KR100493975B1

KR100493975B1 - 생물학적 물질을 정제시키기 위한 연속 유동 방식의 등전 집속방법 및 장치

Info

Publication number: KR100493975B1
Application number: KR10-1999-7007494A
Authority: KR
Inventors: 드뵈어게르벤호페; 소바오토
Original assignee: 세르베르스 엔터프라이즈 비.브이.
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2005-06-10
Also published as: SK110499A3; EP0963237A1; IL131312A0; CN1251538A; DE69815069T2; US20030206894A1; AU739328B2; KR20000071204A; BR9807579A; CN1245246C; ATE241422T1; ZA981370B; OA11147A; AU6124498A; WO1998036821A1; EP0963237B1; DE69815069D1; JP2001513013A; AP9901607A0; CA2281867A1

Abstract

본 발명은, 등전 집속 방식에 의해 용액 또는 현탁액으로부터 하전된 물질을 산업적 규모로 정제시키기 위한 연속 유동 장치 및 방법에 관한 것이다. 상기 장치는, 분리 챔버, 장치의 양끝에 배치된 한쌍의 수직형 전극(9), 양 전극(9) 부근에 위치하여 장치의 중앙부로부터 전극 공간을 분리시키는 음이온 또는 양이온 선택성 막(10), 챔버의 상부에서 액체 분획을 분리시키는 하나 이상의 제1 유출구(12), 각 전극 공간의 상부에 구비된 2개의 제2 유출구(11), 상기 각 유출구(11,12) 사이에 위치하여 적어도 상기 유출구(11,12)의 높이에서 상기 챔버를 분할하는 1개 이상의 수직벽(들)(6), 및 비대류식 상향 유동(convection-free upward flow)을 가능하게 하는 다수개의 수직형 투과성 격벽(13)을 포함한다. 본 발명의 장치는, 적당한 pH 구배를 이루는 데 있어 추가의 양쪽성 완충 용액을 사용할 필요가 없으며, 폴리뉴클레오티드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 유기 용매 및 음료의 정제에 사용할 수 있다.

Description

생물학적 물질을 정제시키기 위한 연속 유동 방식의 등전 집속 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR CONTINUOUS FLOW ISOELECTRIC FOCUSING FOR PURIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES}

본 발명은 하전된 물질의 농축 또는 분리를 위해 전기 전도성이 낮은 장(場; field)을 사용하는 기술, 즉 신규한 연속 유동 방식의 등전 집속법(연속 집속법) 및 장치(연속 집속기)에 의한 유기 물질 또는 생물학적 물질의 정제, 분리, 농축 및 분리에 관한 것이다. 본 발명에서는 적당한 pH 구배를 이루기 위해 원심 분리 단계, 여과 단계, 흡수 단계 또는 캐리어(carrier) 전해질 또는 양성(兩性) 전해질 완충제를 사용하지 않는다.

등전 집속법(Isoelectric focusing)은, 단백질 등의 하전된 양쪽성 분자가 특정 pH[소위 등전점(pI 값)]에서 0의 순전하를 갖는다는 이론을 이용하여 상기 양쪽성 분자를 함유한 혼합물로부터 이들 분자를 분리시키는 공지된 기술이다. 상기 화합물이 전기장에 가해져 분리되면 자체 등전점의 pH로 이동하게 된다.

정적 등전 집속 방법 및 장치는, 예를 들어 WO79/00942, EP-A-256552 및 미국 특허 제5,256,269호에 공지되어 있다. 이러한 유형의 기술이 가진 단점은, 정제량이 적고, 수거가 배치 방식으로 이루어진다는 점이다. 본 발명의 기술적 배경은, 전극 챔버 내에서 유체를 제어적으로 유동시키고, 이 전극 내의 유체 유동은 서로 병렬적으로 이루어지나 "작동" 챔버 내 유체의 유동과는 분리되는 미국 특허 제4,465,582호(1982)의 연속 유동 방식의 전기 영동 장치에 기재되어 있다.

미국 특허 제5,160,594호에는, 각 셀 내로 강제적 재순환시키는 방식, 즉 재순환 등전 집속 방식에 의한 등전 집속 장치가 개시되어 있다. 본 발명에서는 이러한 재순환 방식을 이용하지 않는다. 상기 '594호 특허에서는, 반정제된 양쪽성 물질과 미정제 양쪽성 물질이 혼합되는 것을 방지하기 위한 장치를 다수개 사용하였다. 옴 가열을 감소시키기 위해 각 셀을 추가로 냉각시켜 줘야 한다. 양전해질 또는 음전해질인 강산 및 강염기는 이온 선택성 막에 의해 전극 챔버에만 한정되어 애노드 하전된 이온 또는 캐쏘드 하전된 이온을 반발시켜 적당한 pH 구배를 형성시킨다. 미국 특허 제5,160,594호와는 달리, 본 발명에서는 다른 목적, 즉 전극 유출구로부터 폐기시키기 위해 전극 공간 쪽으로 저분자량 물질을 선택적으로 통과시키기 위한 목적으로 이온 선택성 막을 사용한다. 모든 종래 기술의 장치는, 전도성 및 완충 용량이 비교적 낮은 캐리어 양성 전해질을 작동 챔버에 사용해야 한다. 미국 특허 제5,160,594호의 전도성은 최대 600μS/cm로서, 본 발명의 전도성인 최대 5000 μS/cm보다 훨씬 작다. 미국 특허 제5,160,594호의 장치는 다른 종래 기술의 장치와 마찬가지로 산업적 규모로 정제시키도록 고안된 것이 아니며, 또한 이 특허는 정제시키고자 하는 물질을 언급하고 있지 않다.

캐리어 양성 전해질 완충제를 사용하지 않고 산업적 규모로 사용할 수 있는 연속 유동 방식의 등전 집속 방법 및 장치는 헝가리 특허 제210,584호(1992)에 개시되어 있다. 이 특허에는, 중력에 의해 챔버를 통해 최대 유출구 높이의 분리 챔버 내로 유입시키는 상향 유동 시스템이 기재되어 있다. 이 시스템은 2개의 비전도성 용액 챔버를 포함하는데, 이중 두번째 챔버는 2개 이상의 용액 유출구와, 제1 챔버로부터 제2 챔버의 바닥 내로 용액을 하향 유동시키기 위한 통로를 갖추고 있다. 제2 챔버 내에는 한쌍의 전극이 존재한다. 제2 챔버 내에는 인접하는 격벽 부재가 다수개 위치하며, 이 격벽 부재는 제2 챔버 전체에 걸쳐 연장되어 실질적으로 비대류 용액을 제공하고 수평 방향으로 전류 흐름 통로를 형성시킨다. 헝가리 특허 제210,584호의 단점은, 유입 용액 챔버 내에 자체적으로 구배가 형성될 수 있다는 점이다. 용액을 적하 방식으로 유입시키면 제어가 곤란하다. 헝가리 특허의 상향 유동 시스템은, 본 발명과 같이 자체 구배 형성 경향이 적긴 하나, 2개 챔버 시스템이 복잡하여 제조하기가 어렵다. 또한, 유기 용액의 분리가 전극에 근접한 제2 분리 챔버의 양측부에서 이루어진다. 무기 이온은 분리시키고자 하는 무기 또는 생물학적 물질의 단일 분획과 쉽게 혼합된다. 따라서, 2차 분리 단계를 종종 수행할 필요가 있다.

도 1은 본 발명의 장치의 사시도이다.

도 2는 본 발명의 장치의 정면 입면도이다.

도 3은 도 2의 라인 3-3을 따라 나타낸 본 발명의 장치의 수직 측단면도이다.

도 4는 트윈 배열의 본 발명의 장치를 도 2의 라인 3-3을 따라 나타낸 수직 측단면도이다.

도 5는 지그재그형 격벽을 갖춘 본 발명의 장치의 상부도이다.

도 6은 T형 격벽을 갖춘 본 발명의 장치의 상부도이다.

도 7은 트윈 배열의 본 발명의 장치에 대한 상부도이다.

도 8은 본 발명의 장치의 3가지 유형의 공간 격벽에 대한 상부도이다.

도 9는 4개의 격벽이 장착된 장치의 상부도이다.

도 10은 작동 상태의 본 발명의 폭 전체에 걸친 전도성을 나타낸 그래프이다.

도 11은 본 발명의 장치의 측면도이다.

바람직한 실시 형태에 대한 설명

〈연속 유동식 등전 집속 장치(연속 집속기)〉

이하에서는 도면을 참조하여 설명할 것이며, 도면 중 유사한 부분은 유사한 번호로 지칭하였다. 먼저 도 1 내지 도 11을 참조하면, 장치(1)는 말단벽(2), 바닥 패널(3), 전면벽(4) 및 후면벽(5)을 갖춘 통상 장방형의 전기 화학적 불활성 용기를 포함한다. 장치(1)는, 전극 공간 유출구를 제외한 각 유출구 사이의 후면벽(5)과 전면벽(4)에 수직 부착된 격벽(6)을 갖추고 있다. 이들 격벽은 바닥으로부터 이들 전체 높이의 1/3까지 다공성 물질로 제조되거나 또는 구멍이 뚫려 있다. 후면벽(5)은 그 하부에 하나의 유입구(7)가 있다. 패널(3)의 폭(W2)은 장치(1)의 폭(W1)보다 크다(도 2 참조). 양 전극(9)은, 이온 선택성 막, 즉 캐쏘드 부근의 음이온 선택성 막과 애노드 부근의 양이온 선택성 막의 격벽(10)에 의해 장치의 다른 부분과 분리된다. 전극 공간은 장치의 전극 유출구 상부에 존재하는 다른 작동 유출구(12)와 동일한 높이에 존재한다. 장치(1) 내 격벽(6) 사이의 공간은, 덜 바람직한 다수개의 C형 격벽(10), 또는 지그재그형의 천공형 격벽(13), 또는 다공성 물질로 제조된 다수개의 T형 격벽(6)에 의해 분할되며, 이들 격벽은 각각 1 cm, 0.5 mm 및 0.3 mm의 간격만큼 이격 배치되어 있다(도 8 참조).

도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 분리시키고자 하는 유기 물질 또는 생물학적 물질을 함유한 용액 공급원(전도성이 50 μS/cm 내지 5,000 μS/cm인 것이 바람직함)을 사용한다. 본 발명에서는 적당한 pH 구배를 이루기 위해 캐리어 양쪽 전해질을 사용하지 않는다. 공급원(14)의 유량은, 비전도성 물질로 제조된 적당한 밸브(15)로 제어할 수 있다. 작동 유출구(12)의 수는 이용하는 분리 공정의 특성에 따라 좌우된다. 분리된 용액은, 도 11에 도시된 바와 같이 각 유출구(11)로부터 적당한 용기(16) 내로 수거된다. 장치(1)는, 바닥 패널(3)의 외측 단부 상에 위치한 하나의 수평 조절 나사(8)를 갖추고 있는데, 이 나사(8)는 전면벽(4) 상의 유출구(12)의 수평 상태를 조절하기 위한 것이다.

장치(1)는, 말단벽(2) 부근에 위치한 한쌍의 이격된 전극(9)을 갖추고 있다. 전극(9)은 실질적으로 장치(1)의 바닥으로부터 상부 테두리까지 연장되며, 다수개의 보유 브라킷 등에 의한 삽입 및 제거가 용이하도록 설치한다. 캐쏘드 또는 애노드인 전극(9)의 끝부분에는 말단벽(2)의 상부에 위치한 전기 연결체 또는 플러그를 연결시켜, 도 2에 "P"로서 도시된 외부 전력 공급원과 전극(9)이 용이하게 접속되도록 도모한다. 전극(9)은 화학적으로 불활성이고, 또한 적용된 바이어스 조건 하에 동일한 용액 중에서 애노드 및 캐쏘드의 분리에 대해 안정한 것이 바람직하다. 이러한 목적에는 플라티늄 및 탄소가 만족스럽게 사용되어 왔다. 또한, 상기 장치벽은 화학적 및 전기적 불활성 물질(예, 테플론, 아크릴레이트, 세라믹 물질 또는 유리)로 제조하거나 또는 코팅하는 것이 바람직하다.

도 5 내지 도 8을 참조하면, 장치(1)는 투액성의 수직 C형, 지그재그형 또는 T형의 격벽 부재(13)를 다수개 갖추고 있는데, 이들 부재(13)는 상기 장치(1)의 바닥과 유출구(11,12) 높이 바로 아래 지점 사이에서 수직으로 연장되어 있고, 또한 전극 공간 내를 제외하고는 방수 처리된 격벽(6,10) 사이에 수평으로 연장되어 있다. C형 또는 지그재그형 격벽 부재(13)에는, 0.5∼1 mm의 직경을 가진 다수개의 구멍 또는 개구가 이들 부재(13)의 수직 방향을 따라 동일한 간격을 두고 배치되어 있다. T형 격벽 부재(13)는 약 50 ㎛의 다공성 물질로 제조된다. 수직 격벽(6)의 높이는 실질적으로 장치(1)와 동일하다.

전극 공간을 분할하는 격벽(10)은 방수 처리되며, 이 격벽(10)의 기능은, 저분자 음이온과 양이온이 작동 챔버로부터 이온 선택성 막을 통해 캐쏘드 공간 또는 애노드 공간으로 통과할 수 있게 하는 것이다. 격벽 하부의 소공은, 용액을 전극 공간을 통해 제한적으로 유통시켜 농축된 이온을 세출시킨다. 격벽(6)은 그 상부 1/3까지 방수 처리되어 있다. 이 격벽(6)의 기능은, 최종 단계, 즉 작동 유출구(12)를 통해 장치를 빠져나가기 전 단계에서 장치를 유통하는 중에 분리된 액체 분획을 양호하게 분리시키기 위한 목적과 장치의 구조적인 면에서 중요하다. 천공형 격벽 부재(13)는 다양한 용도를 갖는다. 첫째, 구멍 또는 개구가 유체를 장치(1) 전체에 걸쳐 수평으로 유동시킨다. 구멍의 제2 기능은, 전극(9) 사이에 전압을 가했을 때 전극(9) 사이에 다수개의 수평적 이온 전류 흐름 경로를 형성시키는 경로를 제공하는 것이다. 또한, 다수개의 T형 또는 지그재그형 격벽 부재(13)는, 도 3 내지 도 5에 도시된 바와 같이 장치(1) 내 수직적 유동 채널의 형성을 도모하여, 장치의 바닥으로부터 상부까지 상향으로의 연속적 층 흐름을 가능하게 해준다. 마지막으로, 격벽(13)은, 장치(1) 전체에 걸쳐 전극(9) 사이의 수평적 난류(亂流)와 대류를 억제시킨다.

도 9를 참조하면, 장치(1)는, 2개의 이웃하는 작동 유출구(12) 사이의 전면벽(4)과 후면벽(5)에 외측 테두리를 따라 접합되어 불투액성 밀봉체를 형성시키는 격벽(6)을 갖는다. 각 소챔버의 공간은 다수개의 격벽 부재(13)를 갖추고 있으며, 작동 유출구(12)와 부합되는 격벽(6)에 의해 분할된다. 작동 시에는, 분리시키고자 하는 물질을 함유한 혼합물을 증류수 중에 현탁시키거나 또는 용해시키고, 출발 물질 농축액은 50∼5,000 μS/cm의 전도성을 갖게 된다. 이후, 유입구(7)를 통해 장치(1)에 상기 용액 또는 현탁액을 유입시켜 장치(1)를 채운다. 장치(1)가 유출구(11,12) 바로 아래 높이까지 채워지면, 용액의 유입을 중단하고, 유출구(11,12)가 수평으로 정렬되도록 수평 조절 나사(8)를 조절한다. 이후, 전극(9)을 외부 전력 공급원(P)에 연결시키면, 전극(9)과 장치(1) 내 용액 사이에서 직류(DC) 전압의 강하가 이루어진다. 전극(9) 사이에는 전기적으로 낮은 전류가 흐르기 때문에, 용액의 성분들이 장치(1) 내로 수평적으로 흐르게 된다. 연속 집속 과정 동안, 상기 용액 중 분리시키고자 하는 성분들은 장치 전체에 걸쳐 수평 방향으로 pH 구배를 자동적으로 형성하는 한편, 출발 물질을 포함하는 각종 쯔비터 이온 성분들은 자체 pI 값 또는 등전점에 상응하는 pH를 가진 장치 내 위치로 이동 또는 집속된다. 강하게 분극화된 저분자량의 불순물들은 전극 공간 내에 집속되고, 전극 공간의 폐기물 유출구를 통해 장치로부터 제거된다. 이들 성분들이 분리되어 자체 pI에서 중화되면, 이들은 전기장에서 수평 방향으로는 부동 상태에 놓이게 되나, 수직 방향으로는 격벽(13) 사이의 유동 채널 내에서 여전히 장치(1)의 상부를 향해 상향 유동한다. 이들은 작동 유출구(12)를 통해 배출시켜 수거하거나 또는 폐기시킨다. 대안적으로, 상기 용액은 원료 용액, 용기(14) 내로, 또는 직렬 배열된 또다른 연속 집속기 내로 재순환시킬 수 있다. 장치(1)의 유출구(12) 수는 분리시키고자 하는 성분들의 수에 따라 좌우된다. 다른 등전점을 가진 다양한 성분들을 분리시키고자 하는 경우에는, 많은 수의 유출구를 사용할 수 있다. 다른 물질에 다양하게 사용되는 연속 집속기를 제조하기 위해, 장치(1)에 있어, 전면벽(4)의 내부에 부착된 슬라이딩 부재를 갖춘 몇개의 유출구(12)를 설치하여 이 유출구(12)를 통해 유출 통로를 개방 또는 폐쇄시킬 수 있도록 할 수도 있다.

대개, 1 분당 유량은 장치(1)의 챔버 용적의 1/10으로 유지시킨다. 이러한 유량과 장치(1)의 용적 사이의 관계는, 장치(1)의 폭은 일정하게 유지되는 상태에서 장치(1)의 높이가 증가함에 따라 용적이 증가한 장치(1)에 대해서도 그대로 적용된다. 전기장에서 하전 성분들의 수평 이동에 소요되는 시간은 동일하다. 따라서, 장치의 수직 높이를 증가시키면 유량이 증가할 수 있다. 성분들의 pI가 서로 근접한 경우에는, 이루고자 하는 pH 구배에 대한 분리도를 증가시킬 필요가 있다. 이는, 장치의 수평 길이를 보다 연장시킴으로써 성분의 수평 이동 시간을 연장시키고 유량을 보다 줄이면 달성된다.

유량의 상한치를 결정하는 또다른 인자는, 장치의 작동 공간 전체에 걸쳐 안정한 pH 구배가 설정되고 유지됐는 지의 여부이다. 상기 용액 내 양쪽성 불순물의 분자량이 목적하는 물질보다 훨씬 낮은 경우에는, 정제시키고자 하는 성분들의 통과 시간보다 짧은 시간 내에 pH 구배가 달성된다. 저분자량의 성분들은 보다 빠르게 이동한다. 또한, 극도의 pI 값(< pH 2, > pH 12)을 가진 성분들은 이온 선택성 막을 통해 전극 공간 내로 이동하여 폐기물 유출구를 통해 폐기된다. 이와 같이, 원래는 저분자량의 불순물에 의해 달성되었던 장치 내 pH 구배가 이후에는 고분자량의 성분들에 의해 유지된다.

도 10은 작동 중인 장치(1) 전체에 걸친 정지 상태의 전도성을 예시한 것으로서, 전도성이, 작동 공간 내에서 최저 수준이고 저분자량의 하전된 성분들이 농축되어 있는 전극 공간 내에서 최고 수준임을 보여준다. 이는, 중성액(예, 물, 음료 및 유기 용매)으로부터 불순물을 제거하는 데 있어 연속 집속기의 유용성을 입증해주는 것이다.

본 발명의 장치는 단순히 정적 전기장을 이용하는 것이며, 작동자의 연속적인 주의를 필요로 하는 전기 화학적 장치 또는 다른 장치가 존재하지 않기 때문에 수일동안 방치한 상태로 작동시킬 수 있다. 대부분의 집속 용도에 대한 최적의 작동 형태, 즉 최소의 옴 가열로도 신속한 분리가 가능한 작동 형태를 가능하게 하는 전력량은 3∼50 W이다.

지렁이 효소의 산업적 정제

본 발명은 캘리포니아 지렁이인 에이세니아 포에티다(Eisenia foetida; 이하, "이 포에티다"로 칭함) 등의 무척추 동물로부터 효소를 정제시키는 데 사용할 수 있으며, 이하에는 다수의 산업적 용도를 제시하였으나 이들에 국한되는 것은 아니다. 효소는 다음과 같이 제조한다. 농업적 잔류물, 음식물 및 배설물 상에서 지렁이를 증식시킨 후, 이 전체를 퇴적하여 생물학적 부식토 또는 벌레 배합토를 제조한다. 흡인제를 사용하여 생물학적 부식토로부터 벌레를 분리시키고, 이 벌레는 수돗물로 세정한 후, 용기 내에서 공기압을 이용한 급속 분해 또는 결빙 방식으로 분해시켜 증류수 중에 균질화시킨다. 원하는 효소를 보다 고농도로 얻어내기 위해 생존 번식을 통해 벌레군을 선별하였다.

유통 용량이 2.5 L/분(3,600 L/일)인 트윈 배열의 연속 집속기(2 X 25 L의 용적)를 사용하였다. 매일 4개의 작동 유출구(이들 유출구 사이에 폐기물 유출구가 존재함)로부터 총 2,000 L의 정제된 효소를 수거할 수 있다. 추가 정제를 위해 2차 연속 집속 과정을 수행한다. 이들 2회의 연속 집속 과정에 따른 단백질 산출 농도는 1 g/L이다. 최종 산출 농도가 약 1,200 L/일인 경우, 평균 효소 활성은 80∼170 U/ml이다. 이는, 세균 발효에 의한 유사 생성물의 효소 활성(0.001∼0.002 U/ml)과 좋은 대조를 이룬다. 25회 살론 인터내쇼날 데스 인벤션스(스위스, 제네바, 1997.4)에서는 지렁이 효소 정제용의 10 L 들이 연속 집속기가 금메달을 수상하였다.

본 발명은 전기 전도성 용액 중의 물질을 분리시키기 위한 연속 집속기(contifocuser)에 관한 것인데, 이 장치는 전기적으로 비전도성인 물질로 제조되고, 하나의 액체 유입구, 2개의 전극 공간 유출구, 1개 이상의 작용액 유출구, 및 상기 용액을 바닥으로부터 최대 상부 유출구까지 상향 유동시키기 위한 통로를 갖춘 벽돌형(brick-form) 분리 챔버(chamber)를 포함한다. 분리 챔버의 높이, 폭 및 깊이의 비는 예컨대 3:2:0.2일 수 있다. 분리 챔버의 양측 가장 협소한 벽을 따라 수직 위치로 한쌍의 전극이 배치되어 있다. 이들 전극은 외부 직류(DC) 전력 공급원과 연결될 수 있도록 되어 있다.

본 발명의 장치는 이온 선택성 막으로 제조된 2개의 격벽에 의해 3 부분으로 분할된다. 이들 격벽은 각각 장치의 양 단부로부터 약 1/25 내지 1/15 정도 떨어진 지점에서 전극 부근의 장치 양측에 수직 위치로 배치된다. 양 격벽은 장치 유입관의 1/2에 해당하는 직경을 가진 개구를 바닥에 갖추고 있다. 특히, 하나의 격벽은 애노드 공간을 둘러싸는 것으로서 양이온 선택성 막이고, 나머지는 음이온 선택성 막이다. 이온 선택성 막은, 양이온 또는 음이온이 폐기물 유출구에서 제거될 수 있도록 선택된 특이성을 가지고 있다.

양 단부에서, 폐기물 유출구는 장치의 상부 테두리로부터 1/40 내지 1/10 정도 떨어진 전극 부근에 위치한다. 정제시키고자 하는 물질을 회수하기 위한 작동 유출구는 중앙부의 동일한 높이에 위치한다. 연속 집속기는 3개 이상의 유출구를 포함하는 것이 유리하다. 전극 공간 내를 제외한 유출구 사이에는, 상부 1/4은 폐쇄되어 있고 바닥으로부터 전체 높이의 최대 3/4까지는 소공이 형성되어 있는 전기적으로 비전도성인 물질로 제조된 분할 격벽이 존재한다.

본 발명의 또 다른 특징으로서, 인접하는 교번 지그재그형(zigzag shaped) 또는 T형(T-shaped) 또는 다수개의 T형 격벽 부재 다수개가, 상기 장치에 있어 상기 격벽 사이의 나머지 공간(단, 전극 공간 내 제외)에 존재할 수도 있다. 또한, 이들 격벽은 전기적으로 비전도성인 물질로 제조되고, 양 방향으로 이온 및 분자를 투과시킬 수 있는 다공성 물질로 제조되거나 또는 천공형일 수 있으며, 바닥으로부터 작동 유출구의 최저 높이까지 챔버 전체에 걸쳐 연장되어 있다. 격벽은 장치의 전체 폭에 걸쳐 자유롭게 배치하며, 실질적으로 비대류 용액을 제공하면서 수평 방향으로 전해질 또는 양쪽성 입자의 비교란적(非攪亂的) 흐름을 제공하도록 서로 이격 배치한다. 천공형 막은 비교란적 수직 흐름을 제공하기 위해 이격 배치한다. 본 발명은, 최대 3,600 L/일의 지렁이 효소(헝가리 특허 제210,584호에 따른 종래 기술의 경우 280∼300 L)를 처리하여 정제된 효소를 80,000 내지 170,000 U/일(헝가리 특허 제210,584호의 경우 60,000 내지 70,000 U/일) 생성시킬 수 있다는 점에서 종래 기술의 장치에 비해 우수한 잇점을 갖는다.

본 발명의 또다른 잇점은, 종래 기술 장치의 경우 용액 또는 현탁액의 전도성이 50∼2000 μS/cm인 것에 비해, 용액 또는 현탁액의 전도성이 50∼5000 μS/cm일 수 있다는 점이다(미국 특허 제5,160,594호에서는 전도성이 최대 600 μS/cm임).

본 발명에서, 용액은 상기 장치의 화학적 불활성 통로를 관통하여, 양 전극 사이의 작동 공간으로부터 이격된 양 전극을 분리시키는 2개의 막 격벽 사이에 형성된 다수개의 수직 유동 경로를 통해 수직으로 상향 이동한다. 상기 용액의 소부분은 이들 격벽의 소공을 통해 수평으로 유동한다. 전극 사이에 바이어스 전압을 가하면 장치 전체에 걸쳐 전기 하전된 성분이 애노드 또는 캐쏘드 쪽을 향해 수평 방향으로 분리된다. 이들 하전된 성분은, 장치의 상부 부근에 위치한 유출구를 통해 배되어 수거된다. 저분자량의 하전된 성분(즉, 금속 및 이온) 소량은 전극 공간쪽으로 이동한다. 이들 성분은 폐기물 유출구를 통해 장치를 빠져나가고, 이로써 장치의 중앙부로 이동하는 고분자량의 물질로부터 분리된다.

본 발명에서, 목적 물질은 pI 값에 특징이 있는 1개 이상의 쯔비터(zwitter) 이온 종을 포함하는데, 상기 쯔비터 이온 종은 양쪽성 불순물에 의해 둘러싸여 있다. 바이어스 전위가 가해지면 상기 불순물에 의해 장치 전체에 걸쳐 pH 구배가 형성된다. pH 구배가 형성되면, 쯔비터 이온 종은 이들 종의 pI에 해당하는 pH를 가진 지점으로 이동하여 중화된다. 이후, 이들 물질은 장치 상부의 유출구를 향해 수직 방향으로 유동한다.

용량을 늘리기 위해, 2개의 연속 집속기를 트윈 배열로 서로 연결시킬 수 있으며, 이들 2개의 집속기는 방수 벽으로 분리시킨다. "트윈 집속기"는 장치의 양 단부에 공통의 전극 공간(2,4)을 가지며, 양 연속 집속 챔버에는 한쌍의 전극이 설치된다. 트윈 집속기는 장치의 중앙 바닥부에 공통의 유입구(7)를 가지며, 이곳으로 유입되는 유입물은 양 연속 집속기로 동등하게 나뉘어진다. 양 전극 공간으로부터 1개 또는 2개의 전극 유출구(11)가 배열될 수 있다. 트윈 집속기는 원래의 연속 집속기에서와 같이 양측에 작동 유출구(12)를 갖는다. 트윈 집속기는 2배의 유량과 2배의 분리 용량을 갖는 한편, 전기 에너지 필요량은 단지 1/3 정도만 증가한다.

본 발명은 산업적 규모로 생물학적 물질의 정제, 분리 및 농축시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 적당한 pH 구배를 형성시키기 위해 원심 분리 단계, 여과 단계, 흡수 단계 또는 추가의 캐리어 양성 전해질 완충제를 사용할 필요가 없다. 양 방향으로 입자들을 투과시킬 수 있는 여러 개의 분할 격벽 및 천공형 격벽은, 실질적 비대류 용액을 제공하면서 수직 방향의 비교란적 유체 흐름을 제공하기 위한 새로운 수단으로서 본 발명의 전체 폭에 걸쳐 수직으로 배치된다.

연속 집속기는, 예를 들어 플라스미드, 펩티드, 아미노산, 효소, 면역글로불린, 바이러스 또는 세균(아단위) 백신을 제조하기 위한 항원 또는 진단 시험 키트용 항원, 알레르겐(allergen)을 비용면에서 저렴하게 정제시키고, 세포 군 또는 우유계, 혈액계 또는 소변계 재조합 생성물을 분리시키기 위해 고안된 것이다. 연속 집속기는, 효모 또는 세균 발효 공정에 따른 불순물 또는 독성 물질, 항생 물질, 유기 용매, 식수 및 음료(beverage) 중의 불순물 또는 독성 물질을 제거하는 데에도 사용할 수 있다.

또한, 연속 집속기는, 미생물(예, 세균, 진균류, 효모, 조류 및 다른 단세포 또는 소세포 유기체), 동물(예, 포유 동물, 곤충, 무척추 동물) 또는 식물(예, 해초, 플랑크톤, 버섯, 이끼, 풀 및 이보다 고등 식물), 또는 이들의 일부 또는 유도체에 의해 형질 발현되거나 또는 이들로부터 추출된 생성물을 분리하거나 또는 정제시키는 데에도 사용할 수 있다. 그러한 생성물로는, 미생물의 발현 생성물, 형질전환(transgenic) 포유 동물(예, 소 및 돼지)에서 발생하여 이들 동물의 젖에서 의학적 생성물을 생성시키는 물질, 및 숲과 농장의 생산물에서 추출된 물질이 있다. 그 예로는 천연 색소, 살충제, 리그닌, 폴리올(예, 크실리톨), 탄수화물, 올리고당류 및 다당류(예, 크실란 및 미정질 셀룰로오스), 식이 섬유 및 다른 섬유, 당단백 및 지단백이 있다.

실시예 1 : 이 포에티다로부터 천연 효소를 분리하고 정제시키는 과정

정제된 비세균계 효소의 5개 새로운 종을 이 포에티다로부터 입수하였다. 이 실시예의 효소는 다음과 같이 제조하였다. 유전적으로 선별한 이 포에티다 균주 10 kg을 수거하였다. 이 균주를 -18℃에서 24 시간동안 결빙시킨 후 0.1%의 글리옥살을 함유한 빙수(4℃) 중에서 해동시켰다. 이 미정제 현탁액을 조금씩 고용량의 혼합기에서 혼합하고 100 L의 증류수 중에 균질화시켰다. 이 용액을 연속 유동식 원심 분리기에서 원심 분리시킨 후, 상등액을 2 L의 연속 집속기 내에 넣었다. 4개의 유출구를 갖춘 장치를 사용하였다. 250V DC, 80 mA의 전류 및 100 ml/분의 처음 유량의 조건을 설정하였다. 모든 조작은 4∼10℃에서 수행하였다. 연속 집속 과정은 16 시간동안 계속 수행하였다. 각각 등전점 8.3, 7.0, 6.5, 3.2 및 2.8에 상응하는 각 작동 유출구로부터 용액을 별도로 수거하였다. 분취적 SDS 전기 영동법으로 얻은 이들 각 활성 효소 분획은 미네랄 및 펩신에 의한 가수 분해 방식으로 가수 분해시키고, 아미노산 잔류물은 자동 아미노산 분석기로 분석하였다. 3개의 분석 자료를 산정하여, 아미노산의 평균 개수 및 함량을 계산하였다. 5개의 효소는 다음과 같으며, pI 값이 큰 순서대로 제시하였다.

에이제나아제(Eisenase)

단백질 분해 활성을 가지고, pI가 8.3이며, 적정 pH가 6.0이고, 분자량이 13.2 kDa이며, 아조카제인 분해 활성이 100∼120 U/mg(1 U(단위)는, 설파닐아미드-아조카제인을 가수 분해시켜(머크 카탈로그 p.142, 1992) 37℃ 및 pH 7.5에서 폴린-시오카토(Folin-Ciocatteau) 시약에 의해 1 분당 1.0 μM(=181 ㎍)과 동등한 색상을 발생시킴)인 염기성 효소 혼합물. 단백질 분해 활성의 척도인 아조카제인 분해 활성의 단위(U)는 370 nm에서 자외선 분광 분석계로 측정했을 때 1분당 아조카제인 1 μM을 분해시킬 수 있는 효소의 양으로도 정의된다{토마렐리 외 다수의 문헌 [J. Lab. Clin. Medicine 34, 428, 1949] 참조}. 이 효소를 "에이제나아제"로 칭하며, "국제 효소 분류 카탈로그"의 ECC 부 3.4.21.1, 3.4.21.4, 3.4.23.6, 3.4.21.14에 기재된 바와 같은 세린 및 금속에 의한 단백질 분해 활성을 가진 내부 펩티다아제와 외부 펩티다아제와의 혼합물로서의 특징을 갖는다. 이것은, 예를 들어 육류 포장용 및 국소적 피부 치료용의 천연 방부제로 사용될 수 있다.

펠룰라아제(Fellulase)

셀룰로오스 분해 활성 및 단백질 분해 활성을 가지고, pI가 7.0이며, 적정 pH가 5.9이고, 분자량이 약 54 kDa인 효소. 이 효소를 "펠룰라아제"로 칭하며, 이것의 특징은 ECC 부 3.2.1.4에 기재되어 있다. 셀룰로오스 분해 활성은 약 10∼20 U/mg(1 U는 pH 5.0 및 37℃에서 1 시간동안 셀룰로오스로부터 1.0 μM의 글루코즈를 유리시킴)이다. 펠룰라아제는 저산성 환경에서 셀룰로오스 분해 활성을 발휘한다.

5종 효소의 정제된 샘플을 이들의 기능적 및 물리적 단백질 특성 면에서 분석하고, 그 데이타를 하기 표 1a, 표 1b 및 표 2에 제시하였다.

이 포에티다 효소의 기능적 및 물리적 단백질 특성
	에이제나아제	펠룰라아제	페틸라아제	펩티파아제	워마아제
pI^a	8.3	7.0	6.5	3.2	2.8
적정 pH	6.0	5.9	7.2	4.6	3.6
≥50%의 pH범위^b	4.2∼8.1	4.4∼7.1	5.8∼8.6	3.6∼5.9	2.7∼5.3
적정 온도(℃)	50	45	60	50	50
≥50%의 온도 범위^b	25∼60	10∼55	30∼65	25∼60	5∼70
분자량 kDa(실측치)^c	17	67	36	18	31
분자량 kDa(이론치)^d	13.2	±54	±29	±14.5	±25
아미노산^e	110	446	240	120	205
염기성 아미노산 함량(%)	23	4	6	25	15
산성 아미노산 함량(%)	0	7	5	7	22
단백질 분해활성^f	+Ser, Asn	+	-^l	+/-	+Arg, Trp
α-전분 분해 활성^g	-^l	-	+	-	-
β-전분 분해 활성^h	-	-	+	-	-
셀룰로오스 분해 활성ⁱ	-	+	-	-	-
지방 분해 활성^j	-	-	-	+	-
미카엘리스(mM)^k	1.76	0.85	1.60	0.88	0.35

^a연속 집속 방식으로 결정한 등전점 ^b최대 활성의 ≥50% 활성을 제공하는 범위 ^cSDS-PAGE로부터 결정 ^d아미노산(비글리코실화된 아미노산) 함량으로부터 계산 ^e완전 가수 분해에 의해 결정된 총 분자량 ^f폴리세린, 폴리아르기닌, 폴리트립토판 및 폴리-Trp, Arg에 대한 활성으로 결정 ^g37℃ 및 pH 6.9에서 전분에 대한 활성으로 결정 ^h20℃ 및 pH 4.8에서 전분에 대한 활성으로 결정(분취적 SDS 전기영동법에 의한 본 연구에서는 하나의 효소적 활성 라인 중 α-아밀라아제만이 얻어졌음). β-아밀라아제의 손실은 SDS 중에서의 분해로 인한 것으로 추측된다. ⁱ셀룰로오스 아주어(머크)에 대한 활성으로 결정 {펀리, 엔에이치의 문헌 [Biochem.J., 87, 90(1963)] 참조}. ^j트리글리세라이드 제339호(머크)에 대한 활성으로 결정 ^k각각의 개별 효소의 특이적 기질에 대해 측정한 미카엘리스 상수 ^l효소 활성이 약 0.1 U임을 나타냄

이 포에티다 효소의 아미노산 조성(값±5%)
아미노산	에이제나아제	펠룰라아제	페틸라아제	펩티파아제	워마아제
아미노산의 수	110	240	446	120	205
Ala	4.46	12.3	15.8	2.6	3.3
β-알라닌	0	3.7	0.7	4.1	4.8
Arg	10.30	2.0	1.0	6.8	3.2
Asp + Asn	17.24	4.0	0.9	5.8	12.3
Cys	6.89	4.0	1.2	0	1.7
Glu + Gln	6.89	5.5	7.6	8.3	12.9
Gly	13.79	14.5	12.1	7.5	6.5
His	3.45	4.0	2.9	8.5	8.1
Ile	2.50	2.0	0	0	1.6
Leu	3.45	10.2	9.9	6.8	3.2
Lys	10.34	0	0	8.5	3.2
Met	3.45	0	0	4.1	4.8
Phe	3.45	6.2	4.1	2.2	3.2
히드록시-Pro	0	0	0	8.5	8.1
Pro	0	0	15.2	10.2	9.7
Ser	3.45	12.0	10.7	5.1	3.2
Thr	0	3.6	2.4	0.7	1.6
Trp	0	2.0	2.0	1.7	1.6
Tyr	6.89	0	0	5.1	4.8
Val	3.45	14.0	13.6	3.4	1.6

페틸라아제(Fetilase)

α-전분 분해 활성 및 β-전분 분해 활성과, 특히 단백질 분해 활성을 가지고, pI가 6.5이며, 적정 pH가 7.2이고, 분자량이 약 29 kDa이며, 아조카제인 분해 활성이 80∼100 U/mg인 효소. 이 효소를 "페틸라아제"로 칭하며, 그 특징은 ECC 부 3.2.1.1,, 3.2.1.2, 3.4.22.6에 기재되어 있다. 페틸라아제의 전분 분해 활성은 약 20∼40 U/mg이다(1 U는 pH 6.9 및 37℃에서 3분 이내에 전분으로부터 1.0 mg의 말토오즈를 유리시킴){피 번펠드의 문헌 [Methods in Enzymology 1,149,1955] 참조}. 페틸라아제는 맥주 양조 공정에서 보리 아밀라아제의 대체물로서, 그리고 의약품 중의 췌장 효소 대체물로서 사용할 수 있다,

펩티파아제(Feptipase)

지방 분해 활성 및 약간의 단백질 분해 활성을 가지고, pI가 3.2이며, 적정 pH가 4.6이고, 분자량이 약 14.5 kDa이며, 아조카제인 분해 활성이 80∼100 U/mg인 효소. 이 효소를 "펩티파아제"로 칭하며, 그 특징은 ECC 부 3.1.1.1, 3.1.1.3, 3.4.2.6에 기재되어 있다. 펩티파아제의 지방 분해 활성은 20 U/mg이다(1 U는 pH 7.7 및 37℃에서 1 시간당 트리글리세라이드로부터 1.0 meq.의 지방산을 가수 분해시킴). 펩티파아제는 세정 조성물 중의 활성 물질로 사용할 수 있다.

워마아제(Wormase)

단백질 분해 활성을 가지고, pI가 약 2.8이며, 적정 pH가 3.6이고, 분자량이 약 31 kDa이며, 아조카제인 분해 활성이 80∼100 U/mg(1 U는 pH 7.5 및 37℃에서 1 분당 1.0 μM(181 ㎍)의 티로신에 대응하는 색상을 산출하도록 카제인을 가수 분해시킴). 이 효소는 "워마아제"로 칭하며, EEC 부 3.4.23.1, 3.4.23.6 및 3.4.22.3에 기재된 특징을 갖는다. 워마아제는 세정 분말, 식품 및 음료 산업 분야에서 특히 비교적 낮은 pH 하에 원치않는 단백질을 분해시키기 위해 사용할 수 있으며, 참고적으로 과일 쥬스, 맥주 및 와인의 통상적 pH는 3.9 내지 6.0이다. 이 효소는 단백질 함량을 약 70% 만큼 저하시키므로, 음료 제조 공정에서의 여과 단계를 줄이거나 없앨 수 있다.

실시예 2: 산업 용도의 이 포에티다 효소 혼합물

효소 혼합물(enzymmix)은, 워마아제, 에이제나아제, 펩티파아제와 페틸라아제의 30:40:15:15의 혼합물로 이루어진 다종 효소 조성물로서, 이들 효소의 활성은 워마아제 = 65∼90 U/ml, 에이제나아제 = 80∼100 U/ml, 페틸라아제 = 60∼90 U/ml, 펩티파아제 = 60∼90 U/ml이다. 효소 혼합물은 가수 분해에 의해 주로 단백질, 전분 및 지질로 분해된다. 단백질 잔류물(맥주 및 와인 잔류물), 전분, 근단백질(육류 및 베이컨 내)은 부분적으로 분할 또는 분해된다. 이로써 맛이 개선된다. 효소 혼합물은 호기 처리없이 폐수를 세균으로부터 정제시킬 수 있다. 효소 혼합물은 생물학적 세정 분말, 세정 분말, 세정 제품, 비누, 치약, 샴푸 등에 사용할 수 있다. 효소 혼합물은 이하에 제시된 바와 같이 계면활성제와 병용할 수 있다. 효소 혼합물은 오염수 중의 폴리클로로비페닐(PCB's)의 농도를 40 ㎍/L에서 5 ㎍/L으로 저하시킬 수 있다. 효소 혼합물은 사람의 피부 또는 신체에 대해 알레르기, 습진 또는 독성 효과를 발휘하지 않는다. 이 효소 혼합물은 세균 발효에 의해 제조된 유사 제품에 비해 총 단백질 함량이 30 배 적다.

레쿨톨(Recultol)은 광유 오염물에 의해 오염된 토양을 정화시키기 위한 물질이다. 이것은 효소 혼합물과, 절반 부피의 장쇄(C₂₃) 디카르복실산 계면활성제, 소위 "라우릴란"으로 구성된다. 레쿨톨은 토양 상에 직접 살포하거나, 또는 오염된 영역에 2회 분사하거나, 또는 토양 아래 부분의 수력 순환부에 첨가할 수 있다. 레쿨톨 1 ml는 오염물 약 50 mg을 분리시킬 수 있다. 정화시키고자 하는 토양에 대한 평균 용량은 300∼700 L/HA + 150∼300 L의 라우릴란이다. 또한, 레쿨톨은 쓰레기 퇴적물의 분해를 촉진시키는 데에도 사용할 수 있다. 레쿨톨은, 그 효소 활성이 보다 높은 염 농도에 의해 방해받지 않기 때문에 유조선의 세정 용도라는 특수한 용도로 사용된다. 해양에 누출된 기름의 처리는, 캐리어, 바람직하게는 분해 가능한 제품에 결합된 효소 혼합물을 사용하여 실시할 수 있다. 이때, 상기 결합된 효소 혼합물은 오일상의 상부로 부유되는 밀도와 수-유상에 대한 소수성을 갖는다. 이들 양 제제는, 식물을 연속 집속 처리하여 얻은 분해 가능한 색소(적색 또는 백색)를 포함한다. 상면의 색상은 백색에서 핑크색으로 변하게 된다. 고형 표면, 즉 시멘트, 콘크리트, 철로 등의 경우에는, 1,000 L의 온수(50℃ 이하) 중의 1 L의 효소 혼합물과 1 L의 라우릴란의 혼합물을 사용하여 고압 하에서 레쿨톨로 처리한다.

사나모(Sanamor)는 효소 혼합물, 계면활성제 및 살균제(즉, 0.1% 글리옥살)를 함유하는 세정액이다. 사나모는, 육류, 우유 및 식품 산업 분야의 파이프 및 시설의 세정에 사용할 수 있다. 사나모는, 고온을 필요로 하고 다량의 물로 세정해줘야 하는 산 및 히드록시드의 대체물이다. 사나모는 1:100 내지 1:200의 희석률을 가지고, 40℃의 온도에서 작용한다. 표준 시간 20 분동안의 단 1회의 세척만을 필요로 한다. 사나모는, 파이프의 사각 지대에 존재하는 침착물 및 타르타르를 제거할 수 있다는 또다른 잇점을 제공한다. 사나모는 유기 엽록체를 분해시킨다. 이후, 전체 파이프 시스템을 1회 헹굼으로써 효소 + 가수 분해 산물을 세정 제거한다. 사나모는, 닭 및 그 깔짚에 규칙적으로 분사하여 닭장 내 NH₄ 발생량을 감소시키는 데 사용할 수 있다. 닭장 내 NH₄ 발생량의 약 2/3가 깔짚에서의 세균 증식에 의한 것이므로, 깔짚의 처리는 필수적이다.

효소 예비 혼합물(Enzympremix)은 제올라이트 또는 벤토나이트 등의 적당한 캐리어에 효소가 흡착된 것이라는 것을 제외하고는 효소 혼합물과 동일한 혼합물이다. 원료 혼합물을 영계 및 돼지의 사료에 성장 촉진제로서 첨가하면 사료의 전환률을 향상시킬 수 있다. 이것은 동물 자체 효소의 합성에 필요한 에너지를 현저히 감소시킨다. 효소 예비 혼합물을 사용한 실험동안, 처리된 동물 또는 동물 사육자에게서 어떠한 부작용이나 독성도 관찰되지 않았다. 이 물질은 정상 식품으로 명백히 판매되는 것이기 때문에, 쥐에 있어서의 치사량을 결정할 수 없었다.

이 실시예에서는, 10,000 마리의 영계(오메가, BT Kft., 1078 부타페스트, 헝가리)로 이루어진 2군을 대상으로 한 비교 실험을 위해 효소 혼합물을 제조하였다. 생후 1주일 동안에는 새끼 사료를 양 군에게 공급하였고, 2주 후부터 항생물질과 함께 고열량식을 공급하였으며, 마지막 주(7주) 중에는 항생 물질을 제외한 최종 혼합물만을 공급하였다. 물은 자유로이 공급하였다. 상기 2 군 사이의 유일한 차이는, 원료 혼합물의 혼합 과정 중에 생후 2일 이후부터 공급한 사료 1 톤당 1 L의 효소 혼합물을 첨가하였다는 점이다. 원하는 체중이 달성된 후 상기 2군 사이에 유의적인 차이가 관찰되었으며, 효소 혼합물을 투여한 군이 모두 바람직한 결과를 나타내보였다. 이들 양 군의 차이점은, (1) 보다 짧은 시간 내에 보다 빠른 성장이 이루어짐으로써 새 1 마리당 최종 체중이 200 g 이상 차이가 발생한다는 점(36일 동안 얻어진 평균 체중 2,000 g 대 42일 동안 1,800 g). (2) 효소 군에 있어 사료 전환률이 9.5% 정도 더 우수한 점, (3) 전체 손실량이 52% 정도 감소한 점(총 치사율이 5.5% 대 11.5%)이다. 사료 혼합물에 효소 혼합물을 첨가한 후 깔짚과 깃털에 사나모를 4일 간격으로 분사한 결과, 효소 혼합물 군의 닭장에서 유쾌한 향이 발생하였다. 이로써, 정확히 측정된 바는 아니나 NH₄가 상당히 낮은 정도로 발생하였다. 그러한 상황에서는 NH₄의 총 발생량이 70% 정도 감소할 수 있다.

실시예 3 : 리소자임의 분리

리소자임은 눈물 및 난백 중에 존재하는 효소이다. 이 실시예에서는 2,000개의 달걀로부터 난백(약 50 L)을 수거하고 빙냉 증류수로 최대 150 L까지 희석시켰다. 모든 조작은 4℃에서 수행하였다. 상기 용액을 여과하고, 3개의 작동 유출구(+ 2개의 전극 유출구)를 갖춘 4 L 들이 연속 집속기 내에 넣었다. 연속 집속기에는 먼저 증류수를 채워 넣었다. 유량은 75 ml/분으로 조절하고, DC 1,000 볼트를 설정하며, 시스템의 초기 전력은 1.5 W로 하였다. 미정제 난백 현탁액을 첨가하자, 전력이 10.5 W로 상승하였다. 연속 집속 처리는 34 시간 동안 지속하였다. 애노드에 가장 가까운 작동 유출구(pH 10.5)로부터, 리소자임을 200 U/ml의 농도로 함유하는 현탁액 40 L를 수거하였다. 이 현탁액을 3개의 작동 유출구 및 2개의 전극 유출구를 갖춘 1 L 연속 집속기 내로 서서히 주입하였다. 증류수와 함께 유량을 10 ml/분으로 조절하고, 1,000 V/DC를 설정하였다. 초기 출력은 1.6 W이었으나, 리소자임 현탁액을 첨가한 후에는 5 W로 상승하였다. 연속 집속 처리는 3 일간 지속하였다. 애노드에 가장 가까운 유출구(pH 10.5)로부터의 물질을 수거하였다. 분석 결과, 이때의 리소자임 활성은 1,500 U/ml이었다. 이후, 12 L 분획을, 체분류 겔(Spheron P-200)이 채워진 200 x 1500 mm의 크로마토그래피 컬럼 상에서 4개의 분획에 주입하고, 25 ml의 분획을 수거하였다. 각 분획에 대해, 단백질 함량 및 리소자임 활성을 측정하였다. 5개의 단백질 피크가 관찰되었다. 첫번째 피크는, 단백질 분해 활성이 20,000 U/g인 정제된 리소자임을 포함하였다.

실시예 4: α-아밀라아제의 분리

바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 기초 과학, 의학 및 산업 분야에 있어 중요한 것이다. 전체 게놈은, 몇차례의 합작 연구를 통해 최근에 그 서열이 밝혀졌다 {문헌 [Nature 390, p237 및 p1249, 1997] 참조}. 이 포자 형성 그램 양성 세균의 서열은 그램 양성 병원균의 항생 물질에 대한 내성에 결정적인 역할을 하며, 산업적 용도를 가진 수종의 효소를 암호화한다.

이 실시예에서는, 바실루스 서브틸리스 균주 A-200을 500 L 발효기 내에서 12 시간동안 37℃ 하에 배양하였다. 550 nm에서 분광 분석 측정 결과 > 0.5의 값이 산출된 후 세균 증식이 억제되었다. 분리기를 사용하여 배지로부터 세균체를 분리시켰다. 상등액을 10 L 연속 집속기 내에 250 ml/분의 유량으로 주입하고, 350 V DC를 가하였다. 3개의 작동 유출구, 즉 양 전극 측부에 2개의 유출구와 장치의 중앙에 하나의 유출구를 갖춘 연속 집속기를 사용하였다. 전극 유출물은 폐기시키고, 중앙 유출구로부터 얻은 용액은 5 L의 제2 연속 집속기 내에 주입하였다. 또한, 3개의 유출구를 갖춘 장치를 사용하고, 중앙 유출구로부터 정제된 α-아밀라아제를 회수하였다. 유량은 100 ml/분으로 조정하고, 500 V DC를 가하였다. 중앙 유출구에서는, 전분 분해 활성이 200 U/g인 비교적 순수한 α-아밀라아제가 얻어졌다.

실시예 5: 인슐린의 분리

이 실시예에서는, 시판되는 인슐린(노보노르디스크, 덴마크)을 증류수 중에 1 mg/ml로 현탁시켰다. 이 현탁액 3 L를, 5개의 유출구(2개의 전극 유출구와 작용액을 회수하기 위한 3개의 유출구) 1 L 들이 연속 집속기 내에 주입하였다. 조건은, 25 ml/분의 유량, 400 V DC, 및 8 W의 전력을 산출하는 전류로 설정하였다. 연속 집속 처리는 2시간 동안 지속하였다. 캐쏘드 부근의 제1 작동 유출구로부터 800 ml의 정제된 인슐린을 수거하였다. 대조용 PAGE 분석 결과, 원래의 비처리된 인슐린 제제에서는 12∼8 kB 사이에서 4개의 레인이 확인되었다. 연속 집속 처리 후에는 정제된 인슐린에 해당하는 10 kB의 단 1개의 레인만이 관찰되었다. 인슐린을 더 정제시킬 필요가 있는 경우에는, Spheron P-20으로 채워진 100 x 500 mm의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 추가의 겔 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 정제된 인슐린은 제1 단백질 피크에서 나타났다.

실시예 6: 리신의 정제

공업용 리신은 다른 공급원으로부터 입수 가능하다. 이것은 농장 동물의 사료를 상등급화시키기 위한 아미노산의 원료로 사용된다. 보다 고순도의 리신이 필요한 경우에는, 몇개의 복잡한 단계를 수행해야 하므로 최종 제품의 단가가 보다 높아진다. 이 실시예에서는, 리신의 정제를 위해 본 발명을 이용하였다. 공업용 리신을 증류수 중에 3%의 농도로 희석시켰다. 이 용액의 전도성은 2,000 μs/cm이었다. 이 용액 500 L를, 실시예 5에서와 같이 배치된 5개의 유출구를 갖춘 3 L 들이 연속 집속기 내에 주입하였다. 정제된 리신은 제1 유출구로부터 수거하였다. 이 물질은 전도성이 약 500 μS/cm이고, 리신의 농도는 > 15%이었다. 주입 단백질 물질의 손실률은 약 5∼10%이었으나, 이 손실률은 처음의 세균 발효로 인한 불순물의 손실량을 포함한 것이다.

실시예 7: 위스키의 정제

대부분의 알콜 증류액의 경우에는, 특히 맛을 손상시키는 각종 바람직하지 않은 물질(예, 아밀 아세테이트, 에틸 헥사네이트, 에틸 옥타노에이트, 에틸 데카노에이트, 에틸 도데카노에이트)을 제거하기 위한 1 또는 2 단계가 필요하다. 이들 바람직하지 않은 성분의 제거는 추가의 증류 과정에 의해서만이 달성될 수 있다. 본 발명은 비용 면에서 저렴한 정제법을 제공한다. 이 실시예에서는, 캐나다 브랜드 위스키를 10 L 들이 연속 집속기 내에 주입하였다. 유량은 1 L/분이고, DC 전력은 1,000 V 및 10 mA로 조정하여 10 W를 공급하였다. 3개의 작동 유출구(2개의 전극 유출구와 1개의 중앙 유출구)를 사용하였다. 상기 3개의 유출구에서 얻은 위스키는, 전문가 패널들이 색상, 냄새 및 맛에 있어서의 차이를 판정하였다. 세번째 유출구로부터 수거한 샘플만이 추가 증류 과정을 필요로 하였다. 나머지 2개의 유출물을 혼합한 결과, 품질 및 맛이 향상되었다. 가스 크로마토그래피 결과, 아밀 아세테이트는 0.04 mg/100 ml에서 0.01 mg/100 ml로 감소하고, 에틸 헥사노에이트는 0.05에서 0.02로, 에틸 옥타노에이트는 0.03에서 0.01로, 에틸 데카노에이트는 0.025에서 0.001로, 에틸 도데카노에이트는 0.01에서 0.005 mg/100 ml로 감소한 변화가 나타났다.

실시예 8: 보드카의 정제

이 실시예에서는, 슬로바키안 지방의 보드카와 네덜란드 브랜드 20 L를 3 L 들이 연속 집속기 내에 주입하였다. 유량은 3 L/시간으로 하고, 처음 DC 전력은 275 V 및 80 mA로 설정하여 22 W를 공급하였다. 폐기물 유출구를 통해 전해질이 제거됨으로써 전도성이 저하되었다. 전류량이 감소함에 따라 전력이 750 V로 상승하고, 결과적으로 12∼18 W의 전력이 공급되었다. 2개의 작용 유출구를 작동 챔버의 40% 및 60% 지점에 부착시켰다. 2개의 작동 유출구 및 폐기물 유출구에서 측정한 알콜 함량은 41%이었다. 애노드측의 제1 작동 유출구에서 얻은 보드카는 "독한" 맛을 가졌으며, "세정용" 알콜로 사용할 수 있다. 제2 작동 유출구에서는 "부드러운" 맛을 가진 보드카가 얻어졌다. 다중 불포화 지방산과 알데히드의 농도는 각각 75% 및 80%씩 감소하였다. 제25회 살론 인터내쇼날 데스 인벤션스(스위스, 제네바, 1997.4.)에서는 이하의 발표 내용이 금메달을 수상하였다.

보드카를 정제하기 위한 트윈 배열의 연속 집속기는 유통 용량이 5 L/분 및 7,200 L/일이다. 1일 당 총 6,800 L의 정제된 보드카가 얻어진다. 이 정제 과정 동안 다중 불포화 지방산 및 알데히드는 각각 68% 및 88%씩 감소한다.

실시예 9: 와인의 정제

천연 와인은 산성 성분을 고농도로 함유할 수 있다. 또한, 과다한 발효로 인해 그 품질이 불량해지거나, 잔류하는 효모 생성물로 인해 부패할 수 있다. 인공 맛 또는 산 특성은 통상의 방법을 이용하여 제거하기가 어렵다. 본 발명은, 이 실시예에서 입증된 바와 같이 와인의 품질을 향상시키기 위한 기술 용액을 제공한다. 산 맛을 가진 토카이(Tocai) 와인(pH 3.8) 50 L를 10 L 들이 연속 집속기 내에 주입하였다. 유량을 200 ml/분으로 조정하고, 양 전극 사이에 250 V DC를 설정하였다. 2개의 폐기물 유출구를 비롯한 3개의 작동 유출구를 갖춘 장치를 사용하였다. 분리 과정은 4 시간 동안 지속하였다. 유출물은 전문 와인 감미사 패널에게 주어, 색상, 맛 및 냄새 면에서 평가하도록 하였다. 중앙부의 작동 유출구와 애노드 유출구로부터 우수한 와인이 수거되었다. 샘플을 함께 혼합한 결과, pH 5.2의 우수한 품질의 와인이 얻어졌다. 유입량의 80%가 회수되었다. 전도성은 1,670 μS에서 1,200 μS로 감소하였는데, 이는 바람직하지 않은 저분자량의 하전된 물질이 제거되었음을 말해준다.

실시예 10: 식수(食水)의 정제

식수의 정제 및 제조 과정은 원료가 되는 물에 의해 좌우된다. 최종 정제 단계는 대개 비용이 가장 많이 소요되거나 또는 수행이 어려운 단계이다. 세균 오염물은 흡수 필터로 제거할 수 있으나, 화학적 오염물은 취급하기가 보다 어려운데, 예를 들어 아질산염, 질산염 및 각종 금속은 보다 심각한 문제를 발생시킨다.

본 발명은 비교적 소규모로, 예를 들어 가정, 포장 마차, 농장 및 공장에서 에너지 및 시설 면에서 최소한의 비용으로 물을 정제시킬 수 있는 장치를 제공한다. 본 발명의 장치에 의해 취급 가능한 최대 염 농도는 약 900∼1,200 mg/L이다. 따라서, 해수로부터 염을 제거하는 과정은 이 연속 집속기를 사용해서는 수행할 수 없다. 내부 용적(L)을 가진 하나의 유닛에 의한 최대 성능은 약 150 L/일이다. 유닛이 병렬 배치하는 경우에는, 예를 들어 5개의 유닛으로 약 750 L/일을 정제할 수 있다.

이 실시예에서는, 전극 부근에 2개의 유출구와 1개의 작동 유출구를 갖춘 10 L 들이 연속 집속기에 1 L/분의 유통량으로 공급하였다. DC 전력은 100 V으로 조정하고, 전류는 25 W로 유도하였다. 이하의 분석 결과에서 알 수 있듯이, 중앙 유출구에서는 정제된 음료가 얻어진 한편, 전극 유출구에서 얻어진 유출물에는 바람직하지 않은 이온 및 원소가 다량 함유되어 있다. 물의 부피 손실률은 15∼20%이었다. 이 실험의 분석 결과는 다음 표 3과 같았다.

성분	정제 전	정제 후
구리	8.7	1.6
철	12.3	1.2
니켈	0.05	미량
크롬	3.14	0.8
수은	0.05	미량
아연	71.0	12.4
비소	0.12	0.04
납	0.71	0.05
카드뮴	미량	없음

중앙 작동 유출구로부터 얻은 식수의 품질은, 전압, 전력 및/또는 유량을 변경시켜 조절할 수 있다. 챔버의 용적 또는 장치의 수는 필요한 조건에 맞게 조절할 수 있다. 예를 들어, 깊은 샘의 식수를 사용하는 200 마리의 소를 사육하는 농장에 기준하여 계산하면, 소는 약 40,000 L/일 또는 40,000:24:60 = 28 L/분의 유량을 필요로 하므로 5 L/분의 유량을 갖춘 10 L 들이 연속 집속기 6대가 필요하다.

실시예 11: 면역글로불린의 분리

11a. 마우스: 이 실시예에서는 토끼 IgG(Sevac, Prague)로 면역화시킨 마우스의 혈청 풀 300 ml를 사용하였다. 이 혈청은 빙냉 증류수를 사용하여 1:3으로 희석시키고, 이 용액 1,200 ml를 미리 설정된 5개의 유출구를 갖춘 1 L 연속 집속기에 주입하였다. 연속 집속기에는 먼저 증류수를 채워 넣었다. 유량은 8 ml/분으로 조정하고, DC 전력 1,000 V를 사용하였으며, 시스템의 처음 출력은 1.6 W이었다. 혈청을 첨가한 후, 전도성이 증가함에 따라 전력이 5 W로 상승하였다. 연속 집속 과정은 약 3 시간 동안 지속하였다. 5개의 유출구에서 얻은 유출물 모두에 대해 면역학적 전기 영동법을 통해 면역글로불린의 존재 여부를 시험하였다. 애노드쪽 pH 4 내지 6의 제2 유출구에서는 면역글로불린이 검출되었다. 토끼의 IgG에 대한 항혈청을 사용하는 수동적 적혈구 응집 시험을 통해 시험한 결과, 이 유출물의 항 IgG 역가는 1:128이었다. 이 물질 180 ml를, Spheron P-200로 채워진 크로마토그래피 컬럼 상에 주입하고 증류수로 평형화시켰다. 10 ml 분획을 수거하고, 면역글로불린의 존재 여부를 시험하였다. 4개의 단백질 피크가 관찰되었다. 반정제된 면역글로불린은 첫번째 피크에서 0.5 mg/ml의 농도로 존재하였다. 수동적 적혈구 응집 시험에서는 항 IgG 역가가 1:1024로 산출되었다. 이 피크의 모든 샘플을 수거한 후, 이후의 사용을 위해 동결 건조 방식으로 농축시켰다.

11b. 사람: 이 실시예에서는, B형 간염 바이러스 항원(HBsAg)에 대한 항체를 함유한 사람의 혈청 풀을 정제시켰다. 2 L의 혈청을 8 L 이하의 증류수로 1:4의 희석율로 희석시키고, 우레아로 8 M 이하까지 포화시킨 후 0.1%의 글리옥살을 첨가하였다. 최종 10 L의 양을 4개의 유출구를 갖춘 1 L 들이 연속 집속기 내에 주입하였다. 유량은 0.25 L/시간으로 조정하고, DC 처음 출력은 10 W로 하였다. 혈청을 첨가한 후 전력이 14 W로 상승하였다. 연속 집속 과정은 5 시간 동안 지속하였다. 특이 항체를 포함하는 다량의 단백질(8 mg/ml)을 캐쏘드 측 pH 5.6의 제2 유출구로부터 수거하였다. 총 2 L를 수거하였다. HBsAg에 대한 면역글로불린은 면역 확산 시험에서 1:512의 역가를 갖는 것으로 나타났다. HBsAg 항체는 다음과 같이 겔 크로마토그래피를 통해 추가로 정제시켰다. 반정제된 혈청 샘플을 400 ml씩 5부로 나누고, 이들을 각각 Spheron P-200이 채워진 별도의 크로마토그래피 컬럼 상에 주입하였다. 4개의 단백질 피크가 나타났다. 제1 피크는 특이 항체를 포함하였다. 5개의 겔 크로마토그래피 실험에 따른 특이 항체의 총 생성물을 수거하여 총 4,500 ml의 증류수 중에 희석시켰다. 이후, 전술한 바와 같이 연속 집속 처리 과정을 반복하였다. 본 실시예에서는, pH 5.1 및 pH 5.4의 중앙부 2개의 작동 유출구로부터 항 HBsAg를 수거하였다.

본 발명에 의하면, 예를 들어 효소, 프로테아제, 독소, 또는 바이러스 또는 세균 표면 단백질에 의해 유도된 전체 면역 반응에 대한 항-항체를 효율적으로 제조할 수 있다. 면역 조절의 네트웍 이론{전의 문헌 [Ann. Immunol.125:373-389] 참조}에 있어, 항 이디오타입 항체의 유사 특성은 항원의 기능적 내부 상으로 기술하였다. 본 발명자들은, 면역글로불린 분획을 정제시키는 데 있어 본 발명을 이용하여, 페스티바이러스(Pestivirus) 속에 속하는 전형적인 돼지의 열 바이러스에 대한 항 이디오타입 백신을 제조하기 위해 파일럿 연구를 개시하였다.

11c. 돼지: 이 실시예에서는, 체중이 100 kg인 5 마리의 돼지를, 차이니즈 C 균주를 주성분으로 하는 시판되는 돼지의 열 바이러스(SFV)로 면역화시켰다. 면역화시키고 채혈한 지 5 주후에 돼지를 죽였다. 800 rpm에서 원심 분리시켜 혈청 풀 10 L를 얻었다. 혈청을 증류수로 3배 희석시키고, 30 L를 우레아로 최대 8 M까지 포화시켰다. 0.1%의 글리옥살을 첨가하였다. 이 물질을 5개의 유출구를 갖춘 2 L 연속 집속기 내로 주입하였다. 초기 조건은 100 ml/분의 유량 및 250 V DC 전력으로 조정하였다. 연속 집속 과정은 5 시간 동안 지속하였다. SFV에 대한 특이적 항체는 2개의 유출구, 즉 pH 4.5의 제1 작동 유출구와 pH 6.2의 제2 작동 유출구로부터 수거한 샘플에서 관찰되었다. SFV 중화(VNT) 시험 키트(Sevac, Prague)를 사용하였다[이 실험 결과는 전혀 의외적이었기 때문에, SFV E₂(gp 55) 및 SFV E^RNS에피토프(이들 모두 SFV에 대한 중화 항체를 유도함)를 포함하는 것으로 예상되는 2개의 SFV 군을 포함하는 원래의 SFV 백신도 역시 연속 집속 과정으로 처리하였다. VNT 결과, 양 바이러스 피크는 SFV에 특이성을 보였으며, BVD 바이러스에 의한 오염도 전혀 검출되지 않았다]. 따라서, 2개의 항 SFV 혈청 분획이 얻어졌다. 이들 2개의 양 분획을 동결 건조시킨 후 증류슈 중의 0.9% NaCl 중에 단백질 농도가 3 mg/ml가 될 때까지 희석시키고, 각 실험마다 Spheron P-40이 채워진 크로마토그래피 컬럼 상에 각각 주입하였다. pH 6.2의 분획은, VNT 항체 역가가 1:512인 하나의 단백질 분획을 산출시켰다. pH 4.5 분획은, 겔 크로마토그래피 후 4개의 단백질 분획을 산출시켰다. 2개의 피크는 VNT 항체 역가가 1:64인 SFV 항체(+)이었다. 3개의 단일 SFV 항체(+) 분획 및 모든 3개의 합성된 SFV 항체(+) 분획은, 본 발명이 돼지 열에 대한 항 이디오타입 백신을 제조하는 데 사용될 수 있는 지를 연구하기 위해 염소의 면역화에 사용할 수 있다.

실시예 12: 이 콜리 감염체에 대한 신규한 아단위 백신의 제조

종래 기술에 따라, 이(에스케리챠) 콜리의 각종 접합 인자에 대해 작용하는 일련의 백신을 개발하였다. 각 접합 인자에는 별도의 발효 단계를 사용하였다. 이 실시예에서는, 오직 하나의 세균 발효 단계만을 필요로 하는 소, 돼지 및 양의 이 콜리 감염체에 대한 다인자 재조합 아단위를 설명하였다. 두번째 특징은 본 발명에 따른 제조 방법에 있다. 유전적으로 변성시킨 이 콜리 작제물은 K 88 ab 항원 보유 이 콜리, 균주 G-7(베테리너리 페컬티에서 입수, 코시스 유니버시티, SK), K 88 ac 균주 U-200(스테이트 베테리너리 유니버시티, 우루과이 몬테비데오 소재), K-99 및 Lt 엔테로톡신 항원 보유 균주 S-IH(CZ 미생물 기탁소, 브르노, SK) 및 987-P 균주(살라즈카 박사, 이바노비스 나 헤인, CZ)로 제조하였다. 제한 효소인 BgII, BgIII 및 Pst를 사용하여 항원을 암호화하는 플라스미드를 클로닝하였다. 분석적 및 분취적 PAGE를 통해, 20∼90 kDa의 DNA 쇄를 분리시키고, 각종 조합 상태의 람다 L4 리가아제를 사용하여 결찰시켰다. 이 작제물은, 일렉트로포레이션 (electroporation)을 통해 플라스미드 유리 이 콜리 균주 H-110으로 형질 감염시켰다. 클로람페니콜 및 테트라사이클린에 대한 내성을 암호화하고, 상기 언급한 접합 인자 및 엔테로톡신을 모두 함유하는 2개의 작제물을 선별하였다. K88 ab, ac, K99, 987/P 및 Lt 엔테로톡신 유전자의 조립 및 형질 발현은 적혈구 응집 시험을 통해 시험하였다. 50개의 순차적 세균 배양 단계를 사용하여 모든 외인 항원에 대한 조립 및 형질 발현의 안정성을 입증하였다. 변성된 이 콜리 균주 H-110을 300 L 발효기 내에서 배양시켰다. 8 시간 배양 후, 세균 배양물을 수거하여 800 rpm에서 원심 분리시켰다. 총 750 g의 세균 침전물을 수거한 후, 이 물질의 표면 단백질(섬모)을 20 L의 빙냉 증류수 중에서 10 분동안 전단 처리하였다. 1차 전단 처리 후, 용액을 3,000 rpm으로 다시 원심 분리시키고 상등액을 수거하였다. 나머지 침전물은 20 L 빙냉 증류수 중에 희석시키고, 750 g의 유리 비드를 첨가한 후 10 분동안 혼합하였다. 표면 단백질을 9개의 유출구(전극 부근의 2개 유출구, 4개의 작동 유출구, 및 이들 사이의 3개의 폐기물 유출구)를 갖춘 연속 집속기 내에서 추가로 정제하였다. 연속 집속 과정은 75 ml/분의 유량, 500 V DC, 14 W, 4℃에서 9 시간동안 계속 수행하였다. 각각 pH 4.5∼5.0, pH 6.0∼7.0, pH 7.0∼7.5 및 pH 9.5∼10.0에 상응하는 2번째, 4번째, 6번째 및 8번째 (작동) 유출구로부터 얻은 용액은 각각 K 88 ab, ac; 987-P; 엔테로톡신 LT; 및 K 99 항원을 함유하는 정제된 분획을 산출시켰다. 역가는 수동적 적혈구 응집 시험을 통해 결정하고, 정제된 항원은 1:512의 역가까지 5∼10 배 희석시킬 수 있다. 농축 단계는 필요치 않았다. 0.5 mg/ml의 K88 ab, ac, K99, 987/P 및 Lt. 엔테로톡신 항원을 함유하는 안정한 오일 에멀젼을 제조하였다. 보조제(Spe-col(등록상표), 20% W/W, ID-DLO 인스티튜트, 네덜란드 렐리슈타트 소재) 및 0.1% 글리옥살을 첨가하였다. 이 신규한 재조합 아단위 백신을 분만 5 주전의 임신한 소에게 접종시킴으로써 그 새끼에게 수동적 면역성을 부여하였다. 송아지에서 관찰된 모체 항체 역가는 종래 기술의 백신에서 관찰된 것보다 2배 내지 3배 높았다. 이 콜리 설사 및 이 콜리 패혈증에 의한 손실률이 보다 낮게 관찰되었다(1.5%). 병원균인 이 콜리 균주(10⁹ 세균/ml를 함유하여 2 ml)을 사용한 항원 투여 실험에서는 보다 높은 치사율을 보이지 않았다. 이 백신은, 특히 농업적 수술시 항생 물질이 유용하지 않거나 또는 다른 이유로 인해 원치 않는 경우에 사용할 수 있다.

실시예 13: 폴리뉴클레오티드의 정제

종래 기술의 등전 집속 방법은, 이 콜리 설사 및 이콜리 패혈증의 원인 물질인 이 콜리의 접합 인자를 보유한 DNA 플라스미드를 항생 물질에 대한 내성의 이종성에 기초하여 정제시키는 데 사용하였다. 이 실시예에서는, 마니아티스 외 다수의 문헌 [J. Bacteriology(1982)]에 따른 표준 방법에 의해 이 콜리 균주 F 027(플라스미드 RMS 151), C 600(RSF 1010) 및 J 53(pSa)으로부터 DNA 플라스미드를 분리시켰다. 증류수 중의 3% 글리세롤 용액은 DNA 플라스미드를 희석시키는 데 사용하였다. 연속 집속 과정에는, 약 7㎍의 순수한 DNA/100 ml를 함유하는 각 플라스미드 1 L를 사용하였다. 9개의 작동 유출구를 갖춘 0.5 L들이 소형 연속 집속기를 사용하였다. 유량은 50 ml/시간으로 하였다. 각 플라스미드 제조 과정에서 분리 과정은 10 시간동안 지속하였다. 결과는 다음과 같았다. 플라스미드 RMS 151을 2개의 분획으로 분리시켰으며, 이들은 pH 2.7 및 4.1의 제1 및 제3 캐쏘드 유출구에서 나타났다. 항생 물질에 대한 내성에 근거했을 때, 플라스미드 DNA의 등전 분별에 의해 다른 특성을 가진 분획이 얻어지는 것으로 나타났는데, 즉 원래의 플라스미드 RMS 151은 테트라사이클린 및 암피실린 모두에 대해 내성을 가지나, 이 실험에서는 1개의 분획이 테트라사이클린에 대해서만 내성을 보이고 나머지 것은 암피실린에 대해서만 내성을 보였다. 플라스미드 pSa는 3개의 분획으로 분별되었는데, 이들은 각각 pH 2.1, 3.4 및 4.2의 제1, 제2 및 제3 캐쏘드 유출구에서 나타났다. 그러나, 플라스미드 RFS 1010은 연속 집속 과정 후 균질 상태를 유지하였으며, 테트라사이클린 및 암피실린 모두에 대해 내성을 가진 1개의 분획만이 pH 2.9의 제2 캐쏘드 유출구로부터 수거되었다. 자외선 분광 분석계에 의한 측정을 통해, 플라스미드 농도가 원래 샘플 농도의 4배에 해당하는 20∼28 ㎍ DNA/100 ml까지 증가한 것으로 입증되었다. RMS 151 및 pSa 플라스미드 각 분획의 경우에도 유사한 농도로 측정되었다.

DNA 정제에 있어 본 발명의 잇점은, 항생 물질에 대해 각기 다른 내성을 가짐으로써 각각의 독특한 pI 값을 갖는 정제된 플라스미드가 얻어지며, 동시에 4배 높은 농도로 얻어진다는 점이다. 이들 2가지 점 모두 대규모 제조시 중요하게 작용한다.

실시예 14: 테트라사이클린의 정제

종래 기술의 등전 집속 방법은, 스포파 CSFR(유나이티드 파마슈티칼 웍스, CZ)에서 입수한 시판되는 테트라사이클린 제제를 정제하는 데 사용하였다. 테트라사이클린은 독특한 색상 및 pH 값을 가진 4개의 피크로 분리되었는데, 1개의 분획은 항생 물질에 대한 내성 시험에서 이 콜리 및 2개의 스트렙토코커스 에스피피(Streptococcus spp)에 대해 향상된 항균 활성을 나타내 보였다. pH 6.8에서 수거된 정제된 샘플은, 원래의 테트라사이클린이 85%의 억제율을 갖는 것에 비해 94%의 억제율을 갖는 것으로 입증되었다. pH 2.3에서 수거된 하나의 분획은, 독성 및 알레르기 반응을 유발시키는 3개의 공역 이중 결합을 가진 아라키돈산의 생물학적 활성 대사 물질 군인 류코트리엔을 함유하였다. 그러한 다중 불포화 지방산은, 본 발명에 의한 제조 방법 중에 제거할 수 있다.

이 실시예에서는, 시판되는 테트라사이클린의 동일한 브랜드 200 g을 30%의 에틸 알콜을 함유한 증류수 2 L 중에 용해시킨 후 8개의 작동 유출구를 갖춘 800 ml 들이 연속 집속기 내에 주입하였다. 유량은 40 ml/분으로 조정하고, 처음의 DC 전력 출력은 4W로 조절하였다. 각 홀수번째의 유출구로부터 4개의 분획을 수거하였는데, 즉 pH 2.2에서 갈색의 분획, pH 6.8에서 명황색의 분획, pH 7.9에서 등황색의 분획, 및 pH 9.2에서 오렌지색의 분획을 수거하였다. 이들 유출구 사이에는 4개의 폐기물 유출구가 존재하였다. 4개 분획의 항균 활성은 이 콜리 G7 균주 및 스트렙토코커스 오레우스(Streptococcus aureus), Cat.No. 644 527(체크 미생물 기탁소)에 대해 시험하였다. 디스크 주변에 세균이 완전 증식하고 있는 경우는 "-"로 표시하였고, 디스크 크기만큼 세균이 없는 경우는 "+"로 표시하였으며, 디스크 크기의 2배 영역에서 세균 증식이 없는 경우는 "++", 그리고 그 이상은 "+++"로 표시하였다. pH 2.2, 6.8, 7.9 및 9.2에 해당하는 분획의 항균 활성을 상기 양 균주에 대해 측정하고, 다음과 같이 캐쏘드부로부터 "-","+++","++" 및 "+"로서 평가하였다. 이들 결과는, 트윈 배열의 연속 집속기(2 X 25 L 용적)를 2.5 L/분(3600 L/일)의 유통 용량 하에 사용할 수 있다는 것을 말해준다. pH 6.8의 유출구로부터 매일 총 360 L의 정제된 테트라사이클린을 수거할 수 있다. 파일롯 실험을 통해, 다른 항균 물질에 있어서도 항균 활성이 유사하게 향상되는 지의 여부를 결정할 수 있으며, 독성 생성물을 제거할 수 있다.

Claims

분리 챔버(1), 분리 챔버의 단면 양끝에 배치된 한쌍의 수직형 전극(9), 상기 분리 챔버의 상부에 동일한 높이로 위치하는 2개 이상의 제1 유출구(12), 및 상기 2개 이상의 각 유출구 사이에 위치하여 적어도 상기 유출구의 높이에서 상기 챔버를 분할하는 수직벽(6)을 포함하는, 등전 집속 방식에 의해 액체 매질 중의 하전된 물질을 분리시키는 연속 유동 장치에 있어서,

상기 액체 챔버의 중앙부로부터 전극 공간을 분리시키기 위한, 애노드(anode) 부근에 위치한 수직형 음이온 선택성 막(10)과 캐쏘드(cathode) 부근에 위치한 수직형 양이온 선택성 막(10); 각 전극 공간 내의 챔버 상부에 구비되는 제2 유출구(11); 및 수평적 난류(horizontal turbulence)를 방지하는 구조를 가진 수직형 투과성 격벽(13)을 더 포함하고,

상기 양이온 선택성 막과 음이온 선택성 막(10)은 상기 중앙부로부터 상기 전극 공간으로 저분자량의 양이온과 음이온을 각각 통과시킬 수 있으며, 상기 이온 선택성 막은 고분자량의 물질을 실질적으로 투과시킬 수 없는 것이 특징인 연속 유동식 등전 집속 장치.
제1항에 있어서, 상기 수직형 투과성 격벽(13)이 T형(T-shaped) 벽인 것이 특징인 연속 유동식 등전 집속 장치.
제1항에 있어서, 상기 수직형 투과성 격벽(13)이 지그재그형(zigzag shaped) 벽인 것이 특징인 연속 유동식 등전 집속 장치.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 유출구(12)를 3개 이상 포함하는 것이 특징인 연속 유동식 등전 집속 장치.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수직벽에 실질적으로 수직을 이루는 수직형 가로벽(cross-wall)을 더 포함하고, 상기 가로벽의 어느 한 측면 상에 유출구가 구비되는 것이 특징인 연속 유동식 등전 집속 장치.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 연속 유동식 등전 집속 장치를 사용하는 것이 특징인, 수성 혼합물로부터 물질을 분리 또는 정제시키는 방법.
제6항에 있어서, 수성 혼합물의 단일 상향 유동(single upward flow)을 유지시키는 것이 특징인 방법.
제7항에 있어서, 상기 단일 유동이 25∼250 L/L/일(日)인 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 분리 대상 물질이 식수 또는 다른 음료(알콜 함유 여부 불문) 중의 불순물을 포함하는 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 상기 물질이 폴리뉴클레오티드, 아미노산, 펩티드, 항원 및 면역글로불린을 포함하는 단백질, 효소, 항생 물질, 알레르겐(allergen), 알칼로이드, 또는 세포 배양물 중의 일 성분인 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 상기 물질이 미생물, 육상 또는 해양 동물, 육상 또는 해상 식물, 또는 이들의 일부 또는 유도체에 의해 발현되거나, 또는 미생물, 육상 또는 해양 동물, 육상 또는 해상 식물, 또는 이들의 일부 또는 유도체로부터 추출된 물질인 것이 특징인 방법.
제10항의 방법으로 항원을 정제시키는 단계, 및 정제된 항원을 추가의 백신 성분과 배합하는 단계를 포함하는 것이 특징인 백신의 제조 방법.
제10항의 방법으로 항원을 정제시시키는 단계, 및 정제된 항원을 추가의 시험 키트 성분과 배합하는 단계를 포함하는 것이 특징인 시험 키트의 제조 방법.
연속 등전 집속법에 의해 측정된 등전점이 각각 8.3, 7.0, 6.5, 3.2 및 2.8이고, SDS-PAGE에 의해 측정된 분자량이 각각 17, 67, 36, 18 및 31 kDa인 에이제나아제(eisenase), 펠룰라아제(fellulase), 페틸라아제(fetilase), 펩티파아제 (feptifase) 및 워마아제(wormase) 또는 이들의 2 이상의 혼합물에 상응하는 것인, 지렁이, 특히 이. 포에티다(E. foietida) 종(種)으로부터 유도된 정제된 가수분해 효소.
토양수, 지하수, 해수 중의 누출유, 폐수, 및 선박(유조선)을 제14항의 효소 또는 이들의 혼합물로 처리하는 단계를 포함하는 토양수, 지하수, 해수 중의 누출유, 폐수 및 선박(유조선)의 정화(淨化) 방법.
도살장, 착유기, (차) 세정기, 욕실, 바닥, 파이프 또는 장치를 제14항의 효소 또는 이들의 혼합물로 처리하는 단계를 포함하는 도살장, 착유기, (차) 세정기, 욕실, 바닥, 파이프 또는 장치의 세정(洗淨) 방법.
성장 촉진제(growth promoter)로서 제14항의 효소 또는 이들의 혼합물을 사용하는 방법.
악취 처리 또는 암모니아 배출량의 감소를 위해 제14항의 효소 또는 이들의 혼합물을 사용하는 방법.
샴푸 또는 치약에 제14항의 효소 또는 이들의 혼합물을 사용하는 방법.
양조(釀造)용 보조제(brewing aid)로서 제14항의 페틸라아제를 사용하는 방법.