CN101421295A - 用于提高作物植物中的氮利用效率的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离的NUE(氮利用效率)核酸和它们编码的蛋白质。本发明提供了涉及改变植物中的氮利用和/或摄取的方法和组合物。本发明进一步提供了重组表达盒、宿主细胞、和转基因植物。

Description

用于提高作物植物中的氮利用效率的基因
技术领域
本发明一般地涉及分子生物学领域。
背景技术
许多植物的驯化与产量的极大提高相关。自然群体中存在的大多数表型变异是持续的并且受到多基因影响的作用。负责驯化的植物中产量的极大差异的特定基因的鉴定已经成为农业研究的重要焦点。
影响产量的基因的一个群是氮利用效率(NUE)基因。这些基因用于提高作物植物，尤其是玉蜀黍中的氮的利用。所述基因可以用于改变植物的遗传组成，使得它们以目前的施肥标准可以更多产，或者以显著减少的肥料输入维持它们的生产率。提高的氮应用效率可以起因于氮肥的增强的摄取和同化和/或积聚的氮储备的后来的再流通和再利用。因此包含这些基因的植物可以用于提高产量。在氮肥的获得受限的发展中国家中和在氮利用的水平维持较高的发达国家中，提高玉米中的氮利用效率将提高每个单位的输入氮肥的玉米可收获的产量。氮利用的提高还允许降低农场上的输入成本(on-farm input costs)、降低对氮肥生产所需的不可再生能源的利用和依赖、以及降低氮肥制造和农业应用对环境的影响。
发明内容
本发明提供了当前NUE序列的多核苷酸、相关多肽和所有保守修饰的变体。本发明提供了NUE基因的序列。
本发明介绍了改变作物植物，尤其是玉蜀黍的遗传组成的方法，以便这样的作物可以以目前的施肥更多产和/或以显著减少的肥料输入同样多产。因而本发明的这类应用不仅产量提高，而且肥料成本降低，相应的对环境的影响减小。过去还未由科学家实现任何商业可行意义上的为了提高氮利用效率的作物植物的内在遗传的遗传增强。这个发明独特地利用已经在氮利用方面显示出不同的高度选择的玉蜀黍植物组。随后对所述植物进行mRNA性状(profiling)方面的试验和数据分析以产生用于作物植物(尤其是玉蜀黍)的修饰以提高氮利用效率的成组基因。
因此，在一个方面，本发明涉及包含编码NUE基因的分离的多核苷酸序列的分离的核酸。本发明的一个实施方式是包含选自由以下构成的组的核苷酸序列的分离的多核苷酸：(a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313的核苷酸序列；(b)编码包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312或314的氨基酸序列的核苷酸序列；以及(c)包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313具有至少70％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有提高的氮利用效率活性的多肽。
本发明的组成包括包含选自由下列组成的组的氨基酸序列的分离的多肽：(a)包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312或314的氨基酸序列以及(b)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312或314具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有提高的氮利用效率活性。
在另一方面，本发明涉及包含所述的核酸的重组表达盒。另外，本发明涉及包含所述重组表达盒的载体。此外，包含所述重组表达盒的所述载体可以促进宿主细胞中所述核酸的转录和翻译。本发明还涉及能够表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。可以使用许多宿主细胞，例如但不限于，微生物、哺乳动物、植物、或昆虫。
在另一实施方式中，本发明针对转基因植物或植物细胞，包含本发明的核酸。包含本发明的多核苷酸的优选的植物包括而不限于：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉(canola)、小麦、苜蓿、棉花、稻米、大麦、番茄、及黍(millet)。在另一实施方式中，所述转基因植物是玉蜀黍植物或植物细胞。另一实施方式是来自可操作地连接到驱动在植物中的表达的启动子的本发明的转基因NUE多肽的转基因种子。本发明的植物可以具有与对照植物相比改变的NUE。在一些植物中，NUE在营养组织、再生组织、或者营养组织和再生组织中是改变的。本发明的植物可以具有下列表型的至少一个，所述表型包括而不限于：提高的根质量、提高的根长度、提高的叶子大小、提高的耳穗(ear)大小、提高的种子大小、提高的胚乳大小、导致种子中的蛋白质、油、和/或淀粉的相对水平变化的胚胎和胚乳的相对大小的改变、雄穗(tassel)的缺乏、功能性花粉负载(pollen bearing)雄穗的缺乏、或提高的植物大小。
本发明的另一实施方式将是在基因组基因座处被遗传修饰的植物，其中所述基因组基因座编码本发明的NUE多肽。
提供了用于提高植物中NUE多肽的活性的方法。所述方法可以包括将本发明的NUE多核苷酸引入植物中。
提供了用于减少或消除植物中NUE多肽的水平的方法。所述多肽的水平或活性还可以在特定组织中被减少或消除，造成植物生长速率的改变。减少NUE多肽的水平和/或活性可以导致植物的较小的高度(stature)或较慢的生长。
具体实施方式
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非另外提及，本文所用的或预期的技术是本领域普通技术人员熟知的标准方法。材料、方法和实施例仅是示意性的而非限制性的。下文以示意的方式呈现而不试图限制本发明的范围。
本发明现在将参照附图在下文中更充分的描述，其中示出了本发明的一些，但不是全部的实施方式。实际上，这些发明可以以许多不同的形式体现并且不应当解释为限于本文陈述的实施方式；更确切地，提供了这些实施方式以便这个披露将满足可应用的法律要求。全文相同的数字指的是相同的元件。
利用前面描述和相关附图的教导，这些发明所述领域的技术人员将想到本文陈述的本发明的许多修改和其他实施方式。因此，可以理解本发明不限于披露的具体实施方式并且修改和其他实施方式意图包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用特定的术语，但是它们仅以一般和描述性的意义使用，并不为了限制。
除非另外表明，本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，其在本发明的技术范围内。这样的技术在文献中被充分地解释。参见，例如，Langenheim and Thimann，(1982)Botany：Plant Biology and Its Relation toHuman Affairs，John Wiley；Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants，vol.1，Vasil，ed.(1984)；Stanier，et al.，(1986)The Microbial World，5th ed.，Prentice-Hall；Dhringra and Sinclair，(1985)Basic Plant PathologyMethods，CRC Press；Maniatis，et al.，(1982)Molecular Cloning：ALaboratory Manual；DNA Cloning，vols.I and II，Glover，ed.(1985)；Oligonucleotide Synthesis，Gait，ed.(1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames and Higgins，eds.(1984)；及the series Methods in Enzymology，Colowick and Kaplan，eds，Academic Press，Inc.，San Diego，CA。
单位、前缀、和符号可以以它们的SI认可的形式表示。除非另外说明，分别地，核酸从左到右以5’到3’方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基到羧基方向书写。数字范围包括限定范围的数字。氨基酸可以以它们通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission推荐的一-字母符号在本文中提及。同样地，核苷酸可以以它们通常认可的单字母密码提及。下面定义的术语参照说明书作为整体更充分地定义。
在描述本发明中，下面的术语将被采用，并意图如下所示被定义。
“微生物体(microbe)”是指任何微生物(包括真核和原核微生物)，如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物、以及其它单细胞结构。
“扩增”指的是核酸序列的多个拷贝或互补于所述核酸序列的多个拷贝的构建，其利用所述核酸序列的至少一个作为模板。扩增***包括聚合酶链反应(PCR)***、连接酶链反应(LCR)***、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-Beta复制酶***、基于转录的扩增***(TAS)、以及链置换扩增(SDA)。参见，例如，Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications，Persing，etal.，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增产物被称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指的是编码相同或保守修饰的变体的氨基酸序列的那些核酸。因为遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子表示的每一位置，所述密码子可以被改变为所述相应密码子的任何一个，而不改变编码的多肽。这样的核酸变异为“沉默变异”，并代表一种保守修饰的变异。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了所述核酸的每个可能的沉默变异。普通技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是蛋氨酸的唯一密码子；一个例外是Micrococcus rubens，对于其GTG是蛋氨酸密码子(Ishizuka，et al.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，核酸的每个沉默变异，其编码本发明的多肽，在每个描述的多肽序列中是隐含的，并且以引用方式并入本文。
至于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或缺失编码的序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽、或蛋白质序列的单独的替换、缺失或添加在改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸替换时是“保守修饰的变体”。因此，选自由1到15组成的整数的组的任何数量的氨基酸残基可以被这样改变。因此，例如，可以进行1、2、3、4、5、7或10个改变。保守修饰的变体通常提供与它们来源的未修饰的多肽序列相似的生物学活性。例如，底物特异性、酶活性、或配体/受体结合通常为天然蛋白对其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能相似的氨基酸的保守替换表在本领域是熟知的。
下面的六个组，每个包含对于另一个是保守的替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
还参见，Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.(1984)。
如本文所用的，“基本上由...组成”指的是包括除了目标多核苷酸的另外的序列，其中所述另外的序列在严格的杂交条件下不选择性地杂交到与所述多核苷酸相同的cDNA，并且其中所述杂交条件包括在65℃在0.1X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中的冲洗步骤。
关于指定核酸的“编码”或“编码的”指的是包含用于翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可以包含核酸的翻译区内的非翻译序列(例如，内含子)，或者可以缺乏这样的***非翻译序列(例如，如在cDNA中)。蛋白质被编码的信息通过利用密码子表示。通常，利用“通用”遗传密码由核酸编码氨基酸序列。然而，遗传密码的变体，如在一些植物、动物、及真菌线粒体、细菌Mycoplasma capricolum(Yamao，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9)、或者纤毛虫Macronucleus中存在的，在核酸利用这些有机体被表达时，可以使用。
当核酸被合成地制备或改变时，可以利用核酸要被表达的预定宿主的已知密码子偏好。例如，虽然本发明的核酸序列可以在单子叶植物和双子叶植物物种中表达，序列可以被修饰以说明单子叶植物或双子叶植物的特殊密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已经显示出不同(Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98，以引用方式并入本文中)。因此，用于特定氨基酸的玉蜀黍偏好的密码子可以源自来自玉蜀黍的已知基因序列。来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子选择在上面Murray，et al.的表4中列出。
如本文所用的，关于核酸的“异源的”是起源于外来物种的核酸，或者如果起源于相同的物种，是通过故意的人类干预在组成和/或基因组基因座上从其天然形式实质上(substantially)被修饰的核酸。例如，可操作地连接到异源结构基因的启动子是来自与结构基因来源的物种不同的物种，或者，如果来自相同的物种，一个或两个均实质上从它们的起源形式被修饰。异源蛋白质可以起源于外来物种，或者，如果来自相同物种，通过故意的人类干预从其起源形式实质上被修饰。
“宿主细胞”是指这样的细胞，其包括本发明的异源核酸序列，其包含载体并支持所述表达载体的复制和/或表达。宿主细胞可以为原核细胞，如E.coli，或者真核细胞，如酵母、昆虫、植物、两栖动物、或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞为单子叶或双子叶植物细胞，包括而不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、稻米、棉花、卡诺拉、大麦、黍、及番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。
术语“杂交复合物”包括涉及由选择性相互杂交的两条单链核酸序列形成的双链核酸结构。
在将核酸***细胞内的上下文中术语“引入”指的是“转染”或“转化”或“转导”并且包括涉及核酸并入真核或原核细胞，其中所述核酸可以被并入细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转换入自主复制子，或者被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”涉及材料，如核酸或蛋白质，其实质上或基本上不含有在其天然存在的环境中发现时通常伴随其的成分或者与其相互作用的成分。分离的材料可选地包含在其天然环境中没有伴随所述材料发现的材料。核酸，其是“分离的”，如本文所定义的，还被称为“异源”核酸。除非另外陈述，术语“NUE核酸”指的是包含编码全长或部分长度的NUE多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用的，“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，包括具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物，因为它们以类似于天然存在的核苷酸的方式杂交到单链核酸(例如，肽核酸)。
“核酸文库”指的是分离的DNA或RNA分子的集合，其包括并基本上代表指定的有机体的基因组的整个转录的部分。示例性核酸文库的构建，如基因组和cDNA文库，在标准分子生物学参考文献中教导，如Berger and Kimmel，(1987)Guide To Molecular Cloning Techniques，fromthe series Methods in Enzymology，vol.152，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA；Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd ed.，vols.1-3；及Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，et al.，eds，Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.(1994Supplement)。
如本文所用的，“可操作地连接的”包括涉及第一序列(如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列起始并介导相应于第二序列的DNA的转录。通常，可操作地连接的指的是被连接的核酸序列是邻近的，并且其中必需结合两个蛋白编码区，临近的，并且在相同的阅读框中。
如本文所用的，术语“植物”包括涉及全植物、植物器官(例如，叶子、茎、根等)、种子及植物细胞及其子代。植物细胞，如本文所用的，包括而不限于，种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织区、愈伤组织(callus tissue)、叶子、根、枝条、配子体、孢子体、花粉、及小孢子。植物的类别，其可以用在本发明的方法中，通常与服从转化技术的高等植物的类别一样广泛，包括单子叶和双子叶植物，包括来自以下属的物种：Cucurbita、Rosa、Vitis、Juglans、Fragaria、Lotus、Medicago、Onobrychis、Trifolium、Trigonella、Vigna、Citrus、Linum、Geranium、Manihot、Daucus、Arabidopsis、Brassica、Raphanus、Sinapis、Atropa、Capsicum、Datura、Hyoscyamus、Lycopersicon、Nicotiana、Solanum、Petunia、Digitalis、Majorana、Ciahorium、Helianthus、Lactuca、Bromus、Asparagus、Antirrhinum、Heterocallis、Nemesis、Pelargonium、Panieum、Pennisetum、Ranunculus、Senecio、Salpiglossis、Cucumis、Browaalia、Glycine、Pisum、Phaseolus、Lolium、Oryza、Avena、Hordeum、Secale、Allium、及Triticum。特别优选的植物是Zea mays。
如本文所用的，“产量”可以包括涉及收获的谷类作物的每英亩的蒲式耳，其是谷粒湿度调整过的(例如，对于玉蜀黍，通常15％)，以及产生的生物量的体积(用于饲料作物，如苜蓿，以及用于复种作物的植物根大小)。谷粒湿度在收获的谷粒中被测量。谷粒的调整的测试重量被确定为每蒲式耳的磅重，对于收获的谷粒湿度水平是调整过的。生物量被测量为产生的可收获的植物材料的重量。
如本文所用的，“多核苷酸”包括涉及脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸、或其类似物，其具有天然核糖核苷酸的基本性质，在于它们在严格的杂交条件下杂交到与天然存在的核苷酸基本上相同的核苷酸序列和/或允许翻译为与天然存在的核苷酸相同的氨基酸。多核苷酸可以为天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列(subsequence)。除非另外指明，所述术语包括涉及指定的序列以及其互补序列。因此，具有为了稳定性或为了其它原因修饰的主链的DNA或RNA是那个术语在本文中意指的“多核苷酸”。此外，包含不寻常的碱基，如肌苷，或修饰的碱基，如三苯甲基化(tritylated)的碱基(仅指出两个实例)的DNA或RNA，是本文所用术语的多核苷酸。将认识到已经对DNA和RNA进行了大量修饰，其满足本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸包括多核苷酸的这样的化学、酶、或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括其中，简单和复杂细胞)的DNA和RNA特征的化学形式。
术语“多肽”、“肽”、及“蛋白质”在本文中可交换地使用，指的是氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“启动子”包括涉及从转录的起始的DNA上游区，并且涉及RNA聚合酶和其它蛋白质的识别和结合以引起转录。“植物启动子”是能够引起植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括，而不限于，那些从植物、植物病毒、及细菌(其包括在植物细胞中表达的基因，如Agrobacterium或Rhizobium)获得的启动子。实例是优先引起在一些组织，如叶子、根、种子、须根、木质部导管(xylem vessels)、管胞、或者厚壁组织中的转录的启动子。这样的启动子被称为“组织优先的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中的一些细胞类型中的表达，例如，在根或叶子中的维管细胞。“可诱导的”或“可调节的”启动子是在环境控制下的启动子。可以影响通过可诱导的启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节的启动子，例如，驱动在花粉发育期间的表达的启动子。组织优先的、细胞类型特异性的、发育调节的、以及可诱导的启动子组成“非组成性”启动子的类别。“组成性”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。
术语“NUE多肽”指的是一个或多个氨基酸序列。所述术语还包括其片段、变体、同系物、等位基因或前体(例如，前原蛋白(preproproteins)或前蛋白(proproteins))。“NUE蛋白”包括NUE多肽。除非另外说明，术语“NUE核酸”意味着包含编码NUE多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
本文所用的“重组体”包括涉及细胞或载体，其已经通过引入异源核酸而被修饰或者所述细胞源自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组体)形式内未发现以相同形式存在的基因或者由于故意地人类干预而被另外异常地表达、低表达或全然未表达的天然基因；或者可以具有天然基因的减少的或消除的表达。本文所用的术语“重组体”不包括通过天然存在的事件(例如，自发突变、天然转化/转导/转座)的细胞或载体的改变，如没有故意地人类干预的存在的那些。
如本文所用的，“重组表达盒”是核酸构建体，重组地或合成地产生，具有一系列指定的核酸元件，其允许特定的核酸在靶细胞内的转录。所述重组表达盒可以被并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒、或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，在其它序列中，要被转录的核酸、及启动子。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中被可交换地用于指被并入蛋白质、多肽、或肽(共同地“蛋白质”)中的氨基酸。所述氨基酸可以为天然存在的核酸并且，除非另外限制，可以包括可以以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的天然氨基酸的已知类似物。
术语“选择性地杂交”包括涉及在严格的杂交条件下核酸序列杂交到指定的核酸靶序列到比其杂交到非靶核酸序列和基本上排除的非靶核酸的可检测地更大程度(例如，至少为背景的2倍)。选择性地杂交序列通常具有互相约至少40％的序列同一性、优选60-90％的序列同一性、及最优选100％的序列同一性(即，互补的)。
术语“严格的条件”或“严格的杂交条件”包括涉及这样的条件，在这样的条件下探针将以比其它序列更大的可检测地程度杂交到其靶序列(例如，至少2倍于背景)。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的情况下将是不同的。通过控制杂交和/或冲洗条件的严格性，可以一直到100％互补于所述探针的靶序列可以被鉴定(同源探测)。可替换地，可以调整严格性条件以允许序列中的一些错配，以便检测较低程度的相似性(异源探测)。可选地，探针为约500个核苷酸的长度，但是长度可以极大地变化，从少于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
典型地，严格的条件将是那些条件，其中盐浓度少于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，pH为7.0-8.3，对于短探针(例如，10到50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)，温度为至少约60℃。严格地条件还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括用30-35％的甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，以及在50-55℃的1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中冲洗。示例性的中等严格性条件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在55-60℃的0.5X-1X SSC中冲洗。示例性的高度严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃杂交，并且在60-65℃在0.1X SSC中冲洗。特异性通常为杂交后冲洗的功能，关键因素为最终冲洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以为接近来自于Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138：267-84的等式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％形(form))-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％形为杂交溶液中甲酰胺的百分比，以及L为碱基对中杂交体的长度。Tm为(在限定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列杂交到完全匹配的探针的温度。对于每个1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可以调整Tm、杂交和/或冲洗条件以杂交到希望的同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，Tm可以降低10℃。通常，在限定的离子强度和pH时，对于特异性序列及其互补体，选择的严格的条件比热熔点(Tm)低约5℃。然而，极其严格的条件可以利用比热熔点(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或冲洗；中等严格的条件可以利用比热熔点(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或冲洗；低严格性条件可以利用比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或冲洗。利用所述等式、杂交和冲洗组分、及希望的Tm，普通技术人员将理解杂交和/或冲洗溶液的严格性中的变化被内在的描述。如果希望的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最好是提高SSC浓度以便可以利用更高的温度。对于核酸的杂交的广泛的指导存在于Tijssen，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，part I，chapter 2，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，NewYork(1993)；及Current Protocols in Molecular Biology，chapter 2，Ausubel，et al.，eds，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。除非另外说明，在本申请中，高度严格性被限定为在4X SSC、5X Denhardt’s(500ml的水中5g Ficoll、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸的鲑鱼***DNA、及25mM磷酸钠中在65℃杂交，以及在0.1X SSC、0.1％ SDS中在65℃冲洗。
如本文所用的，“转基因植物”包括涉及植物，其包括在其基因组中的异源多核苷酸。通常，所述异源多核苷酸被稳定的整合入基因组内以便所述多核苷酸被传递到连续世代。所述异源多核苷酸可以单独地被整合入基因组中或者作为重组表达盒的一部分被整合。“转基因”在本文中被用于包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型已经通过异源核酸的存在而被改变，所述异源核酸包括如此改变的起始转基因的那些以及通过有性杂交(sexual crosses)或无性繁殖从起始转基因形成的那些。本文所用的术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或通过天然存在的事件(如随机异株受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座、或自发突变)的基因组(染色体或染色体外)的改变。
如本文所用的，“载体”包括涉及在宿主细胞的转染中所用的核酸，多核苷酸可以被***其中。载体通常为复制子。表达载体允许被***其中的核酸的转录。
下面的术语用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性的百分比”，以及(e)“实质的(substantial)同一性”。
如本文所用的，“参考序列”是用作序列比较的基础的限定的序列。参考序列可以为特定的序列的亚组或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的节段，或者完全的cDNA或基因序列。
如本文所用的，“比较窗”指的是包括涉及多核苷酸序列的相邻和指定节段，其中所述多核苷酸序列可以与参考序列比较并且其中所述比较窗中的多核苷酸的部分可以包括相较于参考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即，间隙)，用于所述两个序列的最佳对准。通常，比较窗为至少20个相邻核苷酸的长度，可选地可以为30、40、50、100个的长度或更长。本领域的技术人员理解为了避免由于多核苷酸序列中包含间隙导致与参考序列的高度相似性，通常引入间隙罚分并且从匹配的数量被减去。
用于比较的核苷酸和氨基酸序列的对准方法在本领域是熟知的。Smith and Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482的局部同源性算法(BESTFIT)可以进行用于比较的序列的最佳对准；通过Needleman andWunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53的同源性对准算法(GAP)；通过Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的检索相似性方法(Tfasta and Fasta)；通过这些算法的计算机化的实施，包括，而不限于：Wisconsin Genetics Software Package，Version 8中通过Intelligenetics，MountainView，California，GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA的PC/Gene程序中的CLUSTAL(可以从GeneticsComputer Group
Figure A200780012807D00201
程序(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)获得)。CLUSTAL程序由Higgins and Sharp，(1988)Gene 73：237-44；Higgins andSharp，(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet，et al.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang，et al.，(1992)Computer Applications in theBiosciences 8：155-65，及Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31充分描述。用于多个序列的最佳全局对准的优选程序为PileUp(Feng andDoolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60，其类似于Higgins and Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53描述的方法，以引用方式并入本文中)。可以用于数据库相似性检索的程序的BLAST家族包括：用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN；用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX；用于针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列的BLASTP；用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列的TBLASTN；以及用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见，Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 19，Ausubel et al.，eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
GAP利用上文Needleman and Wunsch的算法，以发现最大化匹配的数量和最小化间隙的数量的两个完全序列的对准。GAP考虑所有可能的对准和间隙位置并形成具有最大数量的匹配碱基和最少的间隙的对准。它允许规定匹配的碱基的单位中的间隙形成罚分和间隙扩展罚分。GAP必须利用对于它***的每个间隙的匹配的间隙形成罚分数量。如果所选的间隙扩展罚分大于零，那么GAP必须，另外，利用***的每个间隙的间隙长度乘以间隙扩展罚分。Wisconsin Genetics SoftwarePackage的Version 10中缺省间隙形成罚分值和间隙扩展罚分值分别为8和2。间隙形成和间隙扩展罚分可以被表达为选自由从0到100组成的整数的组的整数。因此，例如，间隙形成和间隙扩展罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP表示最佳配准的家族的一个成员。可以存在这个家族的许多成员，但是没有其他成员具有更好的质量。GAP显示四个用于配准的品质因数：质量、比率、同一性、及相似性。质量是为了对准序列最大化的量度。比率是质量除以较短节段中的碱基数量。百分比同一性是实际上匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。从间隙穿过的符号被忽略。当对于成对符号的计分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，相似性被计分。Wisconsin Genetics Software Package的Version 10中所用的计分矩阵是BLOSUM62(参见，Henikoff andHenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
除非另外说明，本文所提供的序列同一性/相似性值指的是利用程序的BLAST 2.0组利用缺省参数获得的值(Altschul，et al.，(1997)NucleicAcids Res.25：3389-402)。
如本领域的那些普通技术人员将理解的，BLAST检索假定蛋白质可以被模型化为随机序列。然而，许多真实的蛋白质包括非随机序列区，其可以为均聚物域(tract)、短周期重复、或一个或多个氨基酸富集的区。这样的低复杂性区可以在不相关的蛋白质之间对准(aligned)，即使所述蛋白质的其他区是完全不同的。大量低复杂性过滤程序可以用于减少这样的低复杂性对准。例如，SEG(Wooten and Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂性过滤可以单独或结合使用。
如本文所用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括涉及两个序列中的残基，其当在指定的比较窗上对准用于最大的相应性时是相同的。当使用的序列同一性的百分比涉及蛋白时，认识到不相同的残基位置通常通过保守的氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被另外的具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基替换，并因此不改变所述分子的功能性质。当序列在保守的替换方面不同时，百分比序列同一性可以被向上调整以校正替换的保守性质。通过这样的保守替换而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这样的调整的方式对于本领域的技术人员是熟知的。典型地，这涉及将保守替换作为部分而不是全部错配计分，由此提高百分比序列同一性。因此。例如，当相同的氨基酸被给予1的得分时，非保守的替换被给予0的得分，保守的替换被给予0和1之间的得分。例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中实施时，例如根据Meyers and Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17的算法，计算保守替换的计分。
如本文所用的，“序列同一性的百分比”指的是通过在比较窗上比较两个最佳对准的序列确定的值，其中比较窗内多核苷酸序列的部分与参考序列相比(其不包括添加或缺失)可以包括添加或缺失(即，间隙)，用于两个序列的最佳对准。百分比通过如下计算：确定两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以产生匹配的位置的数量、匹配的位置的数量除以比较窗中位置的总数、结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。
术语多核苷酸序列的“实质的同一性”意味着多核苷酸包含这样的序列，其利用所述的对准程序之一，利用标准参数，与参考序列相比，具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％。技术人员将认识到这些值可以被适当地调整以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应的同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质的同一性通常意味着55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。
核苷酸序列是实质地同一的另一指征是两个分子在严格的条件下是否相互杂交。遗传密码子的简并性允许导致编码相同的氨基酸的核苷酸序列中的多样性的许多氨基酸的替换，因此DNA序列可以编码相同的多肽但是在严格的条件下不会相互杂交是可能的。例如，在核酸的拷贝是利用由遗传密码允许的最大密码子简并性形成时，这可以发生。两个核酸序列是实质地同一的一个指征是第一核酸编码的多肽是与由第二核酸编码的多肽免疫学交叉反应的。
在肽的上下文中的术语“实质的同一性”表明肽包含这样的序列，其在指定的比较窗上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性，优选与参考序列至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％、更优选80％、最优选至少90％或95％的序列同一性。优选的，最佳对准利用上文Needleman and Wunsch的同源性对准算法进行。两个肽序列是实质地同一的指征是一个肽与针对第二肽产生的抗体是免疫反应性的。因此，肽是与第二肽实质地同一的，例如，在两个肽仅由于保守的替换而不同时。此外，肽可以与第二肽在它们因非保守变化而不同时，如果抗体识别的表位是实质地同一的，那么它们是实质地同一的。“实质上相似的”肽分享如上所述的序列，除了不同的残基位置可以因保守的氨基酸变化而不同。
本发明披露了NUE多核苷酸和多肽。本发明的新型核苷酸和蛋白质具有这样的表达模式，其表明它们提高了氮利用，并且因此在植物发育中扮演重要角色。所述多核苷酸在各种植物组织中表达。所述多核苷酸和多肽因此提供了操作植物发育以改变组织发育、定时(timing)或组成的机会。这可以用于在有限的氮供应下形成具有提高的产量的植物。
核酸
本发明提供了，其中，RNA、DNA、及其类似物和/或嵌合体的分离的核酸，包括NUE多核苷酸。
本发明还包括用于在不同的有机体中表达的最优化的多核苷酸。例如，为了多核苷酸在玉蜀黍植物中的表达，所述序列可以被改变以解释特定的密码子偏好并根据上文Murray，et al改变GC含量。用于来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子选择在上文Murray，et al.的表4中列出。
本发明的NUE核酸包括分离的NUE多核苷酸，其包括：
(a)编码NUE多肽和其保守修饰的和多形的变体的多核苷酸；
(b)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％的序列同一性的多核苷酸；
(c)(a)或(b)的多核苷酸的互补序列。
核酸的构建
本发明的分离的核酸可以利用(a)标准重组方法，(b)合成技术，或其组合制备。在一些实施方式中，本发明的多核苷酸可以从真菌或细菌克隆、扩增、或以其他方式构建。
所述核酸可以方便地包含除了本发明的多核苷酸之外的序列。例如，包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多个-克隆位点可以被***所述核酸以帮助分离多核苷酸。并且，可翻译的序列可以被***以帮助本发明的翻译的多核苷酸的分离。例如，六-组氨酸标记物序列提供了方便的方式以纯化本发明的蛋白质。本发明的核酸-排除所述多核苷酸序列，可选地为用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、适配子(adapter)、或连接子。另外的序列可以被加入到这样的克隆和/或表达序列以最优化它们在克隆和/或表达中的功能、帮助多核苷酸的分离、或者提高所述多核苷酸导入细胞。典型地，本发明的核酸的长度少于本发明的其多核苷酸的长度，少于20千碱基对，通常少于15kb，常常少于10kb。克隆载体、表达载体、适配子、及连接子的应用在本领域是熟知的。示例性的核酸包括这样的载体如：M13、lambda ZAP Express、lambda ZAP II、lambda gt10、lambda gt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、lambda DASH II、lambda EMBL 3、lambda EMBL 4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVI CAT、pOPI3CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、lambda MOSSlox、及lambda MOSElox。用于本发明的最佳载体包括而不限于lambda ZAP II，和pGEX。多种核酸的描述参见例如Stratagene Cloning Systems，Catalogs 1995，1996，1997(La Jolla，CA)；以及，Amersham Life Sciences，Inc，Catalog’97(Arlington Heights，IL)。
用于构建核酸的合成方法
本发明的分离的核酸还可以通过以下方法通过直接化学合成制备，所述方法例如：Narang，et al.，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9的磷酸三酯方法；Brown，et al.，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51的磷酸二酯方法；Beaucage，et al.，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62的二乙基亚磷酰胺(diethylphosphoramidite)方法；上文Beaucage，et al.描述的固相亚磷酰胺三酯(phosphoramidite triester)方法，例如，利用自动合成仪，例如Needham-VanDevanter，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-68中描述的；以及美国专利No.4,458,066的固相支持(solid support)方法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。通过与互补序列的杂交或通过利用单链作为模板借助DNA聚合酶的聚合，这可以被转变为双链DNA。技术人员将认识到虽然DNA的化学合成限于约100个碱基的序列，但是较长的序列可以通过较短序列的联接获得。
UTR和密码子偏好
通常，翻译效率已经发现由RNA的5’非编码或非翻译区(5’UTR)中的特定序列元件调节。正性序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond，et al.，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。负性元件包括稳定的分子内5’UTR茎-环结构(Muesing，et al.，(1987)Cell 48：691)和5’UTR中的AUG序列或前面有合适的AUG的短开放阅读框(Kozak，supra，Rao，et al.，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5’和/或3’UTR区。
此外，本发明的多核苷酸的多肽编码节段可以被修饰以改变密码子选择。改变的密码子选择可以用于改变翻译效率和/或最优化用于在希望的宿主中表达的编码序列或最优化用于在玉蜀黍中表达的异源序列中的密码子选择。本发明的多核苷酸的编码区中的密码子选择可以利用商业上可获得的软件包，如可以从University of Wisconsin GeneticsComputer Group获得的“Codon Preference＂统计分析。参见，Devereaux，etal.，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395)；或MacVector 4.1(EastmanKodak Co.，New Haven，Conn.)。因此，本发明提供了本发明的多核苷酸的至少一个的编码区的密码子选择频率特征。可以用于确定密码子选择频率的多核苷酸的数量(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3到本文所提供的本发明的多核苷酸的数量的任何整数。可选地，所述多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
序列改组(Sequence Shuffling)
本发明提供了利用本发明的多核苷酸的用于序列改组的方法，以及由此获得的组分。序列改组在PCT公开No.96/19256中描述。还参见，Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA　94：4504-9；和Zhao，et al.，(1998)Nature Biotech 16：258-61。通常，序列改组提供了用于产生具有希望的特征的多核苷酸的文库的方式，其可以被选择或筛选。重组多核苷酸的文库从相关序列多核苷酸群产生，其包括序列区，其具有实质的序列同一性并可以在体外或体内同源重组。序列重组的多核苷酸群包括具有希望的或有利的特征并且可以通过合适的选择或筛选方法选择的多核苷酸的亚群。所述特征可以为能够在筛选***中被选择或检测的任何性质或属性，并且可以包括以下性质：编码的蛋白质、转录元件、调控基因或转基因的转录、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、翻译、或其它表达性质的序列、复制元件、蛋白结合元件、或类似物、如赋予可选择的或可检测的性质的任何特征。在一些实施方式中，所选择的特征可以为如本文提供的超过野生型蛋白质的改变的Km和/或Kcat。在另一些实施方式中，从序列改组产生的蛋白质或多核苷酸将具有大于非改组的野生型多核苷酸的配体结合亲和力。在另一些实施方式中，从序列改组产生的蛋白质或多核苷酸将具有与非改组的野生型多核苷酸相比的改变的pH最佳值。这样的性质的提高可以为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或大于150％。
重组表达盒
本发明进一步提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。编码本发明的希望的多核苷酸的核酸序列，例如编码足够长的多肽以编码本发明的活性蛋白质的cDNA或基因组序列，可以用于构建可以被引入希望的宿主细胞的重组表达盒。重组表达盒将通常包括可操作地连接到引导多核苷酸在预期的宿主细胞(如转化的植物的组织)中的转录的转录起始调节序列的本发明的多核苷酸。
例如，植物表达载体可以包括(1)在5’和3’调节序列的转录调控下的克隆的植物基因和(2)显性可选择的标记物。这样的植物表达载体还可以包含，如果希望，启动子调节区(例如，提供可诱导的或组成性的、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性/选择性表达的一个调节区)、转录引发起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点、和/或多聚腺苷酸(polyadenylation)信号。
可以使用植物启动子片段，其可以引导本发明的多核苷酸在再生植物的所有组织中的表达。这样的启动子在本文中被称为“组成性”启动子并在大多数环境条件和发育或细胞分化的状态下是活性的。组成性启动子的实例包括源自Agrobacterium tumefaciens的T-DNA的1’-或2’-启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus(CaMV))的35S启动子，其在Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-2中描述；稻米肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell 163-171)；泛蛋白(ubiquitin)(Christensen，et al.，(1992)PlantMol.Biol.12：619-632和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89)；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.
Figure A200780012807D0027130837QIETU
.81：581-8)；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-30)；及玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit，etal.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85；和Atanassvoa，et al.，(1992)Plant Journal 2(3)：291-300)；ALS启动子，如PCT申请No.WO 96/30530中描述的；以及技术人员已知的来自各种植物基因的其它转录起始区。对于本发明，泛蛋白是用于在单子叶植物中表达的优选的启动子。
可替换地，植物启动子可以引导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可以另外的在更精确的环境或发育控制下的表达。这样的启动子这里被称为“可诱导的”启动子。可以通过可诱导的启动子影响转录的环境条件包括病原体攻击、厌氧条件、或者光的存在。可诱导的启动子的实例为Adh1启动子，其可由缺氧或冷应激诱导，Hsp70启动子，其可以由热应激诱导，及PPDK启动子，其可以由光诱导。
在发育调控下的启动子的实例包括仅，或优先地，在一些组织中，如叶子、根、果实、种子、或花中引发转录的启动子。启动子的操作还可以依赖其在基因组中的位置而变化。因此，可诱导的启动子可以在一些位置中变得完全或部分组成性。
如果多肽表达是希望的，通常希望包括多核苷酸编码区的3’-端的多聚腺苷酸区。多聚腺苷酸区可以源自多种植物基因，或源自T-DNA。要添加的3’端序列可以源自，例如，胭脂碱合酶(nopaline synthase)或章鱼碱合酶(octopine synthase)基因，或可选地源自另一植物基因，或较少优选地源自任何其它真核基因。这样的调节性元件的实例包括，而不限于，3’末端和/或多聚腺苷酸区，如Agrobacterium tumefaciens胭脂碱合酶(nos)基因的那些(Bevan，et al.，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，et al.，(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-50；及An，et al.，(1989)Plant Cell 1：115-22)；以及CaMV 19S基因(Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-72)。
内含子序列可以被加入到部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以提高聚集在胞质溶液中的成熟信使的数量。植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子已经显示在mRNA和蛋白质水平提高基因表达一直到1000倍(Buchman and Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis，et al.，(1987)Genes Dev.1：1183-200)。这样的内含子的基因表达提高通常在位于转录单位的5’端附近时最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的应用在本领域是已知的。一般地参见，The Maize Handbook，Chapter 116，Freeling and Walbot，eds.，Springer，New York(1994)。
植物信号序列，包括，而不限于，靶向蛋白质到植物细胞的细胞外基质的编码信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos，et al.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900)，如Nicotiana plumbaginifolia扩张基因(DeLoose，et al.，(1991)Gene 99：95-100)；靶向蛋白质到液泡的信号肽，如甘薯储藏蛋白(sporamin)基因(Matsuka，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834)及大麦凝集素基因(Wilkins，et al.，(1990)Plant Cell，2：301-13)；造成蛋白质被分泌的信号肽，如PRIb的那些(Lind，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53)或大麦阿尔法淀粉酶(BAA)(Rahmatullah，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：119，并由此以引用方式并入)，或将蛋白质靶向到质体的信号肽，如油菜籽脂烯酰基Acp还原酶的信号肽(Verwaert，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202)，在本发明中是有用的。
包含来自本发明的多核苷酸的序列的载体将通常包含标记物基因，其赋予植物细胞可选择的表型。通常，可选择的标记物基因将编码抗生素抗性、合适的基因包括：编码对抗生素壮观霉素的抗性的基因(例如，aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素(geneticin)抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对除草剂的抗性的基因，其起作用以抑制乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase)(ALS)的作用，尤其是磺酰脲类(sulfonylurea-type)除草剂(例如，包含导致这样的抗性的突变，尤其是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起作用以抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂(如草丁膦(phosphinothricin)或basta)抗性的基因(例如，bar基因)，或者本领域已知的其它这样的基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆(chlorsulfuron)的抗性。
用于基因在高等植物中的表达的典型的载体在本领域是熟知的，并且包括源自Rogers，et al.(1987)，Meth.Enzymol.153：253-77描述的Agrobacterium tumefaciens的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体。这些载体是植物整合载体，因为在转化上，所述载体将载体DNA的部分整合入宿主植物的基因组中。本文所用的示例性A.tumefaciens载体是Schardl，et al.，(1987)Gene 61：1-11，和Berger，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6的质粒pKYLX6和pKYLX7。本文另一有用的载体是可以从CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)获得的质粒pBI101.2。
蛋白质在宿主细胞中的表达
利用本发明的核酸，人们可以在重组工程化的细胞，如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物、或优选的植物细胞中表达本发明的蛋白质。所述细胞在非天然的条件中(例如，量、组成、位置、和/或时间)产生蛋白质，因为它们已经通过人类干预而遗传改变以这样进行。
预期本领域的技术人员在用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的可获得的众多表达***方面是博学的。没有进行尝试来详细地描述抑制用于蛋白质在原核生物或真核生物中的表达的多种已知方法。
简而言之，编码本发明的蛋白质的分离的核酸的表达将通常通过可操作地连接，例如，DNA或cDNA到启动子(其是组成性或可诱导的)，随后并入表达载体而实现。所述载体可以适于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体包含转录和翻译终止子、起始序列、及用于调节编码本发明的蛋白质的DNA的表达的启动子。为获得克隆的基因的高水平表达，希望构建最少包含强启动子，如泛蛋白，以引导转录，用于翻译起始的核糖体结合位点、以及转录/翻译终止子的表达载体。组成性启动子被分类为提供一定范围内的组成性表达。因此，一些为弱的组成性启动子，另一些为强的组成性启动子。通常，“弱启动子”意图指驱动编码序列在低水平表达的启动子。“低水平”意图指在约1/10,000转录物到约1/100,000转录物到约1/500,000转录物的水平。相反地，“强启动子”驱动编码序列在“高水平”，或约1/10转录物到约1/100转录物到约1/1,000转录物的表达。
技术人员将认识到可以对本发明的蛋白质进行修饰而不降低其生物活性。一些修饰可以被进行以促进靶分子的克隆、表达、或并入融合蛋白内。这样的修饰对于本领域技术人员是熟知的，并且包括，例如在氨基末端添加的蛋氨酸以提供起始位点，或位于两个末端的另外的氨基酸(例如，poly His)以形成方便位置的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
在原核生物中的表达
原核细胞可以用作用于表达的宿主。最常见的原核生物以E.coli的各种菌株为代表；然而，也可以使用其它微生物菌株。本文中限定的通常使用的原核调控序列包括用于转录起始的启动子、可选地具有操纵基因、与核糖体结合位点序列一起，包括这样的通常使用的启动子如β内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子***(Chang，et al.，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子***(Goeddel，et al.，(1980)NucleicAcids Res.8：4057)和lambda来源的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，et al.，(1981)Nature 292：128)。在E.coli中转染的DNA载体中包含选择标记物也是有用的。这样的标记物的实例包括指定对氨苄青霉素、四环素、或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以允许感兴趣的基因导入合适的宿主细胞。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源。合适的细菌细胞被噬菌体载体颗粒感染或被裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，细菌细胞被质粒载体DNA转染。用于表达本发明的蛋白质的表达***可利用Bacillus sp.andSalmonella(Palva，et al.，(1983)Gene 22：229-35；Mosbach，et al.，(1983)Nature 302：543-5)获得。来自Pharmacia的pGEX-4T-1质粒载体是用于本发明的优选的E.coli表达载体。
在真核生物中的表达
多种真核表达***如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞，是本领域技术人员已知的。如下面简要解释的，本发明可以在这些真核***中被表达。在一些实施方式中，转化的/转染的植物细胞，如下文讨论的，被用作用于产生本发明的蛋白质的表达***。
酵母中异源蛋白质的合成是熟知的。Sherman，et al.，(1982)Methodsin Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory是描述可以用来在酵母中产生蛋白质的各种方法的充分验证的著作。用于真核蛋白质生产的两个广泛利用的酵母是Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris。用于在Saccharomyces和Pichia中表达的载体、菌株、和方案在本领域是已知的并且可以从商业供应者获得(例如，Invitrogen)。合适的载体通常具有表达调控序列，如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，及复制起点、希望的终止序列等。
本发明的蛋白质，一旦表达，可以通过裂解细胞并将标准蛋白分离技术应用于裂解液或沉淀物(pellet)来从酵母分离。可以利用Westernblot技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定完成纯化过程的监测。
编码本发明的蛋白质的序列还可连接到各种表达载体，用在转染例如哺乳动物、昆虫、或植物起源的细胞培养物中。哺乳动物细胞***通常将为细胞的单层形式，虽然还可以使用哺乳动物细胞悬浮液。在本领域已经开发了大量能够表达完整的蛋白质的合适的宿主细胞系，包括HEK293、BHK21、和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可以包括表达调控序列，如复制起点、启动子(例如，CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)，增强子(Queen，et al.，(1986)Immunol.Rev.89：49)、以及必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸位点(例如，SV40大T Ag poly A添加位点)、及转录终止序列。用于产生本发明的蛋白质的其它动物细胞是可获得的，例如，从American Type Culture Collection Catalogue of Cell Linesand Hybridomas(7th ed.，1992)获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的合适的载体通常源自SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼体、蚕、粘虫、蛾、及果蝇(Drosophila)细胞系，如Schneider细胞系(参见，例如，Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65)。
至于酵母，当采用高等动物或植物宿主细胞时，多聚腺苷酸或转录终止序列通常被并入载体中。终止序列的实例是来自牛生长素基因的多聚腺苷酸序列。还可以包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague et al.，J.Virol.45：773-81(1983))。此外，调控宿主细胞中复制的基因序列可以被并入载体中，如在牛***瘤病毒型-载体中发现的那些序列(Saveria-Campo，“BovinePapilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector，”in DNA Cloning：APractical Approach，vol.II，Glover，ed.，IRL Press，Arlington，VA，pp.213-38(1985))。
此外，位于合适的植物表达载体中的NUE基因可以用于转化植物细胞。所述多肽可以随后从植物愈伤组织分离或者转化的细胞可以用于再生转基因植物。可以收获这样的转基因植物，可以对合适的组织(种子或叶子，例如)进行大规模蛋白提取和纯化技术。
植物转化方法
用于将外源基因引入植物的众多方法是已知的并且可以用于将NUE多核苷酸***植物宿主，包括生物和物理植物转化方案。参见，例如，Miki et al.，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants，”inMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick andThompson，eds.，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)。所选的方法随着宿主植物而变化，包括化学转染方法，如磷酸钙、微生物-介导的基因转移，如土壤杆菌(Agrobacterium)(Horsch et al.，Science227：1229-31(1985))、电穿孔、显微注射、及弹道(biolistic)轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物的再生的表达盒和载体及体外培养方法是已知的和可获得的。参见，例如，Gruber et al.，“Vectors for PlantTransformation，”in Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，supra，pp.89-119。
分离的多核苷酸或多肽可以通过通常用于直接递送入细胞的一种或多种技术被引入植物中。这样的方案可以依赖于有机体、细胞、植物或植物细胞的类型而变化，即，单子叶植物或双子叶植物，靶向用于基因修饰。合适的转化植物细胞的方法包括显微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：320-334；及美国专利6,300,543)、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606，直接基因转移(Paszkowski et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722)、及弹道粒子加速(参见，例如Sanford，et al.，美国专利No.4,945,050；WO 91/10725；及McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926)。还参见，Tomes，et al.，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via MicroprojectileBombardment”.pp.197-213 in Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methods.eds.O.L.Gamborg & G.C.Phillips.Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995；美国专利5,736,369(分生组织)；Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(稻米)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology6：559-563(玉蜀黍)；WO 91/10725(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)PlantPhysiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology8：833-839；及Gordon-Kamm，et al.，(1990)Plant Cell 2：603-618(玉蜀黍)；Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebierm，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Liliaceae)；De Wet，et al.，(1985)In The Experimental Manipulation ofOvule Tissues，ed.G.P.Chapman，et al.，pp.197-209.Longman，NY(pollen)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418；及Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须(whisker)-介导的转化)；美国专利No.5,693,512(声波降解法)；D’Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant CellReports 12：250-255；及Christou and Ford，(1995)Annals of Botany75：407-413(稻米)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotech.14：745-750；土壤杆菌介导的玉蜀黍转化(美国专利5,981,840)；碳化硅晶须(siliconcarbide whisker)方法(Frame，et al.，(1994)Plant J.6：941-948)；激光法(Guo，et al.，(1995)Physiologia Plantarum 93：19-24)；声波降解法(Bao，et al.，(1997)Ultrasound in Medicine & Biology 23：953-959；Finer andFiner，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah，et al.，(2001)J ExpBot 52：1135-42)；聚乙二醇方法(Krens，et al.，(1982)Nature 296：72-77)；单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体可以利用电穿孔(Fromm，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-5828)和显微注射(Crossway，et al.，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)转化；其全部以引用方式并入本文中。
土壤杆菌-介导的转化
用于将表达载体引入植物的最广泛使用的方法是基于土壤杆菌的天然转化***。A.tumefaciens和A.rhizogenes是植物致病土壤细菌，其遗传转化植物细胞。A.tumefaciens和A.rhizogenes的Ti和Ri质粒分别携带负责植物的遗传转化的基因。参见，例如，Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1。用于土壤杆菌-介导的基因转移的土壤杆菌载体***和方法的描述提供在Gruber，et al.，supra；Miki，et al.，supra；and Moloney，etal.，(1989)Plant Cell Reports 8：238中。
类似地，基因可以被***分别源自A.tumefaciens或A.rhizogenes的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因此，表达盒可以利用这些质粒如上构建。许多调控序列是已知的，其在连结到异源编码序列并转化入宿主有机体时在基因表达中表现出关于最初的编码序列的组织/器官特异性的保真度(fidelity)。参见，例如，Benfey and Chua，(1989)Science244：174-81。用在这些质粒中的特别合适的调控序列是用于多种靶植物中的基因的组成性叶子-特异性表达的启动子。其它有用的调控序列包括来自胭脂碱合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，可以从American Type Culture Collection获得，指定为ATCC 67238。如果这样的***被使用，来自Ti或Ri质粒的毒性(vir)基因也必需存在，或者与T-DNA部分一起，或者经由二元***，其中vir基因存在于分开的载体上。这样的***、用于其中的载体、及转化植物细胞的方法描述在以下中：美国专利No.4,658,082；美国专利申请No.913,914，1986年10月1日提交，其在美国专利No.5,262,306中引用，于1993年11月16日授权(issued)；及Simpson，et al.，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(还在‘306专利中引用)；全部以其全部内容以引用方式并入。
一旦构建，这些质粒可以被置入A.rhizogenes或A.tumefaciens中，这些载体用于转化植物物种的细胞，其通常对Fusarium或Alternaria感染易感。几种其它转基因植物也由本发明预期，包括而不限于：大豆、玉米、高粱、苜蓿、稻米、车轴草、甘蓝、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。A.tumefaciens或A.rhizogenes的选择将依赖于由此被转化的植物。通常，A.tumefaciens是用于转化的优选的有机体。大多数双子叶植物、一些裸子植物、少数单子叶植物(例如，Liliales和Arales的一些成员)对于借助A.tumefaciens的感染是易感的。A.rhizogenes也具有广泛的宿主范围，包括大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括Leguminosae、Compositae、和Chenopodiaceae的成员。现在单子叶植物可以有些成功的转化。欧洲专利申请No.604 662 A1披露了利用土壤杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲申请No.672 752 A1披露了利用不成熟胚胎的盾片借助土壤杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida，et al.论述了通过将不成熟胚胎暴露于A.tumefaciens转化玉蜀黍的方法(Nature Biotechnology 14：745-50(1996))。
一旦转化，这些细胞可以被用于再生转基因植物。例如，全植物可以通过弄伤(wound)所述植物并随后将载体引入受伤部位来被这些载体感染。所述植物的任何部分可以被弄伤，包括叶子、茎和根。可替换地，外植体形式的植物组织，如子叶组织或叶盘(leaf disks)，可以被这些载体植入(inoculated)，在促进植物再生的条件下培养。通过用包含编码伏马菌素(fumonisin)降解酶的基因的A.rhizogenes或A.tumefaciens植入植物组织转化的根或枝条可以经由躯体(somatic)胚胎发生或器官发生用作再生伏马菌素抗性的转基因植物的植物组织的来源。用于再生植物组织的这样的方法的实例披露在以下中：Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40；美国专利No.4,658,082；Simpson，et al.，上文；及美国专利申请No.913,913和913,914，均于1986年10月1日提交，其被引用在美国专利No.5,262,306中，于1993年11月16日授权，其中披露的完整内容以引用方式并入本文中。
直接基因转移
尽管事实是土壤杆菌-介导的转化的宿主范围是广泛的，一些主要的谷类作物物种和裸子植物通常对于这种基因转移模式是抵抗的，即使最近已经在稻米中实现了一些成功(Hiei，et al.，(1994)The Plant Journal6：271-82)。植物转化的几种方法，共同地被称为直接基因转移，已经作为土壤杆菌-介导的转化的可选方法而被开发。
植物转化的通常可用的方法是微抛射体(microprojectile)-介导的转化，其中DNA被携带在测量约1到4μm的微抛射体的表面上。表达载体借助将微抛射体加速到足以穿透植物细胞壁和膜的300到600m/s的速度的弹道(biolistic)装置被引入植物组织中(Sanford，et al.，(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299；Sanford，(1990)Physiol.Plant 79：206；及Klein，et al.，(1992)Biotechnology10：268)。
用于DNA物理递送到植物的另一方法是靶细胞的声波降解法(sonication)，描述在Zang，et al.，(1991)BioTechnology 9：996中。可替换地，脂质体或球状质体(spheroplast fusions)已经用于将表达载体引入植物中。参见，例如，Deshayes，et al.，(1985)EMBO J.4：2731；和Christou，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3962。也已经报道了利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇、或聚-L-鸟氨酸将DNA直接摄取入原生质体。参见，例如，Hain，et al.，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161；及Draper，et al.，(1982)Plant Cell Physiol.23：451。
已经描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。参见，例如，Donn，et al.，(1990)Abstracts of the VIIth Int′l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC，A2-38，p.53；D’Halluin，et al.，(1992)Plant Cell4：1495-505；及Spencer，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61。
提高NUE多肽的活性和/或水平
提供了提高本发明的NUE多肽的活性和/或水平的方法。本发明的NUE多肽的水平和/或活性的提高可以通过向植物提供NUE多肽来实现。NUE多肽可以通过以下提供：将编码NUE多肽的氨基酸序列引入植物中、将编码NUE多肽的核苷酸序列引入植物中或可替换地通过修饰编码本发明的NUE多肽的基因组基因座。
如本文其他地方论述的，用于为植物提供多肽的许多方法在本领域是已知的，包括而不限于，直接将多肽引入植物中、将编码具有提高的氮利用活性的多肽的多核苷酸构建体引入植物中(瞬时或稳定地)。还认识到本发明的方法可以采用不能在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因此，NUE多肽的水平和/或活性可以通过改变编码NUE多肽的基因或其启动子来提高。参见，例如，Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling，et　al.，PCT/US93/03868。因此提供了携带NUE基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变提高了NUE基因的表达或者提高了编码的NUE多肽的NUE活性。
降低NUE多肽的活性和/或水平
提供了通过用表达抑制NUE多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞来降低或消除本发明的NUE多肽的活性的方法。所述多核苷酸可以通过防止NUE信使RNA的转录或翻译直接抑制NUE多肽的表达，或者通过编码抑制编码NUE多肽的NUE基因的转录或翻译的多肽间接抑制NUE多肽的表达。抑制或消除基因在植物中的表达的方法在本领域是熟知的，并且任何这样的方法可以用在本发明中以抑制NUE多肽的表达。
按照本发明，如果NUE多肽的蛋白水平少于没有被遗传修饰或诱变以抑制NUE多肽的表达的植物中相同的NUE多肽的蛋白水平的70％，那么NUE多肽的表达被抑制。在本发明的特别实施方式中，根据本发明的修饰的植物中的NUE多肽的蛋白水平少于不是突变体或者没有被遗传修饰以抑制NUE多肽的表达的植物中相同的NUE多肽的蛋白水平的60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％、或少于2％。NUE多肽的表达水平可以被直接测量，例如通过分析植物细胞或植物中表达的NUE多肽的水平，或者间接地测量，例如，通过测量植物细胞或植物中NUE多肽的氮摄取活性，或者通过测量植物中的表型变化。用于进行这样的分析的方法在本文其他地方描述。
在本发明的另外的实施方式中，NUE多肽的活性通过用包含编码抑制NUE多肽的活性的多肽的多核苷酸的表达盒转化植物细胞而被降低或消除。如果NUE多肽的NUE活性少于没有被修饰以抑制NUE多肽的NUE活性的植物中相同的NUE多肽的NUE活性的70％，那么根据本发明NUE多肽的提高的氮利用活性被抑制。在本发明的特别实施方式中，根据本发明的修饰的植物中NUE多肽的NUE活性少于未被修饰以抑制NUE多肽的表达的植物中的相同的NUE多肽的NUE活性的60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、或少于5％。NUE多肽的NUE活性在其通过本文其他地方描述的分析方法不能检测到时根据本发明被“消除”。确定NUE多肽的氮利用活性的改变的方法在本文其他地方描述。
在另外的实施方式中，NUE多肽的活性可以通过破坏(disrupt)编码NUE多肽的基因而被降低或消除。本发明包括携带NUE基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变减少NUE基因的表达或抑制编码的NUE多肽的氮利用活性。
因此，许多方法可以用于降低或消除NUE多肽的活性。此外，超过一种方法可以用于降低单一的NUE多肽的活性。
1.基于多核苷酸的方法：
在本发明的一些实施方式中，植物被能够表达抑制本发明的NUE多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化。这里所用的术语“表达”指的是基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，为了本发明的目的，能够表达抑制至少一个NUE多肽的表达的多核苷酸的表达盒是能够产生抑制本发明的至少一个NUE多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。来自DNA分子的蛋白质或多肽的“表达”或“产生”指的是产生所述蛋白质或多肽的编码序列的转录和翻译，而来自RNA分子的蛋白质或多肽的“表达”或“产生”指的是RNA编码序列的翻译以产生所述蛋白质或多肽。
抑制NUE多肽的表达的多核苷酸的实例在下面给出。
i.有义抑制/共抑制
在本发明的一些实施方式中，NUE多肽的表达的抑制(inhibition)可以通过有义抑制(sense suppression)或共抑制(cosuppression)获得。对于共抑制，设计表达盒以表达相应于“有义”方向上编码NUE多肽的信使RNA的全部或部分的RNA分子。RNA分子的过度表达可以导致天然基因的表达降低。因此，筛查被共抑制表达盒转化的多个植物系以鉴定那些表现出NUE多肽表达的最大抑制的植物系。
用于共抑制的多核苷酸可以相应于编码NUE多肽的序列的全部或部分、NUE多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或编码NUE多肽的所述编码序列和转录物的非翻译区的全部或部分。在一些实施方式中，其中所述多核苷酸包括NUE多肽的编码区的全部或部分，所述表达盒被设计为消除所述多核苷酸的起始密码子以便将没有蛋白产物被翻译。
共抑制可以用于抑制植物基因的表达以产生具有由这些基因编码的蛋白质的不可检测的蛋白水平的植物。参见，例如，Broin，et al.，(2002)Plant Cell 14：1417-1432。共抑制还可以用于抑制相同的植物中多个蛋白质的表达。参见，例如，美国专利No.5,942,657。用于利用共抑制以抑制植物中内源基因的表达的方法描述在以下中：Flavell，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen，et al.，(1996)PlantMol.Biol.31：957-973；Johansen and Carrington，(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin，et al.，(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk，etal.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu，et al.，(2003)Phytochemistry63：753-763；及美国专利Nos.5,034,323、5,283,184、和5,942,657；其每一个以引用方式并入本文中。共抑制的效率可以通过包含有义序列的3′位置的表达盒中的聚-dT区和5′的多聚腺苷酸信号而提高。参见，美国专利公开No.20020048814，以引用方式并入本文中。典型地，这样的核苷酸序列具有与内源基因的转录物的序列的实质的序列同一性，最佳地大于约65％的序列同一性、更最佳地大于约85％的序列同一性，最最佳地大于约95％的序列同一性。参见美国专利Nos.5,283,184和5,034,323；以引用方式并入本文中。
ii.反义抑制
在本发明的一些实施方式中，NUE多肽的表达的抑制可以通过反义抑制获得。对于反义抑制，表达盒被设计以表达与编码NUE多肽的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。反义RNA分子的过度表达可以导致天然基因的表达降低。因此，筛选被反义抑制表达盒转化的多个植物系以鉴定那些表现出NUE多肽表达的最大抑制的植物系。
用于反义抑制中的多核苷酸可以相应于编码NUE多肽的序列的互补体的全部或部分、NUE转录物的5′和/或3′非翻译区的互补体的全部或部分、或者编码NUE多肽的转录物的编码序列和非翻译区的互补体的全部或部分。此外，反义多核苷酸可以完全互补于(即，100％相同于靶序列的互补体)或部分互补于(即，小于100％相同于靶序列的互补体)靶序列。反义抑制可以用于抑制相同的植物中多个蛋白质的表达。参见，例如，美国专利No.5,942,657。此外，反义核苷酸的部分可以用于破坏靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。用于利用反义抑制以抑制植物中内源基因的表达的方法描述在，例如，Liu，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743及美国专利Nos.5,759,829和5,942,657中，其每一个以引用方式并入本文中。反义抑制的效率可以通过包含反义序列的3′位置的表达盒中的聚-dT区和5′的多聚腺苷酸信号而提高。参见，美国专利公开No.20020048814，以引用方式并入本文中。
iii.双链RNA干涉
在本发明的一些实施方式中，NUE多肽的表达的抑制可以通过双链RNA(dsRNA)干涉来获得。对于dsRNA干涉，象上述那样用于共抑制的有义RNA分子和完全或部分互补于有义RNA分子的反义RNA分子在相同的细胞中表达，导致相应内源信使RNA的表达的抑制。
有义和反义分子的表达可以通过设计表达盒以包括有义序列和反义序列而实现。可替换地，分开的表达盒可以用于有义和反义序列。随后筛查用dsRNA干涉表达盒或多个表达盒转化的多个植物系以鉴定表现出最大的NUE多肽表达抑制的那个植物系。用于利用dsRNA干涉以抑制内源植物基因的表达的方法描述在以下中：Waterhouse，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964，Liu，et al.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743，及WO 99/49029、WO 99/53050、WO99/61631、和WO 00/49035；其每一个以引用方式并入本文中。
iv.发卡RNA干涉和包含内含子的发卡RNA干涉
在本发明的一些实施方式中，NUE多肽的表达的抑制可以通过发卡RNA(hpRNA)干涉或包含内含子的发卡RNA(ihpRNA)干涉获得。这些方法在抑制内源基因的表达时是高度有效的。参见，Waterhouse andHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38及其中引用的参考文献。
对于hpRNA干涉，表达盒被设计以表达与其本身杂交的RNA分子以形成包括单链环区和碱基配对的茎的发卡结构。碱基配对的茎区包括相应于编码其表达要被抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列，以及完全或部分互补于所述有义序列的反义序列。可替换地，碱基配对的茎区可以相应于调控要被抑制的基因的表达的启动子序列的部分。因此，所述分子的碱基配对的茎区通常确定RNA干涉的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达时是高度有效的，它们诱导的RNA干涉被植物的随后的世代遗传。参见，例如，Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；及Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。用于利用hpRNA干涉以抑制或沉默基因表达的方法描述在，例如Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini etal.，BMC Biotechnology 3：7，及美国专利公开No.2003/0175965中；其每一个以引用方式并入本文中。用于hpRNA构建体在体内沉默基因表达的效率的瞬时分析(transient assay)由Panstruga，et al.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140描述，以引用方式并入本文中。
对于ihpRNA，干涉分子具有与hpRNA相同的一般结构，但是RNA分子另外包括能够在其中iphRNA被表达的细胞中被剪接的内含子。内含子的应用最小化剪接后发卡RNA分子的环的大小，这提高了干涉的效率。参见，例如，Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320。实际上，Smith，et al.表明利用ihpRNA-介导的干涉100％抑制内源基因表达。用于利用ihpRNA干涉以抑制内源植物基因的表达的方法描述在以下中，例如，Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320；Wesley，et al.，(2001)PlantJ.27：581-590；Wang and Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell and Waterhouse，(2003)Methods 30：289-295，及美国专利公开No.2003/0180945，其每一个以引用方式并入本文中。
用于hpRNA干涉的表达盒还可以被设计以便有义序列和反义序列不相应于内源RNA。在这个实施方式中，有义和反义序列在环序列的侧翼，所述环序列包括相应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因此，是环区确定RNA干涉的特异性。参见，例如，WO02/00904；Mette，et al.，(2000)EMBO J 19：5194-5201；Matzke，et al.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227；Scheid，et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：13659-13662；Aufsaftz，et al.，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506；Sijen，et al.，Curr.Biol.(2001)11：436-440)，以引用方式并入本文中。
v.扩增子-介导的干涉
扩增子表达盒包括植物病毒-来源的序列，其包含靶基因的全部或部分，但是通常不是天然病毒的基因的全部。表达盒的转录产物中存在的病毒序列允许转录产物引导其自身的复制。由扩增子产生的转录物可相对于靶序列(即，NUE多肽的信使RNA)是有义或反义的。利用扩增子以抑制内源植物基因的表达的方法描述在，例如Angell and Baulcombe，(1997)EMBO J.16：3675-3684，Angell and Baulcombe，(1999)Plant J.20：357-362，及美国专利No.6,646,805中，其每一个以引用方式并入本文中。
vi.核酶
在一些实施方式中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化RNA或具有对于NUE多肽的信使RNA的特异性的核酶活性。因此，所述多核苷酸造成内源信使RNA的降解，导致NUE多肽的表达减少。这个方法描述在，例如，美国专利No.4,987,071中，以引用方式并入本文中。
vii.小干涉RNA或微RNA
在本发明的一些实施方式中，NUE多肽的表达的抑制可以通过RNA干涉通过编码微RNA(miRNA)的基因的表达获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA在抑制内源基因的表达时是高度有效的。参见，例如，Javier，et al.，(2003)Nature 425：257-263，以引用方式并入本文中。
对于miRNA干涉，表达盒被设计以表达在内源miRNA基因上被模式化(modeled)的RNA分子。miRNA基因编码形成包含互补于另外的内源基因(靶序列)的22-核苷酸序列的发卡结构的RNA。为了NUE表达的抑制，22-核苷酸序列从NUE转录物序列被选择并包含有义方向上的所述NUE序列的22个核苷酸和互补于有义序列的相应的反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源基因的表达时是高度有效的，并且它们诱导的RNA干涉被植物的随后的世代遗传。
2.基于多肽的基因表达抑制
在一个实施方式中，所述多核苷酸编码结合于编码NUE多肽的基因的锌指蛋白，导致所述基因的表达降低。在特别的实施方式中，所述锌指蛋白结合于NUE基因的调节区。在另外的实施方式中，所述锌指蛋白结合于编码NUE多肽的信使RNA并防止其翻译。选择用于锌指蛋白的靶向的位点的方法描述在，例如，美国专利No.6,453,242中，用于利用锌指蛋白以抑制植物中基因的表达的方法描述在，例如，美国专利公开No.2003/0037355中；其每一个以引用方式并入本文中。
3.基于多肽的蛋白活性抑制
在本发明的一些实施方式中，所述多核苷酸编码结合于至少一个NUE多肽的抗体，降低NUE多肽的提高的氮利用活性。在另一实施方式中，所述抗体的结合导致通过细胞质量控制机制的抗体-NUE复合体的提高的周转。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体的表达和结合于植物细胞中的蛋白质的分子途径的抑制在本领域是熟知的。参见，例如，Conrad and Sonnewald，(2003)Nature Biotech.21：35-36，以引用方式并入本文中。
4.基因破坏(disruption)
在本发明的一些实施方式中，NUE多肽的活性通过破坏编码NUE多肽的基因而被降低或消除。编码NUE多肽的基因可以通过本领域已知的任何方法被破坏。例如，在一个实施方式中，所述基因通过转座子标签(tagging)被破坏。在另一实施方式中，所述基因通过利用随机或靶向的诱变来诱变植物，选择具有降低的氮利用活性的植物而被破坏。
i.转座子标签
在本发明的一个实施方式中，转座子标签被用于降低或消除一个或多个NUE多肽的NUE活性。转座子标签包括在内源NUE基因中***转座子以降低或消除NUE多肽的表达。“NUE基因”意图指编码根据本发明的NUE多肽的基因。
在这个实施方式中，一个或多个NUE多肽的表达通过在编码NUE多肽的基因的调节区或编码区***转座子而降低或消除。NUE基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子、或任何其它调节序列内的转座子可以被用于降低或消除编码的NUE多肽的表达和/或活性。
用于植物中特异性基因的转座子标签的方法在本领域是熟知的。参见，例如，Maes，et al.，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri andSonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner，et al.，(2000)Plant J.22：265-274；Phogat，et al.，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai，et al.，(2000)Nucleic AcidsRes.28：94-96；Fitzmaurice，et al.，(1999)Genetics 153：1919-1928)。此外，用于在被选的基因中选择Mu***的TUSC过程已经描述在Bensen，et al.，(1995)Plant Cell 7：75-84；Mena，et al.，(1996)Science 274：1537-1540；及美国专利No.5,962,764中；其每一个以引用方式并入本文中。
ii.具有降低的活性的突变植物
用于减少或消除植物中内源基因的表达的另外的方法在本领域也是已知的，可以类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲烷磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)-诱导的诱变、缺失诱变、及在反求遗传学意义中使用的快中子缺失诱变(借助PCR)以鉴定其中内源基因已经缺失的植物系。这些方法的实例参见Ohshima，et al.，(1998)Virology 243：472-481；Okubara，et al.，(1994)Genetics 137：867-874；及Quesada，et al.，(2000)Genetics 154：421-436，其每一个以引用方式并入本文中。此外，用于筛查化学诱导的突变的快速和可自动化的方法，TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)，利用变性HPLC或所选的PCR产物的选择性内切核酸酶消化，也可以应用于本发明。参见，McCallum，et al.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457，以引用方式并入本文中。
影响基因表达或干扰编码的蛋白质的功能(提高的氮利用活性)的突变在本领域是熟知的。基因外显子中***的突变通常导致零-突变体(null-mutant)。保守的残基中的突变在抑制编码的蛋白质的活性方面特别有效。已经描述了适于目的是消除NUE活性的诱变的植物NUE多肽的保守的残基。这样的突变体可以根据熟知的过程分离，不同NUE基因座的突变可以通过遗传杂交(genetic crossing)堆叠(stack)。参见，例如，Gruis，et al.，(2002)Plant Cell 14：2863-2882。
在本发明的另一实施方式中，优势突变体由于基因倒位和双链的(duplicated)基因的基因座的重组而用于触发RNA沉默。参见，例如，Kusaba，et al.，(2003)Plant Cell 15：1455-1467。
本发明包括另外的用于降低或消除一个或多个NUE多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中基因组核苷酸序列的其他方法的实例是本领域已知的，包括而不限于：RNA:DNA载体、RNA:DNA突变的载体、RNA:DNA修复载体、混合的双链寡核苷酸、自身互补的RNA:DNA寡核苷酸、及产生重组的寡核酸碱基(oligonucleobases)的应用。这样的载体和应用方法在本领域是已知的。参见，例如，美国专利Nos.5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972；和5,871,984；其每一个以引用方式并入本文中。还参见，WO 98/49350，WO 99/07865，WO 99/25821，和Beetham，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；其每一个以引用方式并入本文中。
iii.调节氮利用活性
在特定的方法中，植物中NUE调节剂的水平和/活性通过提高植物中NUE多肽的水平或活性而降低。负性调节分子的提高的表达可以降低负责提高的NUE表型的下游一个或多个基因的表达水平。
用于提高植物中NUE多肽的水平和/或活性的方法在本文其它地方论述。简短地，这样的方法包括将本发明的NUE多肽提供给植物并由此提高NUE多肽的水平和/或活性。在另外的实施方式中，编码NUE多肽的NUE核苷酸序列可以通过将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中来提供，表达NUE序列、提高NUE多肽的活性、并由此降低植物或植物部分中组织细胞的数量。在另外的实施方式中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地并入植物的基因组中。
在另外的方法中，植物组织的生长通过降低植物中NUE多肽的水平和/或活性而提高。这样的方法详细披露于本文的其他地方。在一个这样的方法中，NUE核苷酸序列被引入植物中并且所述NUE核苷酸序列的表达降低了NUE多肽的活性，并由此提高了植物或植物部分中的组织生长。在另外的实施方式中，被引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定的并入植物的基因组中。
如上所述，技术人员将认识到用于调节植物中NUE的水平/活性的合适的启动子。用于这个实施方式的示例性的启动子已经在本文其他地方披露。
在另外的实施方式中，这样的植物已经稳定地将包含可操作地连接于驱动在植物细胞中的表达的启动子的本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子并入它们的基因组中。
iv.调节根发育
提供了用于调节植物中的根发育的方法。“调节根发育”意图指与对照植物比较时植物根的发育中的任何改变。根发育中这样的改变包括，而不限于，初生根的生长速率、新鲜根重、侧根和不定根形成的程度、维管***(vasculature system)、分生组织发育、或径向扩张的改变。
提供了用于调节植物中根发育的方法。所述方法包括调节植物中的NUE多肽的水平和/或活性。在一个方法中，本发明的NUE序列被提供给植物。在另一方法中，通过将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中提供NUE核苷酸序列，表达NUE序列，并且由此改变根发育。在又一方法中，被引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地并入植物的基因组中。
在另外的方法中，通过改变植物中NUE多肽的水平或活性调节根发育。NUE活性的变化可以导致至少一个或多个根发育的下面的改变，包括而不限于，根生物量和长度的改变。
如本文所用的，“根生长”包括单子叶植物和双子叶植物中根***发育的不同阶段组成根***的不同部分的生长的全部方面。还将理解提高的根生长可以起因于包括初生根、侧根、不定根等的其部分的一个或多个的提高的生长。
测量根***中这样的发育改变的方法在本领域是已知的。参见，例如，美国申请No.2003/0074698和Werner，et al.，(2001)PNAS18：10487-10492，这两者均以引用方式并入本文中。
如上所述，技术人员将认识到用于调节植物中的根发育的合适的启动子。用于这个实施方式的示例性的启动子包括组成性启动子和根-优先(root-preferred)的启动子。示例性的根-优先的启动子已经在本文其它地方披露。
通过降低NUE多肽的活性和/或水平刺激根生长和提高根质量(mass)还发现在提高植物的站立能力(standability)方面的应用。术语“对倒伏的抗性”或“站立能力”指的是植物将其本身固定于土壤的能力。对于具有直立或半直立生长***和/或活性刺激根生长并提高根质量还发现在促进外植体的体外繁殖中的应用。
此外，由于NUE活性的更高根生物量产生对产量具有直接作用，并且对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的产生具有间接作用。根培养物中产生的感兴趣的化合物的一个实例是紫草宁，其产量可以通过所述方法有利地提高。
因此，本发明进一步提供了当与对照植物的根发育相比时具有调节的根发育的植物。在一些实施方式中，本发明的植物具有本发明的NUE多肽的提高的水平/活性，并且具有提高的根生长和/或根生物量。在其它实施方式中，这样的植物具有稳定地并入它们的基因组中的包含可操作地连接到驱动在植物细胞中的表达的启动子的本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子。
v.调节枝条和叶子发育
还提供了用于调节植物中枝条和叶子发育的方法。“调节枝条和/或叶子发育”意指植物枝条和/或叶子的发育中的任何改变。枝条和/或叶子发育中的这样的改变包括，而不限于，枝条分生组织发育、叶子数量、叶子大小、叶子和茎维管***、节间长度、和叶子衰老中的改变。如本文所用的，“叶子发育”和“枝条发育”包括单子叶植物和双子叶植物中，在它们发育的不同阶段，分别形成叶子***和枝条***的不同部分的生长的所有方面。用于测量枝条和叶子***中这样的发育改变的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Werner，et al.，(2001)PNAS98：10487-10492和美国申请No.2003/0074698，其每一个以引用方式并入本文中。
调节植物中枝条和/或叶子发育的方法包括调节本发明的NUE多肽的活性和/或水平。在一个实施方式中，提供了本发明的NUE序列。在另外的实施方式中，NUE核苷酸序列可以通过将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中而提供，表达NUE序列，并由此改变枝条和/或叶子发育。在另外的实施方式中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地并入植物的基因组中。
在特定的实施方式中，通过改变植物中NUE多肽的水平和/或活性调节枝条或叶子发育。NUE活性的改变可以导致枝条和/或叶子发育中与对照植物相比的至少一个或多个下面的改变，包括，而不限于，叶子数量的变化、改变的叶子表面、改变的维管***、节间和植物生长、及叶子衰老中的改变。
如上所述，技术人员将认识到用于调节植物的枝条和叶子发育的合适的启动子。用于这个实施方式的示例性的启动子包括组成性启动子、枝条-优先的启动子、枝条分生组织-优先的启动子、及叶子-优先的启动子。示例性的启动子已经在本文其他地方披露。
提高植物中NUE活性和/或水平导致改变的节间和生长。因此，本发明的方法发现在产生改变的植物中的应用。此外，如上所述，植物中的NUE活性调节根和枝条生长。因此，本发明进一步提供了用于改变根/枝条比例的方法。枝条或叶子发育可以进一步通过改变植物中NUE多肽的水平和/或活性而被调节。
因此，本发明进一步提供了与对照植物相比时具有调节的枝条和/或叶子发育的植物。在一些实施方式中，本发明的植物具有本发明的NUE多肽的提高的水平/活性。在另外的实施方式中，本发明的植物具有降低的本发明的NUE多肽的水平/活性。
vi.调节再生组织发育
提供了用于调节再生组织(reproductive tissue)发育的方法。在一个实施方式中，提供了调节植物中花(floral)发育的方法。“调节花发育”意指与其中NUE多肽的活性或水平没有被调节的对照植物相比时植物的再生组织的结构中的任何改变。“调节花发育”进一步包括与其中NUE多肽的活性或水平没有被调节的对照植物相比时植物的再生组织的发育的定时(timing)中的任何改变(即，花发育的延迟或加速的定时)。宏观改变可以包括以下的变化：再生器官的大小、形状、数量、或位置、这些结构形成的发育时期、或者环境应激时维持或进行开花过程的能力。微观改变可以包括形成再生器官的细胞的类型或形状的变化。
用于调节植物中花发育的方法包括调节植物中的NUE活性。在一个方法中，提供了本发明的NUE序列。NUE核苷酸序列可以通过将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中而提供，表达NUE序列，并由此改变花发育。在另外的实施方式中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地并入植物的基因组中。
在特别的方法中，通过提高植物中NUE多肽的水平或活性调节花发育。NUE活性的变化可以导致与对照植物相比时花发育中下面的改变的至少一个或多个，包括而不限于，改变的开花、变化的花的数量、改变的雄性不育、及改变的种子set。诱导延迟的开花或抑制开花可以用于提高饲料作物如苜蓿的产量。用于测量花发育中这样的发育改变的方法在本领域是已知的。参见，例如，Mouradov，et al.，(2002)The Plant CellS111-S130，以引用方式并入本文中。
如上所述，技术人员将认识到用于调节植物的花发育的合适的启动子。用于这个实施方式的示例性的启动子包括组成性启动子、可诱导的启动子、枝条-优先的启动子、及花序-优先的启动子。
在另外的方法中，通过改变本发明的NUE序列的水平和/或活性调节花发育。这样的方法可以包括将NUE核苷酸序列引入植物中并改变NUE多肽的活性。在另外的方法中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定的并入植物的基因组中。改变本发明的NUE序列的表达可以调节应激期间花发育。这样的方法描述在本文的其他地方。因此，本发明进一步提供了在与对照植物的花发育相比时具有调节的花发育的植物。组成包括具有改变的本发明的NUE多肽的水平/活性并具有改变的花发育的植物。组成还包括具有本发明的NUE多肽的改变的水平/活性的植物，其中所述植物在应激时维持或进行开花过程。
还提供了用于利用本发明的NUE序列以提高种子大小和/或重量的方法。所述方法包括提高植物或植物部分，如种子中的NUE序列的活性。种子大小和/或重量的提高包括种子大小或重量的提高和/或一个或多个种子部分(包括，例如胚胎(embryo)，胚乳、种皮、糊粉、或子叶)的大小或重量的提高。
如上所述，技术人员将认识到用于提高种子大小和/或种子重量的合适的启动子。这个实施方式的示例性的启动子包括组成性启动子、可诱导的启动子、种子-优先的启动子、胚胎-优先的启动子、及胚乳-优先的启动子。
用于改变植物中种子大小和/或种子重量的方法包括提高植物中的NUE活性。在一个实施方式中，NUE核苷酸序列可以通过将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物来提供，表达NUE序列，并由此降低种子重量和/或大小。在另外的实施方式中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地并入植物的基因组中。
进一步认识到提高种子大小和/或重量还可以伴随有幼苗的生长速度的提高或早期活力(early vigor)的提高。如本文所用的，术语“早期活力”指的是植物在早期发育中快速生长的能力，并且涉及充分发育的根***和充分发育的光合器官(apparatus)在萌发后的成功建立。此外，种子大小和/或重量的提高还可以导致与对照相比时种子产量的提高。
因此，本发明进一步提供了与对照植物相比时具有提高的种子重量和/或种子大小的植物。在另外的实施方式中，提供了具有提高的活力和植物产量的植物。在一些实施方式中，本发明的植物具有本发明的NUE多肽的改变的水平/活性并具有提高的种子重量和/或种子大小。在另外的实施方式中，这样的植物具有稳定地并入它们的基因组中的包含可操作地连接到驱动在植物细胞中的表达的启动子的本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子。
vii.NUE多核苷酸、表达盒、及另外的多核苷酸的应用方法
本文披露的核苷酸、表达盒和方法用于调节宿主植物中任何异源核苷酸序列的表达以便改变植物的表型。表型的各种变化是感兴趣的，包括改变植物中脂肪酸的组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等。这些结果可以通过提供植物中异源产物的表达或提高的内源产物的表达来实现。可替换地，所述结果可以通过提供植物中一个或多个内源产物，尤其是酶或辅因子的表达的减少来实现。这些变化导致转化的植物的表型变化。
感兴趣的基因反应商业市场和植物发育中涉及的那些的兴趣。感兴趣的作物和市场改变，并且随着发展中国家打开国际市场，也将出现新的作物和技术。此外，随着我们对农艺学性状和特征(如产量和杂种优势)的理解提高，用于转化的基因的选择将因此改变。感兴趣的基因的一般种类包括，例如信息中涉及的那些基因，如锌指，传达中涉及的那些，如激酶，管家(housekeeping)中涉及的那些，如热休克蛋白。转基因的更特别的种类，例如，包括编码农业经济学的重要性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征、及商业产品的基因。感兴趣的基因通常包括油、淀粉、碳水化合物、或营养物代谢中涉及的那些以及影响仁(kernel)大小、蔗糖负载等的那些。
在一些实施方式中，本发明的核酸序列可以与感兴趣的其它多核苷酸序列组合(“堆叠”)使用，以便形成具有希望的表型的植物。产生的组合可以包括感兴趣的任何一个或多个多核苷酸的多个拷贝。本发明的多核苷酸可以与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种希望的性状组合的植物，包括而不限于对于动物饲料希望的性状，如高油基因(例如，美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美国专利Nos.5,990,389；5,885,801；5,885,802；及5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO98/20122)；及高蛋氨酸蛋白(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359；及Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；提高的消化性(例如，修饰的储备蛋白(美国申请系列No.10/053,410，于2001年11月7日提交)；和硫氧还蛋白(美国申请系列No.10/005,429，于2001年12月3日提交))，其披露的内容以引用方式并入本文。本发明的多核苷酸还可以与昆虫、疾病或除草剂抗性希望的性状堆叠(例如，Bacillus thuringiensis毒性蛋白(美国专利Nos.5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723，756；5,593,881；Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马菌素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒和疾病抗性基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789；Martin，et al.，(1993)Science262：1432；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂如草丁膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；加工或加工产品希望的性状如高油(例如，美国专利No.6,232,529)；修饰的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；及聚合物或bioplastics(例如，美国专利No.5.602,321；β-酮硫解酶(beta-ketothiolase)，聚羟基丁酸合酶(polyhydroxybutyrate synthase)，和乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)的表达)，其披露的内容以引用方式并入本文。人们还可以将本发明的多核苷酸与影响农艺学性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状如雄性不育(例如，参见美国专利No.5.583,210)、茎杆(stalk)强度、开花时间、或转化技术性状，如细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619；WO 00/17364；WO99/25821)，其披露的内容以引用方式并入本文中。
在一个实施方式中，感兴趣的序列提高了植物生长和/或作物产量。例如，感兴趣的序列包括导致提高的初生根或侧根***的农艺学上重要的基因。这样的基因包括，而不限于，营养素/水运输物和生长诱导物。这样的基因的实例，包括而不限于，玉蜀黍质膜H+-ATPase(MHA2)(Frias，et al.，(1996)Plant Cell 8：1533-44)；AKT1，Arabidopsis中钾摄取器官的成分(Spalding，et al.，(1999)J Gen Physiol 113：909-18)；RML基因，其激活根顶端细胞中的细胞***周期(Cheng，et al.，(1995)Plant Physiol108：881)；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya，et al.，(1994)Plant MolBiol 26：1935-46)和血红蛋白(Duff，et al.，(1997)J.Biol.Chem27：16749-16752，Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol 114：493-500及其中引用的参考文献)。感兴趣的序列在表达负性影响根发育的基因的反义核苷酸序列中也是有用的。
此外，除了利用传统的育种方法，农艺学上重要的性状如油、淀粉、及蛋白含量可以被遗传改变。变更包括提高油酸、饱和和不饱和的油的含量、提高赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸、及淀粉的修饰。Hordothionin蛋白修饰描述在美国专利Nos.5,703,049，5,885,801，5,885,802，和5,990,389中，以引用方式并入本文中。另一实例是由大豆2S白蛋白编码的赖氨酸和/或硫丰富的种子蛋白，描述在美国专利No.5,850,016中，和来自大麦的糜蛋白酶抑制剂，描述在Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中，其披露的内容以引用方式并入本文中。
编码序列的衍生物可以通过位点-引导的诱变制备以提高编码的多肽中预选的氨基酸的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦糜蛋白酶抑制剂，美国申请系列No.08/740,682，于1996年11月1日提交，以及WO 98/20133，其披露的内容以引用方式并入本文中。其它蛋白质包括蛋氨酸丰富的植物蛋白质，如来自向日葵种子(Lilley，et al.，(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable ProteinUtilization in Human Foods and Animal Feedstuffs，ed.Applewhite(American Oil Chemists Society，Champaign，Illinois)，pp.497-502；以引用方式并入本文中)；玉米(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359；两者以引用方式并入本文中)；以及稻米(Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123，以引用方式并入本文中)。其它农艺学上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子储藏因子、及转录因子。
昆虫抗性基因可以编码对具有较大产量制约的害虫的抗性，如食虫、切根虫、欧洲玉米螟(European Corn Borer)等。这样的基因包括，例如，Bacillus thuringiensis毒性蛋白基因(美国专利Nos.5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；及Geiser，et al.，(1986)Gene48：109)；等等。
编码疾病抗性性状的基因包括解毒基因、如针对fumonosin(美国专利No.5,792,931)；无毒(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432；及Mindrinos，etal.，(1994)Cell 78：1089)；等等。
除草剂抗性性状可以包括编码对除草剂抗性的基因，其起作用以抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用，尤其是磺酰脲类除草剂(例如，包含导致这样的抗性的突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突变)、编码对作用以抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，如草丁膦或basta(例如，bar基因)，或本领域已知的其它这样的基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性、ALS-基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可以在表达盒中编码并且提供physical去雄的可选方法。以这样的方式使用的基因的实例包括雄性组织优先的基因和具有雄性不育表型的基因，如QM，描述在美国专利No.5,583,210中。其它基因包括激酶和那些编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的基因。
谷粒的质量反映在如下性状中，如饱和和不饱和的油的水平和类型、必需氨基酸的质量和量、纤维素的水平。在玉米中，修饰的hordothionin蛋白描述在美国专利Nos.5,703,049，5,885,801，5,885,802，和5,990,389中。
商业性状也可以编码在基因或多个基因上，其可以提高，例如，用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白的表达。转化的植物的另一重要的商业应用是聚合物和bioplastics的产生，如美国专利No.5,602,321中描述的。基因如β-酮硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸合酶)、和乙酰乙酰-CoA还原酶(参见，Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHAs)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其它真核生物的其他来源的那些。这样的产物包括酶、辅因子、激素等。蛋白质的水平，尤其是具有提高的氨基酸分布以提高植物的营养价值的修饰的蛋白质的水平，可以被提高。这通过具有提高的氨基酸含量的这样的蛋白质的表达实现。
参照下面的非限制性实施例可以更好地理解这个发明。本领域技术人员将认识到可以实践本发明的其它实施方式而不偏离本文披露和要求的本发明的精神和范围。
实施例
实施例1.NUE序列的分离
用于鉴定基因家族的所有成员的程序可以用于检索感兴趣的提高的氮利用效率基因。将制备作为蛋白质序列的基因家族的所有已知成员的不同的组。这个数据包括来自其它物种的序列。这些物种随后被针对专有的(proprietary)玉蜀黍序列数据组(dataset)检索并且重叠命中(hits)的非冗余组被鉴定。分别地，人们处理感兴趣的任何基因的核苷酸序列并且针对所述数据库检索，所有重叠命中的非冗余组被检索到。蛋白质命中的组随后与核苷酸命中比较。如果基因家族是完全的，所有蛋白质命中包含在核苷酸命中内。
实施例2.NUE通过功能的分类
表1
 
基因描述 功能分组 SEQ ID NOS：NA/AA
锌指转录因子 转录因子 1/2
MADS-结构域转录因子 转录因子 3/4
Myb-相关的转录因子 转录因子 5/6
MADS-结构域转录因子 转录因子 7/8
蛋白激酶 信号转导 9/10
氮氧化酶合酶 信号转导 11/12
铁氧还蛋白-NADP+还原酶 氮-碳同化 13/14
铁氧还蛋白—硝酸盐还原酶 氮-碳同化 15/16
B-型细胞周期蛋白 混杂或未知功能 17/18
RING-H2指蛋白 信号转导 19/20
铁氧还蛋白—硝酸盐还原酶 氮-碳同化 21/22
甘氨酸脱羧酶复合体H-蛋白 氨基酸代谢 23/24
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 25/26
酮糖转移酶 代谢酶 27/28
铁氧还蛋白 氮-碳同化 29/30
水解酶 代谢酶 31/32
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 33/34
丝氨酸/苏氨酸激酶 信号转导 35/36
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 37/38
液泡H+-输出ATP酶 转运物 39/40
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 41/42
假定的单脱氢抗坏血酸还原酶 应激和激素反应 43/44
同源异型结构域(Homeodomain)亮氨酸拉链蛋白 转录因子 45/46
3-异丙基苹果酸脱水酶大亚单位 代谢酶 47/48
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 49/50
多胺氧化酶 应激和激素反应 51/52
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 53/54
 
精氨酸N-甲基转移酶 氨基酸代谢 55/56
假定的琥珀酰-CoA连接酶α亚单位 代谢酶 57/58
天冬酰胺合酶(Asparagine synthasetase) 氨基酸代谢 59/60
铁氧还蛋白 氮-碳同化 61/62
tRNA合成酶II类(G，H，P和S)家族蛋白 代谢酶 63/64
假定的HB2同源异型结构域蛋白 转录因子 65/66
EREBP-样蛋白 转录因子 67/68
天冬氨酸甲氨酰转移酶 氨基酸代谢 69/70
假定的氨基酸转运物(transport) 转运物 71/72
N-氨基甲酰-L-氨基酸氨基水解酶 氨基酸代谢 73/74
线粒体苹果酸脱氢酶 代谢酶 75/76
腺苷高半胱氨酸酶-样蛋白 代谢酶 77/78
内切核酸酶/外切核酸酶/磷酸酶家族蛋白-样 代谢酶 79/80
雷帕霉素(Rapamycin)-结合蛋白 混杂或未知功能 81/82
假定的亮氨酸-丰富的受体-样蛋白激酶 信号转导 83/84
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 85/86
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 87/88
发病相关蛋白 应激和激素反应 89/90
肽转运蛋白 转运物 91/92
铁氧还蛋白 氮-碳同化 93/94
氨基酰化酶(Aminoacylase) 氨基酸代谢 95/96
PDR-型ABC转运物-样 转运物 97/98
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 99/100
DRE结合因子2 混杂或未知功能 101/102
甘氨酸羟甲基转移酶 氨基酸代谢 103/104
牙本质涎磷蛋白(sialophosphoprotein)前体-样蛋白 混杂或未知功能 105/106
ATP-柠檬酸合酶 代谢酶 107/108
γ-裂合酶 代谢酶 109/110
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 111/112
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 113/114
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 115/116
 
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 117/118
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 119/120
组氨酸氨基酸转运物 转运物 121/122
NOD26-样膜整合蛋白ZmNIP2-2 转运物 123/124
葡萄糖-6-磷酸盐/磷酸酯-易位体(Glucose-6-phosphate/phosphate-translocator)前体 转运物 125/126
酯加氧酶 应激和激素反应 127/128
高半胱氨酸S-甲基转移酶 应激和激素反应 129/130
铁氧还蛋白 氮-碳同化 131/132
铁氧还蛋白-依赖的谷氨酸合酶，叶绿体 氮-碳同化 133/134
谷氨酰胺合酶 氮-碳同化 135/136
谷氨酰胺合酶 氮-碳同化 137/138
细胞骨蛋白 混杂或未知功能 139/140
OCL3蛋白 混杂或未知功能 141/142
Seven in absentia 混杂或未知功能 143/144
铜伴侣蛋白(Copper chaperone) 混杂或未知功能 145/146
支链氨基酸氨基转移酶 氨基酸代谢 147/148
谷氨酸脱氢酶 氨基酸代谢 149/150
羟基邻氨基苯甲酸羟基肉桂酰转移酶(Hydroxyanthranilate hydroxylcinnamoyltransferase) 氨基酸代谢 151/152
丙氨酸转氨酶 氨基酸代谢 153/154
色氨酸合酶 氨基酸代谢 155/156
假定的天冬氨酸转氨酶 氨基酸代谢 157/158
尿卟啉-III C-甲基转移酶 代谢酶 159/160
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 161/162
ATP-依赖性转运物 转运物 163/164
通透酶 转运物 165/166
ABA-反应蛋白 应激和激素反应 167/168
GTP酶活化蛋白-样 应激和激素反应 169/170
酯加氧酶 应激和激素反应 171/172
铁氧还蛋白 氮-碳同化 173/174
 
Fd III 氮-碳同化 175/176
硝酸盐还原酶 氮-碳同化 177/178
NADP-特异性异柠檬酸脱氢酶 混杂或未知功能 179/180
核酸结合蛋白 混杂或未知功能 181/182
精氨酸N-甲基转移酶 氨基酸代谢 183/184
赖氨酸脱羧酶-样蛋白 氨基酸代谢 185/186
谷氨酸脱羧酶同工酶 氨基酸代谢 187/188
精氨酸脱羧酶(ADC) 氨基酸代谢 189/190
精氨酸脱羧酶(ADC) 氨基酸代谢 191/192
MATE流出物(efflux)家族蛋白 转运物 193/194
假定的硝酸盐转运物 转运物 195/196
寡肽转运物OPT-样 转运物 197/198
铵转运物 转运物 199/200
氨基酸转运蛋白AAP1 转运物 201/202
假定的寡肽转运物 转运物 203/204
NAC转录因子 转录因子 205/206
Myb转录因子 转录因子 207/208
MADS-结构域转录因子 转录因子 209/210
脱落酸-和应激-可诱导的蛋白 应激和激素反应 211/212
海藻糖-6-磷酸合酶 应激和激素反应 213/214
F-盒蛋白；冠菌素(coronatine)-不敏感的1/COL1(FBL2) 信号转导 215/216
丙氨酸转氨酶 氨基酸代谢 217/218
假定的硫酸盐转运物 转运物 219/220
硝酸盐转运物，假定的 转运物 221/222
乙烯-反应元件结合因子 转录因子 223/224
未知的；WRKY转录因子？ 混杂或未知功能 225/226
乙烯-反应元件结合因子 转导因子 227/228
Ser-Thr蛋白激酶 信号转导 229/230
亮氨酸-丰富的重复家族蛋白/蛋白激酶家族蛋白 信号转导 231/232
假定的IAA-氨基酸水解酶 应激和激素反应 233/234
 
碳-氮水解酶家族蛋白 氮-碳同化 235/236
谷氨酰胺合酶 氮-碳同化 237/238
谷氨酰胺合酶 氮-碳同化 239/240
干旱-诱导的疏水蛋白 应激和激素反应 241/242
氨基酸转运物 转运物 243/244
甘油二酯激酶 代谢酶 245/246
亚硝酸还原酶 氮-碳同化 247/248
假定的钾转运物 转运物 249/250
假定的糖转运物 转运物 251/252
S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 应激和激素反应 253/254
TA1蛋白-样 混杂或未知功能 255/256
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 257/258
谷氨酸脱羧酶 氨基酸代谢 259/260
转氨酶 氨基酸代谢 261/262
丙氨酸转氨酶 氨基酸代谢 263/264
白喉酰胺(Diphthamide)合成DPH2-样 混杂或未知功能 265/266
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 267/268
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 269/270
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 271/272
水解酶 代谢酶 273/274
蒜氨酸酶 混杂或未知功能 275/276
钼辅因子合成蛋白3 氮-碳同化 277/278
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 279/280
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 281/282
酰氨酰基(Acylaminoacyl)-肽酶 代谢酶 283/284
丝氨酸棕榈酰转移酶 氨基酸代谢 285/286
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 287/288
未知或假想的(保守的)蛋白质 混杂或未知功能 289/290
通透酶 转运物 291/292
氨基酸通透酶 转运物 293/294
假定的早nodulin 混杂或未知功能 295/296
 
腈水解酶1 混杂或未知功能 297/298
假定的3-异丙基苹果酸脱氢酶 代谢酶 299/300
谷氨酰胺合成酶 氮-碳同化 301/302
S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 应激和激素反应 303/304
ABSCISIC STRESS RIPENING PROTEIN 3 应激和激素反应 305/306
尿卟啉-III C-甲基转移酶 混杂或未知功能 307/308
金属肽酶(Metallopeptidase) 代谢酶 309/310
脯氨酰(Prolyl)氨肽酶 氨基酸代谢 311/312
根特异性金属转运物 转运物 313/314
实施例3.玉蜀黍中利用MPSS的表达模式
MPSS代表Massively Parallel Signature Sequencing，由LynxTherapeutics，Inc.of Hayward，California发明并商业化的技术。MPSS和相关的技术已经描述在Brenner，et al.，(Nature Biotechnol.(2000)18：630-634，and PNAS(2000)97：1665-1670)的公开出版物中。象SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)，MPSS产生从mRNA内的限定位置产生的短序列信号(signature)，这些信号在给定文库中的相对丰度代表那个基因的表达的定量估计。MPSS信号为17bp长，可以独特的鉴定Arabidopsis中的所有基因的>95％。
NUE序列被匹配于MPSS数据，匹配标签(GATC-17mers)被安排(curated)。理想地，用于基因的正确的标签是在正链中，接近但是从poly A尾向上，它是基因特异性的。当超过一个标签匹配基因时，人们通常选择最接近poly A尾的那个，其也通常是具有最高的基因表达的那个。当标签匹配超过一个基因时，正确的基因联合通常是具有最佳地相应于由MPSS数据揭示的表达模式的EST分布的那个。
实施例4.转基因植物的转化和再生
用包含可操作地连接到干旱-可诱导的启动子RAB17启动子(Vilardell，et al.，(1990)Plant Mol Biol 14：423-432)和提供对除草剂双丙氨磷的抗性的可选择的标记物基因PAT的NUE序列的质粒轰击来自温室供体植物的不成熟的玉蜀黍胚胎。可替换地，可选择的标记物基因在分开的质粒上提供。转化如下进行。介质配方如下。
靶组织的制备：
耳穗被脱壳并在30％次氯酸钠漂白剂(Clorox bleach)加0.5％微洗涤剂(Micro detergent)中表面灭菌20分钟，用无菌水漂洗两次。不成熟的胚胎被切下并且放置在560Y培养基上4小时，胚轴侧向下(盾片侧向上)，每个盘25个胚胎，随后排列在2.5-cm靶区域内准备轰击。
DNA的制备：
制备包含可操作地连接于泛蛋白启动子的NUE序列的质粒载体。这个质粒DNA加上包含PAT可选择的标记物的质粒DNA，利用如下的CaCl2沉淀程序被沉淀到1.1μm(平均直径)的钨粒上：
水中100μl制备的钨粒
Tris EDTA缓冲剂中10μl(1μg)DNA(1μg总DNA)
100μl 2.5M CaCl2
10μl 0.1M亚精胺
每个试剂被顺序地加入钨粒悬浮液，同时维持在多管涡旋机(vortexer)上。最后的混合物被简单地超声并且允许在恒定的涡旋下孵育10分钟。在沉淀期后，所述管被简单地离心，去除液体，用500ml 100％乙醇冲洗，并离心30秒。再次去除液体，将105μl 100％乙醇加到最终的钨粒沉淀物。对于基因枪(粒子枪)轰击，钨/DNA粒子被简单地超声并且10μl点到每个大运载体(macrocarrier)的中心上，并且允许在轰击前干燥约2分钟。
基因枪处理：
在基因枪中在水平#4轰击样品盘。所有的样品接受在650 PSI的单击，总共10个等分试样取自制备的粒子/DNA的每个管。
随后的处理：
轰击后，胚胎被保持在560Y培养基上2天，随后转移到包含3mg/L的双丙氨磷的560R选择培养基，并每2周传代培养。在约10周的选择后，选择抵抗的愈伤组织克隆被转移到288J培养基以开始植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，充分发育的体细胞胚被转移到用于萌发的培养基并转移到光亮的培养室。约7-10天后，发育中的小植物被转移到管中272V无激素培养基达7-10天直到小植物被充分地建立。随后将植物转移到包含盆栽土的平面中的***口(insert)(相当于2.5＂罐)并在生长室中生长1周，随后在温室中生长另外的1-2周，随后转移到经典的600罐(1.6加仑)并生长至成熟。对植物监测并对提高的干旱耐性计分。测量提高的干旱耐性的分析在本领域是常规的并包括，例如，在与相同的环境条件下的对照玉蜀黍植物相比时在干旱条件下提高的仁-耳穗容量(kernel-earring capacity)产量。可替换地，转化的植物可以被监测在分生组织发育中的调节(即，耳穗上小穗形成的减少)。参见，例如Bruce，et al.，(2002)Journal of Experimental Botany 53：1-13。
轰击和培养介质：
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(basal salts)(SIGMAC-1416)、1.0ml/l Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l硫胺素HCl、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D、及2.88g/l L-脯氨酸(在用KOH调节到pH 5.8之后用D-I H2O加到体积(brought to volume))；2.0g/l Gelrite(在用D-I H2O加到体积后加入)；及8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌后加入并冷却到室温)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson’s Vitamin Mix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l硫胺素HCl、30.0g/l蔗糖、及2.0mg/l 2，4-D(在用KOH调节到pH 5.8之后用D-I H2O加到体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-I H2O加到体积后加入)；及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(bialaphos)(均在将培养基灭菌后加入并冷却到室温)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素类储备溶液(0.100g烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、及0.40g/l甘氨酸，用精制的(polished)D-I H2O加到体积)(Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖、及1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调整到pH5.6后用精制的D-I H2O加到体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-I H2O加到体积后加入)；及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(在将培养基灭菌后加入并冷却到60℃)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/l MS维生素类储备溶液(0.100g/l烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、及0.40g/l甘氨酸，用精制的D-I H2O加到体积)、0.1g/l肌醇、及40.0g/l蔗糖(在调整pH到5.6后用精制的D-I H2O加到体积)；及6g/l细菌琼脂(bacto-agar)(在用精制的D-I H2O加到体积后加入)，灭菌并冷却到60℃。
实施例5.土壤杆菌介导的转化
为了用本发明的NUE序列的反义序列的土壤杆菌介导的玉蜀黍转化，优选采用Zhao的方法(美国专利No.5,981,840，及PCT专利公开WO98/32326；其内容以引用方式并入本文中)。简短地，从玉蜀黍分离不成熟的胚胎并且将胚胎与土壤杆菌的悬浮液接触，其中细菌能够将反义NUE序列转移到不成熟胚胎的至少一个的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在这个步骤中不成熟的胚胎被优选地浸入土壤杆菌悬浮液用于接种的起始。胚胎与土壤杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，不成熟的胚胎在感染步骤后在固体培养基上培养。在这个共培养期后，预期进行可选的“静止”步骤。在这个静止步骤中，在至少一个已知抑制土壤杆菌的生长的至少一个抗生素的存在下孵育胚胎，而没有添加用于植物转化体的选择性试剂(步骤3：静止步骤)。优选地，不成熟的胚胎在具有抗生素而没有选择性试剂的固体培养基上培养，用于消除土壤杆菌并且用于感染的细胞的静止期。随后，接种的胚胎在包含选择性试剂的培养基上培养并且生长的转化的愈伤组织被回收(步骤4：选择步骤)。优选地，不成熟的胚胎在具有导致转化的细胞的选择性生长的选择性试剂的固体培养基上培养。愈伤组织随后再生为植物(步骤5：再生步骤)，优选地在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上培养以再生植物。植物被监测并计分在分生组织发育中的调节。例如，大小的改变和枝条和花分生组织的出现和/或提高的叶子、花朵、和/或果实的产量。
实施例6.大豆胚胎转化
用包含可操作地连接到如下的泛蛋白启动子的反义NUE序列的质粒轰击大豆胚胎。为了诱导体细胞胚，从大豆栽培种A2872的表面灭菌的、不成熟的种子切下的长度为3-5mm的子叶在合适的琼脂培养基上在26℃的光亮或黑暗中培养六到十周。产生二级胚胎(secondaryembryo)的体细胞胚随后被切下并置入合适的液体培养基中。在重复地选择繁殖为早期、球形期胚胎的体细胞胚的集簇后，悬浮液被如下维持。
大豆胚发生悬浮培养物可以被维持在旋转振荡器上的35ml液体介质中，150rpm，26℃，16:8小时日/夜时间表的荧光。每两周通过将约35mg的组织接种入35ml的液体培养基来传代培养培养物。
随后通过基因枪轰击的方法转化大豆胚发生悬浮培养物(Klein，etal.，(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利No.4,945,050)。Du PontBiolistic PDS1000/HE仪器(helium retrofit)可以用于这些转化。
可以用于促进大豆转化的可选择的标记物基因是由来自Cauliflower Mosaic Virus的35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature313：810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自E.coli；Gritz，et al.，(1983)Gene 25：179-188)、及来自Agrobacterium tumefaciens的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区组成的转基因。包含可操作地连接到泛蛋白启动子的反义NUE序列的表达盒可以被作为限制性片段分离。这个片段可以随后被***携带标记物基因的载体的独特的限制性位点。
向50μl的60mg/ml 1μm金粒悬浮液中加入(按次序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)、及50μl CaCl2(2.5M)。粒子制备物随后被搅拌三分钟、在微量离心机(microfuge)中离心(spun)10秒、去除上清液。DNA-包覆的粒子随后在400μl 70％乙醇中冲洗一次，重新悬浮在40μl的无水乙醇中。DNA/粒子悬浮液可以被超声三次，每次一秒。5μl的DNA-包覆的金粒子随后被加载在每个大运载盘上。
将约300-400mg的两周大的悬浮培养物置于空的60 x 15mm培养皿中并用吸管从组织去除残余的液体。对于每个转化实验，组织的约5-10个盘通常被轰击。膜破裂压设定在1100psi，所述室被抽空为28英寸水银的真空。所述组织被放置在离阻滞筛约3.5英寸远并被轰击三次。在轰击后，所述组织可以被分成两半，放置回液体中，并如上所述培养。
轰击后5-7天，液体介质可以用新鲜介质交换，轰击后11-12天用包含50mg/ml的潮霉素的新鲜介质交换。这个选择性介质可以每周更新。轰击后7-8周，绿色、转化的组织可以被观察到从未转化的、坏死的胚胎发生集簇生长。分离的绿色组织被去除并接种入单独的烧瓶以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚胎发生悬浮培养物。每个新的系可以作为独立的转化事件对待。这些悬浮物可以随后被传代培养并维持为不成熟的胚胎的集簇或通过单独的体细胞胚的成熟和萌发再生为全植物。
实施例7.向日葵分生组织转化
用包含可操作地连接到如下的泛蛋白启动子的反义NUE序列的表达盒转化向日葵分生组织(还参见，欧洲专利No.EP 0 486233，以引用方式并入本文中，及Malone-Schoneberg，et al.，(1994)Plant Science103：199-207)。利用单小麦头脱粒机将成熟向日葵种子(Helianthus annuusL.)去壳。种子在每50ml溶液中添加有两滴吐温20的20％次氯酸钠漂白剂溶液中表面灭菌30分钟。所述种子用无菌蒸馏水漂洗两次。
通过Schrammeijer，et al.(Schrammeijer，et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：55-60)描述的过程的改良制备***的(split)胚轴外植体。在表面灭菌程序后种子被吸入蒸馏水达60分钟。每个种子的子叶随后被破裂，在胚轴的面上产生清楚的裂口。在切除根尖后，外植体在初叶之间纵向切开。两半切割面朝上被放置在GBA培养基上，所述GBA培养基由Murashige和Skoog矿质元素(Murashige，et al.，(1962)Physiol.Plant.，15：473-497)、Shepard′s维生素添加剂(Shepard，(1980)in EmergentTechniques for the Genetic Improvement of Crops(University of MinnesotaPress，St.Paul，Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/l6-苯甲基-氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA3)，pH 5.6，及8g/l Phytagar组成。
在土壤杆菌处理前对外植体进行微抛射轰击(Bidney，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。30-40个外植体被置于为这个处理的60 X20mm盘的中心的圆圈中。约4.7mg的1.8mm钨微抛射体被重新悬浮在25ml的无菌TE缓冲剂(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，每个轰击使用1.5ml等分试样。每个盘通过PDS 
Figure A200780012807D00661
粒子加速装置中位于样品上2cm处的150mm nytex screen被轰击两次。
去除武装的(disarmed)Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105被用在所有的转化实验中。包括包含可操作地连接到泛蛋白启动子的NUE基因的表达盒的双质粒载体经由冻融引入土壤杆菌菌株EHA105，如Holsters，et al.，(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187所述。这个质粒进一步包含卡那霉素可选择的标记物基因(即，nptII)。用于植物转化实验的细菌在具有植物菌株和双质粒维持所需的合适的抗生素的液体YEP培养基(10gm/l酵母提取物，10gm/l Bactopeptone，和5gm/l NaCl，pH 7.0)中过夜生长(28℃和100RPM持续搅拌)。悬浮液在达到约0.4-0.8的OD600时被使用。土壤杆菌细胞被沉淀(pelleted)并以0.5的最终OD600被重新悬浮在包含12.5mM MES pH 5.7、1gm/l NH4Cl、和0.3gm/l MgSO4的接种培养基中。
新鲜轰击的外植体被置于土壤杆菌悬浮液中，混合、不受打扰地留置30分钟。外植体随后被转移到GBA培养基并共培养、切割面朝下，26℃，每天18小时(18-hour days)。在三天的共培养后，外植体被转移到补充有250mg/l头孢噻肟(cefotaxime)和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(GBA培养基，缺乏生长调节剂，及1％的减少的蔗糖水平)。外植体在选择上被培养2-5周，随后被转移到缺乏卡那霉素的新鲜374B培养基，用于持续的发育1-2周。没有产生适于切除的枝条的具有分化、抗生素抗性的生长区域的外植体被转移到包含250mg/l头孢噻肟的GBA培养基，用于第二个3天的植物激素处理。来自绿色、卡那霉素抗性的枝条的叶子样品通过ELISA被分析NPTII的存在并且通过分析在分生组织发育中的调节(即，枝条和花分生组织的大小和外观的改变)分析转基因表达的存在。
NPTII-阳性的枝条被嫁接到体外生长的向日葵幼苗根茎中的
Figure A200780012807D00671
杂种6440。表面灭菌的种子在48-0培养基(半强度Murashige和Skoog盐，0.5％蔗糖，0.3％固化剂(gelrite)，pH 5.6)中发芽并在外植体培养所描述的条件下生长。去除幼苗的上部，1cm垂直薄片在下胚轴中制备，转化的枝条被***切口。完整的区域用封口膜(parafilm)包绕以固定枝条。嫁接的植物在体外培养的一周后被转移到土壤。土壤中的嫁接物维持在高湿度条件下，随后缓慢适应温室环境。温室中成熟的T0植物(亲代)的转化的区段通过NPTII ELISA和/或通过叶子提取物的NUE活性分析鉴定，而从NPTII-阳性T0植物收获的转基因种子通过干种子子叶的小部分的NUE活性分析鉴定。
可替换的向日葵转化方案允许回收转基因子代而不使用化学选择压力。种子被脱壳并在每100ml溶液添加有2-3滴吐温20的20％次氯酸钠漂白剂溶液中表面灭菌20分钟，随后用蒸馏水漂洗3次。灭菌的种子在用水弄湿的滤纸上在黑暗中26℃吸收20小时。子叶和root radical被去除，分生组织外植体在黑暗下在374E(GBA培养基，由MS盐，Shepard维生素，40mg/l硫酸腺嘌呤，3％蔗糖，0.5mg/l 6-BAP，0.25mg/lIAA，0.1mg/l GA，和0.8％Phytagar组成，pH 5.6)上培养24小时。去除初生叶以暴露顶端分生组织，约40个外植体被放置在374M(GBA培养基，具有1.2％Phytagar)的中心的2cm圆圈内，顶端顶面向上，随后在黑暗中在所述培养基上培养24小时。
约18.8mg的1.8μm钨粒被重新悬浮在150μl纯乙醇中。在超声后，8μl的它被滴在大运载体的表面的中心上。每个盘用650psi破裂盘(rupture discs)在26mm的Hg氦枪真空时在第一架中轰击两次。
感兴趣的质粒经由先前所述的冻融被引入Agrobacteriumtumefaciens菌株EHA105。在50μg/l的卡那霉素的存在下在液体YEP培养基(10g/l酵母提取物、10g/l Bactopeptone、及5g/l NaCl，pH 7.0)中在28℃过夜生长的细菌的沉淀(pellet)被重新悬浮在接种培养基(12.5mM 2-mM 2-(N-吗啉代)乙基磺酸(ethanesulfonic acid)，MES，1g/lNH4Cl和0.3g/l MgSO4，pH 5.7)中以达到在OD 600的4.0的终浓度。粒子-轰击的外植体被转移到GBA培养基(374E)，细菌悬浮液的小滴被直接置于分生组织的顶部上。外植体在培养基上共同培养4天，其后外植体被转移到374C培养基(GBA，具有1％蔗糖，没有BAP，IAA，GA3，补充有250μg/ml头孢噻肟)。小植物在所述培养基上在每天16小时和26℃孵育条件下培养约2周。
来自在374C培养基中培养两周的外植体(约2cm长)被筛查在分生组织发育中的调节(即，枝条和花分生组织的大小和外观的改变)。在鉴定了阳性外植体后，没有展现出改变的NUE活性的那些枝条被丢弃，每个阳性外植体被再分成结节(nodal)外植体。一个结节外植体包含至少一个潜在的结节。结节节段在GBA培养基上培养三到四天以促进从每个结节的辅助芽的形成。随后它们被转移到374C培养基并允许发育另外的四周。发育中的芽被分离并在374C培养基上培养另外的4周。从每个新收集的枝条汇集的(pooled)叶子样品通过合适的蛋白活性分析再次筛查。此时，从单一的结节回收的阳性枝条将通常富集在结节培养前在最初的分析中检测的转基因节段。
对于改变的NUE表达阳性的回收的枝条被嫁接到在体外生长的向日葵幼苗根茎中的Pioneer杂种6440。根茎以下面的方式制备。种子被脱壳并在每100ml溶液中添加有2到3滴吐温20的20％次氯酸钠漂白剂溶液中表面灭菌20分钟，并用蒸馏水漂洗3次。灭菌的种子在用水润湿的滤器上发芽3天，随后它们被转移入48培养基(半强度MS盐，0.5％蔗糖，0.3％固化剂pH 5.0)并在黑暗下在26℃生长3天，随后在每天16小时培养条件下孵育。去除选择的幼苗的上部，在每个下胚轴中制备垂直的薄片，转化的枝条被***V-切口。切口区用封口膜包裹。在培养基上培养1周后，嫁接的植物被转移到土壤。在最初的两周内，它们被维持在高湿度条件下以适应温室环境。
实施例8.稻米组织转化
NUE基因的遗传确认
本领域技术人员可获得的用于将DNA转化入高等植物的细胞内的一个方法是利用包覆有感兴趣的核酸构建体的金属粒子的高速弹道轰击(参见，Klein，et al.，Nature(1987)(London)327：70-73，以及参见美国专利No.4,945,050)。Biolistic PDS-1000/He(BioRAD Laboratories，Hercules，CA)用于这些互补实验。粒子轰击技术用于用DNA片段转化NUE突变体和野生型稻米。
来自Streptomyces hygroscopicus提供对抗生素的抗性的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因用作稻米转化的可选择的标记物。在载体中，pML18，Hpt II基因用来自花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)的35S启动子和来自Agrobacterium tumefaciens的章鱼碱合酶基因的终止和多聚腺苷酸信号工程化。pML18在WO 97/47731中描述，WO97/47731于1997年12月18日公开，其披露的内容以引用方式并入本文中。
源自发芽稻米种子的盾片的胚发生愈伤组织培养物被用作转化实验的原料。这个材料通过在愈伤组织起始介质(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，1.0mg/l 2，4-D和10μM AgNO3)上在黑暗中在27-28℃使无菌稻米种子发芽来产生。从胚胎的盾片增殖的胚发生愈伤组织被转移到CM介质(N6盐，Nitsch和Nitsch维生素，1mg/l 2，4-D，Chu，et al.，1985，Sci.Sinica 18：659-668)。愈伤组织培养物通过两周间隔的常规传代培养被维持在CM上并用于在起始的10周内的转化。
通过传代培养置于CM介质上放置的Whatman #541纸的圆圈的中心中，直径为约4cm的圆形区域中排列的间隔为约1mm的0.5-1.0mm薄片制备用于转化的愈伤组织。所述具有愈伤组织的盘在黑暗中、27-28℃孵育3-5天。在轰击前，具有愈伤组织的滤器被转移到补充有0.25M甘露醇和0.25M山梨糖醇的CM，在黑暗中达3小时。随后培养皿的盖在无菌罩中微开20-45分钟，以允许组织上的湿气消散。
每个基因组DNA片段与包含用于稻米转化的可选择的标记物的pML18共沉淀到金粒的表面上。为了完成这个，以2:1比例的性状：可选择的标记物DNA的总共10μg的DNA被加入到已经以60mg ml-1的浓度被重新悬浮的金粒的50μl等分试样。氯化钙(50μl的2.5M溶液)和亚精胺(20μl的0.1M溶液)随后随着管子被涡旋3分钟被加入到金-DNA悬浮液。金粒在微量离心机中被离心1秒，去除上清液。金粒随后用1ml纯乙醇冲洗2次，随后重新悬浮在50μl的纯乙醇中并超声(bathsonicator)1秒以分散金粒。金悬浮液在-70℃被孵育5分钟并且被超声(bath sonicator)(如果需要分散粒子)。6μl的DNA-包覆的金粒子随后被加载到mylar大运载体盘上，乙醇被允许蒸发。
在干燥期末，包含组织的培养皿被置于PDS-1000/He的室中。室中的空气随后被抽空到28-29英寸Hg的真空。大运载体被用氦冲击波利用防爆膜加速，所述防爆膜在冲击管中的He压力达到1080-1100psi时破裂。组织的位置距离停止筛约8cm，愈伤组织被轰击2次。组织的2到4个盘以这种方式用DNA-包覆的金粒轰击。在轰击后，愈伤组织被转移到没有补充山梨糖醇或甘露醇的CM介质。
在轰击后3-5天内，愈伤组织被转移到SM介质(包含50mg/l潮霉素的CM培养基)。为完成这个，愈伤组织从盘转移到无菌50ml圆锥管并称重。40℃的熔化顶层-琼脂(Molten top-agar)利用2.5ml的顶层琼脂/100mg的愈伤组织被加入。愈伤组织块通过重复的通过10ml吸管的分散被碎裂成小于2mm直径的片段。3ml的愈伤组织悬浮液的等分试样被平铺在新鲜SM介质上，所述盘在黑暗中在27-28℃被孵育4周。4周后，转基因愈伤组织事件被鉴定，转移到新鲜的SM盘并在黑暗中在27-28℃生长另外的2周。
生长的愈伤组织被转移到RM1介质(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，2％蔗糖，3％山梨糖醇，0.4％固化剂+50ppm hyg B)在黑暗中在25℃达2周。2周后，愈伤组织被转移到RM2介质(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，3％蔗糖，0.4％固化剂+50ppm hyg B)并在冷白光下(～40μEm-2s-1)，光周期为12小时，在25℃和30-40％湿度下放置。在光中2-4周后，愈伤组织开始有机化(organize)，并形成枝条。枝条从周围的愈伤组织/介质去除，并温和地转移到phytatrays(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)中RM3介质(1/2 x MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，1％蔗糖+50ppm潮霉素B)，利用先前步骤所述的相同的条件继续孵育。
在2-3周后，植物从RM3转移到包含Metro混合物350的4”罐，此时充分的根和枝条生长已经存在。从转基因植物获得的种子被检查NUE突变与包含NUE基因的野生型基因组DNA的遗传互补。
实施例9.NUE序列的变体
A.不改变编码的氨基酸序列的NUE的变体核苷酸序列
NUE核苷酸序列被用于产生与相应的SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比时具有约70％、75％、80％、85％、90％、和95％的核苷酸序列同一性的开放阅读框的核苷酸序列的变体核苷酸序列。这些功能性变体利用标准密码子表产生。虽然变体的核苷酸序列被改变，但是由开放阅读框编码的氨基酸序列不变。
B.NUE多肽的变体氨基酸序列
产生NUE多肽的变体氨基酸序列。在这个实施例中，一个氨基酸被改变。特别地，检查开放阅读框以确定合适的氨基酸改变。改变的氨基酸的选择通过参考蛋白质对准(与来自多种物种的其它直系同源物(orthologs)和其它基因家族成员)进行。选择认为不在高选择压力下(不是高度保守的)并且相当容易由具有相似的化学性质(即，相似的功能侧链)的氨基酸替换的氨基酸。利用所述蛋白质对准，合适的氨基酸可以被改变。一旦鉴定了靶向的氨基酸，进行下面的C部分列出的程序。利用这个方法产生具有约70％、75％、80％、85％、90％、和95％的核酸序列同一性的变体。
C.NUE多肽的另外的变体氨基酸序列
在这个实施例中，形成相对于参考蛋白质序列具有80％、85％、90％、和95％的同一性的人工蛋白质序列。这个后面的努力需要从对准鉴定保守和可变区，随后明智地应用氨基酸替换表。这些部分将在下面更详细的论述。
主要地，基于NUE蛋白质中或其它NUE多肽中的保守区进行哪个氨基酸序列被改变的确定。基于序列对准，可以可能地被改变的NUE多肽的变化区以小写字母示出，而保守区以大写字母示出。认识到保守的替换可以在下面的保守区内进行而不该变功能。此外，技术人员将理解本发明的NUE序列的功能变体可以具有保守的结构域中的较小的非保守的氨基酸改变。
人工蛋白质序列可以随后形成，其不同于原始序列，间隔为80-85％、85-90％、90-95％和95-100％的同一性。这些间隔的中点被靶向，例如，具有加或减1％的自由活动范围。氨基酸替换将被custom Perl script影响。替换表在下面的表2中提供。
表2.替换表
 
氨基酸 强烈相似和最佳的替换 改变的次序等级 注释
I L，V 1 50:50替换
L I，V 2 50:50替换
V I，L 3 50:50替换
A G 4
G A 5
D E 6
E D 7
W Y 8
Y W 9
S T 10
T S 11
K R 12
R K 13
N Q 14
Q N 15
F Y 16
M L 17 第一个蛋氨酸不能改变
H Na 没有好的替换
C Na 没有好的替换
P Na 没有好的替换
首先，蛋白中不应该被改变的任何保守的氨基酸被鉴定并“区分”用于与替换隔离。起始蛋氨酸将当然被自动地加到这个列表中。其次，进行改变。
在任何情况下H、C、和P不被改变。改变将首先用异亮氨酸发生，从N-末端扫到C-末端。随后亮氨酸，等等沿列表向下直到它达到希望的靶标。可以进行临时数量的替换以便不造成改变的反转。所述列表被排序1-17，因此在亮氨酸前以如所需的一样多的异亮氨酸改变开始，等等向下到蛋氨酸。清楚地，以这种方式，许多氨基酸将不需要被改变。L、I和V将涉及两个可选的最佳替换的50:50替换。
变体氨基酸序列作为输出写出。Perl script被用于计算百分比同一性。利用这个过程，NUE多肽的变体产生与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313的起始未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％、和95％的氨基酸同一性。
实施例10.转基因玉蜀黍植物
产生包含在启动子控制下的NUE构建体的T0转基因玉蜀黍植物。这些植物在温室条件中在FASTCORN***下生长，详见美国专利公开2003/0221212，美国专利申请No.10/367,417。
每个植物以下面的方式被分析一个或多个下面的特征的可测量的改变：
分析源自自花授精每个T0植物的T1子代在低KNO3下的提高的生长速率，所述T0植物包含被发现以1:1分开用于转基因事件的每个NUE构建体的单一拷贝。在积累性植物生长时生长被监测到开花，对于转基因阳性的，转基因零的，和非转化的对照事件，确定生长速率和耳穗重量。单独的植物的表型的分布与对照组的分布和所有其余的处理的分布比较。计算对于每个组的方差并利用F检验比较，比较所述事件的方差与非转基因对照组方差和试验中其余事件的合并方差。对KNO3的反应越大，事件组(set)中方差越大，F值越大。阳性结果将与事件内转基因的分布比较以确定转基因内反应分离。
实施例11.来自田地块的转基因事件分析
转基因事件在田地块中评估，其中产量通过减少施肥30％或更多限制。这些减少的氮肥土地中转基因和非转基因植物之间产量、产量成分、或其它农艺学性状的提高用于评估由转基因事件的表达贡献的氮利用的提高。在补充有建议的氮fertility rates的土地中进行类似的比较。有效的转基因事件是那些在氮-限制的和正常氮实验中实现类似的产量的事件。
这个说明书中的所有出版物和专利申请表明这个发明所属的领域的普通技术人员的水平。所有的出版物和专利申请以引用方式并入本文到相同的程度，好像每个单独的出版物或专利申请以引用方式被具体和逐一的表明。
已经参照各种具体和优选的实施方式和技术描述了本发明。然而，应当理解，可以进行许多改变和变更同时保持在本发明的精神和范围内。
序列表
<110>Pioneer Hi-Bred International，Inc.
<120>用于提高作物植物中的氮利用效率的基因
<130>2162
<150>60/771,906
<151>2006-02-09
<160>314
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>915
<212>DNA
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<221>misc feature
<222>651
<223>n＝A，T，C或G
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<213>Zea mays
<400>27
Figure A200780012807Q01002
Figure A200780012807Q01011
<210>28
<211>633
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>28
Figure A200780012807Q01012
Figure A200780012807Q01031
<210>29
<211>687
<212>DNA
<213>Zea mays
<220>
<221>misc feature
<222>678
<223>n＝A，T，C或G
<400>29
Figure A200780012807Q01032
<210>30
<211>155
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>30
Figure A200780012807Q01033
<210>31
<211>1377
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>31
Figure A200780012807Q01042
Figure A200780012807Q01051
<210>32
<211>331
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>32
Figure A200780012807Q01052
Figure A200780012807Q01061
<210>33
<211>1885
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>33
Figure A200780012807Q01062
Figure A200780012807Q01071
<210>34
<211>459
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>34
Figure A200780012807Q01072
Figure A200780012807Q01081
<210>35
<211>1698
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>35
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Figure A200780012807Q01091
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<212>PRT
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<213>Zea mays
<400>37
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Figure A200780012807Q01111
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>38
Figure A200780012807Q01112
Figure A200780012807Q01121
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<212>DNA
<213>Zea mays
<400>39
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>40
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<212>DNA
<213>Zea mays
<400>41
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Figure A200780012807Q01141
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<212>PRT
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<400>42
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<211>1889
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>43
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>44
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Figure A200780012807Q01171
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<212>DNA
<213>Zea mays
<400>45
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Figure A200780012807Q01181
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>46
Figure A200780012807Q01182
Figure A200780012807Q01191
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<211>2011
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<213>Zea mays
<400>47
Figure A200780012807Q01192
Figure A200780012807Q01201
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<212>PRT
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<400>48
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<400>49
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<400>50
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<213>Zea mays
<400>51
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Figure A200780012807Q01241
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<211>500
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>52
Figure A200780012807Q01242
Figure A200780012807Q01251
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<211>1315
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<211>311
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>54
Figure A200780012807Q01262
Figure A200780012807Q01271
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<211>1549
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<213>Zea mays
<400>55
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>56
Figure A200780012807Q01282
Figure A200780012807Q01291
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<211>1493
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>57
Figure A200780012807Q01292
Figure A200780012807Q01301
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>58
Figure A200780012807Q01302
Figure A200780012807Q01311
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<213>Zea mays
<400>59
Figure A200780012807Q01321
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>60
Figure A200780012807Q01322
Figure A200780012807Q01331
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Figure A200780012807Q01352
Figure A200780012807Q01361
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<212>DNA
<213>Zea mays
<400>63
Figure A200780012807Q01362
Figure A200780012807Q01371
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>64
Figure A200780012807Q01381
Figure A200780012807Q01391
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<211>1611
<212>DNA
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<220>
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Figure A200780012807Q01392
Figure A200780012807Q01401
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Figure A200780012807Q01411
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<400>68
Figure A200780012807Q01421
Figure A200780012807Q01431
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<211>1492
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<400>69
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<213>Zea mays
<400>70
Figure A200780012807Q01433
Figure A200780012807Q01441
Figure A200780012807Q01451
<210>71
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<213>Zea mays
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Figure A200780012807Q01452
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<212>PRT
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<400>72
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<211>1735
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<213>Zea mays
<400>73
Figure A200780012807Q01472
Figure A200780012807Q01481
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>74
Figure A200780012807Q01482
Figure A200780012807Q01491
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<400>75
Figure A200780012807Q01492
Figure A200780012807Q01501
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<400>76
Figure A200780012807Q01502
Figure A200780012807Q01511
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<213>Zea mays
<400>77
Figure A200780012807Q01512
Figure A200780012807Q01521
<210>78
<211>485
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>78
Figure A200780012807Q01531
Figure A200780012807Q01541
<210>79
<211>2015
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<213>Zea mays
<220>
<221>misc_feature
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Figure A200780012807Q01542
Figure A200780012807Q01551
<210>80
<211>538
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>80
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<211>801
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>81
Figure A200780012807Q01571
<210>82
<211>155
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>82
Figure A200780012807Q01572
Figure A200780012807Q01581
<210>83
<211>1265
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>83
Figure A200780012807Q01582
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>84
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<212>DNA
<213>Zea mays
<400>85
Figure A200780012807Q01601
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<212>PRT
<213>Zea mays
<400>86
Figure A200780012807Q01611
Figure A200780012807Q01621
<210>87
<211>1418
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>87
Figure A200780012807Q01622
Figure A200780012807Q01631
<210>88
<211>375
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>88
Figure A200780012807Q01632
Figure A200780012807Q01641
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<212>DNA
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<400>89
Figure A200780012807Q01651
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<400>90
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<213>Zea mays
<400>91
Figure A200780012807Q01661
<210>92
<211>580
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>92
Figure A200780012807Q01671
Figure A200780012807Q01681
<210>93
<211>1628
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>93
Figure A200780012807Q01682
Figure A200780012807Q01691
<210>94
<211>368
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>94
Figure A200780012807Q01701
<210>95
<211>1721
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>95
Figure A200780012807Q01702
<210>96
<211>446
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>96
Figure A200780012807Q01712
Figure A200780012807Q01721
Figure A200780012807Q01731
<210>97
<211>1529
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>97
Figure A200780012807Q01732
<210>98
<211>332
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>98
Figure A200780012807Q01733
Figure A200780012807Q01741
<210>99
<211>1687
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>99
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<211>422
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>100
Figure A200780012807Q01761
Figure A200780012807Q01771
<210>101
<211>2001
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>101
Figure A200780012807Q01772
Figure A200780012807Q01781
<210>102
<211>297
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>102
Figure A200780012807Q01782
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<211>2126
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>103
Figure A200780012807Q01792
Figure A200780012807Q01801
<210>104
<211>513
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>104
Figure A200780012807Q01802
Figure A200780012807Q01811
<210>105
<211>1907
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>105
Figure A200780012807Q01812
Figure A200780012807Q01821
<210>106
<211>432
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>106
Figure A200780012807Q01822
Figure A200780012807Q01841
<210>107
<211>1649
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>107
Figure A200780012807Q01842
<210>108
<211>420
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>108
Figure A200780012807Q01851
Figure A200780012807Q01861
<210>109
<211>1712
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>109
Figure A200780012807Q01862
Figure A200780012807Q01871
<210>110
<211>466
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>110
Figure A200780012807Q01872
Figure A200780012807Q01881
<210>111
<211>1154
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>111
Figure A200780012807Q01882
Figure A200780012807Q01891
<210>112
<211>237
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>112
Figure A200780012807Q01892
<210>113
<211>1536
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>113
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<211>379
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>114
Figure A200780012807Q01911
<210>115
<211>818
<212>DNA
<213>Zea mays
<220>
<221>misc_feature
<222>796，799
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<400>115
Figure A200780012807Q01922
<210>116
<211>144
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>116
Figure A200780012807Q01923
Figure A200780012807Q01931
<210>117
<211>2086
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>117
Figure A200780012807Q01932
Figure A200780012807Q01941
<210>118
<211>493
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>118
Figure A200780012807Q01942
<210>119
<211>2271
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>119
Figure A200780012807Q01961
<210>120
<211>628
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>120
Figure A200780012807Q01971
Figure A200780012807Q01981
<210>121
<211>1830
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>121
Figure A200780012807Q01991
<210>122
<211>454
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>122
Figure A200780012807Q02001
Figure A200780012807Q02011
<210>123
<211>1414
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>123
Figure A200780012807Q02012
<210>124
<211>294
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>124
Figure A200780012807Q02021
Figure A200780012807Q02031
<210>125
<211>1926
<212>DNA
<213>Zea mays
<220>
<221>misc feature
<222>935，939，945
<223>n＝A，T，C或G
<400>125
Figure A200780012807Q02032
Figure A200780012807Q02041
<210>126
<211>387
<212>PRT
<213>Zea mays
<220>
<221>变体
<222>200，201，203
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>126
Figure A200780012807Q02042
<210>127
<211>2911
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>127
Figure A200780012807Q02052
Figure A200780012807Q02061
<210>128
<211>873
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>128
Figure A200780012807Q02062
Figure A200780012807Q02071
Figure A200780012807Q02081
Figure A200780012807Q02091
<210>129
<211>1388
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>129
Figure A200780012807Q02092
Figure A200780012807Q02101
<210>130
<211>323
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>130
Figure A200780012807Q02102
Figure A200780012807Q02111
<210>131
<211>776
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>131
Figure A200780012807Q02112
<210>132
<211>150
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>132
Figure A200780012807Q02113
Figure A200780012807Q02121
<210>133
<211>5617
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>133
Figure A200780012807Q02122
Figure A200780012807Q02141
<210>134
<211>1616
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>134
Figure A200780012807Q02142
Figure A200780012807Q02151
Figure A200780012807Q02161
Figure A200780012807Q02181
Figure A200780012807Q02191
<210>135
<211>1297
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>135
Figure A200780012807Q02192
<210>136
<211>357
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>136
Figure A200780012807Q02202
<210>137
<211>1868
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>137
Figure A200780012807Q02212
Figure A200780012807Q02221
<210>138
<211>423
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>138
Figure A200780012807Q02222
Figure A200780012807Q02231
<210>139
<211>1361
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>139
Figure A200780012807Q02232
Figure A200780012807Q02241
<210>140
<211>345
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>140
Figure A200780012807Q02242
Figure A200780012807Q02251
<210>141
<211>3572
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>141
Figure A200780012807Q02252
Figure A200780012807Q02261
<210>142
<211>863
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>142
Figure A200780012807Q02271
Figure A200780012807Q02281
<210>143
<211>1255
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>143
Figure A200780012807Q02292
Figure A200780012807Q02301
<210>144
<211>192
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>144
Figure A200780012807Q02302
<210>145
<211>649
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>145
Figure A200780012807Q02311
<210>146
<211>84
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>146
Figure A200780012807Q02312
<210>147
<211>1405
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>147
Figure A200780012807Q02321
<210>148
<211>298
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>148
Figure A200780012807Q02331
<210>149
<211>1617
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>149
Figure A200780012807Q02332
Figure A200780012807Q02341
<210>150
<211>411
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>150
Figure A200780012807Q02342
Figure A200780012807Q02351
<210>151
<211>1727
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>151
Figure A200780012807Q02361
<210>152
<211>446
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>152
Figure A200780012807Q02371
<210>153
<211>1843
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>153
Figure A200780012807Q02381
<210>154
<211>482
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>154
Figure A200780012807Q02401
<210>155
<211>1170
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>155
Figure A200780012807Q02402
Figure A200780012807Q02411
<210>156
<211>274
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>156
Figure A200780012807Q02421
<210>157
<211>1565
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>157
Figure A200780012807Q02422
<210>158
<211>394
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>158
Figure A200780012807Q02431
Figure A200780012807Q02441
<210>159
<211>1637
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>159
Figure A200780012807Q02442
<210>160
<211>423
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>160
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<211>1366
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>161
Figure A200780012807Q02462
Figure A200780012807Q02471
<210>162
<211>337
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>162
Figure A200780012807Q02472
Figure A200780012807Q02481
<210>163
<211>1299
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>163
Figure A200780012807Q02482
<210>164
<211>295
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>164
<210>165
<211>2005
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>165
Figure A200780012807Q02501
<210>166
<211>527
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>166
Figure A200780012807Q02511
Figure A200780012807Q02521
<210>167
<211>894
<212>DNA
<213>Zea mays
<220>
<221>misc_feature
<222>336，854，855，884，885
<223>n＝A，T，C或G
<400>167
Figure A200780012807Q02522
<210>168
<211>229
<212>PRT
<213>Zea mays
<220>
<221>变体
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<400>168
Figure A200780012807Q02541
<210>169
<211>1978
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>169
Figure A200780012807Q02542
Figure A200780012807Q02551
<210>170
<211>439
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>170
Figure A200780012807Q02552
Figure A200780012807Q02561
<210>171
<211>3034
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>171
Figure A200780012807Q02562
Figure A200780012807Q02571
<210>172
<211>871
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>172
Figure A200780012807Q02581
Figure A200780012807Q02591
Figure A200780012807Q02601
<210>173
<211>1106
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>173
Figure A200780012807Q02602
Figure A200780012807Q02611
<210>174
<211>155
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>174
<210>175
<211>946
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>175
Figure A200780012807Q02621
<210>176
<211>152
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>176
Figure A200780012807Q02622
<210>177
<211>3173
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>177
Figure A200780012807Q02631
Figure A200780012807Q02641
<210>178
<211>910
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>178
Figure A200780012807Q02642
Figure A200780012807Q02651
Figure A200780012807Q02661
<210>179
<211>1663
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>179
Figure A200780012807Q02672
<210>180
<211>412
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>180
Figure A200780012807Q02681
Figure A200780012807Q02691
<210>181
<211>1138
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>181
Figure A200780012807Q02692
<210>182
<211>256
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>182
Figure A200780012807Q02693
Figure A200780012807Q02701
<210>183
<211>1510
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>183
Figure A200780012807Q02702
Figure A200780012807Q02711
<210>184
<211>377
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>184
Figure A200780012807Q02712
<210>185
<211>1263
<212>DNA
<213>Zea mays
<220>
<221>misc_feature
<222>1257
<223>n＝A，T，C或G
<400>185
Figure A200780012807Q02731
<210>186
<211>212
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>186
Figure A200780012807Q02741
<210>187
<211>1942
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>187
Figure A200780012807Q02742
Figure A200780012807Q02751
<210>188
<211>493
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>188
Figure A200780012807Q02752
Figure A200780012807Q02761
<210>189
<211>3081
<212>DNA
<213>Zea mays
<220>
<221>misc_feature
<222>3066，3067，3068
<223>n＝A，T，C或G
<400>189
Figure A200780012807Q02771
Figure A200780012807Q02781
<210>190
<211>694
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>190
Figure A200780012807Q02791
Figure A200780012807Q02801
<210>191
<211>2197
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>191
Figure A200780012807Q02802
Figure A200780012807Q02811
<210>192
<211>639
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>192
Figure A200780012807Q02812
Figure A200780012807Q02821
<210>193
<211>1747
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>193
Figure A200780012807Q02832
Figure A200780012807Q02841
<210>194
<211>1747
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>194
Figure A200780012807Q02842
Figure A200780012807Q02871
<210>195
<211>2198
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>195
Figure A200780012807Q02892
Figure A200780012807Q02901
<210>196
<211>515
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>196
Figure A200780012807Q02911
<210>197
<211>2348
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>197
Figure A200780012807Q02922
<210>198
<211>668
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>198
Figure A200780012807Q02951
<210>199
<211>2073
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>199
Figure A200780012807Q02952
Figure A200780012807Q02961
<210>200
<211>498
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>200
Figure A200780012807Q02962
Figure A200780012807Q02971
<210>201
<211>1832
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>201
Figure A200780012807Q02981
<210>202
<211>395
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>202
Figure A200780012807Q02991
Figure A200780012807Q03001
<210>203
<211>1949
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>203
Figure A200780012807Q03002
<210>204
<211>538
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>204
Figure A200780012807Q03011
Figure A200780012807Q03021
<210>205
<211>951
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>205
Figure A200780012807Q03022
Figure A200780012807Q03031
<210>206
<211>165
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>206
Figure A200780012807Q03032
<210>207
<211>1798
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>207
Figure A200780012807Q03041
<210>208
<211>330
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>208
Figure A200780012807Q03042
Figure A200780012807Q03051
<210>209
<211>1398
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>209
<210>210
<211>233
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>210
Figure A200780012807Q03062
<210>211
<211>953
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>211
Figure A200780012807Q03072
<210>212
<211>131
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>212
Figure A200780012807Q03081
<210>213
<211>3455
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>213
Figure A200780012807Q03082
Figure A200780012807Q03091
Figure A200780012807Q03101
<210>214
<211>863
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>214
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<400>216
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<400>220
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Figure A200780012807Q03331
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Figure A200780012807Q03511
Figure A200780012807Q03521
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Figure A200780012807Q03661
Figure A200780012807Q03671
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Figure A200780012807Q03711
Figure A200780012807Q03721
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<400>300
Figure A200780012807Q04122
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<400>302
Figure A200780012807Q04142
Figure A200780012807Q04151
Figure A200780012807Q04161
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Figure A200780012807Q04181
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Figure A200780012807Q04202
Figure A200780012807Q04211
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<213>Zea mays
<400>309
Figure A200780012807Q04221
<210>310
<211>350
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>310
Figure A200780012807Q04222
Figure A200780012807Q04231
<210>311
<211>1638
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>311
Figure A200780012807Q04241
<210>312
<211>460
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>312
Figure A200780012807Q04242
Figure A200780012807Q04251
<210>313
<211>2099
<212>DNA
<213>Zea mays
<400>313
Figure A200780012807Q04261
<210>314
<211>2099
<212>PRT
<213>Zea mays
<400>314
Figure A200780012807Q04271
Figure A200780012807Q04281
Figure A200780012807Q04301
Figure A200780012807Q04321

Claims (31)

1.一种分离的多核苷酸，选自由下列组成的组：
a.与选自由SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311和313组成的组的多核苷酸的全长序列具有通过GAP算法在缺省参数下确定的至少70％的序列同一性的多核苷酸；其中所述多核苷酸编码用作氮利用效率的改性剂的多肽；
b.编码选自由SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312和314组成的组的多肽的多核苷酸；
c.选自由SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311和313组成的组的多核苷酸；以及
d.与(a)、(b)、或(c)的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.一种重组表达盒，包含权利要求1的所述多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义或反义方向可操作地连接到启动子。
3.一种宿主细胞，包含权利要求2的所述表达盒。
4.一种转基因植物，包含权利要求2的所述重组表达盒。
5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
6.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自由：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻米、大麦、黍、花生和可可组成的组。
8.来自权利要求4的所述转基因植物的转基因种子。
9.一种调节植物中的氮利用效率的方法，包括：
a.将包含可操作地连接到启动子的权利要求1的所述多核苷酸的重组表达盒引入植物细胞；以及
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物；其中所述植物细胞中的所述氮利用被调节。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自选自由：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻米、大麦、黍、花生和可可组成的组的植物。
11.一种调节植物中的氮利用效率的方法，包括：
a.将包含可操作地连接到启动子的权利要求1的所述多核苷酸的重组表达盒引入植物细胞；
b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；以及
c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的所述氮利用效率被调节。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述植物选自由：玉蜀黍、大豆、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻米、大麦、黍、花生和可可组成的组。
13.一种降低植物细胞中的NUE多肽活性的方法，包括：
a.提供包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313的互补体的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；
b.提供包含具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311或313中陈列的序列的mRNA的植物细胞；以及
c.将步骤(a)的所述核苷酸序列引入步骤(b)的所述植物细胞，其中所述核苷酸序列抑制所述mRNA在所述植物细胞中的表达。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、稻米、大麦、高粱或黑麦。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
17.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物中的所述氮利用效率活性被提高。
18.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的根生长。
19.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的种子大小。
20.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的种子重量。
21.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有胚胎大小增加的种子。
22.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的叶子大小。
23.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的幼苗活力。
24.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的丝突出体(silk emergence)。
25.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的耳穗大小。
26.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物中的氮利用效率活性被降低。
27.根据权利要求26所述的转基因植物，其中所述植物具有减少的根生长。
28.根据权利要求26所述的转基因植物，其中所述植物具有减小的种子大小。
29.根据权利要求26所述的转基因植物，其中所述植物具有减小的种子重量。
30.根据权利要求26所述的转基因植物，其中所述植物具有减小的胚胎大小。
31.根据权利要求26所述的转基因植物，其中所述植物具有减少的雄穗产生。
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