CN103881986A - 不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其编码基因与应用 - Google Patents

不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其编码基因与应用。本发明中的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa的编码基因A4-Oxa的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。本发明的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa对真菌毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解能力；原核重组表达的Oxa酶可在12h内降解30%以上的ZEN毒素。本发明确定了Acinetobacter sp.SM04降解玉米赤霉烯酮毒素的非过氧化物酶编码序列，即A4-Oxa基因，为将来研究酶的活性位点和通过定点突变Oxa酶奠定了基础。

Description

不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不动杆菌Acinetobacter sp.SM04的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN，ZEA）毒素降解酶非过氧化物酶（命名为Oxa）及其编码基因与应用。 
背景技术
玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN，ZEA）是一种***类真菌毒素，由玉米赤霉菌、禾谷镰刀菌、三线镰刀菌等真菌产生，主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等农作物及动物饲料。从全国仓库和饲料厂中抽样检测，发现玉米等农作物和饲料中ZEN的检出率高达100%，检出浓度超标严重。谢良民等对上海市大型超市中多类食品调查结果表明，ZEN的检出率极高，其中调味品均超出国家标准（食品中ZEN含量≤60μg/kg），且最高达150μg/kg（谢良民,葛懿云,李俊旋.上海零售食品中玉米赤霉烯酮含量初步研究[J].中国科协第五届青年学术年会文集,2004,756.）。此外，有研究表明十余种市售谷物相关食品中ZEN检出率也高达76.90%。因ZEN残留时间长、难处理，已引起国内外科研工作者的极大关注。FAO和世界卫生组织已将解决ZEA问题作为全世界的当务之急，各国对粮食中ZEA含量有严格限量标准。 
ZEN会引起种猪或家禽早熟，生殖周期紊乱，给种猪等养殖业带来巨大的损失，进一步对摄入被ZEN污染的农、畜产品的人引发多种中毒症、中枢神经受损，甚至死亡。目前，ZEN脱毒技术根据其作用原理可分为3类：物理脱毒法（加热、紫外线照射、有机粘土，活性炭，甘露低聚糖等）；化学脱毒法（酸碱处理，氮化处理，有机溶剂等）；生物转化脱毒法。 
物理方法是通过脱毒剂（主要包括活性炭、硅藻土、蒙脱石等）的吸附作用来达到去除ZEN的目的，但这类脱毒剂的吸附效率很低，达不到真正有效、彻底降解真菌毒素的目的。而且高剂量的吸附剂，会吸附营养物质，也无法被家禽家畜消化，同时带来环境污染。化学方法包括氨化法、碱法、臭氧处理、双氧水处理、碳酸钠浸泡等，此法虽效果显著，但后续处理繁琐，生成的产物可能存在潜在毒性，且此方法效果不稳定，营养成分损失较大，难以广泛规模 化应用（熊凯华,程波财,胡威等.玉米赤霉烯酮降解的研究进展[J].中国粮油学报,2010,25(1):138-140）。 
由于物理法和化学法的种种局限性，生物降解法显示出其独有的优势，受到国内外研究者的青睐。生物降解脱毒是以微生物产生的次级代谢产物分解破坏霉菌毒素，生成无毒的降解产物。生物降解法高效、特异性强，不破坏原料中的营养成分，无二次污染产生，已成为研究热点和主要趋势。 
日本Takahashi-Ando等人对粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）的研究较为全面，分离出的内酯水解酶zhd101可破坏ZEN结构，使其转化为***毒性较弱的化合物，且ZEN的降解率在80～90%之间（Kimara M,Naoko T,Nishiu-chi T.Molecular Biology and Biotechnology for Reduction of Fusarium Mycotoxin Contamination.Pesticide Biochemistry and Physiology,2006,86(3):117-123.）。大肠杆菌和酿酒酵母表达的重组zhd101表现出了内酯水解酶的能力，对ZEN的降解率可达75%，具有zhd101的转基因玉米也具备降解ZEN的能力（Tomoko I,Naoko T,Noriyuki O,et al.Reduced contamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels through genetic modification with a detoxification gene.Applied and Environmental Microbiology,2007,73(5):1622-1629.）。ZHD101主要作用于ZEA的内酯键，将ZEA的球形结构打开变成直链形结构，使之不能与***受体结合，从而消除其高***症。但酯键的水解并不能完全降解ZEA，该反应仍然可逆，而且经过降解产物分析发现ZHD101将部分ZEA降解成为β-ZEA，仍具有较高的***毒性。 
此外，奥地利Molnar从白蚁后肠中分离出了一种新酵母菌—毛孢子菌属Trichosporon mycotoxinivorans，它的培养物能将ZEN降解为二氧化碳和其它弱紫外吸收的代谢物，从而降低其毒性（Molnar O,Schatzmayr G,Fuchs E,et al.Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov.,a new yeast species useful in biological detoxification of various mycotoxins.Systematic and Applied Microbiology,2004,27:661-671.）。该过程降解ZEA效率较低，而且较难进一步水解成为小分子物质，也未能避免***毒性物的生成。 
Abdullah从玉米地里分离出的假单胞菌ZEA-1可利用ZEN为唯一碳源，并且在12h内可将ZEN减少一半，编码此ZEN降解酶的基因在大肠杆菌中也获得了活性表达（Abdulla D.Altalhi,Bahig El-Deeb.Localization of zearalenone detoxifìcation gene(s)in pZEA-1plasmid of Pseudomonas putida ZEA-1and expressed in Escherichia coli.J Hazard Mater,2009,161:1166-1172.）。 
与此同时，其他研究主要集中于筛选获得各种能降解ZEA的微生物，包括棉花枯萎病菌、假单胞菌、根霉菌、乳酸细菌、枯草芽孢杆菌等，对相关作用酶的发现及降解途径分析较少。 
唐语谦等从玉米耕种的土壤中分离获得了一株可高效降解ZEN的不动杆菌Acinetobacter.sp.SM04，可将ZEA彻底分解成无***毒性的降解产物，降解效率高出国内外文献所报道的其他菌株（Yuanshan Yu,Liping Qiu,Hui Wu,Yuqian Tang,et al.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobacter sp.SM04liquid cultures.Biodegradation,2011,22:613–622.），并从中分离出一个在该过程中起关键作用的过氧化物酶Prx（Yuanshan Yu,Liping Qiu,Hui Wu,Yuqian Tang，et al.Oxidation of zearalenone by extracellular enzymes from Acinetobacter sp.SM04into smaller estrogenic products.World Journal of Microbiology and Biotechnology,2011,27:2675-2681.）。至今还没有关于非过氧化物酶（Oxa）相关信息的报道。 
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa。本发明所用的不动杆菌为Acinetobacter sp.SM04。 
本发明的另一目的在于提供上述不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa的编码基因。 
本发明的再一目的在于提供上述不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa的应用。 
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。 
所述的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa的编码基因A4-Oxa，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。 
所述的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa在降解霉变农作物和饲料及其它食物中的玉米赤霉烯酮毒素上的应用。 
本发明通过培养不动杆菌Acinetobacter sp.SM04，从其培养上清液中分离、纯化得到降解ZEN毒素的非过氧化物酶，经过SDS-PAGE和MALDI-TOF-TOF/MS分析和鉴定得到该非过氧化物酶的两段特异性氨基酸序列。 
基于MALDI-TOF-TOF/MS酶蛋白分析鉴定的蛋白序列，设计引物扩增Acinetobacter sp.SM04ZEN降解酶基因的部分序列，采用High-efficiency  Tail-PCR技术多次扩增、拼接后，得到该酶的全基因核苷酸序列，并翻译成氨基酸序列，同时对该基因进行表达和蛋白功能的验证。 
实验结果表明：从编码Oxa的基因序列SEQ ID NO.5和其氨基酸序列SEQ ID NO.6可知，本发明的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa是一种全新的酶，区别于前期研究成果中从不动杆菌SM04中分离的过氧化物酶Prx，不需过氧化氢的辅助也对真菌毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解能力。 
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果： 
（1）不动杆菌SM04将ZEN降解成为无***毒性产物的过程为一系列酶共同作用的结果，本发明采取一种新方法从中分离得另一个新酶，在无H2O2的作用下降解ZEN，是一种新的非过氧化物酶，并已获得该酶的氨基酸序列及编码基因序列，且在大肠杆菌宿主中表达，表达后的重组Oxa粗酶液具有ZEN降解活力。 
（2）本发明的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa对真菌毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解能力，原核重组表达的Oxa酶可在12h内降解30%以上的ZEN毒素。 
（3）本发明确定了Acinetobacter sp.SM04的玉米赤霉烯酮毒素降解酶Oxa的编码序列，即A4-Oxa基因，不同于过氧化物酶Prx的编码基因序列，且通过Genbank中比对，是一种新的序列，为将来研究酶的活性位点和通过定点突变Oxa酶奠定了基础。 
（4）本发明的不动杆菌ZEN毒素降解酶Oxa在降解玉米赤霉烯酮的过程中，不需要双氧水的协同作用，完全区别于已公开的来源于不动杆菌Acinetobacter sp.SM04的过氧化物酶Prx。 
附图说明
图1是实施例1中Acinetobacter sp.SM04的M2培养物上清液的经过DEAE Sephadex A-50柱（洗脱液：20mM磷酸钠盐缓冲液，pH梯度）、Sephadex G-50柱（洗脱液：10mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0）、DEAE Sephadex A-50柱（洗脱液：20mM磷酸钠盐缓冲液，pH梯度）洗脱后各组分的蛋白质吸收峰图谱。 
图2是实施例1中ZEN毒素降解酶Oxa酶组分（图1中P2）降解ZEN产物的HPLC检测图；其中，图A：ZEN（标准品）；图B：ZEN毒素降解酶Oxa酶组分+ZEN，反应时间12h。 
图3是实施例1中获得的ZEN毒素降解酶Oxa酶组分（图1中P2）SDS-PAGE 电泳分析结果；M：蛋白标准分子量marker(14.4kDa～98kDa)；A1、A2：ZEN毒素降解酶Oxa酶组分。 
图4是实施例4中重组质粒pET-32a(+)-A4-Oxa的双酶切琼脂糖电泳检测结果图；M1：DNA标准分子量Marker(250～10000bp)；M2：DNA标准分子量Marker(200～2000bp)；A：质粒pET-32a(+)；B1、B2：重组质粒pET-32a(+)-A4-Oxa（BamHI和XhoI双酶切）。 
图5是实施例4中A4-Oxa基因在E.coli中诱导表达的SDS-PAGE电泳分析结果图；M：蛋白标准分子量Marker(14.4kDa～116kDa)；A：未诱导的重组菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-A4-Oxa粗酶液；B1、B2：IPTG诱导的重组菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-A4-Oxa粗酶液；C：重组菌BL21(DE3)/pET-32a(+)粗酶液。 
图6是测定实施例4中重组Oxa酶ZEN降解活力的HPLC检测结果图；其中，图A：超纯水+ZEN；图B：重组菌BL21(DE3)/pET-32a(+)粗酶液+ZEN；图C：IPTG诱导的重组菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-A4-Oxa粗酶液+ZEN，反应时间12h。 
图7是ZEN毒素浓度与液相色谱吸收峰面积关系标准曲线图。 
图8是重组Oxa粗酶液降解玉米酒精糟中的ZEN毒素的HPLC检测图，其中，图A是对照组，未加酶液+玉米酒精糟；图B是实验组，重组Oxa粗酶液+玉米酒精糟。 
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。 
不动杆菌Acinetobacter sp.SM04为2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.5524。 
玉米酒精糟购自滨州金通饲料原料加工厂。 
实施例1 
一种新的不动杆菌降解ZEN的非过氧化物酶酶组分的制备，包括以下步骤： 
1.培养：将接种有2%(v/v)Acinetobacter sp.SM04菌悬液(OD600=0.8)的培养物（M2培养基）在30℃的气浴摇床中培养(180r/min)36h至对数生长末期，将液体培养物离心12min（9000×g，5℃)，离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤，滤过液在50℃使用真空旋转蒸发仪浓缩9倍成为粗酶液； 
所用培养基的配方如下： 
M2培养基：15g乙酸钠，2.75g NH4NO3，1.35g K2HPO4·3H2O，1.25g KCl，0.5g MgSO4·7H2O，加入10mL微量元素储备液，加蒸馏水定容至1000mL，混合后调节pH至7.3； 
微量元素储备液的配方：2g/L FeSO4·7H2O，0.5g/L MnSO4·4H2O，0.4g/LCuSO4·5H2O，0.5g/L CoCl6·6H2O和0.4g/L ZnCl2。 
2.将步骤1中的粗酶液加入阴离子型葡聚糖凝胶柱DEAE Sephadex A-50柱(2.0cm×15cm)中，用pH7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的磷酸钠盐缓冲液（20mM）进行梯度洗脱（流速为0.5mL/min），分段收集（每管5mL），测定各管组分的A280nm值，选取A280nm≥1.0的收集管进行ZEN降解酶活力测定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管； 
3.将步骤2获得的ZEN降解酶液在50℃下浓缩9倍，加入到阳离子型葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50柱(2.0cm×30cm)中，用20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.0）洗脱（流速为0.5mL/min），分段收集（每管5mL），测定各管的A280nm值，选取A280nm≥1.0的收集管进行ZEN降解酶活力测定；合并ZEN降解酶活力高于30%的各管； 
4.将步骤3获得的ZEN降解酶组分在50℃下浓缩9倍，重新加入到阴离子型葡聚糖凝胶柱DEAE Sephadex A-50柱(2.0cm×15cm)中，用pH7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的磷酸钠盐缓冲液（20mM）进行梯度洗脱（流速为0.5mL/min），分段收集（每管5mL）；测定各管组分的A280nm值，得到蛋白质吸收峰图谱，如图1；取蛋白质吸收峰图谱中P2所在吸收峰的各管进行ZEN降解活力检测；合并ZEN降解活力高于50%的各管； 
5.将步骤4所得的ZEN降解酶组分在50℃下浓缩9倍，即为最终的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa酶组分。取此非过氧化物酶Oxa酶组分进行ZEN毒素降解活力检测。结果表明此组分可在12h内降解71.2%的ZEN毒素，其液相实验图见图2。 
各管组分的ZEN降解酶活力测定方法如下： 
将0.40mL各管收集液、0.10mL0.25mol/L的Tris-HCl（pH9.0）缓冲液和20μL0.5mol/L H2O2溶液混合均匀，添加10μL ZEN甲醇储备液（ZEN浓度为1mg/mL），置于40℃恒温水浴温育12h，添加0.5mL甲醇终止反应，在12000×g下 离心5min，取30μL上清液用HPLC检测其ZEN残量。以去离子水作为空白对照。结果以相对降解活力表示，相对降解活力（%）=（ZEN的添加量-处理后ZEN的残留量)/ZEN的添加量×100。 
高效液相色谱（HPLC）检测ZEN的条件：色谱柱采用Waters XTerraR MS C18柱(4.6×150mm，5μm)。流动相为乙腈:水:甲醇=46:46:8。柱温30℃，流量为1mL/min。结果采用荧光检测器，激发波长274nm，发射波长450nm。采用外标法定量ZEN的浓度，计算各组分的降解效率。 
实施例2 
ZEN毒素降解酶Oxa酶组分的分析及鉴定，包括以下步骤： 
1、将实施例1中最终得到的ZEN毒素降解酶Oxa酶组分用12.5%(w/v)SDS-PAGE凝胶电泳分析，考马斯亮蓝染色后，结果如图3。 
SDS-PAGE蛋白电泳液：10%（w/v）十二烷基苯磺酸钠（SDS）溶液；1%(v/v)四甲基乙二胺（TEMED）；10%(w/v)过硫酸铵（AP）； 
样品溶解液：2%(w/v)SDS，5%(v/v)β-巯基乙醇，10%(v/v)甘油，0.02%(w/v)溴酚蓝，10mM pH8.0Tris-HCl缓冲液； 
凝胶贮液：30%分离胶贮液，10%浓缩胶贮液； 
分离胶配方：4.9mL单体，5.0mL buffer，3.5mL蒸馏水，2.0mL甘油，50μL10%(w/v)AP，10μL TEMED。 
浓缩胶配方：1.62mL单体，3.10mL buffer，7.78mL蒸馏水，25μL10%(w/v)AP，5μL TEMED。 
其中，单体：30%(w/v)聚丙烯酰胺，0.8%(w/v)交联剂；buffer：3M Tris，0.3%（w/v）SDS，pH8.45。 
凝胶缓冲液：分离胶缓冲液（3.0mol/L pH8.9Tris-HCI缓冲液），浓缩胶缓冲液（0.5mol/L pH6.7Tris-HCI缓冲液）； 
电极缓冲液：0.1%(w/v)SDS，0.05mol/L Tris-HCl； 
染色液：考马斯亮蓝R2500.125g，加入50mL甲醇，10mL冰乙酸，定容至100mL。 
脱色液：冰乙酸75mL，甲醇50mL，加入蒸馏水定容至1000mL。 
2、取出图3凝胶中蛋白条带2进行酶解。酶解条件如下：50%(v/v)乙腈，25mmol/L NH4HCO3，0.02μg/μL胰蛋白酶的水溶液，37℃，16h。将酶解上清液萃取冻干。 
3、完全冻干的样品重新用0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液溶解，然后使用MALDI-TOF-TOF质谱仪进行分析，结果见表1。 
表1Acinetobacter sp.SM04中降解ZEN非过氧化物酶酶组分的蛋白条带2的鉴定结果 
Figure BDA0000464943290000081
实施例3 
ZEN毒素降解酶Oxa基因的克隆 
（1）提取不动杆菌Acinetobacter sp.SM04的总DNA 
取培养至对数期的不动杆菌Acinetobacter sp.SM04细胞1mL，先加入567μL的TE缓冲液，再加入30μL10%SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。加入100μL5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。 
加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4～5min，将上清转入一只新管中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合沉淀DNA。用1mL的体积分数70%乙醇洗涤后，离心，弃乙醇，风干。将DNA悬于无菌水或50μL TE缓冲液中溶解，-20℃保存备用。 
（2）ZEN毒素降解酶Oxa编码基因的获得 
1.引物设计 
基于MALDI-TOF-TOF/MS酶蛋白分析鉴定的蛋白序列，利用Primer Premier5.0引物设计软件设计了以下简并引物来扩增Acinetobacter sp.SM04的ZEN毒素降解酶Oxa基因的部分序列，引物交由上海英潍捷基贸易有限公司合成。 
简并引物1：5′-GTNGGNTTYGGNGAYAAYGAYAAYA-3′（SEQ.3） 
简并引物2：5′-TTYGGNGTNGAYGGNACNTAYTAYT-3′（SEQ.4） 
2、酶基因的获得 
(1)PCR参数设置：以Acinetobacter sp.SM04的DNA为反应模板，反应程序为：98℃预变性1min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，保持45个循环；72℃延伸10min。 
(2)将PCR扩增到的产物用T4连接酶连接到pMDTM18-T载体上并测序，测序结果用NCBI BLAST search program分析。 
(3)采用Lie et al.的High-efficiency Tail-PCR技术扩增上述目标核酸序列的两 端侧翼序列，获得的侧翼序列经测序和拼接后，使用NCBI BLAST Search和Expasy Search程序来分析核酸序列和理论氨基酸序列。 
NCBI BLAST Search结果显示，比对Genbank，ZEN毒素降解酶基因A4-Oxa的碱基序列是一个新的序列。获得的673bp的核苷酸序列与Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2来源的hypothetical protein（GB:CP002177.1）、Acinetobacter oleivorans DR1来源的putative porin（GB:CP002080.1）均有较高的同源性。与CP002177.1对比，存在12bp碱基差异，主要来源于C-T互换，且A4-Oxa在11位缺失一个C碱基。与CP002080.1对比，存在42bp碱基差异，A4-Oxa于11位缺失一个C碱基，由此可知，所获得的核苷酸序列与Genbank中序列存在碱基上的明显差异，且上述两种蛋白均未见ZEN降解活性相关报道。Acinetobacter sp.SM04ZEN降解酶基因A4-Oxa的碱基序列见SEQ ID NO.5，Acinetobacter sp.SM04ZEN降解酶Oxa的氨基酸序列见SEQ ID NO.6（见序列表）。 
实施例4 
ZEN毒素降解酶基因A4-Oxa在大肠杆菌中的表达和功能鉴定 
（1）构建表达载体 
根据实施例3得到的ZEN毒素降解酶Oxa编码基因设计引物，引物包含酶切位点（BamHI、XhoI），引物如下： 
引物1：5'-TGAGGATCCATGTACCAAGCTGAAGTT-3'  ----BamHI 
引物2：5'-ATTCTCGAGTTAGAAGCGGTATGCTGC-3'  ----XhoI 
PCR模板和条件同实施例3； 
得到扩增产物后，用BamHI和XhoI分别双酶切PCR产物和pET-32a(+)载体，将酶切后的PCR产物(包含A4-Oxa的开放阅读框)纯化，并用T4DNA连接酶连接到pET-32a(+)载体中，转入感受态E.coLi BL21(DE3)中，涂布于选择性平板培养基上培养，挑取单菌落，接种于LB液体培养基（含50μg/mL氨苄青霉素）中，使用双酶切和测序的方法来检测转化结果（双酶切结果见图4）。成功转入pET-32a(+)-A4-Oxa质粒的大肠杆菌为阳性转化子，即为E.coLi BL21(DE3)/pET-32a(+)-A4-Oxa。 
（2）诱导表达 
将E.coLi BL21(DE3)/pET-32a(+)-A4-Oxa转化子培养于LB培养基（含50μg/mL氨苄青霉素）中（37℃，250r/min），OD600值达到0.6后，添加1.0mmol/LIPTG，继续培养4h后，将液体培养物离心15min（10000×g，4℃)，弃上清，得 到重组大肠杆菌沉淀物。使用15mL去离子水重新悬浮菌体，超声波细胞破碎仪对细胞进行破碎（频率500Hz，启动两秒，停两秒，共超声10min，冰浴）。离心10min（12000×g，4℃)，除去细胞残渣，收集上清液，即为重组表达的Oxa粗酶液。 
（3）重组Oxa粗酶液SDS-PAGE电泳分析 
取步骤(2)中得到的重组Oxa酶粗酶液10mL，真空浓缩5倍，用12.5%(w/v)SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色后，结果如图5。 
SDS-PAGE蛋白电泳液：10%(w/v)十二烷基苯磺酸钠（SDS）溶液；1%(v/v)四甲基乙二胺（TEMED）；10%(w/v)过硫酸铵（AP）； 
样品溶解液：2%(w/v)SDS，5%(v/v)巯基乙醇，10%(v/v)甘油，0.02%(w/v)溴酚蓝，0.01mol/L pH8.5Tris-HCl缓冲液； 
凝胶贮液：30%(w/v)分离胶贮液，10%(w/v)浓缩胶贮液； 
分离胶配方：6.22mL单体（30%(w/v)丙烯酰胺，0.8%(w/v)交联剂），5.0mL buffer（3M Tris，0.3%(w/v)SDS，pH8.45），2.38mL蒸馏水，2.0mL甘油，50μL10%(w/v)AP，10μL TEMED； 
浓缩胶配方：1.62mL单体，3.10mL buffer，7.78mL蒸馏水，45μL10%(w/v)AP，15μL TEMED； 
凝胶缓冲液：分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液（3.0mol/L0.3%(w/v)pH8.45Tris-HCI缓冲液）； 
电极缓冲液：内槽缓冲液：0.1M Tris，0.1M Tricine，0.1%(w/v)SDS，pH8.25；外槽缓冲液：0.2M Tris pH8.9； 
染色液：考马斯亮蓝R2500.125g，加入50mL甲醇，10mL冰乙酸，定容至100mL。 
脱色液：冰乙酸75mL，甲醇50mL，加入蒸馏水定容至1000mL。 
电泳结果如图5所示，ZEN毒素降解酶Oxa能在E.coli BL21(DE3)/pET-32a(+)-A4-Oxa菌株中大量的诱导表达（B1和B2）；与未诱导的对照组（A）相比，诱导组中出现一条明显的蛋白条带（25kDa位置）。从SDS-PAGE电泳染色图片的条带的浓度上可以推算，重组表达蛋白占细胞总蛋白的50%左右。 
（4）表达产物降解ZEN的测试 
用步骤（2）得到的Oxa粗酶液进行降解ZEN的测试（测试方法同实施例1中所述），结果表明原核重组表达的Oxa粗酶液可在12h内降解32%的ZEN毒素，如图6中所示。原核表达的Oxa粗酶液降解率不高，因未对重组大肠杆菌进行培养 条件的优化，导致Oxa酶的分泌量不大，后期经过培养基及培养条件的优化，可实现Oxa酶更高密度的表达，以获得更高的ZEN毒素降解率。 
应用实施例1 
ZEN毒素降解酶Oxa在降解玉米酒精糟中的ZEN毒素的应用 
（1）测定玉米酒精糟中ZEN毒素的含量 
ZEN标准曲线的绘制：取ZEN甲醇储备液（1mg/mL）分别用甲醇稀释成0.25、0.5、1、2、4、8、16μg/mL工作液，进样30μL，重复测定3次，结果取平均值。高效液相色谱检测条件与实施例1一致。根据浓度与峰面积的关系绘制标准曲线，结果见图7。 
取玉米酒精糟（购自滨州金通饲料原料加工厂）1g，溶解于10mL50%（v/v）甲醇水溶液中，超声振荡半个小时后过滤，滤液继续用纯甲醇萃取2次，合并萃取有机相，40℃下使用真空旋转蒸发仪浓缩干，残留物用1mL甲醇（液相级）溶解，用于高效液相色谱检测，进样30μL，重复测定3次，结果取平均值。高效液相色谱检测条件与实施例1一致。结果表明，玉米酒精糟中ZEN毒素的浓度为424.6μg/kg。 
（2）玉米酒精糟中ZEN毒素的降解 
取玉米酒精糟1g，溶解于10mL50%（v/v）甲醇水溶液中，加入1mL实施4中步骤2所得的重组Oxa粗酶液，调节pH至9.0，40℃下过夜反应后加等体积（1mL）甲醇终止反应。离心（12000×g，5min）取上清液，过0.22μm滤膜，用于高效液相色谱检测，检测条件与实施例1一致。 
结果表明，过夜反应后，ZEN毒素残留量为277.69μg/kg，相对降解率为34.6%，结果见图8。 
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 
Figure IDA0000464943390000011
Figure IDA0000464943390000031
Figure IDA0000464943390000041
Figure IDA0000464943390000051

Claims (3)

1.一种不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa，其特征在于：其氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
2.权利要求1所述的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa的编码基因A4-Oxa，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.权利要求1所述的不动杆菌的ZEN毒素降解酶Oxa在降解霉变农作物和饲料及其它食物中的玉米赤霉烯酮毒素上的应用。
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