CN1199569C - 一种双效工程菌生物杀虫剂及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种经基因克隆的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)双效工程菌菌剂，以及双效工程菌生物杀虫剂的生产方法。本发明以苏云金杆菌4.0718菌株及苏云金杆菌类等亚种为宿主，经过可调控表达载体的构建，将带有强启动序列和含有domain II序列融合蛋白基因的蛛毒蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传，构建产生蛛毒蛋白和Bt毒蛋白的基因工程菌，经发酵生产制备双效生物杀虫剂；该菌剂效价在6000围际单位/μg以上，对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的幼虫杀虫率为90-96%，该菌剂为绿色农药，无残留，对人、畜安全，有利保护生态环境。

Description

一种双效工程菌生物杀虫剂及其生产方法

技术领域  本发明涉及一种经基因克隆的苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)双效工程菌，以及双效工程菌生物杀虫剂的生产方法。

背景技术  长期大量化学农药的使用，害虫抗性增强，造成生态环境的严重破坏，以及直接危害人类健康；同时出口农产品因残留农药问题而退货直接导致巨大的经济损失，1998年我国因农药残留问题损失达74亿美元。自八十年代以来，Bt作为农、林、卫生害虫杀虫剂的应用受到越来越多的重视，尤其是其具有杀虫毒性较强，杀虫谱较广、害虫难以产生抗性、残留期短，无公害，对人畜安全，易于工业化生产等重要特点，因此取得了重要的社会、经济、生态三大效益。但是，Bt杀虫剂仍然存在着一系列的问题：(1)杀虫谱相对较窄；(2)杀虫效果和速杀效果明显低于化学农药；(3)杀虫残效期短，因此在使用上存在着一定的局限性。

近年来，由于基因工程技术的快速发展，已有科学家采用基因工程的方法开辟新型生物杀虫剂领域。中国专利86108756公开了日本的前田进构建的一种包含2种核多角体病毒的DNA片断的重组病毒，由于两种病毒的寄主昆虫不同，因而由其生产的杀虫剂能扑灭和防治两种昆虫，扩大了杀虫谱。公告号为CN-1044298A的澳大利亚的M·E·H·豪登等申请的专利，是通过利用漏斗网蜘蛛毒素基因构建工程植物以控制害虫，取得了一定的效果。美国的迈克尔·J·阿丹在1989年采用在高表达的单子叶或双子叶植物蛋白质中优选的密码子，在植物中表达了Bt毒素，因此实现了植物直接抗虫的新方法，该方法的专利公告号为CN-1044298A。虽然在以昆虫杆状病毒作为杀虫基因载体和培育转基因植物等方面的研究工作比较广泛，但在应用上一直受其自身特点的限制。由于大多杆状病毒不能在短时间内表达足够量的外源蛋白，因此，使昆虫停止取食至少需2-3天，一般需要4～14天才能杀死宿主，而在这期间害虫的取食已给作物造成了显著危害。另外，杆状病毒的宿主范围相对狭窄，所以其应用受到相当的限制。因人们担心转基因食品的污染问题，转基因农产品在欧洲市场和日本、泰国等发达国家已由政府部门下令禁止销售和研究。目前转基因作物的生产与发展在全球范围内仍在激烈的争论之中，但绝大多数国家采取了抵制。以美国、加拿大等发达国家主张转基因食品研究，但实际上他们国内很少销售，主要用于销往第三世界国家。

Bt菌能产生晶体蛋白，对鳞翅目(Lepidopteran)、双翅目(dipteran)和鞘翅目(coleopteran)幼虫具有毒杀作用，该种晶体毒蛋白在幼虫肠道的碱性条件下降解成毒性核心片段，作用细胞膜上导致穿孔形成离子通道，引起害虫死亡。

虎纹毒素(Huwentoxin，简称HWTX)是从中国珍稀蜘蛛种虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia Huwena)的毒液中分离纯化的多肽类神经毒素，现已定名了两种毒素，即HWTX-I和HWTX-II。其氨基酸残基数分别为33和74。毒性实验表明，这两种毒素都能特异的阻断昆虫的由谷氨酸介导的神经—肌肉传导而引起麻痹、死亡。雷氏大疣蛛毒素(Raventoxin-I，Raventoxin-II)是从最近发现并定名的异仿蛛科大疣蛛属新种雷氏大疣蛛(Macrothele raveni)的粗毒中分离纯化的两类多肽神经毒素，氨基酸残基数目分别为43和33，对昆虫的神经活动具有强烈抑制作用，能导致死亡。美洲漏斗网蛛毒素(agatoxins)是从美洲漏斗网蛛(Agelenopsis aperta)毒腺中分离纯化的多肽类神经毒素。其中有一组毒素(u-agatoxins I-VI)，其包含了6种毒素，能引起昆虫不可逆的神经麻痹导致死亡。澳洲漏斗网蛛毒素(atracotoxins)是从澳大利亚的漏斗网蛛属(Atrax)的蜘蛛毒液中分离纯化的多肽类神经毒素，其中δ-ACTX-HVIa，Atracotoxin-HVIC，Omega-actx-hvla三类毒素对昆虫有特异的神经抑制作用。黑寡妇蜘蛛(Latrodectus Mactaustredisimguttatus)毒素家族中的昆虫特异神经毒素(α-Latroinsectotoxin，δ-Latroinsectotoxin)是从该种蜘蛛毒液中纯化的多肽神经毒素，能引起昆虫神经递质的大量释放而迅速麻痹、死亡。

发明内容  本发明旨在利用选育的苏云金杆菌高效杀虫新菌株4.0718(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki，国家菌种保藏号：CCTCCNO：M200016)及苏云金亚种(Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis)、库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)、蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp.galleriae)、武汉亚种(Bacillus thuringiensis subsp.wuhanensis)、中华亚种(Bacillusthuringiensis subsp.chinensis)作为受体菌，将上述多种蜘蛛的昆虫特异神经毒素基因以合适的载体克隆并实现高表达，构建出一株生产新型生物杀虫剂的新菌株，研制出超效、广谱、安全的杀虫剂，以克服Bt杀虫剂存在的问题和当前基因工程杀虫植物尚未解决的问题。

双效工程菌生物杀虫剂，是一种产生Bt毒蛋白和经基因克隆后产生蛛毒蛋白的苏云金杆菌工程菌制剂，该制剂的苏云金杆菌工程菌的活芽孢含量在80亿-100亿/ml，制剂的效价在6000国际单位/μg以上，制剂对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的幼虫杀虫率达90-96％。

双效工程菌生物杀虫剂的制备方法，由苏云金杆菌工程菌的构建与苏云金杆菌工程菌剂的生产两部分组成：

(1)苏云金杆菌双效工程菌的构建

①构建可调控表达载体

——受体菌为苏云金杆菌4.0718以及苏云金亚种、库斯塔克亚种、蜡螟亚种、武汉亚种与中华亚种。

——质粒pXLZ401构建，用Triton X-100温和法抽提菌株4.0718总质粒，在PstI/BamHI双酶切以后，得到4Kb左右的基因片段，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化，另用PstI/BamHI双酶切穿梭载体pHT3101，得到带有两个不同粘性末端的链状DNA，用碱性磷酸酶去磷酸化，将分离纯化的4Kb左右的基因片段与去磷酸化的载体pHT3101混合，用T₄DNA连接酶连接，产生质粒pXLZ401。

——ICPs基因强启动子及SD序列的获取，将质粒pXLZ401电转化一株无晶体突变株，通过红霉素平板筛选转化子，通过革兰氏染色镜检选择产生晶体的转化子，在LB培养基上活化、培养转化子，用TritonX-100提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化质粒pXLZ401，并用pstI/BamHI双酶切，双酶切后通过CsCl密度梯度离心，Glass-milk法获得带有完整的ICPs开放阅读框的片段，将片段测序后用计算机软件对序列进行分析，确定其启动序列及SD序列。

——质粒pXLZ402的构建，上述片段通过PCR扩增起始密码子ATG前的全长启动序列，并在5’端和3’端分别加上ECoRI、SalI位点，经纯化，用ECoRI/SalI双酶切，载体pHT3101同样用ECoRI/SalI双酶切，用碱性磷酸酶去磷酸化，两者混合，用T₄DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，形成质粒pXLZ402，转化E.coli DH_5α中扩增。

②蜘蛛特异昆虫神经毒素基因的化学合成及domain II序列的获取

——蛛毒基因的化学合成，依据蛛毒基因序列采用化学合成方法，合成毒素多肽全长基因，在基因的5’端和3’端分别带有ECoRI、XbaI位点，同时在3’端另加终止密码子TGA。

——ICPs中作用于昆虫中肠细胞膜受体的domain II序列的获取，在Gene Bank中查找已有的ICPs的domain II序列，通过序列分析软件，阵列比较保守区，并与测序片段比较，根据保守区确定其domain II边界，用化学合成和PCR方法获得domain II基因片段，分别在5′端和3′端带有SalI、ECoRI酶切位点，在5′端另加起始密码子ATG，通过PCR即可获得domain II区段。

——质粒pXLZ403的构建，用碱裂解法提取质粒pXLZ402，用SalI/XbaI双酶切后，用碱性磷酸酶去磷酸化，另将已获得的domain II序列用ECoRI酶切后，与化学合成的在5′端带有ECoRI位点的毒素基因混合，用T₄DNA连接酶连接，在连接片段纯化后，用XbaI酶切并与去磷酸化的链状质粒pXLZ402混合，用T₄DNA连接酶连接，形成质粒pXLZ403，转化无质粒突变株，通过红霉素平板选择转化子。

③将带有启动序列的融合蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传

——质粒pXLZ404的构建，将野生型转痤子Tn5401两端用核酸外切酶去除转座酶识别的边界，用酶切的方法删除转座酶，纯化剩余片段，用T4DNA连接酶连接，***到pHT3101中，形成质粒pXLZ404，转入E.coli DH_5α中扩增。

——质粒pXLZ405的构建，用TritonX-100温和法分别提取质粒pXLZ403、pXLZ404，分离纯化pXLZ403的重组片段，***到pXLZ404中删除了转座酶的位点上，用酶切去除质粒pXLZ404中的Bt复制子，产生质粒pXLZ405，电转化、基因枪或金属离子诱导法转化E.coli DH_5α中扩增，氨苄青霉素平板选择转化子。

——质粒pXLZ405整合到菌株4.0718的染色体上，将野生型转座子Tn5401转入苏云金杆菌4.0718的染色体上，产生新菌株，将质粒pXLZ405电转化新菌株，改造后的Tn5401及全长融合基因整合到已存在于染色体上的野生型转座子Tn5401中，用红霉素平板选择转化子。

(2)苏云菌杆菌工程菌剂的生产

①菌种活化，保藏的工程菌菌种经斜面培养后，转接于扁瓶培养基中，在28～35℃条件下，培养30～48h，配成孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种。

②种子罐发酵，将孢子液接入经灭菌并装有培养液的一级种子罐中，通入无菌空气培养，得到一级种子罐发酵菌液，按5％～8％接种量将一级种子发酵液接入二级种子罐培养液中，通入无菌空气和搅拌培养，得到二级种子罐发酵菌液。

③发酵罐培养，按5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中，在25℃～30℃温度条件下，通入无菌空气培养42-48h，

④浓缩，发酵罐发酵结束后，将菌液经超滤浓缩，补加增效添加剂，装瓶。

下在结合附图详述本发明。

图1质粒pHT3101结构图；

图2菌株4.0718质粒上ICPs基因强启动子及SD序列获取示意图；

图3蜘蛛毒素基因表达载体构建示意图；

图4融合蛋白整合到Bt菌染色体上示意图；

图5双效杀虫工程菌发酵生产工艺流程示意图；

(一)可调控表达载体的构建

1.受体菌株

本发明的受体菌株为选育的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki)高效杀虫新菌种Hu4.0718(国家菌种保藏号：CCTCC NO：M200016)，共带有6个大小不一的质粒，在其1～3号质粒上携带有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ax、cry1Cb、cry2Ac等基因，对鳞翅目和双翅目昆虫有很强的毒性。受体菌还有苏云金亚种(Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis)、库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)、蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp.galleriae)、武汉亚种(Bacillus thuringiensis subsp.wuhanensis)、中华亚种(Bacillusthuringiensis subsp.chinensis)。

2.菌株4.0718质粒上ICPs基因强启动子及SD序列的获取

图2是从菌株4.0718质粒上寻找ICPs基因强启动子及SD序列的示意图。通过TritonX-100温和法抽提菌株4.0718总质粒，在PstI/BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，对克隆的4Kb左右的基因片段进行分离纯化。pHT3101(结构见图1)是一种在Bt及E.coli都能复制的穿梭载体，携带有Bt、E.coli两种复制子，在Bt中表现红霉素抗性，在E.coli中表现氨苄青霉素抗性。用PstI/BamHI双酶切，得到带有两个不同粘性末端的链状DNA，用碱性磷酸酶去磷酸化，可防止其自身环化而增加工作难度，将上述4kb左右的片段与去磷酸化的载体混合，用T4DNA连接酶连接，产生质粒pXLZ401。电转化一株无晶体突变株，通过红霉素平板筛选转化子，同时通过显微镜观察检测出能产生棱形晶体的带有完整ICPs开放阅读框的转化子。在LB培养基斜面上活化转化子24h，接入LB液体培养基中，在30℃下，200rpm，培养18-24h，通过TritonX-100法提取质粒。在琼脂糖凝胶电泳后分离、纯化目的质粒。用PstI/BamHI双酶切质粒可获得带有完整ICPs开放阅读框的片段。将片段测序后用计算机软件对序列进行分析，确定其启动序列及SD序列。

3.质粒pXLZ402的构建

通过片段序列设计引物，在引物两端加入单克隆位点，使通过PCR扩增ATG前全长启动序列的上游带有ECoRI位点、下游带有SalI位点，将PCR产物纯化后用ECoRI/SalI双酶切，将载体pHT3101同样用ECoRI/SalI双酶切，并用碱性磷酸酶去磷酸化。把两者混合，用T₄DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，形成质粒pXLZ402，转化E.coli DH_5α中扩增。

(二)蜘蛛特异昆虫神经毒素基因的化学合成及domain II序列的获取

1.多种蜘蛛昆虫特异神经毒素的基因序列已知，依据蛛毒基因序列(见说明14页～23页)，采用化学合成方法合成毒素多肽全长基因，并使其在5′端带有EcoRI位点，3′端带有XbaI位点，同时在3′端另加有终止密码子TGA。

2.ICPs中作用于昆虫中肠细胞膜受体的domain II序列的获取

在Gene Bank中查找已有的ICPs的domain II序列，通过序列分析软件(如Jellyfish等)阵列比较保守区，并与测序片段比较，根据保守区确定其domain II边界。根据边界序列设计引物，在避免毒素片段***后发生移码突变的情况下，使扩增的domain II基因在5′端带有ATG，同时分别在5′端、3′端带有SalI、ECoRI酶切位点。通过PCR即可获得domain II区段。

3.质粒pXLZ403的构建

图3为蜘蛛毒素表达载体构建示意图，通过碱裂解法提取质粒pXLZ402，在SalI/XbaI双酶切后，用碱性磷酸酶去磷酸化；将通过PCR产生的domainII序列用ECoRI酶切后，与化学合成的在5′端带有ECoRI位点的毒素基因混合，用T₄DNA连接酶连接，在连接片段纯化后用XbaI酶切并与去磷酸化的链状质粒pXLZ402混合，用T₄DNA连接酶连接，形成质粒pXLZ403，转化无质粒突变株，通过红霉素平板选择转化子。

(三)杀虫功能验证

1.ELISA检测毒素基因的表达产物

将已纯化的目标蜘蛛毒素免疫兔子，获得抗体后与辣根过氧化物酶连接，形成酶联抗体；将培养的细菌用超声波处理后，将总蛋白电泳后转膜、用抗体杂交，洗脱、显色，确定是否有毒素表达。

2.验证毒素表达的正确性

通过HPIC纯化融合蛋白，C端测序可确定表达是否正确。

3.室内杀虫试验

(四)将带有启动序列的融合蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传

1.质粒pXLZ404的构建。

图4是将整个融合蛋白基因整合到染色体上的示意图。将野生型转痤子Tn5401两端通过核酸外切酶处理去除转座酶识别的边界，用酶切的方法删除转座酶，然后***pHT3101中，产生质粒pXLZ404，转入E.coli DH_5α中扩增。

2.质粒pXLZ405的构建

通过TritonX-100温和法提取质粒pXLZ403，将重组片段分离，纯化后***质粒pXLZ404中删除了转座酶的位点上，并用酶切去除质粒pXLZ404中的Bt复制子，产生质粒pXLZ405。

3.质粒pXLZ405整合到菌株4.0718的染色体上

野生型转座子转入Bt4.0718菌株的染色体上，将质粒pXLZ405电转化菌株4.0718，改造后的Tn5401及全长融合基因会整合到已存在于染色体上的野生型转座子Tn5401中，并失去转移能力，用红霉素平板选择转化子。

4.功能验证

通过southern杂交、ELISA确定克隆蛛毒基因存在于染色体上并能表达，杀虫试验确定工程菌株的杀虫效价。

(五)发酵生产

图5是双效杀虫工程菌发酵工艺流程示意图，主要包括菌种活化、一、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养。

1.菌种活化

将保藏的高效广谱杀虫工程菌划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟，接种后在28～35℃条件下培养30～48h，配成孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种。

2.种子罐发酵

先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液。

3.生产发酵罐培养

先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按5％～8％的按种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气。

4.浓缩

发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩、补加增效添加剂、随后装瓶，即可投放市场。

5.灭菌及培养条件

上述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5kg/cm2条件下灭菌30min，发酵罐接种后，在28～35℃条件下培养36～48小时，通气量1～2Vols/vol/min，氧气含量30～40％。种子罐培养液配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO₄·7H₂O0.01～0.06％，K₂HPO₄ 0.01％～0.06％，MnSO₄ 0.02％～0.08％，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后PH6.8～7.8。

发酵罐培养液配方：黄豆粉2～8％，玉米淀粉0.3～1.5％，NaOH 0.2～0.8％，在121℃水解20min后，过滤去除杂质，按体积补加葡萄糖1.3～2.0％，KH₂PO₄ 0.08～0.22％，K₂HPO₄ 0.10～2.2％，CaCO₃ 0.1～2.20％，FeSO₄·7H₂O0.001～0.005％，搅拌均匀，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5。

双效生物杀虫剂增效添加剂配方：茶皂素0.05～25％，二甲苯0.5～3％，山梨醇1～4％，吐温80 1～4％，甘油3～8％，蜂蜜3～8％。

6.发酵液要求

发酵液含活芽胞数每毫升达80亿以上，菌体量不足5％时放罐，pH值7.0-8.0，无杂菌污染。

本发明与现有的生物农药相比具有以下优点：

(1)杀虫效果好：由于工程菌株分别带有多种杀虫毒素Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ac、HWTX-I、HWTX-II、Raventoxin-I、Raventoxin-II、atracotoxin-HV1C、delta-atracotoxin-HV1、omego-actx-Hv1a、mu-agatoxinI～VI、Alpha-Latroinsectotoxin、delta-Latroinsectotoxin，除了自身的杀虫能力外还具有显著的正协同作用，能对害虫产生胃毒及触杀双重效果，因此杀虫效价更高，效价能达到6000国际单位/μg以上，在应用上具有很强的竞争力。

(2)杀虫谱广：工程菌自身带有多种杀虫毒素，同时由于HWTX-I、HWTX-II等蛛毒基因与改造后的ICPs domain II区域以融合蛋白形式表达，使其可识别的范围增大，同时能对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多类害虫有效，因此在使用上防治面很广，成本相对较低。

(3)安全性更高：由于工程菌所携带的毒素均为天然毒素，容易为自然界中的微生物所降解和易受阳光紫外线破坏、不形成残留；同时，各种毒素对人、畜均无害。因此，在生态环境保护、出口创汇及促进人类健康等方面形成极大的优势。

具体实施方式：

下面以受体菌苏云金杆菌4.0718(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)为本发明的具体实施例。

1.活化培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，pH7.2-7.4。

2.保藏菌种于固体活化培养基上30℃静置培养24h，转接于液体活化培养基上，于30℃、200rpm，培养18～24h，于1.5ml Eppendorf管中离心收集3ml沉淀，用STE(50mmol/l Tris·Cl、50mmol/l NaCl、5mmol/l EDTA pH8.0)洗涤一次，加入100μl溶液I(10mg/ml溶菌酶、100μg/ml RNA酶)37℃温育60min，加入100μl溶液II(0.5％TritonX-100、50mol/l Tris·Cl、10mmol/l EDTA，0.1mg/ml proteinase K，pH8.0)40μl 5mol/l NaCl于37℃温育90min，用pH8.0饱和酚抽提两次，氯仿抽提两次，二倍体积的无水乙醇沉淀过夜，以14000rpm和在4℃下离心20min收集沉淀。将沉淀溶于TE(10mmol/l Tris·Cl、1mmol/l EDTA pH8.0)缓冲液。用PstI/BamHI各10U，缓冲液成分为20mMTris·Cl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mmol/L Dithiothreitol、100mM KCl，37℃温育1h，可得到适合克隆的4kb左右的DNA片段。

3.苏云金杆菌——大肠杆菌穿梭载体pHT3101，此质粒带有能在Bt及E.coli中复制的两套复制***，同时在Bt中表现红霉素抗性，在E.coli中表现氨苄青霉素抗性，作为本发明涉及基因的载体。

4.HWTX-I、HWTX-II、u-agatoxins，δ-Latroinsectotoxin、δ-AcTX-Hvla等都是从不同蜘蛛毒液中分离纯化的多肽类神经毒素，能引起神经递质的大量释放，导致昆虫迅速麻痹、死亡，其基因及氨基酸序列见说明书14页-23页。

5.将载体pHT3101用PstI/BamHI双酶切后，用酚∶氯仿抽提样品，用2倍体积的乙醇于10℃沉淀1h，14000rpm、4℃下离心25min回收DNA，用TE重溶DNA，加入1/10体积10×牛小肠碱性磷酸酶缓冲液(10mM ZnCl₂、10mM MgCl₂、100mMTris·Cl(pH8.0))和适量牛小肠碱性磷酸酶于37℃温育30min，然后在5mmol/LEDTA溶液(pH8.0)条件下65℃加热1h灭活磷酸酶。再用酚∶氯仿抽提，纯化去磷酸化的DNA。将去磷酸化的载体DNA与上述4Kb左右的片段等摩尔量混合，加水至7.5μl，45℃加温5min使重新退火的粘端解链，冷却至0℃，加入10×T₄DNAligase缓冲液1μl，T₄DNA ligase 0.1weiss单位，5mM ATP 1μl，于16℃温育1～4h，产生新的质粒pXLZ401，取1-2μl样品通过电转化(电场强度8.75KV/cm，电阻100Ω～200Ω，电容25μF和2×磷酸缓冲液)、基因枪或在36％PEG、50mM CaCl₂介导下通过金属离子诱导的方法转化Bt无晶体突变株或无质粒变变株，通过红霉素抗性平板(10μg/ml)选择转化子，并通过革兰氏染色镜检观察选择能产生晶体的转化子。

6.对能产生晶体的转化子按前面的方法培养并提取质粒，pstI/BamHI双酶切后通过CsCl密度梯度离心、Glass-milk法或在将总质粒通过琼脂糖凝胶电泳后，切下目的带，重新在核酸电泳回收仪上电泳，以获得目的片段并将其纯化。将该片段测序后，用计算机软件(如Jelly-fish)对序列进行分析，找到其启动序列及SD序列，并通过PCR方法扩增起始密码子ATG前的全长启动序列，并在5′端、3′端分别加上ECoRI、SalI识别位点，按前面描述的DNA连接方法***到pHT3101的多克隆位点中，形成质粒pXLZ402。用电转化、基因枪或金属离子诱导法转化E.Coli DH5α，通过氨苄青霉素(50μg/ml)平板选择转化子。

7.依据蛛毒基因序列分别采用化学合成的方法分别合成互补单链，互补单链退火后在基因的5′端、3′端分别带有ECoRI、XbaI粘性末端，3′端另加有终止子TGA。通过利用GeneBanK中现有的ICPs基因数据，结合其空间构象及结构域的功能，采用计算机阵列技术查找ICPs的domain II区域中较为保守序列，与测序片段比较，根据保守区确定其domain II边界，采用化学合成或PCR的方法获得domain II基因片段，并分别在片段的5′端、3′端加有SalI、EcoRI识别位点，在5′端另加有起始密码子ATG(位于SalI位点下游)。

8.将上述的蛛毒基因片段与domain II片段按前面描述的DNA连接方法连接后，并使用同样的方法***到质粒pXLZ402的启动序列下，形成质粒pXLZ403，电转化、基因枪或金属离子诱导的方法转化Bt无质粒突变株，通过红霉素抗性选择转化子。

9.75μl溶于碳酸盐缓冲液中的未知抗原溶液加入到微孔板的4个孔中，4℃过夜或37℃3h；倒置微孔板，将里面的水倒尽，在每孔中加200μl PBS-吐温-20，稍后将PBS-吐温-20倾倒干净，如此重复三次。在微孔板中每孔加200μl封闭液(含有2％小牛血清的碳酸盐缓冲液或5％奶粉溶液)，37℃孵育30min。同上步一样洗涤微孔板，在每孔中加入75μl适当稀释的蜘蛛毒素抗体，37℃孵育30min，同上步一样洗涤微孔板，在每孔中加入100μl适当稀释的第二抗体。第二抗体为用辣根过氧化物酶标记的羊抗免疫球蛋白G抗体，37℃温育30min。同上步一样洗涤微孔板，在每孔中加入100μl酶底物，盖上微孔板，轻摇15min，这时可见孔中显示一定颜色，每孔中加入50μl终止液停止反应，阳性对照孔颜色反应为绿色。通过高效液相色谱仪(HPLC)纯化后，对C端测序检测表达的多肽氨基酸序列是否正确，室内杀虫试验检测表达的神经多肽的生物学活性。

10.将野生型转座子Tn5401用核酸外切酶去除边界，用在转座酶两端有识别位点的限制性内切酶切割，纯化去除转座酶的片段，将剩余片段用T₄DNA连接酶连接，***到pHT3101中，形成质粒pXLZ404，电转化、基因枪或金属离子诱导法转化E.coli DH5α中扩增，氨苄青霉素抗性选择转化子。

11.抽提质粒pXLZ403、pXLZ404，并通过CsCl密度梯度离心，Class-milk法或切胶后用核酸电泳回收仪分离、纯化质粒pXLZ403中的完整重组片段，将其***到质粒pXLZ404中原转座酶的位点上，并酶切去除载体上的Bt复制子形成质粒pXLZ405。电转化、基因枪或金属离子诱导法转化E.coli DH5α中扩增，氨苄青霉素抗性选择转化子。

12.将野生型转座子Tn5401转入Bt4.0718染色体上形成新菌株，抽提质粒pXLZ405，电转化、基因枪或金属离子诱导转化产生的新菌株，则改造后的Tn5401及全长重组片段会整合到存在于染色体上的野生型Tn5401中，并失去转移能力，用红霉素抗性选择转化子。

13.通过室内杀虫试验测试工程菌的杀虫毒力和杀虫谱，选取多个目的适龄幼虫，将经过不同稀释度的发酵液浸泡的植物叶片加入到9cm培养皿中，放入10条小菜蛾或棉铃虫幼虫，在30℃温度、85％湿度、一定光照条件下记录活虫率，检测其杀虫率及杀虫谱。

14.用15吨发酵罐生产菌剂10吨。将发酵罐先空罐消毒，装入培养液后实消。灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃、压力0.5kg/cm2条件下灭菌30min，种子罐、发酵罐培养液灭菌搅拌速度250rpm，然后保压降温至30℃。种子罐、发酵罐按5％的接种量接种后，以通气量2Vols/vol/min、氧气含量40％通入无菌空气进行发酵培养。

发酵罐培养液配方：黄豆粉6.6％，玉米淀粉0.825％，NaOH 0.5％，在121℃，水解20min后，过滤去除杂质。按体积补加葡萄糖1.65％，KH₂PO₄0.165％，K₂HPO₄ 0.165％，CaCO₃ 0.165％，FeSo₄.7H₂O0.0033％，搅拌均匀，pH值消毒前9.8，消毒后7.4。

种子培养基配方：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.3％，NaCl0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，K₂HPO₄ 0.03％，MnSO₄ 0.005％。消毒前pH7.5，消毒后pH7.3。

双效生物杀虫剂增效添加剂配方：茶皂素1～5％，二甲苯1％，山梨醇2％，吐温80 2％，甘油5％，蜂蜜5％。

保藏菌种于种子培养基固体斜面上30℃培养36h，用无菌水洗下，在先灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内打碎菌苔后按5％接入一级种子罐中，培养液为种子培养基。搅拌速度250rpm在30℃下培养8h后按5％的量接入二级种子罐。搅拌速度250rpm、30℃培养8h后按5％的接种量接入15吨生产发酵罐中，培养液为生产发酵培养液。搅拌速度250rpm、30℃培养42-48h，通气量2Vols/vol/min，氧气含量40％，在线检测。当菌体降解释放出芽孢和晶体，其培养液中菌体量不足5％时放罐，超滤浓缩、补加增效添加剂，制成制剂或制成干粉。用此方法生产Bt制剂，其发酵液晶体含量可达1.6g/l，蛛毒蛋白含量50～100mg/l。结合国内外微生物杀虫剂的质量标准，使生产菌剂的效价能达到6000国际单位/μg，没有残留污染，对鳞翅目，双翅目，鞘翅目主要害虫的杀虫率在3天内达到90～98％，在大田应用中残效期达15～20天，菌剂的活芽胞数达80～100亿/ml，浓缩液和粉剂的货架期分别为1～2年。生产的菌剂适当浓缩后用于大田试验，在经过一系列大田应用技术验证后，确定用于农作物、蔬菜、果树、森林和卫生害虫的防治。上市的农产品无菌剂残留，对人、畜无害，对生态环境无破坏，即可应用于生产。

来源于蜘蛛的多种昆虫特异神经毒素基因及氨基酸序列

虎纹捕鸟蛛神经毒素：

HWTX-I：5′GCT TGC AAA GGT GTT TTC GAC GCT TGC ACC CCG GGT AAAAAC GAG TGC TGC CCG AAC CGT GTT TGC TCT GAC AAA CAT AAA TGG TGC AAATGG AAA CTG 3′.

氨基酸序列：Ala cys lys Gly Val phe Asp Ala cys Thr pro Gly lysAsn Glu cys cys pro Asn Arg Val cys ser Asp lys His lys Trp cys lysTrp lys leu.

HWTX-II(a亚基)：5′CTG TTC GAG TGC TCT TTC TCT TGC GAG ATAGAG AAA GAG GGT GAC AAA CCG TGC AAA AAA AAA AAA TGC AAA GGT GGT TGGAAA TGC AAA TTC AAC ATG TGC GTT AAA GTT 3′

氨基酸序列：leu phe Glu cys ser phe ser cys Glu Ile Glu lys GluGly ASp lys pro cys lys lys lys lys cys lys Gly Gly Trp lys cys Lysphe Asn Met cys Val lys val

HWTX II(β亚基)：5′CTG TTC GAG TGC TCT TTC TCT TGC GAG CAG GAGAAA GAG GGT GAC AAA CCG TGC AAA AAA AAA AAA TGC AAA GGT GGT TGG AAATGC AAA TTC AAC ATG TGC GTT AAA GTT 3′

氨基酸序列：leu phe Glu cys ser phe ser cys Glu Gln Glu lys GluGly Asp lys pro cys lys lys lys lys cys lys Gly Gly Trp lys cys lysphe Asn met cys Val lys Val

雷氏大疣蛛毒素：

Raventoxin-I：cys gly thr asn arg ala trp Cys arg asn ala lysasp his cys cys cys gly tyr ser cys val lys gly ile trp ala ser lyslys glu asp asp gly tyr cys trp lys lys phe gly gly cys

基因序列：5′TGC GGT ACC AAC CGT GCT TGG TGC CGT AAC GCT AAA GACCAT TGC TGC TGC GGT TAC TCT TGC GTT AAA GGT ATC TGG GCT TCT AAA AAAGAG GAC GAC GGT TAC TGC TGG AAA AAA TTC GGT GGT TGC 3′

Raventoxin-II：icadeggpcvagigccaglrcsgailglagscq

基因序列：5′ATC TGC GCT GAG GAG GGT GGT CCG TGC GTT GCT GGT ATCGGT TGC TGC GCT GGT CTG CGT TGC TCT GGT GCT ATC CTG GGT CTG GCT GGTTCT TGC CAG 3′

澳洲漏斗网蛛昆虫神经毒素：

1.Atracotoxin-Hv1c：aictgadrpc aaccpccpgt sckaesngvs ycrkdep(氨基酸序列)

基因序列：5′GCT ATC TGC ACC GGT GCT GAC CGT CCG TGC GCT GCT TGCTGC CCG TGC TGC CCG GGT ACC TCT TGC AAA GCT GAG TCT AAC GGT GTT TCTTAC TGC CGT AAA GAC GAG CCG 3′

2.delta-atracotoxin-Hv1：cakkrnwcgk tedcccpmkc vyawyneqgscqstisalwk kc(氨基酸序列)

基因序列：5′TGC GCT AAA AAA CGT AAC TGG TGC GGT AAA ACC GAG GACTGC TGC TGC CCG ATG AAA TGC GTT TAC GCT TGG TAC AAC GAG CAG GGT TCTTGC CAG TCT ACC ATC TCT GCT CTG TGG AAA AAA TGC 3′

3.omega-actx-hv1a：sptcipsgqp cpynenccsq sctfkeneng ntvkrcd(氨基酸序列)

基因序列：5′TCT CCG ACC TGC ATC CCG TCT GGT CAG CCG TGC CCG TACAAC GAG AAC TGC TGC TCT CAG TCT TGC ACC TTC AAA GAG AAC GAG AAC GGTAAC ACC GTT AAA CGT TGC GAC 3′

美洲漏斗网蛛昆虫神经毒素：

1.mu-agatoxin I：ecvpenghcr dwydeccegf ycscrqppkc icrnnn(氨基酸序列)

基因序列：5′GAG TGC GTT CCG GAG AAC GGT CAT TGC CGT GAC TGG TACGAC GAG TGC TGC GAG GGT TTC TAC TGC TCT TGC CGT CAG CCG CCG AAA TGCATC TGC CGT AAC AAC AAC 3′

2.mu-agatoxin II：ecatknkrca dwagpwccdg lycscrsypg cmcrpss(氨基酸序列)

基因序列：5′GAG TGC GCT ACC AAA AAC AAA CGT TGC GCT GAC TGG GCTGGT CCG TGG TGC TGC GAC GGT CTG TAC TAC TCT TGC CGT TCT TAC CCG GGTTGC ATG TGC CGT CCG TCT TCT 3′

3.mu-agatoxin III：adcvgdgqrc adwagpyccs gyycscrsmp ycrcrsds(氨基酸序列)

基因序列：5′GCT GAC TGC GTT GGT GAC GGT CAG CGT TGC GCT GAC TGGGCT GGT CCG TAC TGC TGC TCT GGT TAC TAC TGC TCT TGC CGT TCT ATG CCGTAC TGC CGT TGC CGT TCT GAC TCT 3′

4.mu-agatoxin IV：acvgenqqca dwagphccdg yyctcryfpk cicrnnn(氨基酸序列)

基因序列：5′GCT TGC GTT GGT GAG AAC CAG CAG TGC GCT GAC TGG GCTGGT CCG CAT TGC TGC GAC GGT TAC TAC TGC ACC TGC CGT TAC TTC CCG AAATGC ATC TGC CGT AAC AAC AAC 3′

5.mu-agatoxin V：acvgenkqca dwagphccdg yyctcryfpk cicrnnn(氨基酸序列)

基因序列：5′GCT TGC GTT GGT GAG AAC AAA CAG TGC GCT GAC TGG GCTGGT CCG CAT TGC TGC GAC GGT TAC TAC TGC ACC TGC CGT TAC TTC CCG AAATGC ATC TGC CGT AAC AAC AAC 3′

6.mu-agatoxin VI：dcvgesqqca dwagphccdg yyctcryfpk cicvnnn(氨基酸序列)

基因序列：5′GAC TGC GTT GGT GAG TCT CAG CAG TGC GCT GAC TGG GCTGGT CCG CAT TGC TGC GAC GGT TAC TAC TGC ACC TGC CGT TAC TTC CCG AAATGC ATC TGC GTT AAC AAC AAC 3′

黑寡妇蜘蛛昆虫神经毒素：

1.Alpha-latroinsectotoxin：  acsspevsif hffvyagsfv knfkkmkgssaiskremsra dqckllayta vgyetvgnva adiasiegan lvaapvaagg hlgkgltdaamiamdcssip feeikeilnk efkemgrkld kntealehvs klvsktlstv ekirvemregfklvietien iatkeivfdi nkivqyfnne reninsrqke efvaklqepa pgnfllylrnsrtsesgtly sllfriidqe laipnnagdn naiqalyalf ygtetfisim fylvkqysylaeyhyqkgnl eefntnfdhm kivfqdfkfs liginqntkp lvdevlnvln nvknksfirnvqnklfydlm kqtesllelk keianmelpi idetprlsis isfkersddk pvdtpllkwdkgkevkyaiq feqdgkfski sswskpvtvq hlacpfisvd kdrrnrlifr qfgdqipelvgtlrgsqvef rdihrdlyna aqvpyareal sisrtliqng anvsetfelg rgaihaaasagnydvgelll nkdinlleka dkngytplhi aadsnkndfv mflignnadv nvrtksdlftplhlaarrdl tdvtqtlidi teidlnaqdk sgftplhlsi sstsetaail irntnavinikskvgltplh latlqnnlsv skllagkgay lndgdangmt plhyaamtgn lemvdfllnqqyininaatk ekkwtplhla ilfkkndvae rllsdenlni rletngginp lhlasatgnkqlviellakn advtrltskg fsalhlgiig kneeipfflv ekganvndkt nsgvtplhfaaglgkanifr lllsrgadik aedinsqmpi heavsnghle ivriliekdp slmnvknirneypfylavek rykdifdyfv skdanvnevd hngntllhlf sstgelevvq flmqnganfrlknnerktff dlaiengrln ivafaveknk vnlqaahrgk tilyhaicds akydkieivkyfieklnese cnplheaaay ahldlvkyfv qerginpaef neenqaspfc itihgapcgysldcdtpdrl evveylsdki pdingkcdvq entpitvaif ankvsilnyl vgigadpnqqvdgdpplyia arqgrfeivr clievhkvdi ntrnkerfta lhaaarndfm dvvkylvrqgadvnakgidd lrpidiagek akaylqssrf lrsghsfqsn eidsfgntih gismsartndkltqqisskg trsdsnsteg kmhsenvhvr sidvngalll ldfmirvfas kktnfapygsriktrsaaea qaealimter fenllsglig dpipdsidfs nvhskiykai msgrrsvisemlcsfaeeys klnhesikql lsefetlttt kaseihiees vpyapfeice lkvnsnvsqik

基因序列：5′     GCTTGCTCTT CACCAGAAGT AAGTATTTTT CATTTCTTTGTTTATGCAGG TAGCTTTGTG AAGAATTTTA AAAAAATGAA GGGAAGTAGC GCGATTTCTAAGAGAGAAAT GTCAAGAGCA GATCAGTGTA AGCTTCTTGC GTATACTGCT GTAGGATACGAAACGGTGGG CAACGTTGCA GCCGATATCG CTTCCATTGA GGGAGCGAAT CTGGTAGCCGCACCGGTTGC AGCTGGCGGT CACCTTGGCA AAGGTCTGAC TGACGCCGCA ATGATAGCCATGGATTGCTC TAGCATACCA TTTGAGGAAA TAAAAGAAAT CTTAAATAAA GAATTTAAAGAAATGGGTAG AAAACTCGAT AAGAACACCG AAGCCTTAGA ACACGTTTCT AAATTAGTCTCTAAAACATT GTCCACCGTC GAAAAGATTA GAGTTGAGAT GAGGGAAGGG TTTAAACTTGTTATCGAAAC AATTGAGAAC ATTGCAACAA AAGAAATAGT TTTTGATATT AATAAAATTGTTCAATACTT TAATAACGAA AGAGAAAATA TAAATTCTCG ACAAAAAGAA GAATTTGTTGCTAAACTGCA AGAACCAGCT CCTGGAAATT TTTTGCTCTA TTTAAGAAAT TCTAGAACTTCTGAAAGTGG CACTCTTTAT TCTTTACTAT TTAGAATTAT CGACCAAGAG TTGGCAATTCCAAATAATGC TGGGGATAAT AATGCAATTC AGGCTCTTTA CGCTCTGTTC TATGGTACTGAGACGTTCAT TTCTATCATG TTTTATTTAG TCAAGCAATA CTCGTATCTC GCAGAGTATCACTACCAAAA AGGTAATCTG GAGGAATTCA ATACAAATTT CGATCATATG AAAATAGTATTCCAAGATTT CAAATTCTCT CTTATTGGTA TTAACCAAAA CACGAAGCCT TTGGTGGATGAAGTCCTTAA TGTTTTAAAC AATGTAAAAA ATAAAAGCTT TATTAGAAAT GTCCAAAATAAATTGTTTTA TGACCTAATG AAACAAACTG AATCTTTGCT GGAACTCAAG AAAGAAATTGCGAATATGGA ACTGCCTATT ATAGATGAAA CTCCCAGATT ATCCATTTCT ATTTCTTTTAAAGAGAGAAG TGATGATAAG CCTGTTGATA CACCACTTTT AAAGTGGGAT AAGGGAAAGGAAGTAAAATA TGCTATACAA TTCGAGCAAG ATGGTAAGTT CTCTAAAATT AGCAGTTGGTCGAAACCGGT AACAGTGCAG CACTTAGCAT GCCCATTTAT TTCGGTAGAT AAAGATAGGAGAAACAGATT AATTTTTCGG CAATTTGGAG ACCAAATACC AGAGCTAGTG GGCACTCTGAGAGGTTCTCA GGTTGAATTT CGGGATATCC ATCGTGATCT GTACAATGCA GCGCAAGTTCCTTATGCGAG AGAAGCACTG AGTATCAGCC GAACGCTCAT ACAAAACGGT GCCAATGTGAGTGAAACATT CGAATTGGGC AGAGGAGCTA TTCACGCAGC TGCATCAGCT GGAAATTATGATGTTGGGGA ATTGCTTCTA AATAAAGACA TTAATTTGCT CGAAAAGGCT GATAAAAACGGTTACACTCC ACTTCACATA GCTGCTGATT CAAATAAGAA TGATTTCGTT ATGTTTCTAATCGGAAATAA TGCAGATGTT AATGTTCGAA CTAAATCAGA TTTATTTACT CCTTTACATTTAGCTGCACG GCGGGATTTA ACAGATGTTA CTCAAACATT GATTGATATC ACTGAAATAGACCTTAATGC GCAAGACAAA TCTGGATTCA CTCCATTGCA TCTCTCTATC TCTAGTACTTCTGAAACTGC TGCGATTCTC ATACGAAATA CAAACGCAGT AATAAACATA AAATCTAAGGTCGGATTAAC TCCTTTACAT CTGGCCACGC TTCAAAATAA CTTAAGCGTT TCCAAGTTATTAGCTGGTAA AGGAGCTTAT TTGAATGACG GCGATGCTAA TGGGATGACT CCTCTGCATTATGCAGCGAT GACGGGGAAT TTAGAAATGG TTGATTTTCT TCTTAACCAA CAGTACATAAATATTAATGC AGCTACGAAG GAGAAAAAAT GGACACCTTT GCATTTAGCC ATTCTGTTTAAAAAGAATGA TGTTGCGGAA AGGTTACTAA GTGATGAAAA TCTTAATATA CGCTTGGAAACCAATGGAGG TATTAATCCT TTGCATTTAG CTTCCGCAAC TGGAAATAAG CAATTAGTAATTGAATTATT AGCAAAGAAT GCGGATGTGA CCAGATTAAC ATCCAAAGGT TTTTCTGCCCTTCATTTGGG GATAATAGGT AAAAACGAGG AAATTCCATT CTTTCTGGTT GAAAAAGGAGCAAATGTTAA CGATAAAACT AACAGTGGAG TGACACCTTT ACATTTTGCA GCTGGGTTGGGAAAAGCCAA TATTTTCAGG CTACTGCTCA GCCGAGGAGC AGATATTAAA GCTGAAGATATAAATTCTCA AATGCCTATT CATGAAGCTG TATCGAATGG ACATCTAGAA ATTGTTAGAATACTCATTGA GAAAGATCCC TCCCTGATGA ACGTAAAAAA TATCAGGAAT GAATATCCCTTTTACCTAGC AGTGGAAAAA CGCTATAAGG ATATATTCGA TTACTTTGTA AGCAAAGATGCTAACGTAAA TGAGGTTGAT CATAACGGGA ACACACTTTT GCACTTATTT TCCAGTACAGGAGAACTTGA AGTTGTGCAG TTCTTAATGC AAAACGGCGC TAACTTTCGC CTTAAAAATAATGAAAGGAA GACCTTCTTC GATCTTGCTA TTGAAAATGG ACGCTTAAAC ATTGTGGCCTTTGCTGTAGA GAAAAACAAG GTGAATCTCC AAGCAGCCCA CAGAGGAAAA ACGATTCTGTATCATGCAAT TTGTGATTCT GCAAAATACG ACAAGATTGA AATTGTAAAA TATTTCATTGAAAAACTTAA TGAAAGTGAA TGCAATCCAT TGCATGAAGC CGCGGCTTAC GCGCATTTAGATTTAGTGAA ATACTTCGTT CAGGAAAGAG GAATAAATCC GGCAGAATTT AATGAGGAAAATCAAGCGTC TCCTTTCTGT ATCACTATAC ACGGGGCGCC ATGCGGATAT TCACTTGACTGTGATACGCC TGACCGGTTA GAAGTGGTTG AGTATCTCTC AGACAAAATA CCCGATATTAACGGAAAGTG TGATGTCCAG GAAAACACTC CAATAACCGT AGCCATATTT GCAAATAAAGTCAGCATTTT AAATTATTTA GTAGGGATCG GAGCTGATCC CAACCAACAA GTTGATGGAGATCCTCCTTT ATACATTGCG GCAAGGCAAG GACGTTTCGA AATTGTAAGA TGTTTGATAGAAGTGCATAA GGTCGACATA AATACTAGAA ATAAAGAGCG GTTTACGGCA CTACACGCTGCAGCCCGGAA CGATTTTATG GATGTAGTGA AATATCTCGT AAGGCAAGGG GCCGATGTCAATGCTAAAGG TATAGATGAT CTTAGGCCCA TCGACATTGC TGGAGAAAAA GCAAAAGCATACCTGCAATC GTCTCGTTTC CTTCGAAGCG GTCATTCTTT TCAATCAAAC GAAATCGATAGTTTTGGTAA TACGATACAC GGTATTTCTA TGTCAGCAAG GACAAATGAT AAATTAACTCAACAAATATC TTCTAAAGGA ACCAGATCGG ATTCTAATTC AACGGAAGGC AAAATGCATTCAGAAAACGT CCATGTCCGC AGCATTGACG TTAACGGAGC ACTTCTGCTA TTGGATTTTATGATTAGAGT TTTTGCGAGT AAGAAAACGA ATTTCGCCCC CTACGGCTCC AGAATAAAGACGCGCTCAGC TGCAGAAGCG CAGGCTGAAG CACTGATAAT GACAGAACGA TTCGAAAATCTTTTGAGTGG TTTGATTGGC GACCCGATTC CCGATTCTAT AGACTTTTCC AACGTTCATTCGAAGATATA CAAAGCCATT ATGAGTGGGA GACGAAGTGTAATATCAGAA ATGCTATGTT CCTTTGCAGA AGAGTATTCT AAACTGAATC ATGAAAGTATAAAACAGCTT CTATCAGAAT TCGAAACGCT CACTACTACT AAAGCATCCG AAATTCATATTGAAGAAAGT GTTCCTTATG CTCCTTTTGA AATATGTGAA TTAAAGGTTA ATTCGAATGTCTCACAAATC AAGTAATTAA AGAAAATGAA ATATATATGG ATTATCTTAT GAAGTAAGTATTGCATTTTA CCTATTAAGT TCACTCGAAA TTATTTATTT TATTTTGTTT AACTCATACGCTTAACGCAA TAATATAAAA TAGCTATTAA TTTATTATAA TACATAGTAA GTTTTATTTATCATTAAATG AAAAGGGGCA TTTTTCATTT AATGATAAAA TAATAATTCC ATCTCCATAGTGGTTTTTTT TTTTTTACCT AATTTAAATA GTTTGTAACA AGAGATTTAA TTTTCTAATGCATAATTAGA AACATAGGTT ATTGATTTAT TTCTTAATAA ATTAAAATTA AAATTTGCAACAAATTATTT TAATTGTTTA TTTTAAAGCT TTTTTTTTAT GCATTCCAAA TTCTCTGAAATTTTCGATGT TTGAAATTCT AAGTAAAAGC ACATTCAATA TAAATGTATT TAATTAAAATTTTGTTTTAA TACTTTTATT AAAATTCTGA ACTTGACCTA TGAATTGAAA TCGCAATTATATAACACATC ATATAAAAAA AATTATAAAT ATTATGATAT AAATATCTAA CCAAATTGCAAAGAGTGTAG TTCTTTAAAT AGAAAGAAAC AACTAAATTT ACTTTAAAGT GGAACAATTGCATTTATTTA AATAAAAAAA TGATTCCATA TGTAATTCCA GCTAACATTT GAAAACTTCTTAGTTTTAAT AAATTTTTTG CGTTTTCTTA AATTTCTAAA AGAATTGATT TTGTTAGAATTATCCTTTTA TTTTTGAGAA ATTTTTTTCA TTTTAACTTC TATTCTTTAA AATAGTACTGCAATGTATTT AATTTAATAT ATTTCATTTT TAACACAGTA CTTTTCTTAT TTCAAAACCTATCGATTTCT TAAGGCACTA AATGAAATTA TTGCTTAAAT CGATCATATG CATAGTTATATACTATGTTC TTCCTCCAAG TCTTT 3′

delta-latroinsectotoxin：    mhskelqtis aavarkavpn tmvirlkrdeedgemtleer qaqckaieys nsvfgmiadv andigsipvi gevvgivtap iaivshitsagldiastald cddipfdeik eileerfnei drkldkntaa leevsklvsk tfvtvektrnemnenfklvl etieskeiks ivfkindfkk ffekerqrik glpkdryvak lleqkgilgslkevrepsgn slssalnell dknnnyaipkvvddnkafqa lyalfygtqt yaavmfflleqhsyladyyy qkgddvnfna efnnvaiifd dfkssltggd dglidnviev lntvkalpfiknadsklyre lvtrtkalet lknqikttdl pliddipetl sqvnfpnden qlptpignwvdgvevryavq yeskgmyskf sewsepftvq gnacptikvr vdpkkrnrli frkfnsgkpqfagtmthsqtnfkdihrdlydaalninklkavdeattliekgadieakfdndrsamhavayrgnnkialrfllknqsidielkdkngftp lhiaaeagqa gfvkllinhg advnaktskt nltplhlatrsgfsktvrnl lespnikvnekeddgftplh tavmstymvv dallnhpdid knaqstsgltpfhlaiines qevaeslves nadlniqdvn hmapihfaas mgsikmlryl isikdkvsinsvtennnwtp lhfaiyfkkedaakellkqd dinltivadg nltvlhlavs tgqiniikellkrgsnieek tgegytslhi aamrkepeia vvliengadi earsadnltp lhsaakigrkstvlyllekg adigaktadgstalhlavsg rkmktvetll nkganlkeyd nnkylpihkaiinddldmvr lflekdpslk ddeteegrts imlivqklll elynyfinny aetldeealfnrldeqgkle            layifhnkegdakeavkpti             lvtiklmeyclkklreesgapegsfdspsskqcistfsed  emfrrtlpei  vketnsrylp lkgfsrslnkflpslkfaes knsyrsenfv snidsngall lldvfirkft nekynltgke avpyleakasslriaskfee lltevkgipa gelinmaevs snihkaiasg kpvskvlcsy ldtfselnsqqmeelvntyl stkpsvitsa sadyqklpnl ltatcleper maqlidvhqk mflr

基因序列：5′     GGTCAATTGA AACTTTATGA TAGGATTCAC TTTCTTATATAGAAATGCAT TCCAAAGAAT TACAAACTAT TTCAGCAGCG GTAGCACGAA AAGCAGTACCCAATACTATG GTTATTCGGT TGAAAAGAGA TGAAGAAGAT GGAGAAATGA CTCTAGAAGAAAGACAAGCA CAATGCAAAG CAATAGAGTA CAGCAATTCA GTTTTTGGGA TGATCGCTGATGTAGCTAAC GACATCGGTT CCATTCCTGT AATTGGCGAA GTAGTTGGCA TTGTAACTGCCCCAATTGCC ATCGTAAGTC ACATTACTAG CGCAGGCTTG GATATAGCTT CTACGGCATTAGATTGTGAT GATATACCTT TTGATGAGAT TAAGGAAATA TTAGAAGAAA GATTCAATGAAATAGATAGA AAGTTGGACA AGAACACAGC TGCTTTGGAA GAGGTCTCTA AACTGGTAAGTAAAACTTTT GTTACGGTGG AAAAAACAAG GAATGAAATG AACGAAAATT TTAAGCTTGTTTTGGAAACT ATAGAAAGCA AAGAAATAAA ATCAATTGTA TTCAAAATAA ATGATTTTAAAAAGTTTTTT GAAAAAGAAC GACAAAGAAT TAAAGGTTTG CCTAAAGATA GGTATGTTGCTAAGCTTCTA GAACAAAAAG GTATTTTAGG TTCTTTAAAA GAAGTAAGAG AACCATCTGGAAACAGTCTG AGCTCCGCGT TAAATGAACT CTTAGACAAA AACAACAACT ATGCCATCCCAAAAGTGGTT GATGATAATA AGGCCTTTCA GGCGCTGTAT GCTTTATTTT ATGGAACTGAGACTTATGCA GCCGTTATGT TTTTCTTACT CGAACAACAT TCTTATCTGG CTGATTATTATTACCAAAAA GGTGATGATG TAAATTTTAA TGCAGAATTT AATAATGTAG CAATTATTTTTGATGACTTT AAATCATCAC TAACAGGAGG AGATGACGGA TTAATAGATA ATGTCATTGAGGTTCTTAAC ACCGTGAAAG GATTACCATT TATAAAGAAC GCCGACAGTA AACTATACAGAGAATTAGTA ACTAGAACAA AAGCTTTAGA GACTCTTAAA AATCAAATCA AAACGACTGATTTGCCTCTT ATAGATGATA TACCCGAAAC TTTGTCTCAA GTGAAGTTTC CGAATGAGGAAAATCAATTG CCTACACCAA TAGGAAATTG GGTTGATGGC GTAGAAGTTA GGTACGCAGTACAGTATGAA AGTAAGGGCA TGTATTCGAA ATTCAGTGAA TGGTCTGAAC CATTTACTGTCCAAGGTAAC GCTTGTCCGA CTATAAAAGT TCGTGTTGAT CCGAAAAAGA GAAATAGACTTATCTTTAGG AAGTTCAACT CAGGAAAACC TCAGTTTGCT GGAACCATGA CTCATTCACAAACAAATTTT AAAGATATTC ATCGTGATCT ATACGATGCA GCCTTAAATA TTAATAAGTTGAAAGCAGTG GATGAAGCTA CAACTTTGAT TGAAAAGGGT GCAGACATAG AAGCAAAATTTGACAATGAC AGAAGTGCAA TGCACGCAGT TGCATATCGA GGAAATAACA AAATAGCCTTAAGATTTCTT TTGAAAAATC AATCCATTGA CATCGAGTTA AAAGATAAAA ACGGCTTTACTCCTCTACAC ATCGCAGCTG AAGCAGGTCA GGCAGGATTT GTTAAGTTAC TAATAAATCATGGAGCTGAT GTGAATGCAA AAACAAGTAA GACAAATTTG ACACCATTAC ATCTTGCAACACGTAGTGGA TTTTCAAAAA CTGTAAGAAA TTTACTAGAA AGCCCAAATA TTAAGGTAAATGAAAAGGAG GATGACGGAT TTACACCTTT GCATACTGCA GTAATGAGTA CTTATATGGTTGTCGATGCT TTGCTAAATC ATCCAGACAT TGATAAAAAT GCGCAGTCTA CGTCAGGATTGACTCCTTTC CATTTAGCAA TTATTAATGA AAGTCAAGAA GTTGCAGAAT CTTTAGTGGAAAGTAATGCT GATCTAAATA TTCAGGATGT TAACCATATG GCTCCTATTC ATTTTGCAGCTTCAATGGGT AGTATTAAAA TGCTTAGATA TCTCATTTCC ATAAAAGATA AAGTTAGTATTAATTCTGTG ACTGAGAATA ATAACTGGAC ACCTTTACAT TTTGCTATAT ATTTTAAAAAAGAAGATGCT GCAAAAGAAT TGTTGAAACA AGATGACATA AATTTAACAA TTGTTGCAGATGGTAATCTT ACCGTTTTAC ATCTTGCTGT TTCGACAGGA CAAATAAATA TAATTAAAGAATTATTGAAG AGAGGCTCCA ATATAGAAGA AAAAACTGGA GAAGGATATA CATCTCTCCACATCGCTGCG ATGCGAAAGG AGCCAGAGAT AGCTGTTGTT TTGATTGAAA ACGGTGCTGACATAGAAGCT CGATCAGCTG ATAATTTAAC ACCTTTACAT TCTGCCGCAA AAATAGGAAGGAAATCTACA GTACTTTACT TATTAGAAAA AGGAGCTGAC ATTGGAGCTA AAACAGCAGACGGTTCTACT GCCTTGCATT TAGCTGTATC TGGTCGTAAA ATGAAAACTG TTGAAACTCTATTAAATAAA GGAGCAAATT TAAAAGAATA CGATAACAAT AAATATTTGC CAATACATAAAGCTATTATT AATGATGACC TTGACATGGT ACGTTTGTTT CTTGAAAAAG ATCCCAGTCTCAAAGATGAT GAAACAGAAG AGGGTAGAAC TTCAATTATG TTAATTGTTC AGAAATTGCTTCTTGAATTA TATAACTATT TTATAAATAA TTATGCTGAA ACTTTGGATG AAGAAGCTTTATTCAACCGC TTAGATGAAC AAGGGAAATT AGAGCTTGCA TATATCTTCC ATAATAAAGAAGGTGATGCA AAAGAGGCTG TTAAGCCAAC TATCCTTGTT ACAATTAAAC TTATGGAATACTGCTTAAAA AAACTTCGCG AAGAGTCTGG AGCTCCTGAA GGTAGTTTCG ATTCTCCATCTTCAAAGCAA TGTATTTCTA CCTTTTCAGA GGATGAAATG TTTCGTCGTA CTTTACCGGAAATTGTAAAA GAAACGAACA GCAGATATTT ACCACTAAAG GGCTTTTCTC GCAGCCTAAATAAGTTTCTC CCTTCTCTAA AATTTGCCGA AAGTAAGAAT AGCTACAGAT CTGAAAATTTTGTTAGCAAT ATTGATTCCA ACGGAGCATT ACTTTTACTC GATGTATTTA TCAGAAAGTTTACTAATGAG AAATACAATT TGACTGGAAA AGAAGCTGTA CCCTATCTGG AAGCAAAGGCTTCATCATTA CGTATCGCTT CTAAATTTGA AGAACTTCTA ACTGAAGTTA AAGGTATTCCGGCTGGAGAG CTAATTAATA TGGCCGAAGT GAGTTCCAAC ATACATAAGG CAATTGCAAGTGGTAAGCCT GTATCAAAAG TCTTATGTTC GTATTTGGAT ACCTTTTCTG AATTAAATTCTCAACAAATG GAAGAATTAG TTAACACATA CTTATCCACC AAACCTTCTG TAATTACGTCAGCATCTGCA GATTACCAGA AACTTCCTAA TTTGTTAACT GCAACTTGCT TAGAACCAGAAAGAATGGCT CAACTTATAG ATGTGCATCA AAAGATGTTT TTACGTTAAA ATACCATTCCTTCTGTGTCA TCCATTGAGT ATATGGATTG GCTCTTTCTT TTATGCAAAT ATTTTTTCCACTTTAATGAT TTATTTCGGA TTGTGATTTT CTCACTTCTT TCTTGTTTAT TTCGTTGTTCTGTGCTTTTG AGTGAAATTA TCTGATAATC ATTTCTGAGT TAGTTTCTCT TCTAAGGAGTTTTAGGTATT TGGAATTACA TTAGTTTTGG TTTCGGGTTT TACTTCTATA TTTTGTCCAAAGTAATTTGT AGGAGGGAAT TTCTAAAAAG GAATGGAATC GTTGATAAAT AGTTTTGTATTATTGTACCT TTATAATAAT AAGACTTTAA AGTCAATTTT TTAAAACCAA GCATAAAGTATAGAAGGACT CGTATGTTAT ATAATGAAAT AATAAGTTGC CAAATGTCAT GGATTCAATCAAACAAATTT AAATAATTAA TAATGCAAAA ATTTTTTAAC TTTTTTAATG TTCTTAGTATATTAAGTCAA TAATTTAATA AATACTTTCT AGTTTAATTT TGCTATCTGC TATTACTCTAATTATCAAAC TAGTTATAAA TTCTAAATAT TCTCGTAACA TTATTTTAAA AGTGTAAATAGAGAGACTAT ATTTTTTAAT TATATCCATT TTTATATTGT TAATTTAATT CTTCAAAATTACATTCCTTT TCCTGCATTA TTATTTACAA TTCATTAAAT GCCTATATTT TAAAGACAATACTCAAGTTT CAGATTATTA TAAACAGTCT TATATTGATT CAACGTAAAA TTTTATTGACAATTGCAAAG AAATAATAAT TTAAAATTGT ATTTAAGTAT TTTGAAACAG TTTGATTTTTATTGCAATAT GAATCTAAAT TATTTTCAAA CAATGATAGA A 3′

Claims (3)

1.一种双效工程菌生物杀虫剂，其特征在于该生物杀虫剂是一种含有苏云金杆菌毒蛋白和经基因克隆后含有蛛毒蛋白的苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)工程菌制剂，该制剂的苏云金杆菌工程菌的活芽孢含量在80-100亿/ml，制剂的效价在6000国际单位/μg以上，制剂对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的幼虫杀虫率达90-96％。

2、按权利要求1所述的双效工程菌生物杀虫剂，其特征在于含有苏云金杆菌毒蛋白和蛛毒蛋白的苏云金杆菌工程菌携带的苏云金杆菌毒蛋白基因有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ax、cry1Cb与cry2Ac，苏云金杆菌工程菌携带的蛛毒蛋白基因有HWTX-I、HWTX-II中的α亚基、HWTX-II中的β亚基、Raventoxin-I、Raventoxin-II、Atracotoxin-Hvlc、delta-atracotoxin-Hvl、omega-actx-hvla、mu-agatoxin I～VI、Alpha-latroinsectotoxin与delta-latroinsectotoxin。

3、一种如权利要求1所述的双效工程菌生物杀虫剂的制备方法，其特征在于生物杀虫剂的制备由苏云金杆菌工程菌的构建与苏云金杆菌工程菌剂的生产两部分组成：

(1)苏云金杆菌双效工程菌的构建

①构建可调控表达载体

——受体菌为苏云金杆菌4.0718菌株以及苏云金亚种、库斯塔克亚

种、蜡螟亚种、武汉亚种与中华亚种，

——质粒pXLZ401构建，用Triton X-100温和法抽提苏云金杆菌4.0718总质粒，在Pst I/BamH I双酶切以后，得到4Kb左右的基因片段，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化，另用Pst I/BamH I双酶切穿梭载体pHT3101，得到带有两个不同粘性末端的链状DNA。用碱性磷酸酶去磷酸化，将分离纯化的4Kb左右的基因片段与去磷酸化的载体pHT3101混合，用T₄DNA连接酶连接，产生质粒pXLZ401，

——ICPs基因强启动子及SD序列的获取，电转化质粒pXLZ401的无晶体突变株，通过红霉素平板筛选转化子，通过革兰氏染色镜检选择产生晶体的转化子，在LB培养基上活化、培养转化子，用TritonX-100提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，用pst I/BamH I双酶切或双酶切后通过CsCl密度梯度离心，Glass-milk法获得带有完整的ICPS开放阅读框的片段，将片段测序后用计算机软件对序列进行分析，确定其启动序列及SD序列，

——质粒pXLZ402的构建，上述片段通过PCR扩增起始密码子ATG前的全长启动序列，并在5’端和3’端分别加上ECoR I、Sal I位点，经纯化，用ECoR I/Sal I双酶切。载体pHT3101同样用ECoRI/Sal I双酶切，用碱性磷酸酶去磷酸化，两者混合，用T₄DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，形成质粒pXLZ402，转化E.coli DH_5α中扩增；

②蜘蛛特异昆虫神经毒素基因的化学合成及domain II序列的获取

——蛛毒基因的化学合成，依据蛛毒基因序列采用化学合成方法，合成毒素多肽全长基因，在基因的5’端和3’端分别带有ECoR I、Xba I位点，同时在3’端另加终止密码子TGA，

——ICPs中作用于昆虫肠细胞膜受体的domain II序列的获取，在Gene Bank中查找已有的ICPs domain II序列。通过序列分析软件，阵列比较保守区，并与测序片段比较。根据保守区确定其domain II边界，用化学合成和PCR方法获得domain II基因片段，分别在5′端和3′端带有Sal I、ECoR I酶切位点，在5′端另加起始密码子ATG，通过PCR即可获得domainII区段，

——质粒pXLZ403的构建，用碱裂解法提取质粒pXLZ402，用Sal I/XbaI双酶切后，用碱性磷酸酶去磷酸化，另将已获得的domain II序列用EcoR I酶切后，与化学合成的在5′端带有EcoR I位点的毒素基因混合，用T₄ DNA连接酶连接，在连接片段纯化后，用Xba I酶切并与去磷酸化的链状质粒pXLZ402混合，用T₄ DNA连接酶连接，形成质粒pXLZ403，转化无质粒突变株，通过红霉素平板选择转化子；

③将带有启动序列的融合蛋白基因整合到苏云金杆菌DNA上稳定遗传

——质粒pXLZ404的构建，将野生型转座子Tn5401两端用核酸外切酶去除转座酶识别的边界，用酶切的方法删除转座酶，纯化剩余片段，用T₄ DNA连接酶连接，***到pHT3101中，形成质粒pXLZ404，转入E.coli DH_5α中扩增，

——质粒pXLZ405的构建，用Triton X-100温和法分别提取质粒pXLZ403、pXLZ404，分离纯化pXLZ403的重组片段，***到pXLZ404中删除了转座酶的位点上，用酶切去除质粒pXLZ404中的苏云金杆菌复制子，产生质粒pXLZ405。用电转化、基因枪或金属离子诱导法转化E.coli DH_5α中扩增，氨苄青霉素平板选择转化子，

——质粒pXLZ405整合到苏云金杆菌4.0718的染色体上，将野生型转座子Tn5401转入苏云金杆菌4.0718的染色体上，产生新菌株，将质粒pXLZ405电转化新菌株，改造后的Tn5401及全长融合基因整合到已存在于染色体上的野生型转座子Tn5401中，用红霉素平板选择转化子；

(2)苏云金杆菌工程菌剂的生产

①菌种活化，保藏的工程菌菌种经斜面培养后，转接于扁瓶培养基中，在28～35℃条件下，培养30～48h，配成孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种，

②种子罐发酵，将孢子液接入经灭菌并装有培养液的一级种子罐中，通入无菌空气培养，得到一级种子罐发酵菌液，按5％～8％接种量将一级种子发酵液转入二级种子罐培养液中，通入无菌空气和搅拌培养，得到二级种子罐发酵菌液，

③发酵罐培养，按5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液转入发酵罐中，在25℃～30℃温度条件下，通入无菌空气培养42～48h，

④浓缩，发酵罐发酵结束后，将菌液经超滤浓缩，补加增效添加剂，装瓶。

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