CN1202203A - 植物谷胱甘肽s-转移酶启动子 - Google Patents

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Abstract

化学诱导型基因启动子序列,特别是(但非排他的)基于玉米谷胱甘肽S－转移酶27(GST－27)基因的顺式调控元件的化学诱导型基因启动子序列。在推荐实施方案中,该启动子序列操作性地与一个基因或一系列基因连接或融合,由此可以通过应用有效的外源诱导物控制该基因或该系列基因的表达。

Description

植物谷胱甘肽S-转移酶启动子
本发明涉及一种启动子和包含该启动子的构建物。
具体地说，本发明涉及化学诱导型基因启动子序列，特别是(但不是排他的)基于玉米谷胱甘肽S-转移酶27(GST-27)基因的顺式调控元件的化学诱导型基因启动子序列。本发明也涉及包含该化学诱导型基因启动子序列的基因构建物、表达***、植物和启动子/诱导物组合物。
最近分子生物学技术的进展已经导致更好地理解植物启动子。已经识别并使用顺式调控元件将报道基因活性定位于特定的分化细胞类型和植物的特定发育阶段(Drews等，1992；Gurerrero等，1990)。尽管目前有以空间或时间方式调控转基因活性的技术，但在植物中没有很好地建立通过应用诱导化学药品进行导入基因的外部控制。
在细菌、真菌、昆虫和动物细胞培养物中很好地建立了以诱导方式调控基因的能力。对于有效的诱导型调控***而言，在缺乏诱导物时应该为零水平或低水平表达，在用诱导物处理后为高水平表达，而该诱导物对细胞的其它功能没有影响。
尽管已经从植物中分离出大量的诱导型基因(Kuhlemeier等，1987)，但在常规使用中还没有很好定义的诱导型调控***。已经描述了由病原体攻击或环境刺激(包括光、氧气和温度水平)激活的大量基因。尽管这些基因中的一些在分子水平上的特征已经明确，然而由于由环境信号引起的不合理的激活，使得它们不能用于诱导型基因***。
在植物中有许多文献证明在基因转录的激活中涉及化学刺激，包括植物生长调节剂。与环境刺激相比，可以较好地控制这些化合物的应用，然而，由于不需要的基因多效作用，认为它们不能用于诱导型基因***。
最近大量研究已经证明，通过应用外源化学药品，可以达到植物中转基因的控制。这些包括用水杨酸(Williams等，1992)、四环素(Weinmann等，1994)、糖皮质激素(Schena等，1991)和铜离子(Mett等，1993)激活。尽管这些***满足前述的必要条件，并因此具有研究的实用性，但由于所述化学药品不能与目前的农业实践相容，因此它们的使用是有限的。
有潜在吸引力的、在转基因植物的调控基因表达中可能具有实用性的一组化学药品是除草剂防护剂。这些化合物目前用于农业中，功能是主要通过诱导解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(Hatzios，1991)和依赖于细胞色素p450的混合功能氧化(Fonne-Pfister和Kreuz，1990)，选择性地提高某些除草剂的代谢。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是多功能酶，催化谷胱甘肽的巯基与亲脂化合物的亲电性中心结合，导致它们解毒(Mannervik和Danielson，1988)。GST到处存在，已明确地确定了它们在哺乳动物和植物中异生物质代谢中的作用(Lamoureux和Rusness，1989)。
在玉米中发现了表征最好的植物GSTs***，在此它们占可溶性蛋白的1-2％(Timmerman，1989)。在玉米中已经描述了四种同型GST，即GST I(Mozer等，1983；Weigand等，1986)、GST II(Mozer等，1983；Holt等，1995)、GST III(Moore等，1986)和GST IV(Irzyk和Feurst，1993)。GST-27为GST II和GST IV的组分，表现出依赖于防护剂的诱导性。
在我们的国际专利公开WO93/01294中(其内容通过引用结合到本文中)，我们证明控制GST-27的启动子区可以用来达到依赖于防护剂的转基因表达。这些研究揭示，3.8kb GST-27启动子除指导防护剂诱导的转基因表达外，也在根组织中产生组成型水平的表达。
本发明试图通过用详细的启动子分析，提供缺失的GST启动子，它仍保持化学诱导性的优点。在这方面，我们通过利用缺失和对顺式调控元件进行图谱分析，鉴定防护剂反应中涉及的序列。使用这些序列可以增强基因开关性能。例如，一旦鉴定出诱导型表达涉及的顺式元件，则可能例如通过多体化该元件增强诱导性。
有一些已经开发用于植物诱导型启动子***的实例(铜诱导型开关，Mett等，1993)，其中提供诱导性的顺式调控元件已经与基本启动子融合，产生对化学处理起反应的嵌合启动子。在这方面，本发明试图提供一个包含本发明化学诱导型基因启动子序列的嵌合化学诱导型基因启动子序列。
因此，本发明的另一方面是使用顺式元件鉴定诱导型调控中涉及的转录因子。然后可以对转录因子进行操作，以增加诱导性，例如可以通过加入强激活剂(诸如单纯疱疹病毒的VP16区)，对嵌合因子进行加工。
按照本发明的第一个方面，提供包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游的897个碱基对的化学诱导型基因启动子序列。
按照本发明的第二个方面，提供包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游的760个碱基对的化学诱导型基因启动子序列。
按照本发明的第三个方面，提供包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游的570个碱基对的化学诱导型基因启动子序列。
按照本发明的第四个方面，提供包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游的378个碱基对的化学诱导型基因启动子序列。
按照本发明的第五个方面，提供具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第267-332碱基对区序列的化学诱导型基因启动子序列。
按照本发明的第六个方面，提供具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第275-290碱基对区序列的化学诱导型基因启动子序列。
按照本发明的第七个方面，提供具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第267-279碱基对区序列的化学诱导型基因启动子元件。
按照本发明的第八个方面，提供具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第278-288碱基对区序列的化学诱导型基因启动子元件。
按照本发明的第九个方面，提供具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第286-296碱基对区序列的化学诱导型基因启动子元件。
按照本发明的第十个方面，提供具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第320-332碱基对区序列的化学诱导型基因启动子元件。
按照本发明的第十一个方面，提供与以上特定序列或其变异体基本同源的化学诱导型基因启动子序列或元件。
按照本发明的第十二个方面，提供包含一个或多个本发明序列或元件的DNA分子。
按照本发明的第十三个方面，提供包含一个以上拷贝的任一上述特定的化学诱导型基因启动子序列或元件的多体。
按照本发明的第十四个方面，提供包含一个本发明序列或元件的化学开关性基因构建物，该序列或元件操作性地与一个基因或一系列基因连接，由此通过应用有效的外源诱导物可以控制该基因或该系列基因的表达。
按照本发明的第十五个方面，提供一种具有通过转化整合(最好稳定整合)到植物基因组DNA内的按照本发明构建物的植物。
按照本发明的第十六个方面，提供一种启动子/诱导物组合物，其中该启动子为本发明的化学诱导型基因启动子序列或化学诱导型启动子元件。
按照本发明的第十七个方面，提供一种植物表达***，该表达***包含与本发明序列或元件融合的一个基因或一系列基因，其中该表达***能够在植物中表达，并且可以通过应用有效的外源诱导物控制该基因或该系列基因的表达。
按照本发明的第十八个方面，提供一种转基因植物，后者包含一个按照本发明的基因构建物或表达***，其中该构建物或表达***整合(最好为稳定整合)到植物的基因组DNA中。
按照本发明的第十九个方面，提供本发明序列或元件的用途，即当一个基因或一系列基因与该序列或元件融合时，诱导该基因或该系列基因在植物中表达，由此可以通过应用有效的外源诱导物控制该基因或该系列基因的表达。
按照本发明的第二十个方面，提供一种在植物、按照本发明的构建物或表达***中的表达方法，其中该表达系或构建物整合(最好为稳定整合)到植物的基因组DNA中，并且通过应用有效的外源诱导物可以控制该基因或该系列基因的表达。
该化学诱导型启动子序列或元件最好恰好在第II种同型谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基或第IV种同型谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列的转录起始点上游。
该化学诱导型启动子序列或元件最好恰好在玉米谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的转录起始点上游。
编码第II种同型谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基基因启动子的序列最好如图1所示。
该表达***最好包含按照本发明的一种基因构建物。
本发明的一个优选实施方案为化学诱导型基因启动子序列，它基于玉米第II种同型谷胱甘肽S-转移酶27(GST-27-II)基因的顺式调控元件(如图1所示)，或它与图1元件或其变异体基本上同源，其中该启动子序列操作性地与一系列基因连接或融合，由此通过应用外源诱导物，可以控制该基因或该系列基因的表达。
本发明的一个更优选实施方案为化学诱导型基因启动子序列，它基于玉米第II种同型玉米谷胱甘肽S-转移酶27(GST-17-II)基因的顺式调控元件(如图1所示)，或它与图1元件或其变异体基本上同源，并且该启动子元件整合(最好稳定地整合)到植物材料的基因组DNA中，通过应用有效的外源诱导物可以控制一个基因或一系列基因的表达。
术语“植物材料”包括萌芽谷类或幼苗、小植株或植株、或植物组织或植物细胞(例如根、叶和茎中的细胞)。
术语“基本同源”包括就作为化学诱导型启动子提供同源序列的启动子序列或元件而论，至少相对于其基本核苷酸/核苷酸残基的同源性。与本发明化学诱导型启动子序列或元件的同源性优选至少为大约70％，更优选为至少大约80％，甚至更优选为至少大约90％。
关于本发明的术语“其变异体”是指该启动子序列的一个或多个核苷酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或***，只要所得序列起化学诱导型启动子的作用。该术语也包括可以基本上与该启动子序列杂交的序列。
术语“构建物”与诸如“盒(cassette)”、“杂种(hybrid)”和“缀合物(conjugate)”同义，包括直接或间接与该启动子序列或元件连接的一个基因或一系列基因。与本发明有关的术语“融合”亦是如此，它包括直接或间接连接。
术语“表达***”是指上面限定的***可以在适当的生物体、组织、细胞或媒体中表达。在这方面，本发明的表达***可以包含通过使用化学诱导型基因启动子或元件，确保增加该基因或该系列基因表达的额外组分。该术语也包括能够与化学诱导型启动子序列或元件结合的转录因子。
与本发明有关、特别是与本发明萌芽幼苗和植物有关的术语“转基因”不包括在其自然环境下与相关基因或系列基因结合的自然环境下的野生型启动子。因此，该术语包括加入一个基因或一系列基因(对正在讨论的幼苗或植物可能为天然或非天然的)的幼苗或植物，该基因或该系列基因操作性地与本发明化学诱导型基因启动子序列或元件连接。
然后，本发明的基因开关与外源基因连接并通过转化导入植物时，提供一种外部调控该外源基因表达的方法。用于植物细胞转化的方法于本发明没有特别的关系，可以使用适用于靶植物的任何方法。由转化细胞进行再生获得转基因植物。从文献中已知多种转化方法，诸如采用根癌农杆菌或其Ti质粒进行农杆菌感染(agroinfection)、电穿孔、微注射或植物细胞和原生质体、微弹转化，提到的方法只是少数。可以参考文献-已知方法的全部细节。
***化学诱导型序列植物物种与本发明也不是特别重要。可以转化双子叶植物和单子叶植物。本发明可以用于可利用转化方法的任何植物。因此，本发明可以用来控制多种遗传修饰植物中的基因表达，这些植物包括大田作物，诸如canola、向日葵、烟草、甜菜和棉花；谷类，诸如小麦、大麦、水稻、玉米和高粱；水果，诸如番茄、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉和西瓜；和蔬菜，诸如萝卜、莴苣、卷心菜和洋葱。该开关也适用于多种组织，包括根、叶、茎和生殖组织。
由于可以用来得到诱导性的较小元件的鉴定，因此本发明的一个主要优点在于，较小的片断对于载体的研制更为方便。
限定核心元件的另一优点在于，可以将其多体化，以增强防护剂的反应。
使用核心元件的再一优点为，它允许产生防护剂诱导型嵌合启动子。这可以包括组织特异性启动子或发育启动子，然后可以对它进行操作，以成为防护剂增强型。
另一优点为，这一核心元件可以通过突变策略进行优化。
限定一个核心启动子允许通过south westhern筛选分离相应的转录因子。然后可以通过突变或过量表达对该元件进行操作，以达到较高的依赖于防护剂的表达。
可以用一些诸如先前我们国际专利申请WO90/08826(其说明书通过引用结合到本文中)中所示的已知为“除草剂防护剂”的那些化学化合物诱导该启动子，这些化合物可以例如作为喷雾剂喷洒到生长中的植物上。
以下实施例描述GST-27启动子内的除草剂防护剂诱导型顺式调控元件的鉴定。通过启动子缺失、体内足迹、电泳迁移率变化分析、稳定和瞬时报道基因分析的组合，鉴定这些元件。这已经定义了具有多种用途的一些特异性片断和一个特异性核心元件。
现在仅仅通过非限制性实施例并参考附图，描述本发明的多个推荐特征和实施方案，其中：
图1为第II种同型谷胱甘肽S-转移酶的27kD亚基基因启动子序列的核苷酸序列；
图2为质粒pZM/RMS-3的环形图谱；
图3为质粒pZM/RMS-3-S的环形图谱；
图4为表明玉米中pZM/RMS-3和pZM/RMS-3-S诱导性的图表；
图5为表明用防护剂处理对稳定地转化RMS-3-S的玉米的效果；
图6表示质粒pPUG1、pPUG3、pPUG4、pPUG5、pPUG6和pPUG7；
图7表示图6所示的质粒pPUG3至pPUG7的诱导性；
图8表示GST-27启动子底链的体内足迹；
图9表示与麝香石竹GST-1乙烯反应元件互补的玉米GST-27的足迹；
图10表示用于G290足迹的延迟探针(retard probe)；
图11表示采用WT290和MUT290探针的EMSA放射自显影；
图12表示EMSA竞争分析的放射自显影；
图13表示pPUG5突变的瞬时转化分析结果；
图14表示用于GST-27启动子和ERE1的延迟探针的部分序列；
图15表示采用G275的WT探针和MUT探针的延迟；
图16表示采用G2326、G284和ERE的WT探针和MUT探针的延迟；
图17表示一个竞争分析结果，其中冷WT探针与热WT290竞争。启动子的分离
在国际专利公开WO90/01294中描述了GST-27启动子区的分离和表征。总之，采用PCR扩增对应于GST-27 cDNA的3’未翻译区的205bp杂交探针。该PCR产物用随机引物进行32P标记，并用来从1EMBL3(Clontech)的玉米基因组文库(Zea mays cv.W22)中筛选5×106重组子。按照Sambrook等，1989描述的方法进行噬斑纯化。从基因组克隆中分离1EMBL3 DNA，将其用于限制性降解图谱分析和Southern印迹分析。将多个亚克隆构建到包括pG1E7(将3.9 kb EcoR I片断构建到pBS(Stratagene)中)、pG1S15(将2.1 kb Sac I片断构建到pBluescript KS(Stratagene)中)和pG1X3(将2.2 kb Xho I片断构建到pBluescript KS中)在内的质粒载体中。质粒pG1E7于1991年6月14日保藏在国家工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB)中，登记号为NCIMB40426。GST-II-27启动子的核苷酸序列示于图1中。
采用测序酶2.0版(USB)(Sanger等，1977)，通过二脱氧链终止法测定基因组亚克隆的DNA序列。采用380B型ABI DNA合成仪制备寡核苷酸测序引物。采用Intelligenetics分子生物学软件包的PC/Gene和IG程式组分析DNA序列数据。测试转基因玉米植株中GST-27启动子的缺失
在质粒载体的构建中采用标准重组DNA方法(Sambrook等，1989)。使含有pG1E7的GST-27 3.8 kb EcoRI-Nde I 5’侧翼区的报道基因构建物变为平端，将其连接到农杆菌Ti载体pTAK的Sma I位点中(Jefferson等，1987)。位于预测的GST-27翻译起始密码子的Nde I位点在钝化后被破坏。这在pTAK中形成用于与编码b-葡糖苷酸酶(GUS)的大肠杆菌UidA基因融合的便利的点。分离含有3.8kb的GST启动子GUS报道基因和nos终止子的EcoRI片断，将其亚克隆到EcoRI切割的pIJ109中，后者为一种基于pUC19的载体，含有PAT选择性标记盒(CaMV 35S启动子、AdH I内含子、高丙氨酸基甲基膦酸酯(phosphinothricin)乙酰转移酶(PAT)和nos终止子)，形成玉米转化盒pZMRMS3(参见图2)。通过除去1.9kb片断(EcoRI-EagI)，产生含有GST-27启动子的0.9kb缺失构建物pZMRMS3S(参见图3)。
pZMRMS3和pZMRMS3S用来通过轰击胚细胞悬浮液，产生可育转基因玉米植株(Fromm等，1990)。
采用聚合酶链式反应(PCR)，选择携带转基因的植株。制备用于转基因植株PCR分析的基因组DNA。使用Jepson等(1991)描述的条件进行PCR。用对GST-27启动子3’区特异性的引物GSTPCR 5’-CTCCCGTCGACCAAATACACTTGGT-3’和对GUS基因5’部分特异性的GUS115 5’-GGATTCCGGCATAGTTAAAGAAATCAT-3’分析用pZMRMS3和pZMRMS3S转化的植株。
为了确定是否0.9kb片断和3.8kb片断都保持转基因玉米中的诱导型表达，在存在或缺乏防护剂的情况下进行GUS酶分析。或者通过叶涂剂或者通过喷洒在81.5g/L环己酮、3.3g/L synperonic NPE 1800、1.5g/L吐温85中配制的10g/L R-29148，制备由成熟温室植株诱导的组织(16H光/8H黑暗周期)。用底物4-甲基伞形基(umbelliferyl)-D-葡糖苷酸(Sigma)，按照Jefferson等，1987描述的方法进行GUS活性的荧光分析。在用0.2M碳酸钠终止前，于37℃温育2小时，用Perkin-ElmerLS-35荧光计测定荧光。按照生产商建议的步骤，通过Bio-Rad蛋白分析测定组织匀浆液的蛋白浓度。图4和图5证明了pZMRMS3和pZMRMS3S都保留诱导性。GST-27启动子的精细缺失
在转基因玉米植株中产生的初步缺失分析表明，提供诱导性的元件必须恰好位于转录起始点(TSP)上游的900bp内。通过将900bp区的200bp缺失片断与GUG标记基因融合，制备一系列精细缺失的构建物。鉴定出Pst I位点与GST-27启动子转录起始点相邻。设计PCR引物AI2对应于该区(5’TGCCTGCTGCAGCTGCTACTTAT 3’)。引物AI2与4个引物(AI3、AI4、AI5和AI6)结合使用，所有引物都邻接Hind III位点。AI3(5’GTTAAAGCTTCGCAAGTCGCACCCCACTA3’)、AI4(5’CTGAAAGCTTCGGTGCACCGAAT 3’)、AI5(5’GCGGCAAGCTTAATATGTGATGATGATA 3’)和AI6(5’TTACAAGCTTCGCAAGTATCGGTAGGCAT 3’)与AI3一起用于PCR实验中，分别产生217bp、378bp、570bp和760bp的片断。产生的PCR产物用Pst I和Hind III切割，将片断克隆到用Pst I和Hind III切割的pZMRMS3中。所得的载体pUG4、pUG5、pUG6和pGU7示于图6中。
在存在或缺乏防护剂(dichlormid 40ppm)情况下生长的BMS(Black Mexican Sweet)悬浮细胞中，用pPUG载体进行瞬时转化分析。采用碳化硅晶须转化法(Wang等，1994)传递DNA。通过对颜色形成单位计数，记录启动子活性。图7揭示，除一种只含有启动子217bp的构建物(命名为pPUG7)外，所有的pPUG构建物都是诱导型的。含有378bp的构建物(命名为pPUG6)仍提供诱导性。该数据表明，诱导型元件位于转录起始点上游的-217bp和-378bp之间。用体内足迹法对GST-27启动子内的诱导型元件进行图谱分析
体内足迹法(参见下面的方法)用来检测蛋白质与该启动子的相互作用，由此将提供诱导性的元件定位。硫酸二甲酯(DMS)用来通过将N7位置甲基化，体内修饰鸟氨酸残基。如果一种蛋白质与该DNA紧密相联，那么将抑制该反应，因此可以将DNA结合因子涉及的碱基进行图谱分析。在DMS处理后，扩增该DNA并进行测序。在基因组放射自显影上以G残基鉴定接触点，当它与未诱导DNA的泳道相比时，强度较弱。
设计引物，使得可以采用该方法分析-217和-378之间的区域。用防护剂处理一个玉米植株，诱导GST-27的表达。在处理前(0小时)和处理后6小时、24小时和48小时时进行体内足迹分析。结果示于图8中。可以看出，在该植株用防护剂处理后24小时时，一种蛋白与位置-290的G残基结合(无可见条带)，但在处理后0小时、6小时和48小时时没有蛋白结合(可见条带)。在24小时时，位置-275、-283和-284也有较弱的条带。该结果可重复。简单地说，我们已经鉴定了似乎以依赖于防护剂的方式与蛋白因子结合的2个假定元件。
这些元件相互之间具有同源性。此外，有趣是我们注意到同源区与麝香石竹的GST1基因中已知的乙烯反应元件(Itzhaki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.19，8925-8929，1994)互补，如图9所示。玉米叶体内足迹的方案：(由Hammond-Kosack和Bevan，Plant Mol.BioL.Reporter，Vol.11，No.3，Sept.1993修改)1.体内DMS处理1分钟，然后缓慢地释放。5分钟后，除去培养基，该组织在MS培养基中洗涤几次。将该组织吸干并贮存在-70℃下直至所有时间点(0小时、6小时、24小时和48小时)进行收集。2.染色质DNA的制备：
用杵和研钵以及液氮将DMS处理的冷冻组织压碎为细粉。加入30ml热(65℃)抽提缓冲液(100mM Tris HCl pH8.0、50mM EDTA pH8.0、500mM NaCl、1.25％SDS、8.3mM NaOH、0.38g/100ml亚硫酸氢钠)，进行混合，于65℃温育15分钟。加入6.16ml 5M KAc，然后该样品在冰上保持20分钟。以3.5K离心5分钟后，上清液通过Miracloth过滤，加入0.7体积丙-2-醇。以4K离心10分钟，沉淀在70％乙醇中洗涤2次，然后重悬浮于0.84ml T5E和0.36ml 10M NH4Ac中。该溶液以13K离心5分钟。上清液用0.73ml丙-2-醇沉淀。
沉淀在溶于100ml T10E之前再沉淀1次。该DNA用Hind III降解。3.连接介导的PCR(LMPCR)：
用LMPCR扩增该DNA样品。设计3个嵌套引物扩增TSP上游0-350bp之间GST-27启动子的双链。使每条链的第一引物退火，然后让该分子的末端延伸。将一种已知序列的接头退火到每个延伸分子的末端上。然后用一种对该接头和第二嵌套引物特异性的引物进行正常的PCR。当扩增时，用加入末端标记的第三引物标记该DNA分子。样品用苯酚-氯仿抽提，用丙-2-醇沉淀，再悬浮于测序加样缓冲液中。为了目测该足迹，这些样品在6％测序凝胶中电泳。电泳迁移率变化分析(EMSA)：
用该方法测试体内足迹分析区在体外可以结合特异性核蛋白的假设。放射性标记的启动子短片断(探针)将以由其大小和电荷决定的速度通过电泳凝胶迁移。如果一种探针具有与其结合的蛋白，那么迁移将会迟缓。在放射自显影中，这可以作为一个条带可见，在缺乏蛋白的情况下不存在该条带。与冷探针的竞争分析测定结合是否为特异性的。
由诱导和非诱导的玉米叶中制备核蛋白提取物。制备2个短(25bp)探针(参见图10)与该蛋白温育：
1. WT290-覆盖-290和-283/284足迹分析区
2. MUT290-同1一样，但包括-290周围的5bp突变。
结果示于图11中。WT探针结合一种蛋白(第3泳道和第5泳道中的可见条带)。MUT290中的突变消除了结合(在第4泳道和第6泳道中的弱带)。无论核蛋白提取物是来自诱导叶还是来自非诱导叶，该带型都相同。因此，该结合蛋白必定总是存在的。该蛋白在体内必须进行修饰，使得结合仅仅发生在该基因诱导时。图12表示竞争分析结果。冷WT290探针成功地与放射性标记的WT290探针竞争与该蛋白的结合，导致该条带的丧失(第2、3、4和10、11、12泳道)。当加入冷MUT290时没有见到该效果(第6、7、8和14、15、16泳道)。因此所见的结合是特异性的。
除290区外，我们也证明-275区(参见图14)涉及转录因子的结合。图15表示EMSA的结果，其中275探针结合转录因子，而突变的275元件不能结合转录因子。在随后的实验中，284区和326区(参见图14)已经表明涉及与未诱导核提取物和诱导核提取物的蛋白结合(参见图16)。与275区、284区、290区和326区的竞争分析(参见图17)表明，在EMSA研究中观察到的结合是特异性的。下面列出用于EMSA研究中的各种突变探针和野生型探针：
探针名称         序列
290WTN           5 AGCTT GC TATTTCAGAAT GC A3
                      3A CG ATAAAGTCTTC AG TTCGA 5
290MUTN5         5 AGCTT GC TATGGCCTAAT GC A3
                      3A CG ATACCTGATTA CG TTCGA 5
284WTN           5 AGCTT GC GAATCCGAAAT GC A3
                      3A CG CTTAGGCTTTA CG TTCGA 5
284MUTN6         5 AGCTT GC GACGAATCAAT GC A3
                      3A CG CTGCTTAGTTA CG TTCGA 5
275WTN           5 AGCTT GC AATTTCATAAA GC A3
                      3A CG TTAAAGTATTT CG TTCGA 5
275MUTN5         5 AGCTT GC AATGGACGAAA GC A3
                      3A CG TTACCTGCTTT CG A5
326WTN           5 AGCTT GC GGTTCCTAAAA GC A3
                    3A CG CCAAGGATTTT CG TTCGA 5
326MUTN6       5 AGCTT GC GGCGGAAGCAAAGC A3
                    3A CG CCGCTTCGTTT CG TTCGA 5
ERE-WT         5 AGCTT GC TATTTCAAAAT GC A3
                    3A CG ATAAAGTTTTA CG TTCGA 5
ERE-MUT        5 AGCTT GC TATGGTCCAAT GC A3
                    3A CG ATACCAGGTTA CG TTCGA 5
这些数据与体内足迹法数据一起表明，GST-27启动子的该区涉及依赖于化学药品的转录因子的结合，导致基因激活。电泳迁移率变化分析(EMSA)流程：(由Watson和Thompson，Meth.Enzymol.Vol.118，pp.57-75，1986和Holdsworth和Laties，Planta，Vol.179，pp.17-23，1989进行修改)1.由玉米叶制备核蛋白提取物：
将1％R-29148防护剂溶液涂在3周大玉米叶的上表面和下表面上。在0小时和24小时时收获15g材料。用杵和研钵以及液氮将该组织压碎为细粉。将该组织分为2份，每份样品加入70ml抽提缓冲液(0.25M蔗糖、10mM NaaCl、10mM MES-NaOH pH6.0、5mMEDTA、0.15mM精胺、0.5mM亚精胺、0.2mM PMSF、10mMNaF、20mM b-ME、0.1％BSA、0.6％non-idet P40)。匀浆液通过3层Miracloth过滤到corex管中。将25％Percoll垫层加入该管底部。在水平式离心转头中于4℃以3K离心30分钟。由该管底部收集核，再悬浮于抽提缓冲液(不包含BSA)中。该样品于4℃以5K离心5分钟。将核再悬浮于100ml透析缓冲液(40mM KCl、24.7mM HEPES-NaOHpH7.9、5mg/ml亮抑酶肽、5mM EDTA、5mg/ml木瓜蛋白酶抑制剂、1mM DTT、25％甘油、10mMNaF)中。加入1/10体积的硫酸铵，该样品在冰上保持30分钟，然后以13K离心20分钟。将1.5体积的硫酸铵加入上清液中，在冰上保持60分钟，然后以13K离心20分钟。将该样品再悬浮于100ml透析缓冲液中，在该缓冲液中透析2×2小时。用Bradford法分析测定最终样品中的该蛋白浓度。2. EMSA：
1mg蛋白提取物于室温下，与10ml结合缓冲液(250mM HEPES pH7.6、10mM EDTA、50％甘油)中的20000cpm(c.0.5ng)探针(通过采用Klenow，用标记的dNTP填满3’凹进的末端进行标记)、1mg polyd(I-C)、50mM DTT、50mM KCl、100mM MgCl2一起温育20分钟。将样品加到在0.25×TBE缓冲液中电泳的6％聚丙烯酰胺凝胶中。瞬时表达分析
为了测试足迹分析区显示诱导型元件的位置，进行了瞬时分析。通过使假定诱导型元件突变，以防止反式作用蛋白因子的结合，应该丧失诱导性。含有与GUS融合的该启动子570bp的一种构建物(pPUG5)先前表现出保持诱导性。采用锚式PCR在已经进行足迹分析的区域将其突变。制备3个构建物，每个含有10bp突变：
1. MUT290，在G-290周围含有10bp突变
2. MUT284，在G-284周围含有10bp突变
3. MUT326，在G-326周围含有10bp突变
当在48小时见到涉及G325/326令人信服的足迹时，制备MUT326构建物。采用我们的美国专利5,302,523中描述的所谓硅纤维的晶须技术，将构建物转化到BMS悬浮细胞中。结果示于表1中(图13)。突变构建物仍为诱导型。所有构建物的fold诱导比得上WT pPUG5。
根据该结果，在pPUG5中的570bp片断上调查同源性，以鉴定假设元件的任何复制。如果存在多个元件，那么可能见不到突变一个元件的作用。没有发现直接的复制。然而，观察到在该片断内有高度(67％)的同源性。由该数据我们相信，已经发生了涉及150bp的复制和倒位。此外，由于-290和-275足迹分析区显示出显著的同源性，因此在所有三种突变都在同一载体中的情况下，在pPUG6(378bp)背景启动子中重复瞬时分析实验。植物转化载体PCR介导的GST-27启动子的诱变
PCR介导的诱变需要四种引物，下面列出所用的引物：用来在pPUG6中产生3XMUT的引物：R1＝5’CTGAAAGCTTCGGTGCACCGAAT 3’(pAI4)R2＝3’TATTCATCGTCGACGTCGTCCGT 5’(pAI2)M＝5’CCTAAAATTATTTTAAAAATTTTGGTTCTCATATGGACTACGAATCAA
     TGGACGAAATCCAAATAGACCG 3’rev＝3’GGATTTTAATAAAATTTTTAAAACCAAGAGT 5’
引物R1和R2在该启动子每个待突变区域的侧翼，并含有用于克隆的适当酶的限制位点。引物M的5’末端和3’末端与该启动子相同，而中部含有改变的序列。引物rev与野生型引物M的5’末端相同。
在步骤1中，在具有20ng野生型模板质粒、10×PCR缓冲液、2.5μl 2mM dNTPs、2μl 20mM引物R1或M、2μl 20mM引物rev或R2和0.25μl Amplitaq(Perkin Elmer)的25μl体积中进行2次PCR。所用的程序为92℃ 2.5分钟，然后以94℃ 1分钟、50℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行30个周期。每个反应进行4次，以产生足够的产物用于步骤2。纯化和定量分析所得的片断R1/rev和M/R2。
在步骤2中，将共享重叠序列的片断R1/rev和M/R2退火。250ng的每个片断在具有10×PCR缓冲液、2.5μl 2mM dNTPs和0.25μlAmlitaq的25μl体积中混合。采用94℃ 2.5分钟，随后以94℃ 1分钟、40℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行9个周期的程序，进行退火和退火产物的延伸。
在步骤3中，通过加入引物R1和R2，扩增由含有突变的整个启动子序列组成的延伸的异源二聚体。将2.5μl 10×PCR缓冲液、2.5μl2mM dNTPs、2ml 20mM R1、2ml 20mM R2、15.75μl水和0.25μlAmlitaq加入来自步骤2的同一反应中。采用步骤1所用的相同程序进行PCR。纯化所得的片断，将其克隆到pGEM-T载体(Promgea)中，进行测序，以保证突变正确的碱基。3XMUTBin/6在足迹分析的G残基G-290、G-283/284和G-275及其侧翼的核苷酸处含有5bp突变。
采用相似的策略，用下面给出的引物在pPUG6背景中产生4个突变。用来在pPUG6中产生4XMUT的引物：
R1＝5’CTGAAAGCTTCGGTGCACCGAAT 3’(pAI4)
R2＝3’TATTCATCGTCGACGTCGTCCGT 5’(pAI2)
M＝5’GTCTATTCAGGTTCGGGGAAGCAAATTAT 3’
rev＝3’CAGATAAGTCCAAG 5’
采用p3XMUT/PUG6作为模板DNA进行进一步的PCR介导的诱变，以便突变足迹分析的G残基G-325/326和侧翼的四个核苷酸。4XMUTBin/6在足迹分析的G残基G-290、G-283/284、G-275和G-325/326及其侧翼核苷酸处含有5bp突变。
通过用HindIII和PstI切割pGEM-T载体，将突变片断导入GST-27启动子中，并克隆到已用相同的酶线性化的pPUG6中。这样，除去pPUG6中的野生型启动子，用3XMUT或4XMUT版取代，因此产生质粒p3XMUT/PUG6或p4XMUT/PHG6。采用上述用于野生型pPUG6质粒的相同策略，将其克隆到pBin400中，形成3XMUT/Bin6或4XMUT/Bin6。载体的构建
用5个构建物转化烟草植株，所有构建物都基于双载体pBin400(Spychalla和Bevan，1993)。制备与报道基因GUS融合的GST-27启动子的3个5’缺失，后者含有TSP上游启动子的570bp、378bp和217bp。这些缩短的启动子：GUS的融合存在于构建物pPUG5(570bp)、pPUG6(378bp)和pPUG7(217bp)中。从这三个质粒切下HindIII、EcoRI片断上的与GUS融合的缩短启动子，将其直接克隆到用相同的酶线性化的pBin400中。所得的构建物命名为pBin/5、pBin/6和pBin/7。此外转化3XMUT/Bin6和4XMUT/Bin6。农杆菌的转化
在具有50μg/ml硫酸卡那霉素的10ml YEP肉汤(1％(w/v)Bactopeptone[Difco]、1％(w/v)酵母膏[Difco]、0.5％NaCl)中建立根癌农杆菌(T37SE菌株)过夜培养物，于30℃进行生长。用4ml该培养物接种含有50μg/ml硫酸卡那霉素的100ml YEP肉汤，使其生长4-5小时。细胞以2,500rpm沉淀10分钟(Sorvall RC3C离心机，H6000A转头)，再悬浮于2ml YEP肉汤中，在冰上以200μl等份急冷5分钟。将10μl 0.1-0.2μg/ml pBin DNA加入细胞中。将细胞立刻在液氮中冷冻大约15秒，然后37℃热激5分钟。然后加入1ml YEP，细胞于30℃生长1-2小时。将每种转化的100ml等份涂布在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的YEP平板上(具有1.5％(w/v)琼脂的YEP)，以选择农杆菌，涂布在含有50μg/ml盐酸壮观霉素的YEP平板上，以选择双载体。于30℃培养48小时后检查平板。将单个菌落挑到含有选择抗生素的Minimal T平板(350ml水琼脂[1.5％(w/v)琼脂]、20ml 20×盐、20ml20×T缓冲液、20％葡萄糖)上，于30℃生长3天。来自这些平板的细菌菌落用来接种液体培养物，以制备DNA。由根癌农杆菌中制备质粒DNA
用单菌落根癌农杆菌接种含有抗生素以选择双载体和农杆菌的10ml YEP肉汤，于30℃生长过夜。以2,500rpm离心20分钟收集细胞(Sorvall RC3C离心机，H6000A转头)，然后再悬浮于200ml冰冷的溶液I(Horsch等1985)中，让其于室温下静置30分钟，然后进行涡旋混合。加入200ml溶液II，轻轻摇动进行混合，于室温下温育30分钟。然后加入150ml冰冷的溶液III，该混合物在冰上保持5分钟。该样品以13,000rpm离心5分钟(MSE Microcentaur台式微量离心机)。用等体积苯酚/氯仿抽提上清液，然后进行IPA沉淀。将沉淀再悬浮于50mlT10E1中。加入1ml 1mg/ml RNA酶A降解RNA，然后于37℃温育30分钟。10微升该DNA用于限制酶降解，通过琼脂糖凝胶电泳证实双质粒的鉴定。烟草的转化
采用Horsch等(1985)开发的方法转化烟草。含有双载体构建物的农杆菌在转化前，于30℃在含有适当抗生素的YEP肉汤中生长24小时。通过于室温下以3,000rpm离心20分钟沉淀细胞(Sorvall RC3C离心机，H6000A转头)，再悬浮于10ml新鲜的YEP中。用穿孔器(7mm)从烟草Samsun变种的叶切下叶盘，转移到14cm陪替氏培养皿中。将农杆菌加入陪替氏培养皿中，于室温下放置30分钟。在开始实验前，制备饲养平板。40个平板需要1升NBM培养基(4.6g MS盐[FloWLaboratories]、30g蔗糖、0.1mg EtOH NAA[Sigma]、0.1mg BAP[Sigma]、8g琼脂[Difco]、100×B5 VITS，pH5.9)。将1ml烟草细胞悬浮培养物均匀地涂布在平板表面上，然后覆盖一个无菌的9cmWhatman 1号滤纸圆片。将叶盘转移到饲养平板上，下表皮在最上面。与农杆菌共培养2天后，将叶盘转移到含有100g/ml硫酸卡那霉素和500μg/ml羧苄青霉素钠盐的NBM平板上，以便消除农杆菌和选择转化体。每2周将叶盘转移至含有抗生素的新鲜NBM平板上。大约4周后，在叶盘上可见到小芽。将这些小芽转移至含有200μg/ml羧苄青霉素钠盐和100μg/ml硫酸卡那霉素的MA培养基(4.6g MS盐、30g蔗糖、8g琼脂，pH5.9)中。在大约14天后转化体生根，而未转化的植株黄化并死亡。当将转化植株移植生长时，将它们转移至土壤中，在温室中生长。
不偏离本发明范围的本发明的其它修改对本领域技术人员是显而易见的。参考文献
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Claims (24)

1.一个化学诱导型基因启动子序列，包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基基因启动子序列的转录起始点上游的897碱基对。
2.一个化学诱导型基因启动子序列，包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基基因启动子序列的转录起始点上游的760碱基对。
3.一个化学诱导型基因启动子序列，包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基基因启动子序列的转录起始点上游的570碱基对。
4.一个化学诱导型基因启动子序列，包含恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基基因启动子序列的转录起始点上游的378碱基对。
5.一个化学诱导型基因启动子序列，具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第267-332碱基对区的序列。
6.一个化学诱导型基因启动子序列，具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第275-290碱基对区的序列。
7.一个化学诱导型基因启动子元件，具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第267-279碱基对区的序列。
8.一个化学诱导型基因启动子元件，具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第278-288碱基对区的序列。
9.一个化学诱导型基因启动子元件，具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第286-296碱基对区的序列。
10.一个化学诱导型基因启动子元件，具有恰好在谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基的基因启动子序列转录起始点上游第320-332碱基对区的序列。
11.按照任一前述权利要求的化学诱导型基因启动子序列或元件，其中该序列或元件恰好在玉米谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基基因启动子序列的转录起始点上游。
12.按照任一前述权利要求的化学诱导型基因启动子序列或元件，其中第II种同型谷胱甘肽S-转移酶27kD亚基基因启动子序列示于图1中。
13.化学诱导型基因启动子序列或元件，与权利要求1-12任一项的序列或元件或其变异体基本同源。
14. DNA分子，包含一个或多个权利要求1-13任一项的序列或元件。
15.权利要求8-13任一项的序列或元件的多体。
16.包含权利要求1-15任一项的序列或元件的基因构建物，该序列或元件操作性地与一个基因或一系列基因连接，由此通过应用有效的外源诱导物可以控制该基因或该系列基因的表达。
17.一个植物，具有通过转化整合(最好稳定整合)到植物基因组DNA中的权利要求16要求保护的构建物。
18.一个启动子/诱导物组合物，其中该启动子取决于权利要求1-6时，为权利要求1-6和11-13任一项要求保护的化学诱导型基因启动子序列；或当取决于权利要求7-10时，为权利要求7-10和11-13任一项要求保护的化学诱导型启动子序列元件。
19.植物表达***，该表达***包含与权利要求1-15任一项要求保护的序列或元件融合的一个基因或一系列基因，其中该表达***能够在植物中表达，并且通过应用有效的外源诱导物可以控制该基因或该系列基因的表达。
20.按照权利要求19的表达***，包含一个按照权利要求16的构建物。
21.一个转基因植物，包含按照权利要求16的基因构建物或按照权利要求19或权利要求20的表达***，其中该构建物或该表达***整合(最好稳定地整合)到该植物的基因组DNA中。
22.按照权利要求1-15任一项要求保护的序列或元件的用途，即当一个基因或一系列基因与该序列或该元件融合时，在植物中诱导该基因或该系列基因的表达，由此可以通过应用有效的外源诱导物控制该基因或该系列基因的表达。
23.在植物中表达按照权利要求16的构建物或按照权利要求19的表达***的方法，其中该表达***或该构建物整合(最好稳定地整合)到植物材料的基因组DNA中，由此通过应用有效的外源诱导物可以控制该基因或该系列基因的表达。
24.基本上同以上图1、图2、图3、图6或图14所述一样的启动子、构建物或表达***。
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