CN1235640A - 臭氧诱导的植物基因表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的DNA序列,产生含有新DNA序列新植物的方法,该DNA序列的编码序列经臭氧诱导之后被表达。本发明也涉及所述的新植物和DNA序列用于在植物和植物细胞中产生臭氧反应性基因表达的用途。另外,本发明还涉及新的启动子,通过除去其臭氧反应性能力可增强其特异性。

Description

臭氧诱导的植物基因表达
本发明涉及新的DNA序列，产生含有新DNA序列的新植物的方法，所述DNA序列的编码序列经臭氧诱导后被表达。本发明还涉及所述新植物，和DNA序列在植物和植物细胞中产生臭氧-反应性基因表达的用途。另外，本发明还涉及新的启动子，通过除去其臭氧反应能力可增加其特异性。
在过去的一百年里，较强的工业活动使得北半球陆地上方较低的对流层中臭氧的浓度持续增加(Volz和Kley(1988)，自然，332,240-242)。与此同时，欧洲和北美的臭氧值也达到100nL/L至200nL/L的周期性高峰，(Krupa等，(1995)，环境污染，87,119-126)。
空气污染物臭氧的植物毒性已被完善地检测和报道，例见Heagle(1989),Annu.Rev.Phytopathol,27,397-423；Heath(1994):Alscher,Wellburn(编)“植物对大气环境的反应”,p121-145,Chapman& Hall，伦敦。通常，这种臭氧影响的结果是减少净光合作用，增加早衰，从而会导致植物生长的衰弱和收获产量的降低。
尽管臭氧利用扩散作用由开放的气孔侵入植物细胞，但不论环境中的臭氧浓度如何，叶细胞间空间内的臭氧浓度几乎为零(Laisk等，(1989)，植物生理学，90,1163-1167)。通常假定臭氧与细胞壁和质膜的成分快速反应，并转变为活性氧类，如过氧化物-阴离子，羟基基团和过氧化氢，通过使用电子自旋共振光谱在经臭氧处理的植物材料中可检测到所述的活性氧类(Mehlhorn等，(1990),Physiologia Plantarum,79,377-383)。所谓的“氧化性爆发”，即相对大量的活性氧类的快速发展因改变了植物膜的通透性，灭活了对氧化还原作用敏感的蛋白质和增加了脂质的过氧化而导致对正常细胞功能的显著干扰。
对经臭氧处理的植物所进行的最新试验显示出非特异性防御酶生物合成的增加，所述防御酶的功能是保护活细胞使之抵抗因氧化应力造成的损害(Kangasjarvi等，(1994)，植物细胞和环境，17,783-794)。但迄今为止仍不了解负责臭氧-诱导的基因激活，并将质外体形成的相关信息传递至细胞核心的信号-转导链，即活性氧类。最近讨论的结果是：由氧化应力引起的多种因素可能是信号联系，所述因素在植物的防御反应中一般能起一定的作用，所述因素如：胞质溶胶中钙浓度的增加(Price等，(1994)，植物细胞，6,1301-1310)，水杨酸(Klessig和Malamy(1994)，植物分子生物学，26,1439-1458)和植物激素茉莉酸(Farmer(1994)，植物分子生物学，26,1423-1437)和乙烯(Ecker(1995)，科学，268,667-674)的形成。
对通入臭氧的烟草植物的试验表明：臭氧可导致多种疾病抗性基因，即一些PR-(致病-相关)蛋白表达的增加(Ernst等，(1992)，植物分子生物学，20,673-682；Ernst等，(1996)，植物生理学杂志，148,215-221；Eckey-Kaltenbach等，(1994)，植物生理学，104,67-74)。这些结果表明：由臭氧引起的氧化应力可按与病原体攻击类似的方式影响植物防御基因的表达和调节。目前能利用的有关顺式调节元件和转录因子的信息非常有限，作为对多种环境影响的反应，所述调节元件和转录因子可能在控制非特异性防御基因的基因表达方面起一部分作用(Lee等，(1994)，欧洲生物化学杂志，226,109-114)。然而，根据目前的研究结果，可假定编码PR-蛋白的基因存在分离的或至少仅部分重叠方式的信号转导(Somssich(1994):Nover(编)“植物启动子和转录因子”，p163-179,Springer Publishing House，柏林；Dolferus等，(1994)，植物生理学，105,1075-1087)。
至于参与植物抗毒素合成的1,2-二苯乙烯合酶(STS)的活性，已知在成年植物中环境应力因素可诱导该活性，所述因素如：病原体攻击(Langcake(1981),Physiol.Plant Pathol,18,213-226)，紫外线(Fritzemeier和Kindl(1981),Planta,151,48-52)和臭氧(Rosemann等，(1991)，植物生理学，97,1280-1286)。与之形成对照的是在胚中观察到组成型表达模式(Sparvoli等，(1994)，植物分子生物学，24,743-755)。
1,2-二苯乙烯合酶催化由1分子p-香豆酰基-CoA或肉桂酰-CoA和3单位丙二酰基-CoA合成1,2-二苯乙烯，如白藜芦醇或赤松素。白藜芦醇和赤松素具有植物抗毒素特性和抗真菌活性，并与其它衍生自苯基丙烷代谢的1,2-二苯乙烯联合，作为植物抗毒素在抵抗病原体的防御中行使重要的功能(Hart(1981),Annu.Rev.Phytopathol,19,437-458)。
STS基因被发现于一些不相关的植物种中，如花生(Schroder等，(1988)，欧洲生物化学杂志，172,161-169)，葡萄树(Hain等，(1993)，自然，361,153-156)和松树(Fliegmann等，(1992)，植物分子生物学，18,489-503)，并构建在较大的基因家族中，其含有6个或更多个基因(Lanz等，(1990),Planta,181,169-175；Wiese等，(1994)，植物分子生物学，26,667-677)。
对转基因烟草细胞的实验表明：1,2-二苯乙烯合酶的表达主要在转录水平上被调节，在多个植物种的进化过程中，应力-诱导的信号转导链被保留下来(Hain等，(1990)，植物分子生物学，15,325-335)。
已分离出花生(Arachis hypogaea)和葡萄树(Vitis vinifera)的STS基因(Schroder等，(1988)，文献同上或Hain等，(1993)，文献同上)，并在转基因植物中表达了STS基因(Hain等，(1990)，文献同上或Hain等，(1993)，文献同上)。
已知编码1,2-二苯乙烯合酶的DNA序列，例见欧洲专利EP0309862，德国专利申请DE-A-4107396，欧洲专利申请0464461以及美国专利5.500.367。这些文献描述了1,2-二苯乙烯合酶基因的分离及其生产转基因植物的用途。所得转基因植物对多种植物害虫如真菌，细菌，昆虫，病毒和线虫表现出较强的抗性。含有STS基因的质粒已被保藏于德国微生物保藏中心(DSM),Mascheroder Weg 1B,D-38124,Braunschweig。还保藏了pVstⅠ质粒中的葡萄树VstⅠ-基因，其保藏号为DSM6002(DE-A-4107396,EP-A-0464461，美国专利5.500.367)。
同时还描述了STS编码序列用于产生雄性不育的植物和花颜色有所改变的植物的用途(德国专利申请DE-A-4440200)，但至今仍完全未弄清STS基因表达和臭氧诱导之间可能存在的关系。
同时，有多种迹象表明：为了基于转基因植物中STS基因的表达对疾病产生尽可能有效的抗性，如果植物中异源STS基因的表达(或异源STS基因)首先被进攻病原体刺激，即如果首先被植物和病原体的相互作用所刺激的话较为有利(Fischer和Hain(1994),Current Opinion in Bio-technology,5,125-130；Fischer(1994)“用于植保的1,2-二苯乙烯合酶基因之异源表达的最优化”，Hohenheim大学)。以下观察结果特别赞同这一说法，即病原体-诱导的STS基因表达局限于感染部位，并且具有瞬时特性，这意味着STS的表达相对快地达到最高值，并在48小时之内重新降低(Hain等，(1993)，文献同上)。对转基因烟草植物进行的实验中STS基因在花椰菜花叶病毒的组成型35S RNA启动子的控制下表达，实验结果表明：真菌感染后，所述植物获得的抗病性低于在病原体-诱导的同源STS启动子控制下表达相同基因的植物所获得的抗性(Fischer和Hain等，(1994)，文献同上；Fischer(1994)，文献同上)。无论如何，需要因***STS基因而显示出较强的抗病性的转基因栽培植物中的STS表达只被(和直至)病原体的攻击激活和控制，而不必另外(或以前曾)被不必要的环境应力因素如臭氧所激活和控制。
因此，植保生物技术研究的重要任务是在植物中实现更特殊的防御基因表达，为了以有效的和可控的方式使产生较强抗性植物的分子生物学策略具体化。重要的是除去不必要的，非特异性的环境刺激，如通过臭氧，紫外线，重金属，极端温度和其它非生物刺激诱导某些防御基因。
因此，本发明重要的目的是提供在臭氧诱导的抗性基因表达中直接起作用的新的DNA序列。
本发明的另一个目的是显示除去臭氧诱导的可能性，即消除臭氧对基因表达不必要的刺激。
另外，本发明的重要目的是提供DNA序列，借助于该DNA序列，仅在植物与病原体接触之后，而不必通过臭氧刺激可在转基因植物中表达1,2-二苯乙烯合酶基因。
正如在本文开始时所述，可观察到对植被也有显著影响的臭氧影响的稳定增加。目前，对空气中臭氧浓度的观察和测定已构成化学，物理学，和生物学，环境学研究的焦点。用于这种研究的重要工具是所谓的生物监测器，借助于该工具易于定性和定量地测定臭氧影响及其后果，尤其是生物毒性效果。
因此，本发明的另一目的是提供可用于产生定向的臭氧可诱导的启动子的DNA序列。借助于这种启动子可使生物技术研究领域中众所周知的所谓的报道基因被用作生物监测器，由简单的酶促试验即可证明所述报道基因的表达。
本发明的另一目的是提供一种***，借助于该***，可使某些基因在必要时，如臭氧影响较大的情况下能被“打开”，所述基因的表达产物能解毒细胞中的氧类。换句话说，通过提供负责臭氧-反应基因之调节的DNA序列，应该可以提供所述基因的臭氧-诱导的表达，所述基因如过氧化氢酶和/或超氧化物歧化酶基因。因此，本发明的目的是提供可用于产生臭氧诱导的，细胞“臭氧保护***”的DNA序列。随着下列描述的进行，本发明的其它目的将是显而易见的。
通过独立权利要求的主题，特别是根据本发明所提供的直接参与植物中臭氧诱导的基因表达的DNA序列可解决这些问题。
我们惊奇地发现某些植物核酸序列直接参与臭氧-反应性STS表达。而对转基因的烟草胚和植物(在不同长度的5’缺失的葡萄树VstⅠ启动子的控制下表达大肠杆菌中常规的报道基因uidA，所述基因编码β-葡糖醛酸酶)所作的实验表明：至少一些负责真菌诱导的顺式元件(cis-element)位于含有碱基对-140至-280(从转录起点处计算)的启动子范围内(Fischer(1994)，文献同上)，含有碱基对-280至-430的VstⅠ序列范围是通过臭氧强烈激活基因表达所必需的。根据我们的实验，可以表明：剩下直至并包括-280的唯一碱基对的VstⅠ启动子(因而缺乏位于其上游的VstⅠ-启动子序列)不再是臭氧可诱导的启动子。然而，如上所述，所述变短的启动子仍能表现出由其控制的编码序列的病原体-诱导的基因表达(见Fischer(1994)，文献同上)。
上述分析也让我们怀疑用臭氧处理植物与植物细胞中乙烯生物合成或释放增加之间的关系，因此，臭氧诱导的基因表达中乙烯反应元件的参与不能被排除，通过考虑最近在乙烯反应能力方面被讨论的熟悉的顺式元件(Sessa等，(1995)，植物分子生物学，28,145-153；Shinshi等，(1995)，植物分子，27,923-932)，在臭氧诱导的STS基因表达中不能排除含有碱基对-283至-273的VstⅠ启动子之序列范围的参与。
因此，首次在本文中描述的臭氧反应性DNA序列范围含有葡萄树VstⅠ启动子的碱基对-270至-430。
因此，本发明涉及权利要求1所限定的DNA序列(SEQ ID NO:1):
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTT
TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAAT
GTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACC
CAATAGCCAA T，
所述序列是植物中臭氧诱导的基因表达所必需的。本发明优选的DNA序列涉及得自葡萄树的DNA序列，特别优选得自葡萄树1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ的DNA序列(碱基对-270至-430)。
另外，本发明涉及至少缺乏含有VstⅠ基因之碱基对-270至-430的DNA序列的VstⅠ基因启动子区域。优选本发明涉及仅含有VstⅠ基因翻译起始点至碱基对-270的序列范围的VstⅠ基因启动子区域。特别优选缺乏VstⅠ基因之序列范围-270至-430的启动子区域能赋予植物病原体诱导的基因表达。
本发明也涉及嵌合的核酸分子，其中***了VstⅠ基因之碱基对-270至-430的DNA序列或至少***此序列范围的片段。特别优选本发明的嵌合核酸分子因VstⅠ基因之碱基对-270至-430的DNA序列或至少其片段的存在可为含有所述核酸分子的植物提供编码区的臭氧诱导的表达。
核酸分子可以是任何核酸分子，尤其是DNA或RNA分子，如cDNA，基因组DNA,mRNA等。它们可以是天然产生的分子或通过基因技术或化学合成方法制备的分子。
目前，通过利用本发明的DNA序列，启动子区域，核酸分子或载体，可以利用基因技术方法以使植物细胞显示出臭氧诱导特性的方式突变所述植物细胞。另外，可以利用基因技术方法以使植物细胞显示出一个或多个基因不再能被臭氧诱导，但优选主要被病原体诱导之特性的方式突变所述植物细胞，所述基因因权利要求1所述DNA序列或衍生自该序列的DNA序列或与所述DNA序列同源的DNA序列而天然地可被臭氧诱导。
本发明特殊的优点是这一事实：可通过在基因中缺失权利要求1所述的DNA序列，或至少缺失其片段来消除植物和植物细胞中天然可被臭氧诱导的基因的臭氧诱导，所述基因中天然含有此DNA序列或可衍生自此DNA序列的DNA序列或与所述DNA序列同源的DNA序列。
本发明的另一优点是通过使用本发明的核酸序列能使植物和植物细胞中不能或基本上不能天然地被臭氧诱导的基因显示出能被臭氧诱导的特性。在优选的实施方案中，负责臭氧诱导之表达的核酸分子或至少其片段控制着基因表达，所述基因的基因产物能解毒植物细胞中由臭氧引起的除别的以外还可产生的活性氧类。在特别优选的实施方案中，核酸分子控制过氧化氢酶和/或超氧化物歧化酶基因的表达。
在其它的实施方案中，负责臭氧诱导之基因表达的DNA序列控制着报道基因的表达，为了定量和/或定性地测定臭氧浓度和评价臭氧的影响可测定报道基因的表达。这种报道基因可以是例如植物生物技术中常规的大肠杆菌编码β-葡糖醛酸酶(GUS)的uidA基因，萤光素基因或其它基因。生物技术，生物化学或分子生物学领域的每一位技术人员都熟悉适当的报道基因。
另外，本发明涉及含有上述DNA序列或其启动子区域或其片段的载体，因此，本发明也涉及基因技术中常见的含有本发明的上述核酸分子的载体，特别是质粒，粘粒，病毒，噬菌体和其它载体，如有必要，可使用所述载体将所述核酸分子转移到植物或植物细胞中。
本发明也涉及含有本发明核酸分子的经转化的微生物，如细菌，病毒和真菌。
本发明的另一个目的是提供植物和植物细胞，所述植物和植物细胞的特征在于缺乏在植物中可天然地通过臭氧诱导的基因的臭氧诱导的表达。
通过提供负责臭氧诱导的DNA序列和通过利用缺乏所述序列的启动子，因而可以不再为受该启动子控制的植物和植物细胞中的基因提供臭氧诱导的基因表达解决了这一难题。
通过提供本发明的DNA序列可类似地解决为不能天然地被臭氧诱导的基因提供臭氧反应性基因表达的难题，因此，利用了在臭氧存在的条件下可特异性地确定某些特性的植物和植物细胞。
优选的实施方案涉及经转化的植物和植物细胞，其中基因经臭氧诱导而表达，其基因产物能解毒植物细胞中的活性氧类。在此方面特别优选过氧化氢酶和/或超氧化物歧化酶基因。或者，也可以产生植物和植物细胞(包括原生质体)，所述植物和植物细胞经臭氧诱导后显示出所谓的报道基因的特性，所述报道基因必要时可用作生物监测器。
因此，本发明的主题是转基因植物，所述转基因植物含有整合至植物基因组的如上所述的重组核酸分子，这种植物在理论上可以是任何植物，优选这种植物是单子叶或双子叶的有用植物。单子叶植物的例子是属于下列属的植物：燕麦，小麦，黑麦，大麦，水稻，稷，狼尾草，狗尾草，小米，玉米。有用的双子叶植物如棉花，豆科植物，如豆，尤其是苜蓿，大豆，油菜，番茄，甜菜，马铃薯，观赏植物，树。其它有用的植物可以是产果植物(尤其是苹果，梨，樱桃，葡萄树，柑橘，凤梨和香蕉)，油棕榈，茶树和可可灌木，烟草，西沙尔麻以及药用植物，如萝芙木属植物和洋地黄。特别优选谷类植物，如小麦，黑麦，燕麦，大麦，水稻，玉米和黍，甜菜，油菜，大豆，番茄，马铃薯和烟草。
另外，本发明的主题是本发明植物的增殖材料，如种子，果实，插条，块茎，根状茎等以及这种植物的组成成分，如植物细胞，原生质体和愈伤组织。
植物细胞包括分化的和未分化的植物细胞(包括原生质体)以及其中核酸分子整合至植物基因组中或以自主分子的形式存在(包括瞬时转化)的植物细胞(包括原生质体)。
在另一个实施方案中，本发明涉及已被上述重组核酸分子或载体转化或接种的宿主细胞，特别是原核或真核细胞，和衍生自所述宿主细胞并含有所述核酸分子或载体的细胞。宿主细胞可以是细菌或真菌细胞以及植物或动物细胞。
本发明的目的还在于描述生产植物和植物细胞的方法，所述植物和植物细胞的特征在于在植物和植物细胞中的其表达能天然地被臭氧刺激的基因缺乏臭氧诱导的表达。
通过利用生产新的不具有这种天然产生的臭氧诱导的基因表达的植物和植物细胞的方法可解决这一难题。
如上所述，本发明的另一目的是提供在臭氧刺激后表达这种基因的植物和植物细胞的生产方法，所述基因的表达天然地不被，或基本上不被臭氧激活。通过生产植物和植物细胞的方法可解决这一难题，所述植物和植物细胞在本发明的DNA序列或至少其片段***天然不能被臭氧诱导的基因或仅在很低水平上被臭氧诱导的基因之后，经臭氧刺激可表达这种基因。
有多种生产这种新植物或植物细胞的方法，首先，通过常规的基因技术转化方法，以新的核酸分子整合至植物基因组的方式(这意味着产生稳定的转化体)突变植物或植物细胞。
根据本发明，可通过包括下列步骤的方法生产因缺乏本发明的核酸序列或至少其片段而不再显示出天然含有所述序列之基因的臭氧诱导现象的植物或植物细胞：
a)从基因中缺失如权利要求1所限定的DNA序列，或能衍生自所述序列的序列，或与所述序列同源的序列，或至少缺失这种序列的片段，所述基因缺失了本发明的DNA序列之后，包括植物细胞中可能被调节的转录和翻译所必需的调节元件，并具有至少一种编码序列，以及可能有的用于终止转录和给各个转录物加上poly-A-尾的终止信号。
b)用步骤a)产生的基因或核酸分子转化植物细胞，和
c)可以再生转基因植物和增殖植物。
可选择的另一种方法是：在步骤a)中不必缺失负责臭氧诱导的序列，只需通过例如诱变将所述序列或至少其片段灭活或阻断，使其在基因中以失活的形式存在。不论以何种方式缺失臭氧反应性基因的序列范围，利用常规方法并借助于重组基因技术(例见Sambrook等，(1989)，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)
可进行所有的操作检测。
在特别优选的实施方案中，在步骤b)中被转移至植物或植物细胞的核酸分子含有允许例如编码序列经病原体诱导而进行基因表达的调节元件。
根据本发明，可通过包括下列步骤的方法生产因本发明核酸序列或至少所述序列的片段存在而显示出臭氧诱导的基因表达的植物或植物细胞，所述核酸序列是含有该序列之基因的臭氧诱导的表达所必需的或共同负责所述表达：
a)在天然地不被，或基本上不被臭氧诱导表达的基因中***至少一种在植物中可产生臭氧诱导的基因表达的本发明的DNA序列，或衍生自所述序列的序列，或与所述序列同源的序列，或至少***所述序列的片段。
b)用步骤a)产生的具有在植物细胞中表达所天然必需的所有元件的基因或核酸分子转化植物细胞，和
c)可以再生转基因植物和增殖植物。
在优选的实施方案中，涉及的基因是过氧化氢酶歧化酶，超氧化物歧化酶或一般的报道基因。
本发明的另一目的是显示本发明核酸序列有利的应用。
因此，本发明包括新的DNA分子用于生产上述本发明植物和植物细胞的用途，所述植物和植物细胞的特征在于或者缺乏正常情况下受臭氧影响的某些表型区别性标志，或者就是因为本发明DNA序列的存在，通过臭氧诱导的特性即可将它们自身与非转基因植物和植物细胞区分开。
另外，本发明包括本发明的核酸分子用于生产其特征在于病原体诱导的而不是臭氧诱导的抗病性有所增加的植物的用途。
本发明也涉及本发明的核酸序列或其片段用于检测和鉴定臭氧反应性核酸元件的用途。
技术人员通过应用常规的分子生物学方法，如杂交实验或DNA蛋白质结合研究可鉴定这种臭氧反应性核酸元件。例如，第一步可从经臭氧处理的组织中分离poly(A)*RNA，然后建立cDNA库。第二步可借助于基于未经处理之组织的poly(A)*RNA分子的cDNA克隆，利用杂交来鉴定第一个库中的那些克隆，所述杂交中相应的poly(A)*RNA分子在臭氧处理过程中被严格诱导。借助于以此方式鉴定的cDNA，随后可分离具有臭氧反应性元件的启动子。当检查和鉴定这些分离的启动子时，核酸序列和分子可能是有用的工具。
本发明的主题也包括与本发明的上述核酸分子之一或上述DNA序列之一杂交的核酸分子或其片段。在本发明范围内，术语“杂交”指的是在常规杂交条件下，优选在严紧条件下进行的杂交，所述条件描述于例如Sambrook等，(1989)，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。
可从例如基因组文库或cDNA文库中分离与本发明的分子杂交的核酸分子。
通过使用本发明的核酸分子，或所述分子的片段或这种分子的反向互补物，根据标准方法(例见Sambrook等，文献同上)杂交即可实现这种核酸分子的鉴定和分离。
因此，本发明也涉及本发明DNA序列或其片段用于从植物或其它生物体中鉴定和分离同源序列的用途。
例如，精确地或大体上具有本发明核苷酸序列的核酸分子或这种序列的片段可用作杂交探针。用作杂交探针的片段也可以是合成的片段，借助于常规的合成技术可产生这种合成片段，该片段的序列基本上相当于本发明核酸分子的序列。一旦鉴定和分离出与本发明核酸分子杂交的基因，必需测定序列并分析其特性。为此，技术人员可使用大量分子生物学，生物化学和生物技术的标准方法。
与本发明的核酸分子杂交的分子也包括上述DNA分子的片段，衍生物和等位基因变体，所述DNA分子含有活性形式或失活形式的臭氧反应性序列，或者其特征在于它们不再具有这种序列。本文中所用术语“衍生物”指的是这些分子的序列与上述核酸分子之序列仅在一个或几个位置上有差别，在很大程度上与所述序列同源。在此方面的同源性指的是序列同一性至少为40％，特别是同一性至少为60％，优选为80％以上，特别优选为90％以上。缺失，添加，取代，***或重组可导致得自上述核酸分子的衍生物。
至于与上述分子同源并构成这种分子的衍生物的核酸分子，它通常包括这种分子的变体，所述变体具有修饰，但行使相同的生物学功能。这些变体可包括天然产生的变异，如得自其它生物体的序列，或突变，所述突变中这些修饰可天然产生或通过定点诱变导入。另外，变异可涉及合成产生的序列。至于等位基因变体，它们可以是天然产生的，也可以是合成产生的变体，或通过重组DNA方法产生的变体。
为了将外源基因***高等植物或其细胞，可使用大量克隆载体，所述载体含有大肠杆菌复制信号和用于选择经转化的细菌细胞的标记基因。这种载体的例子是pBR322,pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。可在适当的限制性切割位点处将所需序列***载体中，将所得质粒用于转化大肠杆菌细胞，在适当的培养基中培养经转化的大肠杆菌细胞，随后收获细胞并裂解之，回收质粒。通常将限制性分析，凝胶电泳和其它生物化学，分子生物学方法用作分析方法以鉴定所得的质粒DNA。每次操作后，裂解质粒DNA，将所得的DNA片段与其它DNA序列连接，每个质粒DNA序列可被克隆至相同的或其它的质粒中。
可使用很多众所周知的方法将DNA导入植物宿主细胞中，技术人员可毫不困难地确定各个适当的方法。这些技术包括：通过使用根瘤农杆菌或毛根农杆菌作为转化介质用T-DNA转化植物细胞，原生质体融合，将分离的DNA直接基因转移至原生质体中，DNA电穿孔，利用biolistic方法导入DNA以及其它方法。转化过程中可产生稳定的以及瞬时的转化体。
当将DNA注射和电穿孔至植物细胞中时，对所用的质粒没有特殊的需求，直接基因转移也是如此。可使用简单的质粒，如pUC衍生物。然而，如果需由以此方式转化的细胞再生整个植株，需要选择性标记基因的存在。本领域技术人员熟知通常的选择性标记，对于他们而言不难选择适当的标记，通常使用的选择性标记是使经转化的植物细胞对杀虫剂或抗生素具有抗性，所述杀虫剂或抗生素如卡那霉素，G418，博来霉素，潮霉素，氨甲碟呤，glyphosate，链霉素，磺酰脲，庆大霉素或膦丝菌素等。
根据所选择的将基因导入植物细胞中的方法，也需要另外的DNA序列，例如，如果使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，至少应将Ti或Ri质粒中所含T-DNA的右边界，但通常将其右和左边界作为侧翼区与被导入的基因连接。
如果使用农杆菌转化，需导入的DNA必需被克隆至特殊的质粒中，即或者克隆至中间质粒中或者克隆至二元载体中。由于存在与T-DNA中的序列同源的序列，通过同源重组可将中间质粒整合到农杆菌的Ti或Ri质粒中。另外，后者包括T-DNA转移所需的vir-区域。中间载体不能在农杆菌中复制，利用辅助质粒可将中间质粒转移至根瘤农杆菌中(接合)。二元载体可在大肠杆菌以及农杆菌中复制，它们含有选择性标记基因和接头或多接头，框内还含有T-DNA右和左边界区域。它们可以直接被转化至农杆菌中(Holster等(1978)，分子和普通遗传学，163,181-187)。用作宿主细胞的农杆菌应含有具有vir-区域的质粒，vir-区域是T-DNA转移至植物细胞所必需的。可以存在另外的T-DNA，将按所述方式转化的农杆菌用于转化植物细胞。
已深入研究了T-DNA用于转化植物细胞的用途，有关内容详细描述于EP120515；Hoekema：二元植物载体***，OffsetdrokkerijKanters B.V,Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等，(1993),Crit.Rev.Plant.Sci,4,1-46和An等，(1985),EMBO J,4,277-287。
为了将DNA转移至植物细胞，可将植物外植体与根瘤农杆菌或毛根农杆菌一起适当地培养。在含有抗生素或杀虫剂以选择经转化细胞的适当培养基中，由被感染的植物材料(叶片，茎节，根，也有原生质体或悬浮培养的植物细胞)可再生出整个植株。根据常规的再生方法，使用众所周知的培养基可进行植物的再生。然后检查按上述方式得到的植物或植物细胞中被导入的DNA的存在。通过应用biolistic法或原生质体转化导入外源DNA的其它方法是已知的(例见Willmitzer L,(1993)，转基因植物：Biotechnology,A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H.J.Rehm.G.Reed,A.Puhler,P.Stadler编)，vol.2,627-659,V.C.H.Weinheim-纽约-Basel-Cambridge)。
尽管通过Ti质粒载体***并借助于根瘤农杆菌转化双子叶植物或其细胞的方法已被完善地建立，但新的研究表明单子叶植物或其细胞也很能接受用基于农杆菌的载体转化(Chan等，(1993)，植物分子生物学，22,491-506；Hiei等，(1994)，植物学杂志，6,271-282；Deng等，(1990)，中国科学，33,28-34；Wilmink等，(1992)，植物细胞报道，11,76-80；May等，(1995),Bio/Technology,13,486-492；Conner和Domiss,(1992)，国际植物科学杂志，153,550-555；Ritchie等，(1993)，转基因研究，2,252-265)。
转化单子叶植物或其细胞的另外的***是利用biolistic setup转化(Wan和Lemaux,(1994)，植物生理学，104,37-48；Vasil等，(1993),Bio/Technology,11,1553-1558；Ritala等，(1994)，植物分子生物学，24,317-325；Spencer等，(1990),Theor.Appl.Genet,79,625-631)，原生质体转化，部分透化之细胞的电穿孔和利用玻璃纤维导入DNA。
以一般的方法在植物内培养经转化的细胞(见McCormick等，(1986)，植物细胞报道，5,81-84)。正常地培养所得植物，并用具有相同的，经转化的遗传性状或其它遗传性状的植物嫁接。所得的各个杂交植物具有各自的表型特性。
应培养两代或更多代以确保表型特性能稳固地维持和增殖。也应收获种子以确保各个表型或其它特性能得以维持。
通过利用一般的方法可确定其中新的核酸分子为纯合的转基因品系，另外，可检查表型行为中存在的或不存在的臭氧反应能力并与半杂合品系的相比较。
一般也可将含有本发明核酸分子的植物细胞作为植物细胞(包括原生质体，愈伤组织，悬浮培养物等)进一步培养。
本发明的另一目的是本发明的核酸分子，或这种分子的片段，或这种分子的反向互补物用于从植物或其它生物体中鉴定和分离包括臭氧反应元件的同源分子的用途。至于术语“同源性”的定义可参见上文给出的定义。
为了解释本发明给出了下列实施例。
实施例
实施例1：
在二元载体pPCV002中将VstⅠ启动子的5’-缺失构建为GUS融合结构
葡萄树VstⅠ基因的5’非编码序列范围(下文称之为启动子)由1570个碱基对组成。此启动子的序列公开于德国专利申请DE4107396和Fischer(1994)，文献同上中，借助于使用下列寡核苷酸作为引物的通常的聚合酶链反应和含有整个VstⅠ基因(DE-A-4107396；Fischer(1994)，文献同上)的质粒pVstⅠ，扩增所述启动子的序列以作为模板：
5’-CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT-3’(引物1,SEQ ID NO:2)
5’-CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT-3’(引物2,SEQ ID NO:3)。
根据Perking Elmer(Norwalk,USA)的方法，使用由Perkin Elmer提供的天然Taq DNA聚合酶进行PCR，随后用限制性酶HindⅢ(此限制性位点位于引物1的5’端)和BamHⅠ(此限制性位点位于引物2的5’端)重新切割在一般的PCR条件下扩增的DNA片段，并通过pUC18-多接头的HindⅢ和EcoRⅠ限制性切割将所得片段与得自载体pBI101.2(Jefferson(1987),Plant Mol.Biol.Reporter,5,387-405)且含有大肠杆菌β-葡糖醛酸酶报道基因(GUS,uidA)以及根瘤农杆菌nos基因终止信号的BamHⅠ/EcoRⅠ片段一起亚克隆至pUC18-质粒中。使用常规的分子生物学方法和辅助物(例如Sambrook等，(1989)，文献同上)进行所有的克隆步骤；用于克隆的限制性酶和其它酶得自Boehringer Mannheim。因此，所得克隆(pUC-VstⅠ/GUS)含有VstⅠ启动子与GUS基因的翻译融合，其中阅读框中的前5个STS密码子通过BamHⅠ切割与GUS基因连接。利用酶促链终止法(Sanger等，(1977),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467)，通过使用Pharmacia(Freiburg)之T7测序试剂盒检查融合转换之序列范围以及VstⅠ启动子序列的正确性。
下文将解释5’缺失突变体在二元载体pPCV002(Koncz和Schell,(1986),Mol.Gen.Genet,204,383-396)中的克隆。在大多数情况下可使用pUC18亚克隆作为中间载体，因为与相对较大的二元载体相比，较小的pUC质粒易于操纵。
质粒的命名源于从位于距起始密码子73个碱基对的转录起始点开始计算的各个启动子片段的大致长度(Hain等，(1993)，文献同上；Fischer(1994)，文献同上)。用于逐渐缩短VstⅠ启动子的限制性位点示于图1。
-p1500GUS：含有完整的STS启动子以及GUS基因的HindⅢ/EcoRⅠ片段分离自上述质粒pUC-VstⅠ/GUS，此片段被***pPCV002多接头中的限制性位点HindⅢ和EcoRⅠ之间。
-p1060GUS：通过限制性切割BamHⅠ和SspⅠ从pUC-VstⅠ/GUS中分离1130bp的启动子片段并将此片段克隆至经BamHⅠ/HincⅡ线性化的pUC18中(得到pUC1130)，随后从pUC-VstⅠ/GUS中分离出BamHⅠ/EcoRⅠ形式的GUS基因，并将GUS基因克隆至pUC1130的BamHⅠ位点和EcoRⅠ位点之间。最后，通过HindⅢ/EcoRⅠ双消化分离融合物并经由相同的位点***pPCV002的多接头中。
-p930GUS：通过限制性酶BamHⅠ和HincⅡ从pUC-VstⅠ/GUS中分离出1.0kb的启动子片段并经由相同的位点***pUC18的多接头中(得到pUC1000)，接下来的操作与p1060GUS中的类似。
-p740GUS：从质粒pUC-VstⅠ/GUS中分离出大致1.6-kb-长的HindⅢ/BamHⅠ启动子片段并用限制性酶DraⅠ消化。随后，经由限制性位点BamHⅠ和HincⅡ将所得的810-bp-长的BamHT/DraⅠ片段克隆至pUC18中(得到pUC810)，随后从pUC-VstⅠ/GUS中分离出BamHⅠ/EcoRⅠ片段形式的GUS基因，并将GUS基因克隆至pUC810的BamHⅠ位点和EcoRⅠ位点之间，最后，通过HindⅢ/EcoRⅠ双消化分离融合物并经由相同的位点***pPCV002的多接头中。
-p550GUS：用限制性酶AF1Ⅱ消化pUC-VstⅠ/GUS，根据厂商说明用Klenow酶(Boehringer Mannheim；dNTP，也得自BoehringerMannheim)补平突出的5’端，随后用限制性酶BamHⅠ重新切割，将所得的620bp-启动子片段连接至用BamHⅠ/HincⅡ线性化的pUC18中(得到pUC620)，接下来的操作与p1060GUS中的类似。
-p500GUS：通过BamHⅠ/HaeⅢ双消化从pUC-VstⅠ/GUS中分离出570bp-长的启动子片段并连接至用BamHⅠ/HincⅡ线性化的pUC19载体中(得到pUC570)，接下来的操作与p1060GUS中的类似。
-p430GUS：使用限制性酶SnaBⅠ使上述质粒pUC1000线性化，然后用HincⅡ消化，再重新连接线性化的载体，从而缺失了-930至-430之间500个碱基对的启动子(-＞pUC500)，接下来的克隆与pUC1060GUS中的类似。
-p280GUS：用限制性酶BanⅡ消化pUC-VstⅠ/GUS，用K1enow酶补平突出的5’端，随后用限制性酶BamHⅠ消化线性化的载体，分离出350-bp-长的平端/BamHⅠ-启动子片段之后，接下来的克隆与p1060GUS中的类似。
-p140GUS：用限制性酶NsiⅠ和PstⅠ消化上述pUC亚克隆pUC620，随后纯化线性化的载体并重新连接，这可导致启动子序列-550至-140的缺失(得到pUC210)，随后从pUC-VstⅠ/GUS中分离出BamHⅠ/EcoRⅠ片段形式的GUS基因，并将GUS基因克隆至pUC1130的BamHⅠ位点和EcoRⅠ位点之间，最后，通过HindⅢ/EcoRⅠ双消化分离融合物并经由相同的位点***pPCV002的多接头中。
-p40GUS：通过NheⅠ/EcoRⅠ双消化从pUC-VstⅠ/GUS中分离出110bp的启动子片段以及GUS基因，随后将此片段克隆至经XbaⅠ/EcoRⅠ线性化的pPCV002中。
-pΔGUS：用限制性酶BamHⅠ消化结构p1500GUS，随后重新连接纯化的载体(cleaned vector)，因此，通过载体pPCV002多克隆位点中天然含有的除HindⅢ位点以外的BamHⅠ位点(Koncz和Schell(1986)，文献同上)可消除整个启动子片段。
-p35SGUS：从表达载体pRT99GUS(Topfer等，(1988)，核酸研究，16,8725)中以HindⅢ片段的形式分离出用作阳性对照的花椰菜花叶病毒35S RNA启动子与GUS基因的融合物，并***pPCV002的多克隆位点。
实施例2：
转基因植物的植物材料，植物转化和再生
在26℃,3000勒和16小时光周期的条件下，在含有1％蔗糖的无激素1/2 LS-培养基(Linsmaier和Skoog(1965)，植物生理学，18,100-127)中将烟草品种Petit Havana SR1(Maliga等(1973),Nature NewBiol,224,29-30)培养成无菌幼芽培养物。6-8周的间隔之后，将芽节断转移至新鲜的LS培养基中。为了用根瘤农杆菌转化叶切片(Horsch等，(1985)，科学，227,1229-1231)，将无菌幼芽培养物2-3cm长的叶压成直径为1cm的切片，并与含有上述质粒结构之一的农杆菌悬浮液(约109个细胞/ml YEB培养基)一起保温5分钟，于26℃，将经保温的叶节断置于无激素的LS培养基上放2至3天，其时，细菌长满叶节断，随后用不含激素的液体LS培养基洗涤叶节断，并将该叶节断置于含卡那霉素(75μg/ml；Sigma,Munich)，头孢噻肟(500μg/ml；Hoechst,Frankfurt)和苄氨基嘌呤(BAP,0.5mg/l；Duchef,Haarlem,TheNetherlands)的LS培养基上。2至3周后，可以看见经转化的芽，该芽生根于含75μg/ml卡那霉素和100μg/ml头孢噻肟的无激素LS培养基上。
按下述方法产生用于转化烟草叶节断的农杆菌培养物：首先将上述pPCV002衍生物***大肠杆菌转移菌株S17-l(Simon等(1983),Bio/Technology,1,784-790)中。这可产生感受态的S17-1大肠杆菌细胞，根据Taketo(1988),Biochem.Biophys.Acta,949,318-324或Hanahan(1983)，分子生物学杂志，166,557-580所述方法用各个质粒转化感受态细胞，随后，在相关的培养基中将含有各个二元载体的大肠杆菌菌株和根瘤农杆菌菌株GV3101 C58C1 Rifr pMP90RK(Koncz和Schell(1986)，文献同上)培养至OD580=1.0。使用下列条件培养大肠杆菌：37℃，常规的YT培养基(Miller(1972)，分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)：细菌用胰蛋白胨0.8％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v),NaCl0.5％(w/v,pH7.0)。为了培养根瘤农杆菌，于28℃使用YEB培养基(牛肉膏0.5％(w/v)，酵母提取物0.1％(w/v)，细菌用胰蛋白胨0.5％(w/v)，蔗糖0.5％(w/v),MgSO4 2mM,pH7.2)。为了进行接合，通过于1500×g离心5分钟分离细菌，并用新鲜制备的10mM MgSO4溶液将细菌洗涤两次，然后以1∶1的比率混合供体(大肠杆菌)和受体(根瘤农杆菌)并滴在YEB琼脂平板上。28℃保温16小时后，用10mM MgSO4溶液冲洗细菌菌落，将10-2,10-3和10-4的稀释液平铺在YEB选择平板上。于28℃，由单个培养物培养用于转化烟草的农杆菌培养物。
通过芽培养增殖各含有上述VstⅠ启动子/GUS融合物之一的转基因烟草芽，并将所述烟草芽部分转移至土壤中，在正常条件下(22℃,60％相对大气湿度，约15,000勒)于温室中培养至开花。利用羊皮纸袋保护花免受外源传粉，4至6周后收获成熟的含F1-代种子的种子荚。为了在温室中进行生物学试验，将F1-代的种子平铺在含75μg/ml卡那霉素的LS培养基上，在无菌条件下，直接在荚外进行这些操作，或消毒表面后(1．用无菌水粗略地洗涤；2．在70％乙醇中保温2分钟；3．在3％的NaOCl(13％的活性氯)中保温10分钟；4．用水洗涤3次；5．在安全工作区的分层空气流中干燥)进行这些操作。于25-26℃,2000-3000勒和60％大气湿度下，在含75μg/ml卡那霉素的LS培养基上培养约2周后，可以明显地区分卡那霉素抗性烟草胚和卡那霉素敏感的烟草胚。与敏感的胚相比，抗性胚显示出明显的初生根生长。除了子叶以外，2周后在抗性胚中还可辨认出初生的叶，在这种“四叶阶段”，将抗性F1-胚转移至土壤中，使之变得结实后，再在适当条件下进一步培养。
实施例3：
植物培养，臭氧处理和叶的收获
为了进行臭氧处理，首先将转基因的卡那霉素抗性的烟草胚从琼脂平板上转移至花盆中，所述花盆中含有标准基质(T型/Fruhstofer/Lauterbach)和Pearlit的2∶1混合物，在气候室中，以12小时-昼/夜周期，15,000勒，白昼温度为25℃，夜晚温度为20℃，大气湿度为65-70％和过滤空气的条件将所述烟草胚培养3周。
随后，使烟草植株经受单次臭氧脉冲10小时，然后在无污染的，经过滤空气中保温2-14个小时。在特定的气候条件下，于置于气候室中的密闭的有机玻璃盒中进行所有的通气实验。臭氧处理总在早上9点钟开始，并延续完一天的周期。通过在干燥的氧气中放电可产生臭氧，在计算机的控制下进行剂量安排和分析(Langebartels等，(1991)，植物生理学，95,882-889)。从植株的顶端至底部计数烟草植株的叶，然后按叶数目1-10分类，其中第一片叶至少为8cm长。在臭氧处理开始后的不同的时间点将烟草叶(从1-10分类)各冷冻于液氮中，并储存于-80℃中。
实施例4：
β-葡糖醛酸酶活性试验
严格按照Jefferson(1987)，文献同上或Jefferson等(1987),EMBOJ,6,3901-3907所述，使用4-甲基-umbelliferyl-葡糖苷酸(MUG,Sigma,Munich)进行GUS酶活性的荧光计分析。用荧光光度计(PerkinElmer LS-2B滤片荧光计)在石英流式池中测定产物4-甲基伞形酮(MU)的浓度。植物提取物中的GUS活性被计算为pmol MU×mg-1×min-1。根据Bradford(1976),Analyt.Biochem,72,248-254所述测定烟草叶提取物中的蛋白质浓度。
用经臭氧处理的葡萄树植株进行平行实验，随后进行Northern印迹分析，结果表明：用0.2μl/l和0.4μl/l臭氧通气导致在mRNA水平上大量诱导STS基因的表达。为此，葡萄树的STS基因应特别适于鉴定臭氧反应性DNA元件。在这一点上应说明的是：与未经处理的植株相比，经臭氧处理的植株中至今已显示出显著的，能可靠测定的臭氧诱导的基因是没有的。
为了能分析臭氧对启动子水平的影响，在臭氧通气实验中使用了确实被转化的烟草品系的F1-烟草植株(11周龄)，该植株中含有具完整启动子区的VstⅠ启动子/GUS融合结构(p1500GUS)。用荧光计测定叶粗提取物中的GUS-酶活性，所述叶收获于通入不同浓度的臭氧(0.1μl/l臭氧，0.2μl/l臭氧或0.4μl/l臭氧)10小时和在未经污染的空气中保温14小时后的不同时间点。图2所示结果表明：与仅置于无污染空气中的对照植物的相比，GUS活性呈快速的臭氧诱导的增加。因此，开始用臭氧处理12小时之后，用0.1μl/l臭氧处理导致11倍的由STS启动子控制的GUS基因表达诱导，用0.2或0.4μl/l臭氧处理甚至可导致高达25倍的诱导。
为了鉴定负责已观察到的STS启动子之强臭氧诱导的顺式调节序列，在臭氧通气实验中将含有与细菌GUS报道基因融合的上述VstⅠ启动子5’缺失的转基因烟草品系作为独立的FO-植物来分析。将初次再生的植株无菌培养几个月，并通过芽培养增殖，还需检查这些稳定转化体的F1烟草植株(11周龄)的臭氧诱导的GUS表达。
用0.1μl/l臭氧处理转基因的烟草植株10小时，然后在未污染的空气中保温2小时，测定培养基-老叶粗提取物中的GUS活性并与未经处理的对照植株中的酶活性相比。GUS酶活性的荧光计分析结果示于表1。尽管GUS活性导致臭氧诱导略为降低(在经臭氧诱导的受试植株以及未经处理的对照植株中，随着启动子范围逐渐由-1500缩短为-430，诱导系数也由约12(-1500)降至约10(-430))，但启动子范围-430和-280之间的另外的缺失使经臭氧处理的受试植株中GUS表达大幅度的降低。而其中GUS基因受-430-5’缺失启动子控制的植株与对照植株相比显示出10倍的臭氧诱导，其中GUS基因受较短的-280-5’缺失启动子控制的植株仅显示出最大为2倍的GUS表达臭氧诱导。因此，含有碱基对-430至-280的葡萄树VstⅠ基因之启动子范围中含有显著臭氧诱导的STS基因表达所必需的顺式活性元件。
通过含有上述结构并在植物细胞培养中培养的植物细胞可证实这些结果。
图和表
图1：
质粒pUC-VstⅠ/GUS中VstⅠ启动子/GUS翻译融合物的限制性图谱。所述质粒含有葡萄树VstⅠ启动子与大肠杆菌GUS基因的翻译融合物。已标出用于克隆5’缺失突变体的限制性位点。nos ter=根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶基因的终止信号。
图2：
通过多种浓度的臭氧在转基因F1烟草植株中由VstⅠ启动子控制的GUS表达的诱导的动力学，所述植株含有GUS基因与葡萄树完整的VstⅠ启动子的翻译融合物(p1500GUS)。
根据Jefferson(1987)，文献同上所述，用荧光计测定烟草叶(4号叶)粗提取物中的GUS活性，从图中可确定多种收获时间。10小时臭氧处理后，将烟草植株在未污染的空气中保温14小时。对照植株仅置于未污染的空气中(没有通入臭氧)，n=3或4；平均值±标准误差；所有试验都进行双份。
表1：
用荧光计测定培养基-经臭氧处理(+)和未经处理的(-)，独立的烟草转化体之老叶的蛋白质提取物中的GUS酶活性。转基因的烟草品系含有与细菌GUS报道基因融合的VstⅠ启动子的多种5’缺失。在FO-转化体和F1植株(11周龄)中通入100nl/l臭氧达10小时，随后在未污染的空气中保温2小时。平均值±标准误差；所有试验都进行双份。表1
Vst1启动子5′-缺失至位置 被检测的，独立的转基因烟草品系     GUS-酶活性 诱导系数
[pmol MUmin-1+臭氧 mg-1蛋白质-臭氧
    -1500-740-550     1(F1)2(F1)3(FO)2(F1)  735±100388±59126±13173±25     63±730±512±31 5±3     11.712.910.511.5
    -500-430-280-140-40+70     5(FO)6(FO)6(FO)2(F1)2(FO)3(F1)3(F1)1(F1)     148±52141±3822±430±312±0.224±324±23.5±1     15±614±413±315±38±315±315±33.5±1     9.910.01.7201.51.61.61.0
表1
用荧光计测定培养基-经臭氧处理(+)和未经处理的(-)，独立的烟草转化体之老叶的蛋白质提取物中的GUS酶活性。
转基因的烟草品系含有与细菌GUS报道基因融合的VstⅠ启动子的多种5’缺失。在FO-转化体和F1植株(11周龄)中通入100nl/l臭氧达10小时，随后在未污染的空气中保温2小时。平均值±标准误差；所有试验都进行双份。
表1
 Vst1启动子5′-缺失至位置 被检测的，独立的转基因烟草品系         GUS-酶活性  诱导系数
[pmol MUmin-1+臭氧 mg-1蛋白质-臭氧
-1500-740-550-500-430-280-140-40+70     1(F1)2(F1)3(FO)2(F1)5(FO)6(FO)6(FO)2(F1)2(FO)3(F1)3(F1)1(F1)     735±100388±59126±13173±25148±52141±3822±430±312±0.224±324±23.5±1     63±730±512±315±315±614±413±31 5±38±31 5±315±33.5±1     11.712.910.511.59.910.01.7201.51.61.61.0
序列表
(1)一般资料：
  (ⅰ)申请人：
      (A)姓名：GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und GesundheitGmbH[Research Center for Environment and Health Inc.]
      (B)街道：Ingolstaedter Landstr.l
      (C)城市：Oberschleissheim
      (E)国家：德国
      (F)邮政编码：85764
      (A)姓名：BAYER AG
      (B)街道：BAYERWERK
      (C)城市：Leverkusen
      (E)国家：德国
      (F)邮政编码：51368
  (ⅱ)发明题目：臭氧诱导的植物基因表达
  (ⅲ)序列数：3
  (ⅳ)计算机可读形式：
      (A)介质类型：软盘
      (B)计算机：IBMPC可兼容机
      (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
      (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPA)
(2)SEQ ID NO:1的资料：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：161个碱基对
      (B)类型：核苷酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：基因组-DNA
  (ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO:1:ACTTTTCGAG  CCCCTTGAAC  TGGAAATTAA  TACATTTTCC  ACTTGACTTTTGAAAAGGAG                                              60GCAATCCCAC  GGGAGGGAAG  CTGCTACCAA  CCTTCGTAAT  GTTAATGAAATCAAAGTCAC                                             120TCAATGTCCG  AATTTCAAAC  CTCANCAACC  CAATAGCCAAT        161
(2)SEQ ID NO:2的资料：
  (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：33个碱基对
      (B)类型：核苷酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线性
 (ⅱ)分子类型：其它核酸
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT                33
(2)SEQ ID NO:3的资料：
  (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：34个碱基对
      (B)类型：核苷酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线性
 (ⅱ)分子类型：其它核酸
 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ IN NO:3CGCGGATCCT  CAATTGAAGC  CATTGATCCT  AGCT            34

Claims (36)

1．植物DNA序列：
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTT
TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAAT
GTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACC
CAATAGCCAAT。
2．权利要求1所述的DNA序列，其来源于葡萄树(Vitis vinifera)。
3．权利要求1或2所述的DNA序列，该序列天然包含在1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ中，并对应于碱基对-270至-430。
4．葡萄树1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ的启动子区域，所述区域至少缺乏权利要求1所述的DNA序列。
5．权利要求4所述的启动子区域，所述区域仅含有翻译起始点至碱基对-270的序列范围。
6．权利要求4或5所述的启动子区域，所述区域还能赋予植物细胞病原体诱导的基因表达。
7．嵌合的核酸分子，其中导入了权利要求1所述的DNA序列或至少其片段。
8．权利要求7所述的嵌合核酸分子，所述核酸分子可为植物提供所述分子中所含编码区的臭氧诱导的表达。
9．含有上述权利要求之一所述的DNA序列，启动子区域或嵌合核酸分子，或其片段的载体。
10．含有上述权利要求之一所述的DNA序列，启动子区域或嵌合核酸分子，或衍生自所述DNA序列的DNA序列的转基因植物，以及这种植物的组分及其增殖材料，如原生质体，植物细胞，愈伤组织，种子，块茎或插条等，以及这种植物的后代。
11．转基因植物，所述植物因缺乏(天然状态下存在)DNA序列ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTT
TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAAT
GTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACC
CAATAGCCAA T或至少缺乏其一个片段而不再显示出天然可被臭氧诱导之基因的臭氧诱导的表达。
12．权利要求11所述的植物，其中抗病基因的臭氧诱导的表达被大大降低。
13．权利要求11或12所述的植物，其中1,2-二苯乙烯合酶基因，尤其是葡萄树VstⅠ基因的臭氧诱导的表达被大大降低。
14．权利要求10所述的植物，其中因导入了权利要求1所述的DNA序列，或至少其片段，在不会天然出现所述DNA序列的基因中可发生臭氧诱导的基因表达。
15．权利要求14所述的植物，其中可发生那些其在植物细胞中的表达产物能解毒活性氧类的基因的臭氧诱导的表达。
16．权利要求14或15所述的植物，其中可发生过氧化氢酶或超氧化物歧化酶基因的臭氧诱导的表达。
17．权利要求14所述的植物，其中可发生报道基因的臭氧诱导的表达。
18．权利要求10至17中任一个所述的双子叶植物，尤其是有用的植物，如大豆，油菜，番茄，甜菜，马铃薯，棉花，烟草以及观赏植物或树。
19．权利要求10至17中任一个所述的单子叶植物，尤其是如燕麦，小麦，黑麦，大麦，水稻，小米或玉米的谷类作物。
20．包括原生质体的转基因植物细胞，含有权利要求1至9中任一个所述的DNA序列，启动子区域或嵌合的核酸分子，或衍生自它们的DNA序列。
21．包括原生质体的植物细胞，所述植物细胞因缺乏(在天然状态下存在)DNA序列
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTT
TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAAT
GTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACC
CAATAGCCAAT或至少缺乏所述DNA序列的一个片段而不再显示出天然可被臭氧诱导之基因的臭氧诱导的表达。
22．权利要求20所述的植物细胞，其中因导入了权利要求1所述的DNA序列，或至少其片段，在不会天然出现所述DNA序列的基因中可发生臭氧诱导的基因表达。
23．产生转基因植物或植物细胞的方法，其中通过从天然含有权利要求1所述DNA序列或衍生自所述DNA序列的DNA序列的防御基因中缺失所述DNA序列或至少其片段可大大降低或消除天然可被臭氧诱导的防御基因的臭氧诱导的表达。
24．权利要求23所述的方法，其中1,2-二苯乙烯合酶基因的臭氧诱导的表达可被大大降低或消除。
25．权利要求23或24所述的方法，其中葡萄树VstⅠ基因的臭氧诱导的表达可被大大降低或消除。
26．产生转基因植物或植物细胞的方法，其中因导入了权利要求1所述的DNA序列或至少其片段而使一个或几个基因可被臭氧诱导，所述基因的表达天然不被或基本上不被臭氧诱导。
27．权利要求26所述的方法，其中通过臭氧可诱导一个或几个过氧化氢酶和/或超氧化物歧化酶基因。
28．权利要求26所述的方法，其中通过臭氧可诱导一个或几个报道基因。
29．通过缺失或灭活权利要求1所述的DNA序列或至少其片段以除去天然含有权利要求1所述DNA序列或衍生自所述DNA序列的DNA序列的天然可被臭氧诱导的防御基因的臭氧诱导能力的方法。
30．权利要求29的方法，其中基因是1,2-二苯乙烯合酶基因。
31．权利要求29或30所述的方法，其中基因是葡萄树的VstⅠ基因。
32．通过将权利要求1所述的DNA序列或至少其片段***天然不被或基本上不被臭氧诱导的那些基因中而在转基因植物或植物细胞中产生臭氧诱导之特性的方法。
33．权利要求1所述DNA序列或其片段用于检测植物基因中臭氧反应性序列范围的用途。
34．权利要求1所述DNA序列或其片段用于在转基因植物或植物细胞中产生臭氧诱导之特性的用途。
35．权利要求1所述DNA序列或其片段用于产生权利要求17所述的植物的用途，所述植物可用作生物监测器以定量和/或定性地检测臭氧浓度。
36．权利要求4至6中任一个所述的启动子区域用于在转基因植物中产生可被病原体更强诱导但不能被臭氧诱导的抗病性的用途。
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