CN102471779A

CN102471779A - 使用二聚化结构域组分堆叠以调节植株构造

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Publication number: CN102471779A
Application number: CN2010800329201A
Authority: CN
Inventors: S·J·拉维特; D·T·托姆斯
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2012-05-23
Also published as: AU2010274146A1; EP2456874A1; IN2012DN00531A; WO2011011273A1; US9175301B2; US20150361442A1; EA201200177A1; CA2768571A1; US20110023190A1; WO2011011273A9; MX2012001080A; ZA201200337B

Abstract

本方法提供了通过用二聚化结构域和组分堆叠以调节转基因的表达，从而调节植株构造来改变作物的收获指数的手段。在单个转化载体单元中提供了所述转基因/二聚化结构域堆叠并用于调节植物中的植物生长、产量和收获指数。

Description

使用二聚化结构域组分堆叠以调节植株构造

技术领域

本发明整体涉及分子生物学领域。

背景技术

收获指数即谷粒与总地上部分生物量之比在过去100年里已近乎保持在约50％不变(Sinclair，(1998)Crop Science 38：638-643；Tollenaar和Wu，(1999)“Crop Science 39：1597-1604)。因而，已因为每单位土地面积的总生物量产量的增加而在过去50-60年间谷粒产量增加了四倍，这种每单位土地面积的总生物量产量的增加是通过增加种植密度来实现的(Duvick和Cassman，(1999)Crop Science 39：1622-1630)。对不断增加的种植密度条件下更高谷粒产量的选择已导致植物结构的显著构造变化，其具有相对竖直且狭小的叶片以尽量减小遮光。较高密度种植(或高植物种群)的不良后果是茎秆倒伏和根倒伏的频率增加。随着追求最大的每单位土地面积生物量产量而接近最佳的密度时，种植密度与生物量产量之间的关系显著偏离线性。这反映在个体植株生物量的成比例地更大降低，该降低以较弱的茎秆以及因此导致的倒伏增加的形式表现出来。另外，成熟时大约20％的总生物量以根的形式保持在土壤中，构成其有机物含量(Amos和Walters，2006)。由于茎秆和根倒伏二者是影响收获指数的农学特性，所以矮秆型植物可能在产量稳定性方面具有潜在的优势。

矮秆植物对农业具有大的影响。由于倒伏可能性低和对更集约的管理的响应以及产量稳定性和潜在更高的产量，小麦(以及其他小谷粒谷类)的矮秆品种在北美得以广泛应用。还存在可从矮秆作物的较高收获指数实现的其他有益效果，包括所需的杀虫剂和肥料的量减少、种植密度更高以及人工费用减少。矮秆植物使得易于收获、作物管理简化以及水和营养物质使用量的潜在减少。

鉴于当前人口不断增加以及适于农业的土地面积不断减少这两个趋势，不断增加农业生产力是且将继续是极为重要的挑战。矮秆作物是我们农业生产体系的重要组成。矮秆作物的使用率增加可有助于满足未来的农业生产需求。

可对增加茎秆强度的基因即在作物中负责纤维素产生的纤维素合酶进行修饰以增加多种植物组织的尺寸和强度。据发现单位玉米茎秆长度中的纤维素是机械强度的最好指标(Appenzeller等人(2004)，Cellulose 11：287-299；Ching等人(2006))。茎秆干物质中不断增加的纤维素浓度可导致改善茎秆机械强度以及增加生物量，这继而可增加产量以及潜在地增加收获指数。植物强度(生物量)的改善和特定植物组织(器官)的生长为植物提供了更高的生物量和增加的收获指数。

开花时间决定成熟期，是一个重要的农学特性。控制从营养生长向生殖生长转变的基因是操纵开花时间所必需的。在玉米中，成花基因为作物产量增加、种质对不同气候带的适应以及杂交种子生产的同步开花提供了机会。开花经修饰的近交系的开发有利于优良种质跨越整个成熟带(maturityzone)。此外，还存在另外的机会来增加灌浆和/或谷粒脱水速率以对开花开始的改变进行补充。

转化植物内的植株构造基因、开花时间基因和矮秆基因组分的组合控制表达将不仅会增加作物的产量潜力和收获指数，而且还会改善使管理规范简化以及增加作物物种对新地理区域的适应性的农学特性。

本发明提供了通过用多种堆叠的植物基因和矮秆基因组分调节转基因的表达，从而调节植株构造来改变作物的收获指数的手段。矮秆基因D8的组分即二聚化结构域(DD)为亮氨酸拉链二聚化结构域(SEQ ID NO：9)，作为显性负效应转基因过表达。在单个转化载体单元中提供该转基因/二聚化结构域组分堆叠并在植物中用于调节植物的特定植物器官以增加植物的生长、产量和收获指数。在特定植物组织如根、穗或雄穗中表达可导致特定植物器官的伸长。

这些堆叠单元可在若干领域中用于增强作物性能和价值，这些领域包括：1)植株抗倒伏性(由茎秆倒伏和根倒伏构成)、收获指数和产量潜力；2)特定植物器官尺寸的修饰；3)作为乙醇或其它可再生生物产品的给料的植物干物质和4)青贮饲料。

发明内容

提供了用于控制植物生长和二聚化结构域组分堆叠形成以用于增加植物产量的组合物和方法。所述组合物包含来自玉米的二聚化结构域组分堆叠。本发明的组合物包含选自SEQ ID NO：1-22的氨基酸序列和核苷酸序列以及它们的变体和片段。

在DNA构建体中提供了编码该二聚化结构域组分堆叠的多核苷酸用于在所关注的植物中表达。还提供了包含本发明的序列的表达盒、植物、植物细胞、植物部分和种子。在具体的实施方案中，该多核苷酸有效地连接至组成型启动子。

提供了用于调节植物或植物部分中二聚化结构域组分堆叠序列的水平的方法。该方法包括向植物或植物部分引入异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含本发明的二聚化结构域组分堆叠序列。可增加或降低二聚化结构域组分堆叠多肽的水平。这种方法可用来增加植物中的产量；在一个实施方案中，该方法用来提高谷类中的谷粒产量。

植物激素GA在多种生长过程(特别是植物生长过程中茎和根的伸长)中是活跃的。玉米的D8(和D9)基因编码起到赤霉酸信号传导途径抑制剂的作用并且由DELLA和GRAS结构域组成的转录调节因子。在存在GA的情况下GA受体与DELLA蛋白相互作用，这导致DELLA蛋白的多泛素化。多泛素化是26S蛋白酶体进行蛋白质降解的信号。TDELLA蛋白的降解消除了它们对GA生长响应的抑制。通常，D8/D9蛋白的降解速率看起来与植物尺寸相关(即较慢的降解导致对GA的响应较少，伸长较少以及高度减少越大)。D8的DELLA结构域中的缺失和特定突变因为这些蛋白质的降解动力学改变而造成矮秆表型。

D8(和D9)蛋白据认为在体内作为二聚体发挥功能，该二聚体的分解代谢调节植物伸长。强矮秆基因如D8的二聚体对降解较不敏感，而中等矮秆基因如D8MPL对降解相对更敏感。天然野生型基因d8对降解敏感，观察到高的或正常的高度。D8蛋白的特异性亮氨酸拉链结构域ZM-D8 243-331涉及二聚体的形成。一种改变的二聚化结构域蛋白由ZM-D8 243-331蛋白的过表达形成。这些截短的蛋白质片段竞争结合全长D8和D9的亮氨酸拉链结构域。该竞争性结合导致形成具有全长蛋白质：截短蛋白质的缺陷型二聚体。所得的非功能性二聚体缺乏抑制GA响应的能力，当在植物或植物器官中存在时增加伸长。另外，与矮秆植株相比较，利用特定植物器官如根、穗或雄穗的启动子的组织特异性表达预计具有增加的尺寸(长度)。具体地讲，矮秆植物类型可具有尺寸与野生型或正常高度的植株类似的根。

附图说明

图1：使用杂交体33A14、PHP24843、PHP26998和PHP26998时的根生长，该根生长是2006年在爱荷华州的约翰斯顿的微根管(Mini Rhizitron)中测量的。

图2：构建体D8-MPL堆叠平均收获指数，该收获指数是基于晚季植株干重的。

图3：24K时的D8-MPL堆叠产量比较。

图4：描述DD的Zm-D8 243-331(显性负效应转基因)过表达的选择性构造修饰的示意图，Zm-D8 243-331的过表达导致非功能性二聚体。当在诸如根、穗或雄穗之类的组织中表达时非功能性二聚体(DN)增加了伸长。

图5：多个物种(大豆(Glycine max)(SEQ ID NO：24、26、28、30)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(SEQ ID NO：32、34、36、38和40)、玉米(Zea mays)(SEQ ID NO：19))的DD结构域的比对，示出了保守区和共有序列(SEQ ID NO：41)。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和例子仅为示例性的而不是限制性的。如下内容以举例说明的方式给出而无意于限制本发明的范围。

下文将参考附图更完整地描述本发明，其中示出了本发明的一些但并非全部实施方案。确实，这些发明方案可以以许多不同的形式来体现，不应被认为局限于本文给出的实施方案；提供这些实施方案是为了使本公开内容能满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。

借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施方案。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并旨在将修改形式和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。

除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技术在文献中有完全的解释。参见例如Langenheim和Thimann，BOTANY：PLANT BIOLOGY AND ITS RELATIONTO HUMAN AFFAIRS，John Wiley(1982)；CELL CULTURE AND SOMATICCELL GENETICS OF PLANTS，第1卷，Vasil编辑(1984)；Stanier等人，THE MICROBIAL WORLD，第5版，Prentice-Hall(1986)；Dhringra和Sinclair，BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS，CRC Press(1985)；Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(1982)；DNA CLONING，第I和第II卷，Glover编辑(1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS，Gait编辑(1984)；NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION，Hames和Higgins编辑(1984)以及METHODS INENZYMOLOGY系列，Colowick和Kaplan编辑，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA。

单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。

在描述本发明时，将采用下面的术语，并且旨在如下文所指出的进行定义。

所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。

所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增***包括聚合酶链反应(PCR)***、连接酶链反应(LCR)***、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶***、基于转录的扩增***(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications，Persing等人(编辑)，AmericanSociety for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增的产物称为扩增子。

术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子中的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，可修饰核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，对于其来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka等人，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32)以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。

对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质对于其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。

下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

还可参见Creighton，PROTEINS，W.H.Freeman and Co.(1984)。

本文所用的“基本上由…组成”意指包括目标多核苷酸以外的额外序列，其中该额外序列在严格杂交条件下不选择性杂交至所述多核苷酸所杂交的同一cDNA，并且其中所述杂交条件包括在65℃下在0.1X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中的洗涤步骤。

术语“基本上由…组成的”或“基本上由…组成”在编码二聚化结构域的核酸序列或该二聚化结构域的氨基酸序列的语境中，通常指在本质上不改变该二聚化结构域片段的基本结合性质(例如，与目标蛋白质形成缺陷型二聚体)的重组二聚化结构域序列和任何其他序列。例如，ZM-D8 243-331为D8蛋白对应于二聚化结构域区的部分。在一个实施方案中，该结构域片段可含有在氨基端和/或羧基端的其他序列，只要该另外的序列本质上不改变该二聚化结构域片段与目标蛋白质的基本结合性质，该基本结合性质会导致受赤霉酸(GA)激素的抑制减少。例如，全长D8氨基酸序列是不合适的，因为其将导致形成会阻断GA响应的功能性二聚体。

就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)，或可缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，可使用如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum)(Yamao等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-2309)或纤毛虫大核中存在的通用密码的变体，当用这些生物体表达该核酸时。

当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98，将其以引用的方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉米优选密码子可由来自玉米的已知基因序列得出。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。

如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。

所谓“宿主细胞”意指含有载体并且支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉、大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。

术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。

在将核酸***细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指核酸掺入进真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入进细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。如本文所定义，“分离的”核酸也称为“异源”核酸。除非另有说明，否则术语“二聚化结构域组分堆叠核酸”意指包含编码二聚化结构域组分堆叠多肽的多核苷酸(“二聚化结构域组分堆叠多核苷酸”)。

如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。

所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考文献中教导，如Berger和Kimmel，GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES，METHODS IN ENZYMOLOGY系列，第152卷，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(1987)；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第2版，第1-3卷(1989)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel等人(编辑)，CurrentProtocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.合著(1994增刊)。

如本文所用，“可操作地连接”包括指第一序列(如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始或介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。

如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物类型通常与适用于转化技术的高等植物类型一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括来自如下属的种：南瓜属(Cucurbita)、玫瑰属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡罗卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卡属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)，、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。还包括在内的是来自禾本科(Poaceae)的草本植物，包括但不限于如下属：早熟禾属(Poa)、剪股颖属(Agrostis)、黑麦草属(Lolium)、羊茅属(Festuca)、结缕草属(Zoysia)、狗牙根属(Cynodon)、钝叶草属(Stenotaphrum)、雀稗属(Paspalum)、蜈蚣草属(Eremochloa)、地毯草属(Axonopus)、野牛草属(Buchloe)、格兰马草属(Bouteloua)，包括蓝草、本特草、黑麦草、羊茅、结缕草、百慕大草、奧古斯丁草(St.Augustine grass)、百喜草、假俭草、地毯草、水牛草和格兰马草。特别优选的植物是玉米。

如本文所用，“产量”包括指收获时针对谷粒水分(通常是15％)进行了调整后的每英亩谷类作物的蒲式耳数。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位为磅/蒲式耳。

如本文所用，“多核苷酸”包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其子序列。除非另外指明，否则该术语包括指指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个例子)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。

本文所用的“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。例子为优先起始在某些组织，如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子称为“组织优选的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下活跃的启动子。

术语“二聚化结构域组分堆叠多肽”指一种或多种氨基酸序列，该氨基酸序列包括所关注的二聚化结构域区和不是该二聚化结构域序列所源自的同一母体序列的另一多肽序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“二聚化结构域组分堆叠蛋白”包含二聚化结构域组分堆叠多肽。除非另有说明，否则术语“二聚化结构域组分堆叠核酸”意指包含编码二聚化结构域组分堆叠多肽的多核苷酸(“二聚化结构域组分堆叠多核苷酸”)的核酸。

如本文所用，“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。术语“重组多肽”或“重组核酸”指已经经过修饰而使得它们在天然情况下不以它们现有的形式存在的多肽和核酸序列。

本文所用的“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。

术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指掺入进蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似物。

术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，最优选100％的序列同一性(即互补性)。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。

通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括37℃下在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在60至65℃下在0.1XSSC中洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，T_m可从Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.138：267-84的公式来估计：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中的鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form为杂交溶液中的甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。T_m为50％的互补靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度。每1％错配，T_m减少约1℃，因而，可调节T_m、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(T_m)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(T_m)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(T_m)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(T_m)11、12、13或14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的T_m，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导可在如下文献中找到：Tijssen，LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULARBIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，第I部分，第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays，”Elsevier，New York(1993)和CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，第2章，Ausubel等人(编辑)，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。除非另外指明，否则在本专利申请中，高严格性定义为在65℃下在4X SSC、5X Denhardt’s(500ml水中的5gFicoll，5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸鲑精DNA和25mM磷酸钠中杂交，并在65℃下在0.1XSSC、0.1％SDS中洗涤。

如本文所用，“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。可将异源多核苷酸单独整合进基因组中或作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用于包括其基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初经如此改变的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。

如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中***多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许***其中的核酸转录。

以下术语用来描述两条或更多条核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“基本上相同”。

本文所用的“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可为指定的序列的子集或全部；例如作为全长cDNA或基因序列的区段或者该完全cDNA或基因序列。

如本文所用，“比较窗口”意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482的局部同源算法(BESTFIT)可对用于比较的序列进行最佳比对；通过Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53的同源比对算法(GAP)；通过Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索算法(Tfasta和Fasta)；通过这些算法的计算机化执行，包括但不限于：Intelligenetics(Mountain View，California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics SoftwarePackage

第8版(可得自Genetics Computer Group(GCG程序(Accelrys，Inc.，San Diego，CA))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。如下文献详细描述了LUSTAL程序：Higgins和Sharp，(1988)Gene 73：237-44；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic AcidsRes.16：10881-90；Huang等人，(1992)Computer Applications in theBiosciences 8：155-65以及Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31。用于多序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60，其类似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53描述的方法，藉此以引用的方式将其并入本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST程序家族包括：用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的BLASTN；用于核苷酸查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTX；用于蛋白质查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTP；用于蛋白质查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTN和用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTX。参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第19章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork(1995)。

GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其***的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个***的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics Software Package

第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。

GAP给出最好的比对的群体中的一个成员。这个群体可能存在许多成员，但其他成员没有更好的质量。GAP显示关于比对的四个品质因素：品质(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity)。品质是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。Wisconsin Genetics SoftwarePackage版本10中所用的打分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-402)。

如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可被模拟为随机序列。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，SEG(Wooten和Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie和States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂性过滤器可单独使用或联合使用。

在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers和Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中所执行的。

本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本上相同通常意指55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。

核苷酸序列基本上相同的另一指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。遗传密码的简并性允许许多氨基酸置换，这种氨基酸置换在编码相同氨基酸的核苷酸序列中导致多样化，因而有可能该DNA序列可编码相同多肽但在严格条件下不彼此杂交。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列是基本上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。

在肽的情形中，术语“实质相同”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽基本上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位基本上相同，则它们基本上相同。“基本上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。

本发明公开了二聚化结构域多核苷酸和多肽。本发明的新核苷酸和蛋白质具有表明它们改变细胞壁形成并因而在植物发育中起重要作用的表达模式。该多核苷酸在多种植物组织中表达。该多核苷酸和多肽因而提供了操纵植物发育来改变种子和营养组织发育、时间安排或组成的机会。这可用于产生不育植株、无种子植株或具有改变的胚乳组成的植株。

核酸

本发明特别提供了分离的RNA、DNA及其类似物和/或嵌合体核酸，包含二聚化结构域多核苷酸。

本发明还包括为在不同生物体中表达而经优化的多核苷酸。例如，对于多核苷酸在玉米植物中的表达，可变更该序列以解决特定的密码子偏好性和改变GC含量，如根据Murray等人(出处同上)所述。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。

该二聚化结构域核酸包括分离的二聚化结构域多核苷酸，该分离的二聚化结构域多核苷酸包括：

(a)编码二聚化结构域多肽的多核苷酸及其经保守修饰的和多态性的变体；

(b)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；

(c)(a)或(b)的多核苷酸的互补序列。

下表1列出了本文所公开的序列的具体命名。

表1

核酸的构建

可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合产生分离的本发明核酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以其他方式构建。

便利的是所述核酸可包含除本发明多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点***核酸中以帮助分离该多核苷酸。另外，可***可翻译序列以助于分离翻译了的本发明多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了便利的手段来纯化本发明的蛋白质。本发明的核酸(排除所述多核苷酸序列)任选为用于本发明多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。可将另外的序列添加至这种克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以助于分离所述多核苷酸，或改善所述多核苷酸向细胞内的引入。通常，本发明的核酸的长度减去其多核苷酸的长度为不到20千碱基对，通常不到15kb，常常不到10kb。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域已知的。示例性的核酸包括诸如如下的载体：M13、λZAP Express、λZAP II、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASH II、λEMBL 3、λEMBL 4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和pSPORTII、pOPRSVI CAT、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTbGAL、pNEObGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox and λMOSElox。本发明的任选载体包括但不限于λZAP II和pGEX。有关多种核酸的描述，参见例如Stratagene Cloning Systems，Catalogs1995，1996，1997(La Jolla，CA)和Amersham Life Sciences，Inc，Catalog’97(Arlington Heights，IL)。

构建核酸的合成方法

用于本发明方法中的核酸还可用诸如如下的方法通过直接化学合成来制备：Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9的磷酸三酯法；Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51的磷酸二酯法；Beaucage等人，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62的二乙基亚膦酰胺法；Beaucage等人(出处同上)描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用自动合成仪，例如，如Needham-VanDevanter等人，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-68中所描述的，以及第4,458,066号美国专利的固相载体法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。技术人员将会认识到，虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。

UTR和密码子偏好性

总体来说，已发现翻译效率受RNA的5′非编码或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond等人，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing等人，(1987)Cell 48：691)和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao等人，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。

另外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。可采用改变了的密码子使用，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉米中表达而优化异源序列中的密码子使用。本发明多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包(如可得自University of Wisconsin Genetics Computer Group的“Codon Preference”)进行统计分析。参见，Devereaux等人，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395；或MacVector 4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。因而，本发明提供了本发明多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。

序列改组

本发明提供了使用本发明的多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在第96/19256号PCT公开中有描述。另参见Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-9和Zhao等人，(1998)Nature Biotech 16：258-61。一般来讲，序列改组提供出用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，该文库可被进行选择或筛选。从一群相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，所述相关序列多核苷酸包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以为任何能够被选择用于筛选***或在筛选***中检测的性质或属性，可包括：所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，例如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施方案中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白质而言改变了的K_m和/或K_cat。在其它实施方案中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其它实施方案中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可以为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。

重组表达盒

本发明还提供了重组表达盒的用途，该表达盒包含本发明的核酸。可将编码所需的本发明多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白质的多肽的基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含可操作地连接至转录起始调控序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调控序列将引导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(如转化植物的组织)中的转录。

例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标志物。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

可采用会引导本发明多核苷酸在再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′-或2′-启动子、Smas启动子、肉桂基醇脱氢酶启动子(第5,683,439号美国专利)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell等人，(1985)Nature 313：810-2中所述；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，(1990)Plant Cell 163-171)；泛素启动子(Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-30)和玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85和Atanassvoa等人，(1992)Plant Journal 2(3)：291-300)；ALS启动子，如第WO 96/30530号PCT申请中所述；GOS2(第6,504,083号美国专利)以及技术人员已知的来自多种植物基因的其他转录起始区。对于本发明而言，泛素启动子是用于在单子叶植物中表达的优选启动子。

或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下。这种启动子在本文中称为“诱导型”启动子(Rab17、RAD29)。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。

在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。

如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3′-端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或作为另一种选择，源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这种调控元件的例子包括但不限于3′终止和/或多腺苷酸化区如根瘤农杆菌胭脂碱合酶(nos)基因的那些(Bevan等人，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil等人，(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-50和An等人，(1989)Plant Cell 1：115-22)和CaMV 19S基因(Mogen等人，(1990)Plant Cell 2：1261-72)。

可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在植物表达构建体和动物表达构建体二者中的转录单位中包括可剪接内含子，已证实能在mRNA水平和蛋白质水平二者上使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.CellBiol.8：4395-4405；Callis等人，(1987)Genes Dev.1：1183-200)。当设置在接近转录单位的5′端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。主要参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，New York(1994)。

植物信号序列，包括但不限于将蛋白质靶向植物细胞的细胞外基质的信号肽编码DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等人，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900)，如皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)扩展基因(DeLoose等人，(1991)Gene 99：95-100)；将蛋白质靶向液泡的信号肽，如甘薯甘薯贮藏蛋白基因(Matsuka等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834)和大麦凝集素基因(Wilkins等人，(1990)Plant Cell，2：301-13)；引起蛋白质分泌的信号肽，如PRIb的信号肽(Lind等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53)或大麦α淀粉酶(BAA)的信号肽(Rahmatullah等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：119，藉此将该文献以引用的方式并入本文)或将蛋白质靶向质体的信号肽如油菜籽烯酰-Acp还原酶的信号肽(Verwaert等人，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202)，在本发明中是有用的。融合至二聚化结构域组分堆叠多核苷酸的大麦α-淀粉酶信号序列是本发明的用于在玉米中表达的优选构建体。

包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标记基因，该标记基因可在植物细胞上赋予选择性表型。通常，选择性标记基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。

可用于基因在高等植物中的表达的典型载体是本领域所熟知的，包括源于根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，这类载体由Rogers等人，(1987)，Meth.Enzymol.153：253-77进行了描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性根瘤农杆菌载体是Schardl等人，(1987)Gene61：1-11和Berger等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6的质粒pKYLX6和pKYLX7。本发明中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)。

蛋白质在宿主细胞中的表达

使用本发明的核酸，可以在重组工程改造的细胞如细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或优选植物细胞中表达本发明的蛋白质。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组成、位置和/或时间方面)产生蛋白质，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白质。

预期的是，本领域的技术人员会知道多种可用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。

简单概括而言，编码本发明蛋白质的分离核酸的表达通常将通过使例如DNA或cDNA可操作地连接至启动子(组成型或诱导型)，然后掺入进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调控编码本发明蛋白质的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达载体，该表达载体在最低程度上含有用以指导转录的强启动子(如泛素启动子)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以“高水平”或约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物进行表达。

技术人员将认识到，可对本发明的蛋白质进行修饰而不减少其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。

在原核生物中的表达

原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的多种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核控制序列，包括诸如β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子***和乳糖(lac)启动子***(Chang等人，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子***(Goeddel等人，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，(1981)Nature 292：128)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标志物也是有用的。这种标志物的例子包括规定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。

选择载体以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本发明蛋白质的表达***可用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)提供(Palva等人，(1983)Gene 22：229-35；Mosbach等人，(1983)Nature 302：543-5)。来自Pharmacia的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。

在真核生物中的表达

多种真核表达***如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核***中表达。在一些实施方案中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达***，用于产生本发明的蛋白质。

异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman等人，(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方法是本领域已知的并可从商业来源(例如Invitrogen)获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。

本发明的蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。

还可将编码本发明蛋白质的序列连接至多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物起源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞***通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白质的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起始区、启动子(例如CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen等人，(1986)Immunol.Rev.89：49)和必要的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag polyA添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明蛋白质的其他动物细胞可从(例如)美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)Catalogue of Cell Lines and Hybridomas(第7版，1992)获得。

用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇属(Drosophila)细胞系如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65)。

如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列整合进载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，(1983)J.Virol.45：773-81)。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列掺入进载体(如牛***瘤病毒类型的载体中存在的那些)(Saveria-Campo，“Bovine PapillomaVirus DNA a Eukaryotic Cloning Vector”，DNA CLONING：A PRACTICALAPPROACH，第II卷，Glover编辑，IRL Press，Arlington，VA，第213-38页(1985))。

另外，可将设置在适当植物表达载体中的二聚化结构域的基因用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，将适当的组织(例如，种子或叶)进行大规模蛋白质提取和纯化技术。

植物转化方法

多种将外来基因引入植物中的方法是已知的并且可用于将二聚化结构域多核苷酸***植物宿主中，包括生物和物理植物转化方案。参见例如Miki等人，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，Glick和Thompson编辑，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67-88页(1993)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移如农杆菌介导的基因转移(Horsch等人，Science 227：1229-31(1985))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。

用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber等人，“Vectors for PlantTransformation”，METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY(出处同上)，第89-119页。

可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334和第6,300,543号美国专利)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，第4,945,050号美国专利；WO 91/10725和McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)。还可参见Tomes等人，Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells ViaMicroprojectile Bombardment，第197-213页，Plant Cell，Tissue and OrganCulture，Fundamental Methods编辑，Gamborg and Phillips，Springer-VerlagBerlin Heidelberg New York，1995；第5,736,369号美国专利(分生组织)；Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；WO91/10725(玉米)；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-839和Gordon-Kamm等人，(1990)Plant Cell 2：603-618(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas，(1984)Nature(伦敦)311：763-764；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)，TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues，G.P.Chapman等人(编辑)，第197-209页；Longman，NY(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant CellReports 9：415-418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；第5,693,512号美国专利(超声处理)；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant CellReports 12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(rice)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotech.14：745-750；农杆菌介导的玉米转化(第5,981,840号美国专利)；碳化硅晶须方法(Frame等人，(1994)Plant J.6：941-948)；激光方法(Guo等人，(1995)Physiologia Plantarum93：19-24)；超声处理方法(Bao等人，(1997)Ultrasound in Medicine &Biology 23：953-959；Finer和Finer，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah等人，(2001)J Exp Bot 52：1135-42)；聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296：72-77)；可利用电穿孔转化单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体(Fromm等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-5828)和显微注射法(rossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)，以引用的方式将这些参考文献并入本文。

农杆菌介导的转化

最广泛使用的将表达载体引入植物中的方法是基于农杆菌的天然转化***。根瘤农杆菌和毛根农杆菌是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1。如下文献提供了有关用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体***和方法的描述：Gruber等人(出处同上)；Miki等人(出处同上)和Moloney等人，(1989)PlantCell Reports 8：238。

相似地，可将基因***源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如Benfey和Chua，(1989)Science 244：174-81。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂碱合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这样一种***，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因也必须存在，或者与T-DNA部分一起，或者通过其中vir基因存在于单独载体上的双元***。用于本发明的这类***、载体以及转化植物细胞的方法在如下文献中进行了描述：第4,658,082号美国专利；1993年11月16日提交的第5,262,306号美国专利中引用的、1986年10月1提交的系列号为913,914的美国专利申请以及Simpson等人，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(也在‘306专利中引用)，将所有上述参考文献以引用的方式全文并入本文。

一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本发明还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。多大数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主范围，涵盖大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。第604 662 A1号欧洲专利申请公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。第672 752 A1号欧洲专利申请公开了利用未成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉米的方法(NatureBiotechnology 14：745-50(1996))。

一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植株可通过使该植株产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植株的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。用于再生植物组织的这类方法的例子在如下文献中有所公开：Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40；第4,658,082号美国专利；Simpson等人(出处同上)和在1993年11月16日提交的第5,262,306号美国专利中引用的均于1986年10月1日提交的系列号为913,913和913,914的美国专利申请，将上述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。

直接基因转移

尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在稻中获得了一定的成功(Hiei等人，(1994)The Plant Journal 6：271-82)。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代。

一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300至600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford等人，(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299；Sanford，(1990)Physiol.Plant79：206和Klein等人，(1992)Biotechnology 10：268)。

物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang等人，(1991)BioTechnology 9：996中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes等人，(1985)EMBO J.4：2731和Christou等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962。利用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中已有报道。参见例如Hain等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161和Draper等人，(1982)Plant Cell Physiol.23：451。

原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn等人，(1990)，Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC，A2-38，第53页；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-505和Spencer等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61。

增加二聚化结构域多肽的活性和/或水平

提供了方法来增加二聚化结构域多肽的活性和/或水平。二聚化结构域多肽的水平和/或活性的增加可通过向植物提供二聚化结构域多肽来实现。可通过将编码二聚化结构域多肽的氨基酸序列引入植物中、向植物中引入编码二聚化结构域多肽的核苷酸序列或作为另一种选择，通过选择编码本发明的二聚化结构域多肽的基因座的不同变体来提供二聚化结构域多肽。

如本文别处所讨论的，许多用来将多肽提供给植物的方法是本领域已知的，包括但不限于将多肽直接引入到植物中，或者将编码具有引导植物发育活性的二聚化结构域组分堆叠的多肽的多核苷酸构建体引入到植物中(瞬时引入或稳定引入)。还应认识到，本发明的方法可采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因而，二聚化结构域多肽的水平和/或活性可通过改变编码二聚化结构域多肽的基因或其启动子来增加。参见例如Kmiec，第5,565,350号美国专利；Zarling等人，PCT/US93/03868。因而提供了在二聚化结构域基因中携带突变的诱变植物，其中所述突变可增加二聚化结构域基因的表达或增加植物生长和/或所编码的二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性。

降低二聚化结构域多肽的活性和/或水平

提供了方法来通过用表达可抑制二聚化结构域多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞，降低或消除本发明的二聚化结构域多肽的活性。该多核苷酸可通过防止二聚化结构域信使RNA的翻译直接抑制二聚化结构域多肽的表达，或通过编码可抑制编码二聚化结构域多肽的二聚化结构域基因的转录或翻译的多肽间接抑制二聚化结构域多肽的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所熟知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制二聚化结构域多肽的表达。

如果目标多肽的蛋白质水平低于还未经遗传修饰或诱变处理来抑制该二聚化结构域多肽的表达的植物中该多肽的蛋白质水平的70％，则该多肽的表达被抑制。在本发明的特定实施方案中，在根据本发明的经修饰的植物中二聚化结构域多肽的蛋白质水平不到不是突变体或还未经遗传修饰来抑制该二聚化结构域多肽的表达的植物中相同二聚化结构域多肽的蛋白质水平的60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。二聚化结构域多肽的表达水平可例如通过测定植物细胞或植物中表达的二聚化结构域多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量植物细胞或植物中的植物生长和/或二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性，或通过测量植物中的生物量来间接测量。进行这种测定的方法在本文的其他地方进行了描述。

在本发明的其他实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除二聚化结构域多肽的活性，所述表达盒包含编码可抑制二聚化结构域多肽的活性的多肽的多核苷酸。如果植物生长和/或二聚化结构域组分堆叠多肽的二聚化结构域活性不到还未经修饰以抑制植物生长和/或该二聚化结构域组分堆叠多肽的二聚化结构域活性的植物中的植物生长和/或相同二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性的70％，则植物生长和/或二聚化结构域组分堆叠多肽的二聚化结构域活性根据本发明受到了抑制。在本发明的特定实施方案中，在根据本发明的经修饰的植物中植物生长和/或二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性不到还未经遗传修饰以抑制该二聚化结构域多肽的表达的植物中植物生长和/或相同二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性的60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。当植物生长和/或二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性不能通过本文其他地方所描述的测定法检测时，则其根据本发明而得以“消除”。确定植物生长和/或二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性的方法在本文其他地方进行了描述。

在其它实施方案中，可通过破坏编码二聚化结构域多肽的基因来降低或消除二聚化结构域组分堆叠多肽的活性。本发明涵盖在二聚化结构域基因中携带突变的诱变植物，其中该突变可降低二聚化结构域基因的表达或抑制植物生长和/或所编码的二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性。

因而，可将许多方法用于降低或消除二聚化结构域多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于降低单种二聚化结构域多肽的活性。降低或消除二聚化结构域多肽的表达的方法的非限制性实例在下面给出。

1.基于多核苷酸的方法：

在本发明的一些实施方案中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本发明的二聚化结构域多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种二聚化结构域多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制至少一种本发明的二聚化结构域多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白质或多肽。

可抑制二聚化结构域多肽的表达的多核苷酸的例子在下面给出。

i.有义抑制/共抑制

在本发明的在一些实施方案中，二聚化结构域多肽表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码二聚化结构域多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植物品系进行筛选以鉴别对二聚化结构域多肽表达显示出最大抑制的那些品系。

用于共抑制的多核苷酸可对应于编码二聚化结构域多肽的序列的全部或部分、二聚化结构域多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或者编码二聚化结构域多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中所述多核苷酸包含二聚化结构域多肽的编码区的全部或部分的一些实施方案中，将表达盒设计用于消除该多核苷酸起始密码子，使得不会翻译出蛋白质产物。

共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见(例如)Broin等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432。共抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。利用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在如下文献中有描述：Flavell等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等人，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington，(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等人，(2003)Phytochemistry 63：753-763和第5,034,323号、第5,283,184号和第5,942,657号美国专利，将这些文献每一者以引用的方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置包括多聚dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利申请公开，将其以引用的方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有相当大的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见第5,283,184号和第5,034,323号美国专利，将它们以引用的方式并入本文。

ii.反义抑制

在本发明的一些实施方案中，对二聚化结构域多肽表达的抑制可通过反义抑制来获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子与编码二聚化结构域多肽的信使RNA的全部或部分互补。该反义RNA分子的过量表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该反义抑制表达盒转化的多个植物品系进行筛选以鉴别对二聚化结构域多肽表达显示出最大抑制的那些品系。

用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码二聚化结构域多肽的序列的互补序列的全部或部分、二聚化结构域转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或者编码二聚化结构域多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸可与目标序列完全互补(即与目标序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与目标序列的互补序列的同一性低于100％)。反义抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献中有描述：Liu等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743以及第5,759,829号和第5,942,657号美国专利，将这些参考文献的每一者以引用的方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置处包括多聚dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利申请公开，将其以引用的方式并入本文。

iii.双链RNA干扰

在本发明的一些实施方案中，对二聚化结构域多肽表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。

有义和反义分子的表达可通将表达盒子设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。对用一个或多个dsRNA干扰表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别对二聚化结构域多肽表达显示出最大抑制的植物品系。利用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在如下文献中有描述：Waterhouse等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964、Liu等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和WO 99/49029、WO 99/53050、WO 99/61631以及WO00/49035，将这些参考文献的每一者以引用的方式并入本文。

iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰

在本发明的一些实施方案中，对二聚化结构域多肽表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38以及其中引用的参考文献。

对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。因而，该分子的碱基配对颈区通常决定RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代遗传。参见(例如)Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731以及Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。利用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法例如在如下文献中有描述：Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat，Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等人，BMC Biotechnology 3：7和第2003/0175965号美国专利申请公开，将这些参考文献的每一者以引用的方式并入本文。hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定法已由Panstruga等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140进行了描述，将该文献以引用的方式并入本文。

对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环区大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见(例如)Smith等人，(2000)Nature 407：319-320。事实上，Smith等人显示使用ihpRNA介导的干扰100％抑制了内源基因表达。利用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在如下文献中有描述：Smith等人，(2000)Nature 407：319-320；Wesley等人，(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse，(2003)Methods 30：289-295以及第2003/0180945号美国专利申请公开，将这些参考文献的每一个以引用的方式并入本文。

还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施方案中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO02/00904，以引用的方式将其并入本文。

v.扩增子介导的干扰

扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于目标序列(即二聚化结构域多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。利用扩增子来抑制内源植物基因表达的方法例如在如下文献中有描述：Angell和Baulcombe，(1997)EMBO J.16：3675-3684、Angell和Baulcombe，(1999)Plant J.20：357-362以及第6,646,805号美国专利，将这些参考文献的每一者以引用的方式并入本文。

vi.核酶

在一些实施方案中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化性RNA或具有二聚化结构域多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致二聚化结构域多肽表达降低。这个方法例如在第4,987,071号美国专利中进行了描述，将该专利以引用的方式并入本文。

vii.小干扰RNA或微RNA

在本发明的一些实施方案中，对二聚化结构域多肽表达的抑制可通过经由编码微RNA(miRNA)的基因的表达进行的RNA干扰来获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调控因子。miRNA在抑制内源基因的表达方面是高度有效的。参见例如Javier，等人，(2003)Nature 425：257-263，将该文献以引用的方式并入本文。

对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为了抑制二聚化结构域表达，从二聚化结构域转录物序列选择该22核苷酸序列，其含有有义取向的所述二聚化结构域序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的相应反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代遗传。

2.基因表达的基于多肽的抑制

在一个实施方案中，所述多核苷酸编码与编码二聚化结构域多肽的基因结合的锌指蛋白，从而导致所述基因的表达降低。在特定实施方案中，该锌指蛋白结合至二聚化结构域基因的调控区。在其它实施方案中，该锌指蛋白结合至编码二聚化结构域多肽的信使RNA并防止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已例如在第6,453,242号美国专利进行了描述，利用锌指蛋白来抑制植物中的基因表达的方法例如在第2003/0037355号美国专利申请公开中进行了描述，将这些专利每一者以引用的方式并入本文。

3.蛋白质活性的基于多肽的抑制

在本发明的一些实施方案中，所述多核苷酸编码与至少一种二聚化结构域多肽结合并降低该二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性的抗体。在另一个实施方案中，该抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体-二聚化结构域复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领域所熟知的。参见例如Conrad和Sonnewald，(2003)Nature Biotech.21：35-36，将该文献以引用的方式并入本文。

4.基因破坏

在本发明的一些实施方案中，通过破坏编码二聚化结构域多肽的基因来降低或消除该二聚化结构域多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码二聚化结构域多肽的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标签法破坏所述基因。在另一个实施方案中，通过利用随机诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有降低的二聚化结构域活性的植物来破坏所述基因。

i.转座子标签法

在本发明的一个实施方案中，将转座子标签法用于降低或消除一种或多种二聚化结构域多肽的二聚化结构域活性。转座子标签法包括在内源二聚化结构域基因内***转座子以降低或消除所述二聚化结构域多肽的表达。“二聚化结构域基因”旨在意指编码根据本发明的二聚化结构域多肽的基因。

在该实施方案中，通过在编码二聚化结构域多肽的基因的调控区或编码区内***转座子来降低或消除一种或多种二聚化结构域多肽的表达。处于二聚化结构域基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子，可用于降低或消除所编码二聚化结构域多肽的表达和/或活性。

用于对植物中的特定基因进行转座子标记的方法是本领域所熟知的。参见(例如)Maes等人，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等人，(2000)Plant J.22：265-274；Phogat等人，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等人，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等人，(1999)Genetics 153：1919-1928)。此外，用于选择选定基因中的Mu***序列的TUSC方法已在如下文献中进行了描述：Bensen等人，(1995)Plant Cell 7：75-84；Mena等人，(1996)Science 274：1537-1540和第5,962,764号美国专利，将这些参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。

ii.活性降低的突变体植物

用于降低或消除植物中的内源基因的表达的另外方法也是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源基因已缺失的植株。这些方法的例子参见Ohshima等人，(1998)Virology 243：472-481；Okubara等人，(1994)Genetics 137：867-874和Quesada等人，(2000)Genetics 154：421-436，将这些参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(Targeting Induced LocalLesions In Genomes(定向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum等人，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457，将该文献以引用的方式并入本文。

影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能(二聚化结构域活性)的突变是本领域所熟知的。基因外显子中的***突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白质的二聚化结构域活性方面是特别有效的。植物二聚化结构域多肽的适于以消除二聚化结构域活性为目标来进行诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同二聚化结构域基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis等人，(2002)Plant Cell 14：2863-2882。

在本发明的另一个实施方案中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用于引发RNA沉默。参见例如Kusaba等人，(2003)Plant Cell15：1455-1467。

本发明涵盖另外的用于降低或消除一种或多种二聚化结构域多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA:DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenic oligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如第5,565,350号美国专利；第5,731,181号美国专利；第5,756,325号美国专利；第5,760,012号美国专利；第5,795,972号美国专利和第5,871,984号美国专利，将这些专利中的每一个以引用的方式并入本文。另参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778，将这些专利和参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。

iii.调节植物生长和/或二聚化结构域组分堆叠活性

在特定的方法中，通过增加植物中的二聚化结构域多肽的水平或活性来增加二聚化结构域基因的水平和/或活性。增加植物中的二聚化结构域多肽的水平和/或活性的方法在本文其他地方进行了论述。简而言之，这种方法包括将本发明的二聚化结构域多肽提供给植物，从而增加该二聚化结构域多肽的水平和/或活性。在其它实施方案中，可通过向植物引入包含本发明的二聚化结构域核苷酸序列的多核苷酸，使该二聚化结构域序列表达，增加二聚化结构域多肽的活性，从而增加二聚化结构域活性并因而增加所述植物或植物部分中的植物生长来提供编码二聚化结构域多肽的二聚化结构域核苷酸序列。在其他的实施方案中，引入植物中的二聚化结构域核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。

在其他方法中，通过增加植物中的二聚化结构域多肽的水平或活性来增加植物组织的细胞数目和生物量。这种方法在本文其他地方进行了详细公开。在一这样的方法中，将二聚化结构域核苷酸序列引入植物中，所述二聚化结构域核苷酸序列的表达可降低二聚化结构域多肽的活性并从而增加植物或植物部分中的植物生长和/或二聚化结构域。在其他的实施方案中，引入植物中的二聚化结构域核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。

如上面所论述的，技术人员将认识到，可将适当的启动子用于调节植物中的植物生长和/或二聚化结构域多核苷酸和多肽的水平/活性。在本文其他地方已经公开了该实施方案的示例性启动子。

因此，本发明还提供了当与对照植物组织的植物生长和/或二聚化结构域比较时具有经修饰的植物生长和/或二聚化结构域的植物。在一个实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明二聚化结构域多肽的水平/活性，因而在植物组织中具有增加的植物生长和/或二聚化结构域。在另一个实施方案中，本发明的植物具有降低的或消除的本发明二聚化结构域多肽的水平，因而在植物组织中具有降低的植物生长和/或二聚化结构域。在其它实施方案中，这种植物已在其基因组中稳定掺入了核酸分子，该核酸分子包含可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子的本发明二聚化结构域核苷酸序列。

iv.调节根发育

提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管***、分生组织发育或径向扩张度。具体地讲，最期望的结果将是根具有较强的维管结构，该较强的维管结构可改善植物的抗倒伏性并因而减少根倒伏以及较不易受害虫影响。

提供了用于调节植物中的根发育的方法。该方法调节植物中的二聚化结构域多肽的水平和/或活性。在一种方法中，将本发明的二聚化结构域序列提供给植物。在另一方法中，通过向植物中引入包含本发明的二聚化结构域核苷酸序列、表达该二聚化结构域序列并从而修饰根发育来提供二聚化结构域核苷酸序列。在其他的方法中，引入植物中的二聚化结构域核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。

在另外的方法中，通过改变植物中的二聚化结构域多肽的水平或活性来调节根发育。当与对照植物比较时二聚化结构域活性的增加可导致至少一种或多种如下对根发育的变更，包括但不限于：较大的根分生组织、根生长增加、增强的径向扩张、增强的维管***、增加的根分支、更多的不定根和/或鲜根重的增加。

本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。

测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如第2003/0074698号美国专利申请和Werner等人，(2001)PNAS 18：10487-10492，将这两篇文献以引用的方式并入本文。

如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根优选的启动子。示例性的根优选的启动子已在本文别处公开。

通过增加二聚化结构域多肽的活性和/或水平来刺激根生长和增加根量也在改善植物的抗倒伏性方面得到应用。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长***和/或活性来刺激根生长和增加根量也在促进外植体的体外繁殖方面得到应用。

此外，由于增加的二聚化结构域活性的水平和/或活性引起的较高的根生物量产量对产量具有直接效果以及对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的产生具有间接的影响。在根培养物中产生的关注化合物的一个实例是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。

因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明二聚化结构域多肽的水平/活性，并且具有增加的根生长和/或根生物量。在其它实施方案中，这种植物已在其基因组中稳定掺入了核酸分子，该核酸分子包含可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子的本发明二聚化结构域核苷酸序列。

v.调节苗和叶发育

还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。苗和/或叶发育中的这种改变包括但不限于在苗分生组织发育方面、在叶数目、叶尺寸、叶和茎维管***、节间长度和叶老化方面的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶***和苗***的不同部分在这些***发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶***中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner等人，(2001)PNAS 98：10487-10492和第2003/0074698号美国专利申请公开，将这两篇文献各以引用的方式并入本文。

调节植物中的苗和/或叶发育的方法包括调节本发明的二聚化结构域多肽的活性和/或水平。在一个实施方案中，提供了本发明的二聚化结构域序列。在其他实施方案中，通过向植物中引入包含本发明的二聚化结构域核苷酸序列的多核苷酸、表达该二聚化结构域序列并从而修饰苗和/或叶发育来提供二聚化结构域核苷酸序列。在其他的实施方案中，引入植物中的二聚化结构域核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。

在具体的实施方案中，通过降低植物中的二聚化结构域多肽的水平和/或活性来调节苗或叶发育。当与对照植物比较时，二聚化结构域活性的降低可导致至少一种或多种如下苗和/或叶发育的改变，包括但不限于：叶数目减少、叶表面降低、维管减少、节间较短以及生长矮小和叶老化延缓。

如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、苗优选的启动子、苗分生组织优选的启动子和叶优选的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。

降低植物中的二聚化结构域活性和/或水平会导致节间较短和生长矮小。因而，本发明的方法可在产生矮秆植物方面有应用。另外，如上面所论述的，植物中的二聚化结构域活性的调节可调节根和苗二者的生长。因而，本发明还提供了用于改变根/苗比的方法。可进一步通过降低植物中的二聚化结构域多肽的水平和/或活性来调节苗或叶发育。

因此，本发明还提供了与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明二聚化结构域多肽的水平/活性，从而改变了苗和/或叶发育。这种改变包括但不限于与对照植物相比较，叶数目增加、叶表面增加、维管结构增加、节间更长和植物株高增加以及叶老化改变。在其他实施方案中，本发明的植物具有降低的本发明二聚化结构域多肽的水平/活性。

vi调节繁殖组织发育

提供了用于调节繁殖组织发育的方法。在一个实施方案中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”其意指与其中二聚化结构域多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的繁殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中二聚化结构域多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物繁殖组织发育的时限的任何改变(即花发育时限的延迟或加速)。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：繁殖组织的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间周期，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成繁殖组织的细胞的类型或形状的改变。

用于调节植物中的花发育的方法包括调节植物中的二聚化结构域活性。在一种方法中，提供了本发明的二聚化结构域序列。可通过向植物中引入包含本发明的二聚化结构域核苷酸序列的多核苷酸、表达该二聚化结构域序列并从而修饰花发育来提供二聚化结构域核苷酸序列。在其他的实施方案中，引入植物中的二聚化结构域核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。

在具体的方法中，通过降低植物中的二聚化结构域多肽的水平或活性来调节花发育。当与对照植物比较时，二聚化结构域活性的降低可导致至少一种或多种如下的花发育改变，包括但不限于：开花延迟、花数目减少、部分雄性不育和种组减少。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov，等人，(2002)The Plant Cell S111-S130，将该文献以引用的方式并入本文。

如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗优选的启动子、花序优选的启动子。

在其他方法中，通过增加本发明的二聚化结构域序列的水平和/或活性来调节花发育。这种方法可包括将二聚化结构域核苷酸序列引入植物从而增加二聚化结构域多肽的活性。在其他的方法中，引入植物中的二聚化结构域核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。增加本发明的二聚化结构域序列的表达可调节胁迫期间的花发育。这种方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供了当与对照植物的花发育相比时具有受调节的花发育的植物。组合物包括具有增加的本发明二聚化结构域多肽的水平/活性且具有改变的花发育的植物。组合物还包括具有增加的本发明二聚化结构域多肽的水平/活性的植物，其中所述植物在胁迫时保持或继续开花过程。

还提供了使用本发明的二聚化结构域来增加种子尺寸和/或重量的方法。该方法包括增加植物或植物部分如种子中的二聚化结构域的活性。种子尺寸和/或重量的增加包括种子尺寸或重量增加和/或一个或多个种子部分(包括例如胚芽、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的尺寸或重量增加。

如上面所论述的，技术人员将认识到用于增加种子尺寸和/或种子重量的适当启动子。该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子优选的启动子、胚优选的启动子和胚乳优选的启动子。

降低植物中的种子尺寸和/或种子重量的方法包括降低该植物中的二聚化结构域活性。在一个实施方案中，通过向植物中引入包含本发明的二聚化结构域核苷酸序列的多核苷酸、表达该二聚化结构域序列并从而修饰种子重量和/或大小来提供二聚化结构域核苷酸序列。在其他的实施方案中，引入植物中的二聚化结构域核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。

还认识到，增加种子尺寸和/或重量可以还伴随有籽苗生长速度的增加或早期活力的增加。如本文所用，术语“早期活力”指植物在早期发育期间快速生长的能力并且涉及萌发后的成功建植、具有发育良好的根系和发育良好的光合作用器官。此外，当与对照比较时，种子尺寸和/或重量的增加还可导致植物产量的增加。

因此，本发明还提供了当与对照植物比较时具有增加的种子重量和/或种子尺寸的植物。在其它实施方案中，还提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明二聚化结构域多肽的水平/活性并且具有增加的种子重量和/或种子尺寸。在其它实施方案中，这种植物已在其基因组中稳定掺入了核酸分子，该核酸分子包含可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子的本发明二聚化结构域核苷酸序列。

vii.二聚化结构域启动子多核苷酸的使用方法

当与DNA构建体装配使得二聚体结构域启动子序列可操作地连接至包含所关注的多核苷酸的核苷酸序列时，包含本发明中所公开的二聚化结构域启动子的多核苷酸以及其变体和片段可用于任何宿主细胞(优选植物细胞)的遗传操纵。这样，本发明的二聚化结构域启动子多核苷酸连同所关注的多核苷酸序列一起在表达盒中提供用于在所关注的宿主细胞中表达。本发明的二聚化结构域启动子序列在含有具有二聚化结构域的细胞的多种组织中表达，因而所述启动子序列可特别是在含有该二聚化结构域的细胞中用于调节所关注的多核苷酸的时间和/或空间表达。

合成的杂合启动子区是本领域已知的。这种区域包含可操作地连接至另一多核苷酸的启动子元件的一多核苷酸的上游启动子元件。在本发明的一个实施方案中，通过合成的杂合启动子控制异源序列表达，该合成的杂合启动子包含可操作地连接至来自异源启动子的上游启动子元件的本发明的二聚化结构域启动子序列或其变体或片段。涉及植物防御***的上游启动子元件已被鉴定并可用于产生合成启动子。参见例如Rushton等人，(1998)Curr.Opin.Plant Biol.1：311-315。作为另一种选择，合成的二聚化结构域启动子序列可包含二聚化结构域启动子序列内存在的上游启动子元件的重复。

已经认识到，本发明的启动子序列可与其天然的二聚化结构域编码序列使用。包含与其天然二聚化结构域基因可操作地连接的二聚化结构域启动子的DNA构建体可用于转化任何所关注的植物来引起所需的表型变化，例如调节细胞数目、调节根、苗、叶、花和胚的发育、胁迫耐受性和本文其他地方描述的任何其他表型。

本文所公开的启动子核苷酸序列和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。

所关注基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。所关注作物和市场在变化，并且随着发展中国家开放了世界市场，也将会出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。所关注基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些。

在某些实施方案中，可将本发明的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括所关注多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。本发明的多核苷酸可与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于对动物饲料而言理想的性状如高油脂基因(例如第6,232,529号美国专利)；平衡的氨基酸(例如hordothionin类(第5,990,389号；第5,885,801号；第5,885,802号和第5,703,409号美国专利)；大麦高赖氨酸(Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359和Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的可消化性(例如经修饰的贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的系列号为10/053,410的美国专利申请)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的系列号为10/005,429的美国专利申请))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。本发明的多核苷酸还可与昆虫、病害或除草剂抗性所需的性状进行堆叠(例如苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白(第5,366,892号、第5,747,450号、第5,737,514号、第5723,756号、第5,593,881号美国专利；Geiser等人，(1986)Gene 48：109)；凝集素(VanDamme等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马毒素解毒基因(第5,792,931号美国专利)；无毒性和病害抗性基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，如膦丝菌素或basta(例如bar基因)和草甘磷抗性(EPSPS基因))，以及对加工或工艺产品而言理想的性状如高油脂(例如第6,232,529号美国专利)；经修饰的油脂(例如脂肪酸去饱和酶基因(第5,952,544号美国专利；WO 94/11516))；经修饰的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如第5,602,321号美国专利；促进聚羟基链烷酸酯(PHA)表达的β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响诸如雄性不育(例如参见第5,583,210号美国专利)、茎秆强度、开花时间之类的农学性状或诸如细胞周期调控或基因打靶(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，将上述文献以引用的方式并入本文。

在一个实施方案中，所关注序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导。这类基因的例子包括但不限于玉米质膜H⁺-ATP酶(MHA2)(Frias等人，(1996)Plant Cell8：1533-44)；AKT1，拟南芥属中钾摄取器的组件，(Spalding等人，(1999)J Gen Physiol 113：909-18)；RML基因，其激活根顶端细胞中的细胞***周期(Cheng等人，(1995)Plant Physiol 108：881)；玉米谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya等人，(1994)Plant Mol Biol 26：1935-46)和血红蛋白(Duff等人，(1997)J.Biol.Chem 27：16749-16752；Arredondo-Peter等人，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266；Arredondo-Peter等人，(1997)Plant Physiol114：493-500以及其中引用的参考文献)。所关注序列还可用于表达负面影响根发育的基因反义核苷酸序列。

另外，除了利用传统的育种方法外，还可遗传改变诸如油脂、淀粉和蛋白质含量之类的农学上重要的性状。修饰包括增加油酸、饱和或不饱和油的含量、增加赖氨酸或硫的水平、提供必需氨基酸以及修饰淀粉。第5,703,049号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,990,389号美国专利中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些文献以引用的方式并入本文。另外的例子是第5,850,016号美国专利中描述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白和Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，将上述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。

可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽的基因(BHL)源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，参见于1996年11月1日提交的系列号为08/740,682的美国专利申请和WO 98/20133，将这两篇文献的公开内容以引用的方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白如来自向日葵籽(Lilley等人，(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilizationin Human Foods and Animal Feedstuffs，Applewhite(编辑)(American OilChemists Society，Champaign，Illinois)，第497-502页，将该文献以引用的方式并入本文)；玉米(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359，将这两篇文献均以引用的方式并入本文)和水稻(Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123，将该文献以引用的方式并入本文)。其他农学上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。

昆虫抗性基因可编码针对会导致产量大跌的害虫(如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这类基因包括例如苏芸金杆菌毒蛋白基因(第5,366,892号、第5,747,450号、第5,736,514号、第5,723,756号、第5,593,881号美国专利和Geiser等人，(1986)Gene 48：109)等等。

编码病害抗性性状的基因包括：解毒基因，如对抗伏马毒素的基因(第5,792,931号美国专利)；无毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432和Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)等等。

抗除草剂性性状可包括编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对抑制烯醇丙酮莽草酸磷酸合酶(EPSPS)的除草剂的抗性的基因(例如草甘膦乙酰转移酶(GAT))、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶作用的作用的除草剂(例如草胺膦或basta)的抗性的基因(例如bar基因)、它们的组合或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变编码针对除草剂氯磺隆的抗性。

不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。可以这类方式使用的基因的例子包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因如QM，其在第5,583,210号美国专利中进行了描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。

谷粒品质反映在诸如饱和和非饱和的油的水平和类型、必需氨基酸的品质和数量以及纤维素的水平之类的性状中。在玉米中，修饰的hordothionin蛋白在第5,703,049号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,990,389号美国专利中进行了描述。

还可在(一种或多种)基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，如在第5,602,321号美国专利中描述的。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶之类的基因(参见Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)可促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。

外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。

参考如下非限制性实施方案可更好地理解本发明。本领域技术人员将会理解，可在不脱离本文所公开的并受权利要求书保护的发明的精神和范围的情况下实施本发明的其他实施方案。

实施例

实施例1.产量和收获指数测试-RT810ZBS_T(Intro-EF09B/GR1B5)

-PHP26963(S2a：D8MPL+S2a：CesA10)-10个事件

-PHP26998(S2a：D8mpl+Nas2：DD+S2a：CesA10)-8个事件

-PHP24843(S2a：D8MPL+NAS2：DD)-4个事件

-无效构建体(3个事件/无效)

-野生型(Intro-EF09BZTZ/GR1B5)

2种密度

-36,000PPA(JH，MR)-产量(5个重复)

-48,000PPA(JH，MR)-产量(5个重复)，收获指数(3个重复)

以两种密度(36,000株植株/英亩(PPA)和48,000PPA，20英寸苗幅宽度)在爱荷华州的约翰斯顿(Johnston，JH)和马里昂(Marion，MR)测试了这些构建体。所测试的基因由矮秆突变型D8mpl和另外的基因(堆叠基因)DD(D8基因的二聚化结构域)或Ces A10基因。下面示出了所述构建体，其中转基因事件与它们的质粒名称一起示出，无效构建体(分离的非转基因同胞)与它们的质粒名称和字母n一起示出。

表2

选择了较高的植物种群密度来确定矮秆和矮秆堆叠转基因植物与构建体无效同胞(无转基因，具有正常高度)就产量和收获指数而言表现是相同还是不同。一般而言，谷类在高于最佳经济产量的种群中显示出产量的下降，使得产量水平下降。通过穗干物质/总地上部分干物质进行定义，谷类的收获指数已相对稳定，为45至50％。生物量的和收获指数的增加是产量的主要决定因素，因而任一属性的积极改变可导致更高的潜在产量。

对于所选择的不同构建体的事件，在约翰斯顿和马里昂进行了产量比较。一般而言，相比与各个转基因堆叠构建体，由于密植导致的产量水平降低在无效同胞中更明显。在某些情况下，转基因处理显示出意料不到的且增加的产量响应，特别是在爱荷华州的马里昂。这种观察现象表明，除了与这些转基因堆叠使用的那些或对农学因素(例如苗幅宽度、施肥规范或矮秆表型的最优化植物种群)的额外优化之外，用多种不同种质来源进一步育种将进一步改善产量潜力。

测量了在48,000PPA的较高种群密度下的各测试物的收获指数。总体上，无效同胞的收获指数刚好在0.5至0.52之间，而转基因堆叠的大多数的收获指数在0.54至0.58的范围内。收获指数的增加可预期能更好地利用可用的土壤水分和营养物质，因为更大比例的所产生的干物质是以谷粒的形式。

实施例2.产量和收获指数测试-(Intro-EF09B/HG11)

用PHP26963、PHP26998和PHP24843 T0植株与HG11雌株进行顶交。这产生了类似于市售杂种33A14的背景基因型，可将33A14用作参照。然后将这些植株在约翰斯顿观察用地中栽培。还包括了小面积栽培的PHP17881杂种。

-PHP26963(S2a：D8MPL+S2a：CesA10)-2个事件，6苗行

-PHP26998(S2a：D8mpl+Nas2：DD+S2a：CesA10)-2个事件，6苗行

-PHP24843(S2a：D8MPL+NAS2：DD)-2个事件，8苗行

-PHP17881(S2a：D8MPL)

-野生型(EF09B/HG11-33A14)-11行

将微根管***靠近这些植株的土壤中以使得能对与管相交的根进行成像。这使得能直接测量NAS2：DD堆叠构建体的根长度(图2-5)。与非DD对应物相比，同等DD堆叠构建体在较早的时间点具有更长的根系，并且看起来在土壤中定植更快。在稍后的时间点显示，非DD构建体在较浅的深度处与DD堆叠构建体具有相似的根长，但仍未完全定植在所测量土壤的最深处。这些植株的表面积随长度成比例地增加，从而表明没有牺牲根宽度。植株高度和产量与先前对S2a：D8MPL构建体的观察结果一致(图4和表3-来自田间试验的高度)

表3

实施例3.温室栽培的转基因堆叠植物

在introEF09B背景中在T0代测试了三种构建体以确定D8二聚化结构域堆叠植物的农学特性以及用于田间测试的准备。将每一种堆叠的构建体(PHP24843、PHP26963和PHP26998)均利用S2A PRO：D8MPL基因、NAS2 PRO：D8 243-331和/或S2A PRO：ZM-CES A10。

·所测试的基因(Intro EF09B)

-S2a：D8MPL(维管元件优选的启动子：中等矮秆基因)

-Nas2：DD(根优选的启动子：亮氨酸拉链二聚化结构域)

-S2a：CesA10(维管元件优选的启动子：茎秆组织中的纤维素合酶基因)

·两种或三种基因的组合(“堆叠”)

-PHP24843-NAS2 PRO：D8 243-331/S2A PRO：D8MPL堆叠(13个事件)

-PHP26963-S2A PRO：ZM-CES A10/S2A PRO：D8MPL堆叠(15个事件)

-PHP26998-NAS2 PRO：D8 243-331/S2A PRO：ZM-CES A10/S2APRO：D8MPL(14个事件)

对来自该试验的成熟T0植株进行形态测定分析(图6)。在该试验中NAS2 PRO：D8 243-331基因增加了叶宽度和面积。S2A PRO：ZM-CES A10基因增加了叶角，降低了叶长度且增加了种子数目。

实施例4.温室栽培的转基因堆叠植物

在GS3×GF3中的T0代测试了五种构建体以确定D8二聚化结构域逆转玉米根系的矮化的效力。每一种堆叠的构建体(PHP24843、PHP24844和PHP24861)均利用不同的根优选启动子来驱动D8 243-331编码序列的表达。

·所测试的基因(GS3×GF#)

-S2a：D8MPL(维管元件优选的启动子：中等矮秆基因)

-Nas2：DD(根优选的启动子：亮氨酸拉链二聚化结构域)

-ZRP2.47 PRO：D8 243-331(根优选的启动子：亮氨酸拉链二聚化结构域)

-ROOTMET2 PRO：D8 243-331(根优选的启动子：亮氨酸拉链二聚化结构域)

-ROOTMET2 PRO：GUSINT(根优选的启动子：β-葡糖醛酸酶报道基因)

·两种基因的组合(“堆叠”)

-PHP24843-NAS2 PRO：D8 243-331/S2A PRO：D8MPL堆叠(25个事件)

-PHP24844-ZRP2.47 PRO：D8 243-331/S2A PRO：D8MPL堆叠(23个事件)

-PHP24861-ROOTMET2 PRO：D8 243-331/S2A PRO：D8MPL堆叠(22个事件)

-PHP17881-S2A PRO：D8MPL(矮秆对照)(14个事件)

-PHP23206-ROOTMET2 PRO：GUSINT(实际尺寸对照)(14个事件)

对来自该试验的成熟T0植株进行形态测定分析(图7)。结果是根重量未显著改变。预期的根改变是根长度的改变，由于在温室盆中根生长受限所以不能测量根长度。带有S2A PRO：D8MPL基因的每种构建体显示出降低的株高，植株高度降低约25-35％。茎秆重量在二聚化结构域构建体中比在仅S2A PRO：D8MPL中低，在S2A PRO：D8MPL中继而比原尺寸对照低。相比于原尺寸对照，在PHP24844、PHP24861和PHP17881中叶重量和种子数目降低；然而PHP24843(NAS2 PRO：D8 243-331/S2A PRO：D8MPL堆叠)保持了与全尺寸对照的那些相等的叶重量和种子数目。种子数目是产量的组分而茎秆重量是生物量的组分，从而表明PHP24843可增加收获指数。

实施例5.温室栽培的D8二聚化结构域转基因植物

在GS3×GF3中的第T0代测试了四种构建体以确定D8二聚化结构域以非堆叠构型在根中表达时的效果。每一种堆叠的构建体(PHP24711、PHP24712和PHP24713)均利用不同的根优选启动子来驱动D8 243-331编码序列的表达。

·所测试的基因(GS3×GF#)

-Nas2：DD(根优选的启动子：亮氨酸拉链二聚化结构域)

·基因构建体

-PHP24711-ZRP2.47 PRO：D8 243-331(25个事件)

-PHP24712-ROOTMET2 PRO：D8 243-331(25个事件)

-PHP24713-NAS2 PRO：D8 243-331(25个事件)

-PHP24715-S2A PRO：AC-GFP1(原尺寸对照)(25个事件)

对来自该试验的成熟T0植株进行形态测定分析(图8)。在ROOTMET2 PRO：D8 243-331和NAS2 PRO：D8 243-331构建体中茎秆重量和种子数目增加。

实施例6.两个地点、3种构建体的产量和收获指数试验

用基因型“Intro EF09B/GR1B5”中的三种不同构建体以及用于比较的它们各自的无效构建体进行了产量和收获指数比较。数据在表4中描述。在爱荷华州的约翰斯顿和马里昂以重复实验(5个)测量了产量和收获指数，种植密度为48,000PPA，以20英寸苗幅宽度播种，采用随机化完全区组设计。总体上，对于每种构建体半矮秆植株高度大约为无效构建体(CN)的60-70％。phP29693和phP26998植株高度比phP24843高约65％(高约12英寸)。与无效构建体相比，在约翰斯顿的产量几乎等于具有该表中所示的事件的无效构建体。在约翰斯顿收获指数显著更高。在马里昂，数种构建体/事件在产量上比它们各自的无效构建体高。收获指数在数值上高于并且在大多数情况中显著高于它们各自的无效构建体。与以36,000ppa的较低种群密度栽培时的无效构建体比较，半矮秆转基因植物在高种群密度下具有更好的产量响应。在这两个地点，对于产量D8mpl+DD的‘堆叠’组合不显著低于无效构建体而具有较高的收获指数。在约翰斯顿和马里昂，构建体phP26963中的组合具有较高的产量潜力，收获指数较高。在约翰斯顿，D8mpl+DD+CesA 10的组合具有类似的或相等的产量和较高的收获指数，而在爱荷华州的马里昂，三基因堆叠显示出较低的产量，但收获指数较高。尽管存在显示出根和茎倒伏的某些个体栽培盆，但没有一个地点在转基因和它们的无效构建体之间具有显著差异。

实施例7.转基因植物的转化和再生

用质粒轰击来自温室供体植株的未成熟玉米胚，所述质粒含有可操作地连接至干旱诱导型启动子RAB17启动子(Vilardell等人，(1990)PlantMol Biol 14：423-432)的Zm二聚化结构域序列和赋予针对除草剂双丙氨膦的抗性的选择性标记基因。作为另外一种选择，在单独的质粒上提供该选择性标记基因。如下进行转化。培养基配方见下文。

靶标组织的制备：

将穗去壳并在30％Clorox

漂白剂加0.5％Micro去污剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。

DNA的制备：

制备质粒载体，该质粒载体包含可操作地连接至泛素启动子的二聚化结构域序列。使用如下的CaCl₂沉淀程序将该质粒DNA加上含有PAT选择性标记的质粒DNA沉淀于1.1μm(平均直径)的钨小球上：

100μl制备的钨粒子水溶液

10μl Tris EDTA缓冲液中的(1μg)DNA(1μg总DNA)

100μl 2.5M CaCl₂

10μl 0.1M亚精胺

将每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时保持在复式管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml 100％乙醇洗涤，离心30秒。再次除去液体，将105μl 100％乙醇加至最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。

粒子枪处理：

将样品板在粒子枪#HE34-1或#HE34-2中以水平#4进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。

后续处理：

在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2星期进行传代培养。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的盘***孔(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1星期，随后在温室中再生长1-2个星期，然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。针对增加的耐旱性对植株进行检测和评分。测量改善的耐旱性的测定法是本领域的常规工作，包括例如当与干旱条件下的对照玉米植株比较时在相同环境条件下的核仁-抽穗能力产量增加。作为另一种选择，可针对分生组织发育的调节(即穗上小穗形成的降低)监测转化植株。参见例如Bruce，等人，(2002)Journal of Experimental Botany 53：1-13。

轰击法和培养基：

轰击介质(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/l Gelrite

(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l 2，4-D(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/l Gelrite

(在用去离子水定容后加入)以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)(Murashige和Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调至pH 5.6后用精炼去离子水定容)；3.0g/l Gelrite

(在用去离子水定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/l MS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/1盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH 5.6后用精炼去离子水定容)和6g/l bacto^TM琼脂(在用精炼去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。

实施例8.农杆菌介导的转化

对于用本发明的Zm二聚化结构域序列的反义序列对玉米进行农杆菌介导的转化，优选的是采用Zhao的方法(第5,981,840号美国专利和PCT专利公布WO98/32326，藉此以引用的方式将这两篇参考文献的内容引入本文)。简单而言，从玉米分离出未成熟胚并使胚与农杆菌的悬浮液接触，其中该细菌能够将二聚化结构域序列转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，优选将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中用于开始接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在这个共培养期之后，可设想任选的“静息”步骤。在该静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。优选将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不加选择剂，用于消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息期。接着，将接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并优选将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。针对分生组织发育的调节对植株进行监测并评分。例如，对苗和花分生组织的尺寸和外观的改变和/或叶、花和/或果实的产量增加进行监测。

实施例9.甘蔗转化

该方案描述了用于产生转基因甘蔗品系的常规条件。相同的条件对于在轰击进甘蔗胚性愈伤组织中后瞬时表达的细胞的数目而言接近最佳。还可参见Bower等人，(1996)。Molec Breed 2：239-249；Birch和Bower，(1994).Principles of gene transfer using particle bombardment.In Particle BombardmentTechnology for Gene Transfer，Yang和Christou编辑(New York：OxfordUniversity Press)，第3-37页以及Santosa等人，(2004)，MolecularBiotechnology 28：113-119，将上述参考文献以引用的方式并入本文。

甘蔗转化规程：

1.在轰击前4天，在MSC3上对愈伤组织进行传代培养：

(a)将活跃生长的胚性愈伤组织(主要为球状原胚状体而不是更晚的分化阶段)用于轰击以及通过随后的选择阶段。

(b)在传代培养时将愈伤组织分成直径约5mm的小块并用镊子在琼脂表面产生小坑，用于每块转化的愈伤组织块。

(c)在28℃下在深(25mm)培养皿中暗处温育，使用微孔带密封件用于进行气体交换。

2.将胚性愈伤组织块放置在MSC3Osm培养基上的圆圈(约2.5cm直径)中。温育4小时，然后轰击。

3.将0.7μm直径的钨(M-10等级，Bio-Rad#165-2266)在无水乙醇中灭菌。涡旋该悬浮液，然后在微量离心机中将钨离心约30秒。抽去上清液并将粒子以相同的浓度再悬浮于无菌H₂O中。用无菌H₂O重复该洗涤步骤两次并彻底再悬浮粒子，然后将50μl等分试样转移进微量离心管中。

4.添加沉淀混合物组分：

5.让混合物立在冰上5分钟。在这期间，完成下面的步骤6-8。

6.通过用乙醇擦拭‘基因枪’靶室的内部进行消毒，让其干燥。

7.调节氦气筒处的出口压力至所需的轰击压力。

8.调节螺线管定时器至0.05秒。使足够的氦气通过以从供气管线除去空气(2-3次脉冲)。

9.在冰上5分钟后，从沉积的沉淀混合物移出(并弃去)100μl上清液。

10.将粒子在剩余的溶液中充分分散。

11.立即将4μl分散的钨-DNA制备物置于13mm塑料注射过滤器夹具中的支撑网的中央。

12.将过滤起夹持器附接至靶室中的氦气出口。

13.用无菌保护网替换靶组织上的封盖。将样品放置进靶室内，保持居中在粒子源下16.5cm，关闭门。

14.打开通向真空源的阀门。当室内真空达到28英寸汞柱时，按下按钮以施加加速气体脉冲，该脉冲将粒子排放进入靶室中。

15.关闭通向真空源的阀门。让空气通过灭菌过滤器慢慢返回至靶室内。打开门，用无菌封盖覆盖样品并从室内移出样品。

16.对于连续的靶板，使用相同的沉淀混合物、过滤器和网重复步骤10-15。

17.在轰击后大约4小时，将愈伤组织块从MSC3Osm转移至MSC3。

18.在射击后两天，将愈伤组织转移至选择培养基上。在该转移过程中，将愈伤组织分成直径约5mm的块，在整个选择过程中每一块保持分离。

19.以2-3周的间隔对愈伤组织块进行传代培养。

20.当愈伤组织块生长至直径约5至10mm(通常是轰击后8至12周)时，转移至光照下的28℃再生培养基上。

21.当再生的苗为30-60mm高具有若干发育良好的根时，将它们转移进盆栽混合物(potting mix)中，保持惯例的警惕防止机械损伤、病原体攻击和干燥作用，直至在温室中确立小植株。

实施例10.大豆胚芽转化

如下所述，用含有可操作地连接至泛素启动子的二聚化结构域序列的质粒轰击大豆胚芽。为诱导体细胞胚，将从大豆栽培种A2872的经表面灭菌的不成熟种子切取的3-5mm长的子叶在适当的琼脂培养基中，在26℃下在光照或黑暗中培养六到十周。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在反复选择作为早期球状阶段的胚繁殖的体细胞胚的簇之后，如下所述维持悬浮物。

大豆胚发生悬浮培养物可在旋转振荡器上在150rpm、26℃下维持在35ml液体培养基中，以荧光灯按16∶8小时白日/黑夜时间表进行维持。每隔两周，通过将大约35mg的组织接种到35ml的液体培养基中，将培养物进行传代培养。

可然后通过粒子枪轰击方法(Klein等人，(1987)Nature(London)327：70-73、第4,945,050号美国专利)转化大豆胚发生悬浮培养物。可使用Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪器(氦改型)进行这些转化。

可用于促进大豆转化的选择性标记基因，是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，(1983)Gene 25：179-188)的潮霉素磷酸转移酶基因和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区所组成的转基因。包含可操作地连接至泛素启动子的二聚化结构域正义序列的表达盒，可作为限制性片段分离。然后可将这个片段***携带标记基因的载体的独特限制性酶切位点中。

向50μl的60mg/ml 1μm金颗粒悬浮液加入(按顺序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl₂(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μl 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μl无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。

将大约300-400mg两周龄悬浮培养物置于空的60×15mm培养皿中，用移液管将残余液体从组织移除。对于每次转化实验，通常轰击大约5-10个板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。

轰击后五至七天，可将液体培养基与新鲜培养基交换，轰击后七至十二天与含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基交换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的转化事件。然后可将这些悬浮物传代培养，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。

实施例11.向日葵分生组织转化

如下所述，用含有可操作地连接至泛素启动子的二聚化结构域序列的表达盒转化向日葵分生组织(另参见第EP 0 486233号欧洲专利(其以引用方式并入本文)和Malone-Schoneberg等人，(1994)Plant Science 103：199-207)。用单小麦头脱粒机(single wheat-head thresher)将成熟的向日葵种子(Helianthus annuus L.)脱壳。将种子在20％Clorox漂白溶液中进行表面灭菌30分钟，每50ml溶液加入两滴Tween20。将种子在无菌蒸馏水中清洗两次。

通过Schrammeijer等人所提出的程序(Schrammeijer等人，(1990)PlantCell Rep.9：55-60)的修改方案，制备***胚轴外植体。在表面灭菌程序后，将种子在蒸馏水中浸60分钟。然后将每个种子的子叶折断，在胚轴的平面产生整齐的断裂。在切除根尖后，将外植体在初叶之间纵向对切。将两半以切面朝上放在GBA培养基上，该培养基的组成为：Murashige和Skoog矿物质元素(Murashige等人，(1962)Physiol.Plant.，15：473-497)、Shepard维生素添加物(Shepard(1980)in Emergent Techniques for the Genetic Improvement ofCrops(University of Minnesota Press，St.Paul，Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-苄基-氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA₃)，pH 5.6和8g/l Phytagar。

外植体在进行农杆菌处理之前先进行微粒轰击(Bidney等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。将三十至四十个外植体放在60×20mm板的中央的圆圈中进行这个处理。将大约4.7mg的1.8mm钨微射弹悬浮在25ml的无菌TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，每次轰击使用1.5ml等分试样。每个板通过150mm nytex屏轰击两次，该屏在PDS 1000粒子加速装置中放置在样品上方2cm处。

在所有的转化实验中使用解除武装的(disarmed)根瘤农杆菌菌株EHA105。如Holsters等人，(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187所述，通过冷冻-解冻将包含含有可操作地连接至泛素启动子的二聚化结构域基因的表达盒的二元质粒载体引入到农杆菌菌株EHA105中。此质粒还包含卡那霉素选择性标记基因(即nptII)。将植物转化实验用的细菌在液体YEP培养基(10g/l酵母膏、10g/l Bacto蛋白胨和5g/l NaCl，pH 7.0)中生长过夜(28℃和100RPM连续搅拌)，该培养基含有细菌菌株和二元质粒维持所需要的适当抗生素。当悬浮液达到约0.4-0.8的OD₆₀₀时进行使用。使农杆菌细胞沉淀并将其以0.5的最终OD₆₀₀重悬于由12.5mm MES pH 5.7、1g/l NH₄Cl和0.3g/l MgSO₄组成的接种培养基中。

将刚轰击的外植体放在农杆菌悬浮液中，混合并让其不受干扰地放置30分钟。然后将外植体转移到GBA培养基，并以切面朝下在26℃下进行共培养18小时。在三天的共培养后，将外植体转移到374B(缺乏生长调节物且蔗糖含量减低为1％的GBA培养基)，该374B补加有250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素。将外植体在选择上培养两到五周，然后转移到缺乏卡那霉素的新鲜374B培养基进行一到两周的连续发育。将具有分化的、耐抗生素的生长区域(未产生适合切除的苗)的外植体转移到含有250mg/l头孢噻肟的GBA培养基进行第二次3天植物激素处理。对得自绿色的耐卡那霉素的苗的叶样品，通过ELISA分析是否存在NPTII，并通过分析分生组织发育的调节(即苗和花分生组织的大小和外观的改变)来分析是否存在转基因表达。

将NPTII阳性苗嫁接到Pioneer

hybrid 6440试管生长的向日葵苗根茎。使经表面灭菌的种子在48-0培养基(半浓度Murashige和Skoog盐、0.5％蔗糖、0.3％gelrite

，pH 5.6)中发芽，并在对外植体培养所描述的条件下生长。移除苗的上部分，在下胚轴中作出1cm垂直切片，并将转化的苗***到切口中。将整个区域用parafilm包裹以对，苗进行保护。在体外培养一周后，可将嫁接的植株转移到土壤。将土壤中的嫁接物维持在高湿度条件下，然后慢慢适应温室环境。在温室中成熟的T₀植株(亲代)的转化部分通过NPTII ELISA和/或通过对叶提取物的二聚化结构域活性分析进行鉴定，而从NPTII阳性T₀植株收获的转基因种子通过对小部分干种子子叶的二聚化结构域活性分析进行鉴定。

另选的向日葵转化方案使得可以不使用化学选择压力就能恢复转基因后代。将种子脱壳并在20％Clorox

漂白溶液中进行表面灭菌20分钟，每100ml溶液加入两到三滴Tween

20，然后用蒸馏水清洗三次。将经灭菌的种子在用水湿润的滤纸上在暗处26℃下吸水20小时。移除子叶和根，将分生组织外植体在374E(由MS盐、Shepard维生素、40mg/l硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.5mg/l 6-BAP、0.25mg/l IAA、0.1mg/l GA和0.8％Phytagar(pH 5.6)组成的GBA培养基)上黑暗培养24小时。移除初生叶以暴露出顶端分生组织，将大约40个外植体以圆形顶部朝上放在374M(含有1.2％Phytagar的GBA培养基)的中央的2cm圆圈中，然后在培养基上在暗处培养24小时。

将大约18.8mg的1.8μm钨粒子重悬在150μl无水乙醇中。超声处理后，取8μl滴在巨载体的表面的中央上。每个板用在第一架子中在26mm Hg的氦枪真空下用650psi保险片(rupture disc)轰击两次。

如之前所述通过冷冻-解冻将目的质粒引入到根瘤农杆菌菌株EHA105中。将在液体YEP培养基(10g/l酵母膏、10g/l Bacto

蛋白胨和5g/l NaCl，pH 7.0)中在50μg/l卡那霉素存在下在28℃过夜生长的细菌的沉淀重悬于接种培养基(12.5mm 2-mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、MES、1g/l NH₄Cl和0.3g/lMgSO₄(pH 5.7))，以达到4.0OD₆₀₀的最终浓度。将经粒子轰击的外植体转移到GBA培养基(374E)，并将一小滴细菌悬浮液直接放置到分生组织的顶部上。将外植体在培养基上进行共培养4天，然后将外植体转移到374C培养基(具有1％蔗糖而不含BAP、IAA、GA3且补加250μg/ml头孢噻肟的GBA)。将小植株在培养基上在16小时白日和26℃温育的条件下培养约两周。

对来自374C培养基中的两星期培养物的外植体(大约2cm长)筛选分生组织发育的调节(即苗和花分生组织的大小和外观的改变)。鉴定了阳性(即二聚化结构域表达的变化)外植体后，弃去未显示二聚化结构域活性的改变的苗，将每个阳性外植体再分成节外植体。一个节外植体含有至少一个潜在的节。将各节段在GBA培养基上培养三到四天以促进从每个节形成腋芽。然后将它们转移到374C培养基并让其再发育四周。分离发育中的芽，在374C培养基上在培养四周。通过适当的蛋白质活性测定法，对来自每个新恢复的苗的集中在一起的叶样品再次进行筛选。此时，从单个节恢复的阳性苗将通常已富集了在节培养之前在初始测定中检测到的转基因部分。

将二聚化结构域表达的改变呈阳性的恢复的苗嫁接到Pioneer

hybrid6440试管生长的向日葵苗根茎。根茎按以下方式制备。将种子脱壳并在20％Clorox漂白溶液中进行表面灭菌20分钟，每100ml溶液加入两到三滴Tween

20，然后用蒸馏水清洗三次。使经灭菌的种子在用水湿润的过滤器上发芽三天，然后将它们转移到48培养基(半浓度MS盐、0.5％蔗糖、0.3％gelrite

，pH 5.0)中，在26℃下暗处生长三天，然后在16小时白日培养条件下进行温育。移除选定的籽苗的上部分，在每个下胚轴中作出垂直切片，并将转化的苗***到V形切口中。将切割区域用parafilm

包裹。在培养基上培养一周后，将嫁接的植株转移到土壤。在前两周，将它们维持在高湿度条件下以使其适应温室环境。

实施例12.农杆菌介导的草转化

可按照Luo等人，(2004)Plant Cell Rep(2004)22：645-652的农杆菌介导转化对草植株进行转化。

材料和方法

植株材料

可使用由Turf-Seed(Hubbard，Ore.)供应的本特草(Agrostis stolonifera L.，cv.Penn-A-4)的市售栽培种。将种子在4℃下保藏备用。

细菌菌株和质粒

使用含有3种质粒中的一种的农杆菌菌株。一种质粒包括pUbi-gus/Act1-hyg构建体，其由驱动含内含子的b-葡糖醛酸酶(GUS)报道基因的玉米泛素(ubi)启动子和驱动潮霉素(hyg)抗性基因的水稻肌动蛋白1启动子组成。另两种pTAP-arts/35S-bar和pTAP-barnase/Ubi-bar构建体是这样的载体，其含有驱动水稻绒毡层特异性反义基因rts(Lee等人，(1996)Int RiceRes Newsl 21：2-3)或核糖核酸酶基因barnase(Hartley，(1988)J Mol Biol202：913-915)的水稻绒毡层特异性启动子，该启动子连接到驱动作为选择性标志物的除草剂抗性的bar基因的花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)或水稻ubi启动子(Huq等人，(1997)Plant Physiol 113：305)。

胚性愈伤组织和农杆菌介导的转化的诱导

用砂纸将成熟种子脱壳，在10％(v/v)Clorox

漂白剂(6％次氯酸钠)加0.2％(v/v)Tween

20(聚山梨醇酯20)中剧烈搅拌下进行表面灭菌90分钟。在无菌蒸馏水中清洗五次后，将种子放到愈伤组织诱导培养基上，该培养基含有MS基础盐和维生素(Murashige和Skoog，(1962)Physiol Plant15：473-497)、30g/l蔗糖、500mg/l酪蛋白水解物、6.6mg/l 3，6-二氯-o-大茴香酸(dicamba)、0.5mg/l 6-苄基氨基嘌呤(BAP)和2g/l Phytagel。将培养基的pH调至5.7，然后在120℃下高压灭菌20分钟。将含有制备的种子外植体的培养板在室温下暗处存放6周。目视选择胚发生愈伤组织，将其在进行共培养之前在新鲜的愈伤组织诱导培养基上室温下暗处进行传代培养1周。

转化

转化过程分为五个相连续的步骤：农杆菌感染、共培养、抗生素处理、选择和植株再生。在进行农杆菌感染前一天，将胚性愈伤组织分成1至2mm的片，放在含有100μM乙酰丁香酮的愈伤组织诱导培养基上。然后将农杆菌悬浮液(660nm处OD＝1.0)的10ml等份试样施加到每片愈伤组织，接着在25℃下暗处进行共培养3天。对于抗生素处理步骤，然后将愈伤组织转移在愈伤组织诱导培养基加125mg/l头孢噻肟和250mg/l羧苄西林(用以抑制细菌生长)上并进行培养2周。随后，对于选择，将愈伤组织转移到含有250mg/l头孢噻肟和10mg/l草胺膦(PPT)或200mg/l潮霉素的愈伤组织诱导培养基保持8周。抗生素处理和整个选择过程都在室温下在暗处进行。选择过程中的传代传代培养间隔通常为3周。对于植株再生，首先将增殖的PPT抗性或潮霉素抗性愈伤组织转移到补加有头孢噻肟、PPT或潮霉素的再生培养基(MS基础培养基、30g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1mg/l BAP和2g/lPhytagel)。将这些愈伤组织在室温下保持在暗处1周，然后转移到光线中2-3周以使苗发育。然后分离小苗，将其转移到含有PPT或潮霉素和头孢噻肟的无激素再生培养基以促进根生长，同时维持选择压力和抑制任何残余的农杆菌细胞。然后将具有发育良好的根的小植株(3-5周)转移到土壤，在温室中或田地中进行生长。

GUS活性染色

通过如Jefferson，(1987)Plant Mol Biol Rep 5：387-405中所述，用1mm5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-葡糖醛酸(X-Gluc，Biosynth，Staad，瑞士)进行组织化学染色，分析转化的愈伤组织中的GUS活性。将从选择存活下来的潮霉素抗性愈伤组织在100μl含有X-Gluc的反应缓冲液中37℃温育过夜。然后通过摄影记录GUS表达。

转基因植株的春化处理和异型杂交

将转基因植株在户外维持在防护苗圃中(3-6个月)，直到十二月冬至为止。然后将经春化的植株转移到温室并在25℃下按16/8h[白日/光线(人造光)]光周期进行保持，在它们周围是非转基因野生型植株，这些野生型植株将它们与其他花粉来源物理分隔。植株在被转移回到温室后，将开始开花3-4周。将它们与来自周围的野生型植株的花粉进行异型杂交。使从每棵单独的转基因植株收集的种子在土壤中25℃下发芽，将T1植株在温室中生长以供进一步分析。

种子测试

测试转基因植株及其后代的PPT抗性

评估转基因植株及其后代对草胺磷(PPT)的耐性，这表示bar基因的功能表达。给苗喷洒两次浓度1-10％(v/v)Finale(AgrEvo USA，Montvale，N.J.)，其含有11％草胺膦作为活性成分。在所有喷洒处理中，在施加Finale

后1周，可清楚区分抗性苗和敏感苗。

统计分析

通过每100个受感染的胚发生愈伤组织回收到的PPT抗性事件的数目，估计给定的实验的转化效率，而再生效率则用每100个尝试过的事件的再生事件数目来确定。平均转化效率和再生效率基于从多个独立实验获得的数据来确定。可使用卡方检验(Chi-square)来确定当与来自未转化的野生型植株的花粉异型杂交时，在T1后代当中所观察到的作为单一基因座的bar基因的遗传的分离比是否符合预期的1∶1比例。

DNA提取和分析

基本上如Luo等人，(1995)Mol Breed 1：51-63所述，从大约0.5-2g的新鲜叶提取基因组DNA。将十微克的DNA用HindIII或BamHI按照供应商说明书(New England Biolabs，Beverly，Mass.)进行消化。将各片段按大小分离通过1.0％(w/v)琼脂糖凝胶，并转印到Hybond-N+膜(Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.)上。将通过限制性消化从pTAP-arts/35S-bar分离的bar基因用作Southern印迹分析的探针。如Sambrook等人，(1989)Molecular cloning：a laboratory manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中所述，用Random Priming Labeling试剂盒(Amersham Biosciences)对DNA片段进行放射标记并将Southern印迹进行处理。

聚合酶链反应

两个被设计用来扩增bar基因的引物如下：5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’(SEQ ID NO：42)，其对应于bar基因的5’末端的附近，和5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAACC-3’(SEQ ID NO：43)，其对应于bar编码区域的3’末端。使用这对引物扩增bar基因应产生出0.44kb的产物。反应混合物(25μl总体积)的组成为：50mm KCl、10mmTris-HCl(pH 8.8)、1.5mm MgCl2、0.1％(w/v)Triton X-100、各200μM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP、0.5μM的各引物、0.2μg的模板DNA和1UTaq DNA聚合酶(QIAGEN，Valencia，CA)。扩增是在Stratagene RobocyclerGradient 96热循环仪(La Jolla，CA)中进行，该热循环仪设定为：94℃1分钟(变性)、55℃2分钟(杂交)、72℃3分钟(延伸)，25个循环，最后延伸步骤在72℃下10分钟。在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶上分离PCR产物，通过用溴化乙锭染色进行检测。

实施例13.植株表征分析-温室

用两个构建体加比较对照进行温室实验。它们都具有35s::BAR作为选择性标志物。Php37407含有S2A PRO::D8 MPL+F3.7 PRO::CESA4+FTM1PRO::DD+NAS2 PRO::DD。Php39175含有S2A PRO::D8 MPL S89T(ALT4)。对于每个构建体，种植了10个事件。预期有相等数目的阳性和阴性植株(每周4株×4周)。由于温室生长条件和随后额外的种植，各样品的结果为：

对于php37407：28株阳性植株来自10个事件，24株阴性同胞植株来自9个事件。

对于php39175：25株阳性植株来自8个事件，29株阴性同胞植株来自10个事件。

对每一株植株进行观察，并记录测量结果。所收集的数据包括：植株高度、叶宽度和叶长度(穗节的叶-2、+2、+4)、中心雄花穗测量值(绝对值和归一化到高度)、花粉囊外露长度、雄花穗评分(1-9：1为极小，无分支；5为平均大小，大约有6个分支，9为极大，有20个或更多个分支)、花粉评分(1-5：低到高，为收集的花粉的测量值，每个单位相当于在0.25英寸宽的装置中0.7″的收集的花粉)和叶计数。

对各植株的最终分析表明，含有二聚化结构域的堆叠的php37407构建体对php39175植株中显示的矮秆基因的表型具有缓和作用。与php39175相比，php37407的植株高度增加8.8％。用php37407中的堆叠，php39175中的矮秆基因的叶宽度的增加和叶长度的减少也得到缓和。在php37407植株中，在穗下方两个节处的叶的叶宽度减少6％，在穗上方两个节处的叶的叶宽度减少4.2％，而在穗上方四个节处的叶的叶宽度减少5.4％。php37407植株的叶长度，在穗下方两个节处和上方两个节处分别增加2.7％和2.8％，而对于在穗上方四个节处的叶没有显示差异。另外，与php39175样品相比，php37407样品的中心雄花穗的绝对长度增加3％。在php37407中，雄花穗长度与高度的百分比降低6.4％，缓和了矮秆基因的作用以增加与植物植株高度相比的相对雄花穗长度。此外，在各样品的代表性子集上，php37407植株的外露花粉囊长度(包括花丝加花粉囊)与php39175花粉囊相比增加9.9％。此外，叠堆的php37407植株中通过温室获得的雄花穗评分指数(1-9)显示9.5％的增加。在各样品的代表性子集上，花粉评分指数(1-5)在各样品之间没有显示差异。php37407和php39175之间叶计数也相似，且发现与它们的阴性同胞植株相比每植株大一个节。总之，php37407植株中基因的堆叠显示了对php39175样品中的矮秆基因表型的缓和作用。缓和矮秆基因的作用包括但不限于：增加植株高度和雄花穗大小、叶长度和花粉囊外露。

实施例14.拟南芥二聚化结构域研究

用含有驱动二聚化结构域(DD)的表达的组成型启动子或组织优选的启动子的构建体转化拟南芥植株生态型。用农杆菌介导的转化方法对植株进行转化，通过除草剂抗性选择阳性转化体。使转基因拟南芥植株在富含营养物的土壤中在温室条件下生长。收集种子以测定转基因植株和对照植株之间产量或产量相关性状的改进。对照植株为含有无所述启动子和二聚化结构域的载体骨架的阳性转化体。有效的转基因事件是那些在正常生长条件下显示产量或种子重量的增加的事件。

含有驱动二聚化结构域的表达的推定叶优选的启动子的转基因植株，与对照植株相比显示大约22％的种子重量增加。

实施例15.根生长分析

将转基因杂合体和野生型分离的种子种植在充满Turface MVP的Custom 200C盆中，然后用含有1mM KNO3或4mM KNO3作为氮源以及含有全部以下其他营养物的营养溶液进行浇灌：

加入84ml H₂SO₄以降低pH。最佳pH为5-5.5。将200ul的营养溶液加到3ml自来水，检查pH，应为5-5.8。如果使用蒸馏水，要用10M KOH提高pH，而不是降低。

^*如果使用Ca⁺⁺浓度在0.5-0.7mM范围的自来水，则将此数量减少到235g。如果将6mM生长与任何其他营养物混合物作比较，则将CaCl₂水平保持在588g/100l。

在这些培养基中生长3周后，通过对从最年轻的最完全扩展的叶的基部获取的至少5个读数取平均值，作出SPAD计测量值。将植株从盆移除，从根部洗掉Turface，并分离成苗和根。将这些样品干燥(70℃下72小时)，将干燥的根与苗分开进行称重。将干燥的苗磨成细粉，用该研磨组织的样品测定总氮。对低和高氮肥力下生长的植株的绿色(SPAD)、总植株重量、苗重量、根重量、根/苗比、苗氮浓度和总氮这些参数进行计算。

植株在较低氮肥力下生长时具有较高的根/苗比。若植株为最小，则用于生长玉米的农学条件具有较高的土壤硝酸盐条件。较高的土壤硝酸盐条件有助于较低的根/冠比，这个根/冠比不有助于根对土壤的大量利用。这些在高或低氮肥力下提高根/冠比的转基因将很可能在生长过程早期利用较大部分的土壤而使植株生长最大化。在较高的氮肥力下根/冠比将较高。

根优选的启动子如NAS2和二聚化结构域(DD)的使用能在发育早期增强根生长。根生长的变化可在用这个基因转化后在植株再生的组织培养阶段检测到，具体而言由准备用于生根的试管中出现更多的根和更大直径的根而检测到(Zhao的参考文献)。表达NAS2：DD的转基因种子预期将具有增强的早期根生长表型，与组织培养实验中观察到的类似。上述测定中的预期的表型将预期能在三周的生长周期结束时产生更大的根干重。转基因植株与非转基因植株相比，在较高的氮条件下改变了的根生长(较高)将特别合乎需要，因为土壤利用能力更大。

实施例16.DD(二聚化结构域)组分与中等矮秆基因(D8MPL)一起使用以改进用于草皮草应用的本特草(Agrostis stolonifera L.)。

玉米中S2a：D8MPL的半矮秆特性可用来改进草皮草物种如本特草(Agrostis stolonifera L.)。具体而言，宽度增加而长度减少的更紧密的叶是合乎需要的，在玉米中观察到的深绿色叶颜色在草皮草中将特别合乎需要。除了S2a：D8MPL所具有的减少的叶长度外，与非转基因本特草相比根还可具有较短的长度。DD显性阴性转基因与根优选的启动子如NAS2的一起使用可在转基因堆叠中进行组合，以相对于在叶中所需的更为紧密的叶表型选择性增加根生长。紧密的叶结构还将在减少维护(割草)方面具有优点，同时所施化肥的数量相似或减少。此外，DD与根优选的启动子或特异性启动子的一起使用，与具有矮苗/叶表型的较小的根的预期相比，将增加相对的根长度和根密度。增加根长度和密度，尤其在植株发育的较早期，将有助于移植生长且还可缓和商业草皮草种植的移植生长和维护的灌溉要求。对于转基因本特草物种的非商业性家庭用途预期有类似的优点—容易移植生长，因为从苗形成根的能力强且维护更有效，体现在需要较少的割草和灌溉来维护所需的地面上草皮草(即深绿色)外观，根更深和更强大以支持叶生长和草皮质量维护。

实施例17二聚化结构域序列的变体

A.不改变所编码的氨基酸序列的二聚化结构域变体核苷酸序列

用二聚化结构域核苷酸序列产生变体核苷酸序列，这些变体核苷酸序列所具有的开发阅读框(ORF)核苷酸序列与相应SEQ ID NO的起始的未改变的ORF核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性。这些功能变体是用标准的密码子表产生。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。这些变体与二聚化结构域形成缺陷性二聚体的能力有关，从而防止对GA的抑制性响应。

B.二聚化结构域多肽的变体氨基酸序列

产生了二聚化结构域多肽的变体氨基酸序列。在这个实施例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过考虑蛋白质比对(与其他直系同源物或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。利用蛋白质比对，可对适当的氨基酸进行改变。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。用这个方法产生了具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。

C.二聚化结构域多肽的另外的变体氨基酸序列

在这个实施例中，产生出相对于参比蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一种尝试需要从比对鉴定保守区域和可变区域并然后审慎应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。

大体上，根据二聚化结构域蛋白当中或其他二聚化结构域多肽当中的保守区域，作出哪些氨基酸序列要进行改变的决定。基于序列比对，二聚化结构域多肽的可能进行改变的不同区域以小写字母表示，而保守区域以大写字母表示。应认识到，可在以下保守区域中作出保守置换而又不改变功能。另外，本领域技术人员将认识到，本发明的二聚化结构域序列的功能变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸改变。

然后产生出与原始蛋白质序列相差在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表5中提供。

表5.置换表

首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。

H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interim number substitution)，以便不造成改变的逆转。名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。

将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与SEQ ID NO：9的起始的未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的二聚化结构域多肽变体。

所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。

已参考了各种具体的和优选的实施例和技术描述了本发明。但是，应理解，在保持在本发明的精神和范围内的前提下可作出许多变化和修改。