份400毫升，每一份都引入单独的色谱柱，柱中填充Spheron P-200。获得四个蛋白质峰。第一峰含有特定抗体。从五个凝胶色谱分离过程中收集所有的特定抗体，并稀释在总体积为4,500毫升的蒸馏水中。然后重复上述连续聚焦。从中间的两个流出口收集HBsAg抗体，其pH分别为5.1和5.4。
本发明可有效地制备针对由如酶、蛋白酶、毒素或病毒功细菌表面蛋白质诱导的光谱免疫应答的抗抗体。在免疫调节的网络理论(Jerne：Ann.Immunol.125：373-389)中，抗独特型抗体的模拟特性被描述为抗原的有功能的内部反映。采用本发明纯化免疫球蛋白组分的方法，我们已开始了中试研究，制备抗经典的猪瘟病毒—属于瘟病毒属(Pestivirus genus)—的疫苗。
11c.猪：在这一实施例中，使用以Chinese C毒株为基础的市售的猪瘟病毒(SFV)疫苗对五头体重100千克的猪进行免疫。在免疫五周后，杀掉猪并放血。在800rpm下离心获得10升血清。血清用蒸馏水稀释三倍，得30升，并用尿素饱和到8M；加入0.1％的乙二醛。这一材料引入到有五个流出口的2L连续聚焦器中。开始时的条件是：流量调节到100ml/min，DC电源为250V。连续聚焦运行5小时。从两个流出口，第一流出口pH4.5，第二流出口pH6.2，收集的样品中观察到特异的抗SFV抗体。使用SFV中和(VNT)试剂盒(Sevac，Prague)(因为这完全是未曾预料的观察，原始SFV疫苗经过了聚焦操作，也说明其中SFV疫苗包括两种SFV，可能包括SFV E2(gp55)和SFV ERNS表位，两者诱导中和抗SFV抗体。VNT表明两个病毒峰都是SFV特异的，没有观察到BVD病毒的污染)。因此获得了两种抗SFV血清组分(L)。这两种组分都冷冻干燥，然后稀释在含0.9％NaCl的蒸馏水中，使蛋白质浓度为3mg/ml，分别引入到填充了SpheronP-40的色谱柱，每个组分进行一次。pH6.2的组分产生一种VNT抗体滴度为1∶512的蛋白质组分。pH4.5的组分在通过凝胶色谱后产生了四个蛋白质组分。两个峰是SFV抗体阳性的，VNT抗体滴度为1∶64。三个单个的SFV抗体阳性组分和三个混合的SFV抗体阳体组分用于山羊免疫，以研究本发明是否能制备针对猪瘟的抗独特型疫苗。实施例12-新的抗大肠杆菌(E.Coli)感染的亚单位疫苗的制备
按现有技术，已开发了抗E.Coli的各种粘着因子的一系列疫苗。对于这些粘着因子，每一个都进行单独的发酵步骤。这一实施例描述了一种独特的多组分亚单位重组体疫苗，是针对牛、猪和绵羊的E.coli感染的，为此，仅需要一个细菌发酵步骤。第二个改进是按本发明的生产：遗传修饰的E.coli构造体是由携带K 88 ab抗原的E.coli菌株G-7(从Veterinary Faculty，University of Kosice，SK购得)；携带K 88 ac抗原的E.coli菌株U-200(State Veterinary UniversityMontevideo，Uruguary)；携带K-99抗原和携带Lt肠毒素抗原的E.coli菌株S-IH(CZ Collection of Microorganisims，Brno，SK)；和E.coli987-P菌株(Dr.Salajka，Ivanovice na Hane，CZ)制备的。使用限制性内切酶BglI、BglII和Pst，克隆编码质粒的抗原，经分析和制备PAGE，分离出20-90kDa的DNA链，并以各种组合经Lambda L4连接酶连接。通过电穿孔将这种构造体转染到无质粒的E.coli菌株H-110中。选择两种编码抗氯霉素和四环素的构建体，它们含有所有上述粘着因子和肠毒素。K88 ab、ac、K99、987/P和Lt肠毒素基因的整合和表达通过血凝测验检测。使用五十个顺序的细菌培养步骤以证明所有外源抗原的整合和表达的稳定性。修饰的E.coli菌株H-110在一个300L的发酵罐中培养。培养8小时后，收集细菌培养物，并在800rpm下离心。得到750g细菌沉淀物，这一材料在20L冰冷的蒸馏水中剪切表面蛋白质(菌毛)10分钟。第一次剪切后，溶液再在3,000rpm下离心，收集上清液。剩下的沉淀物稀释在冰冷的20L蒸馏水中，加入750g玻璃珠，并混合10分钟。表面蛋白质在九个流出口的连续聚焦器中进一步纯化，其中两个靠近电极，四个工作流出口，以及它们之间的三个废物流出口。连续聚焦器在75ml/min的流量、500VDC电压、14W、4℃的条件下运行9小时。从第2、4、6、8(工作)流出口流出的溶液，相应pH4.5-5.0、pH6.0-7.0、7.0-7.5、pH9.5-10.0，分别生产了纯化的组分，分别含有K 88 ab，ac；987-P；肠毒素LT；和K99抗原。由被动血凝试验测定其滴度，纯化的抗原可以被稀释5-10倍以达到1∶512的滴度。不需要浓缩步骤。制备包括0.5mg/ml的K 88 ab，ac，K99，987/P和LT肠毒素抗原的稳定油乳液。加入助剂(Spe-col，20％W/W，ID-DLO Institute，Lelystad，NL)和0.1％乙二醛。用这种新的重组体亚单位疫苗使离分娩还有五周的妊娠母牛接种，以获得被动免疫后代。观察到小牛的母体抗体滴度高于现有技术疫苗所观察到的2-3倍。观察到的由于E.coli腹泻和E.coli脓毒产生的损失较小(1.5％)。用致病E.coli菌株(2ml，含有109个细菌/ml)进行攻击实验，没有导致高的死亡率。这种疫苗特别适合于不能获得或不因其它原因不想使用抗生素的饲养业。实施例13-多核苷酸的纯化
现有技术中已经使用等电聚焦程序基于抗生素的抗药性来分离携带E.coli粘着因子的不均匀性DNA质粒，这种E.coli粘着因子是E.coli腹泻脓毒的一种病原体。在本实施例中，按Maniatis et al.Bacteriology(1982)标准方法，从E.coli菌株F 027(质粒RMS 151)、C 600(RSF 1010)和J 53(pSa)分离DNA质粒。用3％甘油的蒸馏水溶液以稀释DNA质粒。1升的每种质粒，含有约7μg的纯DNA/100ml，用于连续聚焦。使用具有9个工作流出口的0.5升的小连续聚焦器。流量为50ml/hr。对于每一质粒的制备，运行10小时。获得了如下结果：质粒RMS 151分离成两个组分，在第一和第三阳极流出口，pH分别为2.7和4.1。基于针对抗生素的抗药性，质粒DNA等电分离产生的组分具有不同的性质即：原始的质粒RNS 151对四环素和氨苄青霉素都有抗药性，而现在仅一个组分对四环素具有抗药性，另一组分仅对氨苄青霉素具有抗药性。质粒pSa被分离成三个组分，出现在第一、第二和第三个阳极流出口，pH分别为2.1、3.4和4.2。然而，质粒RFS 1010在连续聚焦后还保持均一性，仅从第二阳极流出口收集到一个具有四环素和氨苄青霉素抗药性的组分，pH为2.9。通过紫外光谱测定，质粒浓度升高到20-28μg DNA/100ml，是原始样品的4倍。对于RMS 151和pSa质粒的每一组分，也测得了类似的浓度。
本发明在纯化DNA上的优点是纯化的质粒是基于不同的pI值获得的，对抗生素具有不同的抗药性，同时达到了4倍的浓度。对大规模生产而言，两者都是很重要的。实施例14-四环素的纯化
现有等电聚焦方法用于纯化从Spofa CSFR(United Pharma-ceutical Works，CZ)购得的市售四环素制剂。四环素被分离成四个具有不同颜色和pH值的四个峰，在抗E.coli的抗生素抗药性实验中，一个组分表现出提高的杀菌活性，两个在抗链球菌(Streptococcus spp)中具有提高的杀菌活性。在pH6.8下收集的纯化样品具有94％的抑制作用，而原始四环素只有85％。在pH2.3下收集的一个组分含有白三烯，是具有三个共轭双键的花生四烯酸的一组具有生物活性的代谢产物，能引起毒性和变应性的反应。在使用本发明的生产过程中，这些多不饱和脂肪酸可以除去。
在本实施例中，200克同一品牌的市售四环素溶解在2升的含30％乙醇的蒸馏水中，并引入800毫升的具有8个工作流出口的连续聚焦器中。流量调节到40ml/min，DC电源的起始输出功率调节到4W。从奇数流出口中收集四个组分，即在pH2.2下得到棕色、在pH6.8下得到亮黄色、在pH7.9下得到橙黄色、在pH9.2下得到橙色组分。四个废物流出口位于其间。四个组分进行抗E.coli G7菌株和金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)，Cat，No.644 527(Czech Collection ofMicroorganisms)的杀菌实验。在圆片周围细菌充分生长的区域标记为“-”，有圆片大小的空白区域标记为“+”，在圆片大小两倍的区域没有细菌生长标记为“++”，更大的区域标记为“+++”。记录pH2.2、6.8、7.9和9.2的组分在抗两种菌株上的杀菌活性，从阳极侧记录分别为：“-”、“+++”、“++”和“+”。此结果说明，可以使用成对构造的连续聚焦器(2×25L体积)，其流量为2.5L/min(3600L/天)。每天可以从pH6.8的流出口得到360升纯化的四环素。中试研究可以确定是否可以获得类似的杀菌活性得以增强、毒素得以去除的其它抗生素产品。

Claims (20)

1.一种通过等电聚焦分离液体介质中的带电物质的连续流动设备，包括：分离室，一对放置在分离室中的其横截端部的垂直电极，位于室上部同一高度的两个或多个流出口，所述两个或多个流出口的每一个之间的至少在所述流出口高度上分割所述室的垂直壁，至少一个可渗透垂直间壁，其特征在于：该设备进一步包括用于将电极空间与所述液体室中央部分分开的、位于阴极附近的垂直阳离子选择膜和位于阳极附近的垂直阴离子选择膜，在每个电极空间内的位于所述室上部的辅助流出口。
2.权利要求1的连续流动等电聚焦设备，其中所述离子选择膜分别可以渗透低分子量阳离子和阴离子，对高分子量物质基本上是不可渗透的。
3.权利要求1或2的连续流动等电聚焦设备，其中所述可渗透垂直间壁被构造以防止水平扰动，如锯齿形壁或T形壁。
4.权利要求1-3中任何一项的连续流动等电聚焦设备，包括至少三个所述主流出口。
5.权利要求1-4中任何一项的连续流动等电聚焦设备，进一步包括基本上垂直于所述垂直壁的垂直交叉壁，在所述交叉壁的任一侧提供流出口。
6.一种从含水混合物中分离或纯化物质的方法，其特征在于使用权利要求1-5中任何一项的连续流动等电聚焦设备。
7.权利要求6的方法，其中维持含水混合物向上的单向流动。
8.权利要求7的方法，其中所述单向流动的流量为25-250L/L/天。
9.权利要求6-8中任何一项的方法，其中要分离的物质包括饮用水或其它含有或不含有酒精的饮料中的杂质。
10.权利要求6-8中任何一项的方法，其中所述物质是多核苷酸、氨基酸、肽、蛋白质，包括抗原和免疫球蛋白、酶、抗生素、变应素、生物碱、或来自细胞培养的组分。
11.权利要求6-8中任何一项的方法，其中所述物质是由微生物、陆生或海洋动物或植物或其一部分表达或提取的物质或其衍生物。
12.由权利要求10或11的方法获得的纯化物质。
13.含有由权利要求10或11的方法获得的抗原的疫苗或试剂盒。
14.一种从蚯蚓，特别是从物种赤子爱胜蚓，得到的纯化水解酶，相应于具有表1和/或2中的一个或多个特征的eisenase、fellulase、fetilase、fetipase、wormase，或其两种或多种的混合物。
15.权利要求14的酶或其混合物在补救土壤和土壤下层水、除去海水中的油泄漏、废水处理和清洗海船(油船)中的应用。
16.权利要求14的酶或其混合物在清洁屠宰场、挤奶机、(汽车)清洗机、浴室、地板、管道和设备中的应用。
17.权利要求14的酶或其混合物作为生长促进剂的应用。
18.权利要求14的酶或其混合物在气味处理或减少氨排放中的应用。
19.权利要求14的酶或其混合物在香波或牙膏中的应用。
20.权利要求14的fetilase作为酿造助剂的应用。
CNB988027151A 1997-02-20 1998-02-20 纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备 Expired - Fee Related CN1245246C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97200489 1997-02-20
EP97200489.9 1997-02-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1251538A true CN1251538A (zh) 2000-04-26
CN1245246C CN1245246C (zh) 2006-03-15

Family

ID=8228030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB988027151A Expired - Fee Related CN1245246C (zh) 1997-02-20 1998-02-20 纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6572751B1 (zh)
EP (1) EP0963237B1 (zh)
JP (1) JP2001513013A (zh)
KR (1) KR100493975B1 (zh)
CN (1) CN1245246C (zh)
AP (1) AP9901607A0 (zh)
AT (1) ATE241422T1 (zh)
AU (1) AU739328B2 (zh)
BR (1) BR9807579A (zh)
CA (1) CA2281867A1 (zh)
DE (1) DE69815069T2 (zh)
IL (1) IL131312A0 (zh)
OA (1) OA11147A (zh)
SK (1) SK110499A3 (zh)
WO (1) WO1998036821A1 (zh)
ZA (1) ZA981370B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102824854A (zh) * 2011-06-15 2012-12-19 杜权 一种电泳装置及其应用
CN104254390A (zh) * 2012-02-15 2014-12-31 生物辐射实验室股份有限公司 pH和离子强度的电子控制
CN104307367A (zh) * 2014-10-27 2015-01-28 上海交通大学 一种往复式自由流等电聚焦电泳装置及方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6638408B1 (en) * 2000-04-03 2003-10-28 The Wistar Institute Method and device for separation of charged molecules by solution isoelectric focusing
AUPQ697300A0 (en) 2000-04-18 2000-05-11 Life Therapeutics Limited Separation apparatus
ITRM20010070A1 (it) * 2001-02-12 2002-08-12 Ct Sviluppo E Applic Tita Nio Procedimento di evoluzione controllata di vini e relativo dispositivodi attuazione.
AU2003234885A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Picosep A/S Method and system for multi-stage isoelectric focussing
WO2008089120A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 Integrated Environmental Technologies, Ltd. Aqueous solution for managing microbes in oil and gas production and method for their production
US20080299624A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Edward Heslop Continuous fermentation apparatus and method
CA2749272A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Linde North America, Inc. Subcritical and supercritical fluid extraction of fat and drying residual solids for protein/carbohydrate content from food industry liquid or solid waste
US8012770B2 (en) 2009-07-31 2011-09-06 Invisible Sentinel, Inc. Device for detection of antigens and uses thereof
US9475049B2 (en) 2009-07-31 2016-10-25 Invisible Sentinel, Inc. Analyte detection devices, multiplex and tabletop devices for detection of analyte, and uses thereof
EP2486120B1 (en) 2009-10-09 2014-04-02 Invisible Sentinel, Inc. Device for detection of antigens and uses thereof
US9766207B2 (en) 2011-11-04 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity methods and compositions employing electronic control of pH
EP2773221B1 (en) 2011-11-04 2019-01-09 Bio-Rad Laboratories, Inc. Simultaneous purification of cell components
EP3578980B1 (en) 2012-03-09 2021-09-15 Invisible Sentinel, Inc. Methods and compositions for detecting multiple analytes with a single signal
US9321012B2 (en) 2012-04-04 2016-04-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Electronic protein fractionation
CN109260231B (zh) * 2017-07-18 2021-09-03 首都儿科研究所 一种蚯蚓中止咳祛痰抗炎抗微生物提取物的制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4465582A (en) * 1982-05-24 1984-08-14 Mcdonnell Douglas Corporation Continuous flow electrophoresis apparatus
GB8318754D0 (en) * 1983-07-11 1983-08-10 Fagerhol M K F Human proteins anti-sera test kits
GB8412207D0 (en) * 1984-05-12 1984-06-20 Wellcome Found Antigenic preparations
FR2568485B1 (fr) * 1984-08-06 1990-03-23 Rhone Poulenc Rech Appareil de fractionnement par electrophorese de solutions contenant des proteines, utilisable notamment pour le fractionnement du plasma humain
GB8706599D0 (en) * 1987-03-19 1987-04-23 Hoffmann La Roche Plasmodium falciparum merozoite antigen peptides
US4971616A (en) * 1987-04-08 1990-11-20 Glogowski Mark E Process for preparing organic compost from municipal refuse
US5160594A (en) * 1989-03-08 1992-11-03 Board Of Regents Of The University Of Texas System Apparatus and methods for isoelectric focusing of amphoteric substances incorporating ion selective membranes in electrode chambers
US5576026A (en) * 1994-09-30 1996-11-19 Charter; Edward A. Lumbricus product and method of making same

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102824854A (zh) * 2011-06-15 2012-12-19 杜权 一种电泳装置及其应用
CN104254390A (zh) * 2012-02-15 2014-12-31 生物辐射实验室股份有限公司 pH和离子强度的电子控制
CN104254390B (zh) * 2012-02-15 2017-05-10 生物辐射实验室股份有限公司 pH和离子强度的电子控制
CN104307367A (zh) * 2014-10-27 2015-01-28 上海交通大学 一种往复式自由流等电聚焦电泳装置及方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR9807579A (pt) 2000-03-21
OA11147A (en) 2003-04-22
AU6124498A (en) 1998-09-09
AP9901607A0 (en) 1999-09-30
EP0963237A1 (en) 1999-12-15
DE69815069D1 (de) 2003-07-03
KR100493975B1 (ko) 2005-06-10
SK110499A3 (en) 2000-05-16
ZA981370B (en) 1998-09-07
US20030206894A1 (en) 2003-11-06
ATE241422T1 (de) 2003-06-15
IL131312A0 (en) 2001-01-28
AU739328B2 (en) 2001-10-11
KR20000071204A (ko) 2000-11-25
DE69815069T2 (de) 2004-04-01
CA2281867A1 (en) 1998-08-27
US6572751B1 (en) 2003-06-03
CN1245246C (zh) 2006-03-15
JP2001513013A (ja) 2001-08-28
EP0963237B1 (en) 2003-05-28
WO1998036821A1 (en) 1998-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1245246C (zh) 纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备
Banin et al. Proline-rich peptide from the coral pathogen Vibrio shiloi that inhibits photosynthesis of zooxanthellae
CN104114710B (zh) 由枯草芽孢杆菌新菌株产生的生物表面活性剂、包含它的组合物、其获得方法及其用途
Olsen et al. Alternative routes for dissemination of Legionella pneumophila causing three outbreaks in Norway
ES2647771T3 (es) Fermentación en ecosistemas gestionados (FEG) con rumen y una fuente de nitrógeno
CN101489584B (zh) 重组减毒梭状芽孢杆菌生物体和疫苗
CN110282758A (zh) 一种利用复合微生物制剂处理高盐废水cod的方法及复合微生物制剂
CN101736062B (zh) 一种重组猪α干扰素标准品的制备方法
WO2017165290A1 (en) Apparatuses, systems, and methods for growing algae biomass
CN106519041A (zh) 猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2融合蛋白在CHO细胞株的构建方法及其制备方法和应用
Every Purification of pili from Bacteroides nodosus and an examination of their chemical, physical and serological properties
CN103074279B (zh) 一株类芽胞杆菌及其在降解微囊藻毒素中的应用
CN1199569C (zh) 一种双效工程菌生物杀虫剂及其生产方法
Habel et al. The genetic consequences of different dispersal behaviours in Lycaenid butterfly species
CN104387459A (zh) 一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法
CN101469314B (zh) 检测类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母及检测方法
SlEKEL et al. Mutagenic effects of two nitrofuran food preservatives
CN1198185A (zh) ***瘤趾皮炎的检测、预防和治疗
CN101426886A (zh) 恢复和再生烃燃料的装置和方法
Cummins Investigations on Gymnodinium breve toxins in shellfish
CN105349446B (zh) 降解黄曲霉毒素m1的短小芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白
CN101721686A (zh) 猪用干扰素-胸腺肽广谱抗病毒药物制剂及制备方法
Coombs et al. Australasia
CN103881986A (zh) 不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其编码基因与应用
Krishnamurthy et al. Patent Reports

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1030181

Country of ref document: HK

C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee