本申请要求享受两项美国临时申请的35USCξ119(e)保护,这两项申请号分别是60/023,040(1996年8月2日提交)和60/039,959(1997年3月7日提交)。
优选实施方案的详细描述1.反义序列和核酶
本发明提供了能抑制核糖核苷酸还原酶蛋白质表达进而调节细胞增殖的化合物。这种化合物可通过抑制基因转录或mRNA翻译成蛋白质而抑制核糖核苷酸还原酶的表达。其可包括反义寡核苷酸和核酶。
此处所用术语“反义寡核苷酸”是指与其靶互补的核苷酸序列。术语“寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和内糖(骨架)键组成的核苷酸单体、寡聚体或多聚体。此术语也包括被修饰或取代的寡聚体,其包括功能相似但非天然存在的单体或其部分。这种被修饰或取代的寡核苷酸,由于其性质如细胞吸收提高或在核酸酶存在下稳定性增强而比天然存在的形式更为优选更实用。此术语也包括含有两个或两个以上化学不同区域的嵌合寡核苷酸。例如嵌合寡核苷酸可含有至少一个赋予有益特性的修饰过的核苷酸(如,酶降解抗性增加和细胞吸收能力提高),或是两个或两个以上本发明寡核苷酸结合形成的一个嵌合寡核苷酸。
本发明中的反义寡核苷酸可指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸,且可包含天然存在的碱基包括腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶和尿嘧啶。寡核苷酸也可含有被修饰的碱基如黄嘌呤,次黄嘌呤,2-氨基腺嘌呤,6-甲基、2-丙基和其它烷基腺嘌呤,5-卤代胞嘧啶,5-卤代尿嘧啶,6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶,假尿嘧啶,4-硫代尿嘧啶,8-卤代腺嘌呤,8-氨基腺嘌呤,8-硫代腺嘌呤,8-硫代烷基腺嘌呤,8-羟基腺嘌呤或其它8-取代的腺嘌呤,8-卤代鸟嘌呤,8-氨基鸟嘌呤,8-硫代鸟嘌呤,8-硫代烷基鸟嘌呤,8-羟基鸟嘌呤或其它8-取代的鸟嘌呤,其它氮杂和脱氮尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤,5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。
本发明中的其它反义寡核苷酸可包含在磷酸骨架上、短链烷基或环烷基糖间(intersugar)键或短链杂原子或杂环烷基糖间键上,含有被修饰过的磷、氧杂原子。例如,反义寡核苷酸可含有硫代磷酸酯,磷酸三酯,甲基磷酸酯或二硫代磷酸酯。在本发明的一个实施方案中在3′末端4-6碱基之间连接有硫代磷酸酯键。另一个实施方案中是用硫代磷酸酯键连接所有的核苷酸。
本发明的反义寡核苷酸也可以包含可能更适合用作治疗或实验试剂的核苷酸类似物。核苷酸类似物的一个例子是肽核酸(PNA),其中DNA(或RNA)中脱氧核糖(或核糖)磷酸键被与肽中的键相似的聚酰胺键所取代产生(P.E.Nielsen等人,科学Science,1991,254,1497)。PNA类似物能耐受酶降解,具有很长的体内和体外寿命。由于PNA链与DNA链之间没有电荷排斥,PNA能与互补的DNA序列有很强的结合。其它寡核苷酸可包括具有聚合物骨架、环状骨架或开链状骨架的核苷酸。例如,核苷酸可含有吗啉代骨架结构(美国专利No15,034,506)。寡核苷酸还可有象报告基团一样的基团(用于改善反义寡核苷酸的药代动力学性质的基团),或用于改善反义寡核苷酸药物动力学性的基团。反义寡核苷酸还可含有糖类似物。
筛选表现出最小的二聚体形成、自身互补相互作用以及与靶序列以外的核糖核苷酸还原酶mRNA结合的可能性之反义寡核苷酸。这些性质可通过计算机模拟程序OLIGO引物分析软件(3.4版,NationalBioSciences)进行测定。这个程序可对上述三个参数进行定性测定并指出“无可能”,“有一定可能”或“基本上完全可能”。如表7和11所述,所选的寡核苷酸的这三个参数优选的应评估为“无可能”或“有一定可能”,最优选的为“无可能”。筛选寡核苷酸,以使它们的功能基本上不受任何修饰或取代影响。
本发明的反义寡核苷酸优选地与核糖核苷酸还原酶基因的mRNA区域互补。更优选地,该反义寡核苷酸与核糖核苷酸还原酶R2基因的mRNA区域互补。
一般来说,反义寡核苷酸至少含有七个核苷酸或核苷酸类似物,更优选的含有至少20个核苷酸或核苷酸类似物,最优选的含有30-35个核苷酸或核苷酸类似物。如本发明优选的反义寡核苷酸序列列于表11和7。它们是SEQ.ID.NOS.1-102和SEQ.ID.NOS.103-161.更优选的反义寡核苷酸见表12。最优选的寡核苷酸为SEQ.ID.NOS1,2, 12,16,18,21,25,29,34,42,44,45,46,52,53,59,60,64,65,66,68,69,70,72,73,74,76,78,79,80,90,91,92,96,99,100和102,如表7所示。
本发明的反义寡核苷酸优选地可通过常规的和周知的技术制备。例如,可以使用固相合成特别是使用已经商品化的设备如AppliedBiosystems生产的装置制备寡核苷酸。人们也优选地纯化合成的寡核苷酸以排除可能干扰其活性的因素。本发明的寡核苷酸也可通过基因互补技术或使用本文所描述的探针进行鉴定。本领域普通技术人员均周知制备被修饰的或取代的反义寡核苷酸。
核酶序列也能被用于调节细胞增殖。它含有与本发明的反义寡核苷酸同源或互补序列,且含有用于切断寡核苷酸的必需催化中心。本发明所使用的核酶类型可选自本领域周知的类型。几种已被鉴别的核酶结构家族包括GroupⅠ内含子、RNaseP、丁型肝炎病毒核酶、锤头核酶和从烟草环型病毒卫星RNA(sTRSV)的阴性链衍生出来的发夹状核酶(Sullivan,1994美国专利No.5,225,347,卷4至5)。后两种家族是从类病毒和拟病毒中产生,据信该核酶是用来分离在滚环复制中的寡聚体的单体形式(Symons,1989和1992)。锤头核酶和发夹状核酶通常经改造以用于基因治疗中mRNA的反式切割(Sullivan,1994)。现在已在临床上试用的发夹状核酶优选地用于本发明。一般该酶长度从30到100核苷酸。2.评价化合物的方法
此项发明设计了一种评价化合物是否抑制核糖核苷酸还原酶基因转录或翻译并进而调节(即减低)细胞增殖的方法,其包括用一种表达载体转染细胞,该表达载体包含编码核糖核苷酸还原酶的核酸序列和该核酸转录或翻译必需元件;加入待测的化合物;然后用核糖核苷酸还原酶的表达水平与不含待测化合物的对照中所得的水平加以比较。
含有编码核糖核苷酸还原酶的核酸序列的表达载体可通过用本领域已知的有关基因序列的方法而建立。合适的转录或翻译元件可来自多种来源,包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫的基因。合适元件的选择取决于被选用的宿主细胞,可由本领域普通技术人员容易地完成。
报告基因的例子是指编码蛋白质如β-半乳糖苷酶(如lacZ)、氯霉素、乙酰基转移酶、萤火虫萤光素酶或免疫球蛋白或其部分的基因。通过测定报告蛋白质如β-半乳糖苷酶等浓度变化可监测报告基因的转录。因而可通过观察和分析重组分子的表达来决定一种物质对核糖核苷酸还原酶基因表达的影响。
适于进行本发明的宿主细胞包括CHO、COS、BHK、293和Hela细胞。转染哺乳动物细胞的方法已被本领域所熟知,其中包括磷酸钙介导的电穿孔法,逆转录病毒法和原生质体融合介导的转染方法。
本发明发现R2与Raf-1和/或Rac-1相互协同作用并籍此影响Ras信号传导途径,因此本发明还设计了评价一种化合物调节Ras信号传导途径能力的方法,其通过分析R2与Raf-1和/或Rac-1相互作用的激动剂或拮抗剂(即:刺激剂或抑制剂)进行。评价一种化合物是R2与Raf-1和/或Rac-1相互作用的激动剂或拮抗剂的基本方法是,在适合R2与Raf-1和/或Rac-1相互作用的条件下制备一种含有R2与Raf-1和/或Rac-1的反应混合液。被测化合物可在开始时或在加入R2与Raf-1和/或Rac-1后加入此反应混合液。同时制备一种不含被测化合物或带有对照物的对照反应混合液。测定信号传导途径的活化或复合物形成。如果仅在对照品中有传导途径的活化或复合物形成,则表明此化合物干扰R2与Raf-1和/或Rac-1的相互作用。这种反应可在液相中完成,或者R2与Raf-1和/或Rac-1或者被测化合物可被固定化。
本发明也可筛选抑制R2与Raf-1和/或Rac-1相互作用之激动剂的作用的拮抗剂。因而本发明也可用于鉴定竞争R2同一结合位点的化合物。
本发明还设计一种鉴定能与同R2相互作用的蛋白质结合,进而抑制R2的化合物的方法。蛋白质之间相互作用可通过传统的方法如共免疫沉淀、交联和使用梯度或色谱柱共纯化方法进行鉴定。也可使用其它可同时鉴定编码与R2相互作用的蛋白质的基因的方法。这些方法包括用标记的R2探查表达文库。
双杂交***也可被用于体内测定蛋白质相互作用。一般来说,要先建立编码两种杂合蛋白质的质粒。第一个杂合蛋白质由与R2融合的转录激活蛋白的DNA结合结构域组成,第二个杂合蛋白质由与未知蛋白质融合的转录激活蛋白激活结构域组成。未知蛋白质被一种重组入作为cDNA文库的一部分的质粒cDNA编码。然后质粒被转化入一株含有报告基因(如lacZ、萤光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)的酵母中(如S.cerevisiae),此报告基因的调节区域含有转录激活蛋白的结合位点。杂合蛋白质单独不能激活报告基因的转录,但是二杂合蛋白质相互作用可重构有功能的激活蛋白进而导致报告基因的表达,这可通过分析报告基因产物测定。
可以推断融合蛋白质能用于上述方法。特别是融合于谷胱甘肽S转移酶的R2可用于此方法。
用本发明所确定的化合物包括但不仅局限于肽,如可溶性肽,其包括具有Ig加尾的肽,随机肽库成员和用组合化学衍生出的由D和/或L构型氨基酸组成的分子文库,磷酸肽(包括随机或部分简并的和直接磷酸肽文库的成员),抗体(如多克隆的、单克隆的、人源化的、抗独特型的,嵌合的、单链抗体、片段(如Fab,F(ab)2和Fab表达文库片段及其表位结合片段),和小的有机或无机分子。这些化合物可以是内源生理性化合物,也可为天然或合成的化合物。
适于应用本发明中的各种方法以评价调节R2与Raf-1和/或Rac-1相互作用化合物的试剂可被包装入方便的药盒,其能提供装在合适容器中的必需材料。这种药盒还可包括应用本发明的方法所需要的合适支持物。
这里描述的应用本发明方法确定的化合物和其它R2表达抑制剂(如反义R2序列)可被用来调节Ras信号传导途径。特别是指那些被用来抑制Raf-1和/或Rac-1信号传导性质、抑制细胞增殖、改变细胞周期和下调自身免疫病病人免疫反应的化合物。在本发明的一个实施方案中,这些化合物具有抗癌基因或肿瘤抑制活性。3.调节细胞生长或转移的方法及组合物
用本发明中的方法确定的反义寡核苷酸、核酶和化合物调节细胞增殖,特别是肿瘤细胞增殖。因此,提供了干预细胞增殖,优选地肿瘤细胞增殖的方法,包括用一种或多种本发明的方法确定的寡核苷酸、核酶和化合物与组织或细胞接触。优选地施用如表7、11或12所列的反义寡核苷酸。
术语“接触”一词指将反义寡核苷酸、核酶等以液相载体中的形式加入到细胞悬浮液或组织样品中,或指直接或间接地将寡核苷酸施予动物体内的细胞或组织。
这些方法可用以治疗增生性疾病,例如各类癌症,如白血病,淋巴瘤(何杰森氏和非何杰森氏病),肉瘤,黑素瘤,腺瘤,实体组织瘤,乏氧肿瘤,口、咽、喉和肺部的鳞状细胞癌,泌尿生殖道癌,如宫颈和膀胱癌,造血细胞癌,大肠癌,乳腺癌,胰腺癌,头颈部癌和神经***癌。良性损伤如***状瘤,关节硬化症,牛皮癣,原发或继发的polythemia,肥大细胞增生病,自身免疫疾病,血管生成疾病,细菌感染和病毒感染,如艾滋病毒感染,肝炎和疱疹病毒感染。
用本发明的方法确定的反义寡核苷酸、核酶以及化合物也可用于治疗耐药性肿瘤。耐药性肿瘤的例子有如对羟脲耐药的肿瘤;表达高水平P-糖蛋白质的肿瘤(已公认P-糖蛋白质赋予多种抗癌药物,如秋水仙素,长春花碱和阿霉素的耐药性),或者那些表达多药抗药性蛋白质的肿瘤,如R.Deeley等所述(科学258:1650-1654,1992)。
已经发现本发明的反义寡核苷酸抑制肿瘤转移。在本发明的一个实施方案中,提供减少肿瘤转移的方法包括,给予治疗对象一定量的本发明的反义寡核苷酸可以有效地抑制肿瘤转移。优选的是SED.ID.NOS1-102或SEQ.ID.NOS.103-161中所列出的反义寡核苷酸序列,最优选的是列入表12中的序列。
可检测所选反义寡核苷酸、核酶和化合物调节特定的体内和体外实验***中的细胞(特别是肿瘤细胞)生长或抑制肿瘤转移的能力。
在治疗应用中,用本发明的方法确定的反义寡核苷酸、核酶和化合物可以制成药物组合物。这些药物组合物可含有一种或多种用本发明的方法所确定的反义寡核苷酸、核酶和化合物,以便用于向患者以生物可接受的方式施用。本发明的组合物意在用于人类和多种其它哺乳动物,如羊、牛、马、猪、犬和猫。
根据治疗的区域以及局部或***性治疗,本发明的药物组合物可以不同的方式给药。组合物可以如口服、皮下或肠道外给药(包括静脉、动脉内、肌内、腹膜腔内注射),或鼻腔内给药,还可以根据恶性细胞的治疗需要采取鞘内或持续输注给药。对于在中枢神经***内输运,可用如Ommaya药池或其它本领域已知的方法进行鞘内给药。药学可接受的载体、稀释剂、佐剂和载体以及植入性载体、稀释剂,一般指那些情性、无毒性的固体或液体填充剂、稀释剂或不与本发明的活性物质反应的包装材料。组合物中也可包括阳离子脂类(如Lipofectin,Life Technologies),以促进寡核苷酸的吸收。化合物内植体也可应用。一般说来,药物组合物应是无菌的。
本发明的寡核苷酸和核酶也可以由病毒或非病毒载体来输运。这些序列可以整合入表达盒或构建体中去,以便本发明的反义寡核苷酸或核酶可以在细胞内表达。一般这种构建体含有适当的允许寡核苷酸或反义寡核苷酸在细胞中转录的转录控制区。
因此,本发明提供了含有有效地连接到编码本发明的反义寡核苷酸或核酶的序列上的转录控制序列的载体。本发明还进一步提供了宿主细胞,它们选自于合适的用这些载体转化的真核或原核细胞。这些转化的细胞促成了本发明对恶性细胞的功能和调控的研究和本发明的治疗的研究。
载体为已知或可由本领域普通技术人员构建。载体应含有取得期望的序列转录所必需的所有表达元件。这些载体也可有其它有利的特性,比如以不同形式回收核酸的机制。噬菌粒就是这种有利载体的一个特殊例子,因为这种载体既可用作质粒又可用作噬菌体载体。其它载体的例子包括病毒,如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒、DNA病毒、脂质体和其它重组载体。这些载体也可包含用于原核或真核宿主细胞的元件。本领域普通技术人员知晓何种宿主***与特殊载体可以匹配。
用任何一种本领域已知的技术都可以将载体转入细胞或组织。这类方法可从以下书目所述中找到。Sambrook等所著的《分子克隆,实验室手册》(冷泉港试验室,纽约1989和1992),Ausubel等所著的《当今分子生物学技术》(John Wiley and Sons,Bultimore,Maryland,1989),Chang等所著的《体细胞基因治疗》(CRCPress,AnnArbor,MI,1995),Vega等所著的《基因打靶》(CRC Press,Ann Arbor,MI,1995),《载体:分子克隆载体及其应用大全》(Butterworths,Boston,MA,1988),和Giloa等。且包括稳定的或瞬时转染、Lipofection、电穿孔和用重组病毒载体感染细胞。
用感染法导入核酸有几个益处。因为这种感染具有自然特性,因而感染的效率较高。此外,病毒非常特化且一般仅在特定细胞类型中感染和增殖。因此其天然特异性可被用于将载体定向于体内特定的细胞类型或定向于在一种组织或混合培养物中的细胞。病毒载体也可用特异的受体或配基来修饰,以通过受体介导的事件来改变定向特异性。
还可向载体添加额外的特性以确保其安全性和/或增加其治疗功效。这种特性包括如,可用于针对用重组病毒感染的细胞负性筛选的标记。这种负性筛选的标记的一个例子为TK基因,其赋予对抗病毒药物9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(gancyclowir)的敏感性。由于它通过抗生素的加入提供了可诱导的***,因此负性筛选是一种控制感染的方法。这种保护特性确保了例如当出现了生产变异形式的病毒载体或序列的突变时,不会发生细胞转化。所述特性也可包括限制表达于特定细胞类型的特性。这种特性包括如特异性用于期望的细胞类型的启动子和调控元件。
重组病毒载体是另一个用于在体内引入所需核酸的例子,因为这种载体具有侧面感染(lateral infection)和目标特异性等优点。侧面感染是如逆转录病毒生命循环中固有的,籍此单一感染的细胞产生很多子代病毒粒,然后其子代病毒粒生长并感染邻位细胞。其结果能造成大面积快速感染,而大多数感染不是被原始病毒粒感染的。这种过程与仅通过子代体传播感染的垂直型病毒感染相反。也能生产不能进行侧面扩散感染的病毒载体,这种特性对如果想仅引入一个特定基因到目标细胞的附近部位是很有用的。
本发明的方法所用的载体可依赖于所期望定向的细胞类型进行选择。例如如果要治疗乳腺癌,应该选用对这种上皮细胞特异性的载体。相似地,如果治疗造血***细胞,则应该选用对血液细胞和它们的前体特异性的病毒载体,优选地采用对于特定类型的造血细胞特异性的病毒载体。
逆转录病毒载体可被构建成感染性颗粒或构建成仅能单次首次感染。在前一种情况下,病毒基因组被修饰以保留了合成新一代病毒蛋白质或RNA所需的所有必需基因、调控序列及装配信号。一旦合成这些分子,宿主细胞会将RNA包装入新一代病毒颗粒中,其具备进行新一轮感染的能力。对载体基因组进行改造是为了能编码和表达所需的重组基因。就非感染性病毒载体而言,通常突变载体基因组来破坏病毒包装信号,因为这些信号为RNA装配入病毒颗粒所必需。没有这种信号,任何形成的颗粒都不含基因组,因而也不能进入下一轮的感染。特殊类型的载体可按使用需要构建。实际所用载体已公知并为本领域可得或可使用公知技术由本领域技术人员构建。
举例来说,如果使用病毒载体,其靶向特异性有利于操作程序,因此不必将载体局部施用于患病的位点。然而,局部应用也许更迅速有效。也可用其它的施用方式如静脉或皮下注射给药。将病毒载体注入脊髓液也是一种施用方式。注射之后,病毒载体将在体内循环直到识别带有合适的用于感染的靶向特异性宿主细胞。
转染载体如脂质体也可被用于将以上所述的非病毒载体引入到接种区中的受体细胞中。这种转染载体已被本领域技术人员所熟知。
本发明的药物组合物和载体可以按照良好的医疗实践和本领域公知的治疗模式单独施用或与其它药物联合使用。可与本发明的组合物联合施用的其它药物的例子有细胞毒药物、免疫毒素、烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素和其它抗肿瘤药物。
反义寡核苷酸、核酶和化合物的剂量将取决于所治疗疾病的严重性和反应性,其治疗时间可从数天到数月直到获得疾病改善。通过测定药物在体内积累可计算出最佳给药时间间隔。本领域普通技术人员可方便地确定最佳剂量、给药方式和给药时间间隔。最佳剂量可根据每个寡核苷酸的相对强度而改变,其一般取决于体外和体内动物实验的ED50值。本发明的药物组合物或载体及联合用药可以细胞毒性或无细胞毒性的剂量服用,或一种药物在细胞毒性剂量下而另一种药物在无细胞毒性剂量下服用。其剂量选择决定于其能否产生协同效果。
实施例
实施例通过转基因技术对失去调节的R2表达细胞的肿瘤相关特性进行了分析。R2过度表达导致经活化的H-ras转染的鼠成纤维细胞转化灶形成的频率增高。此外,ras转化的细胞中,重组R2表达导致在软琼脂上集落形成效率增加,且在体内明显增强其致癌及转移潜能。此外,失去调节的R2表达还与其它癌基因,如rac-1在转化机制上有协同作用。
这里陈述的结果首次证明,哺乳动物核糖核苷酸还原酶R2组分是癌决定因子,它可与活化的癌基因协同作用从而改变其致癌潜能;且支持如下模型:即由于失去调节的R2表达引起主要的Ras途径发生变化,从而介导了上述致癌作用。观察结果还表明,R2也参与其它重要的细胞功能,并通过与癌基因的协作而对确定致癌潜能起直接作用。
这些实施例也证明,寡核苷酸还原酶R2基因表达在决定药物敏感特性上也起重要作用,这一效应至少部分是借助参与基因组稳定性的机制实现的。
由于R2异常表达而改变药物敏感特性的机制并不要求野生型p53功能的丢失或突变型p53的直接参与,虽然由p53调控途径的下游遗传事件有可能参与。正如实施例1中所示,R2表达增加与ras途径活化有关,涉及Raf-1蛋白质和促***原活化的蛋白质激酶-2(MAPK)活性。在Balb/c3T3和NIH-3T3细胞中,重组R2基因的表达明显增加Raf-2蛋白质的活化以及促***原活化的蛋白质激酶(MAPK)活性。
对上述观察结果能够提出一个假设而不意在将本发明局限于这种作用模式。这些观察提示,蛋白质R2除了作为核糖核苷酸还原中的限速成分外,还具有作为MAPK途径中信号分子的能力。诸如C-myc基因产物的一些转录因子是MAPK途径的下游目标,它们控制例如在细胞周期的多个关键环节起重要调节作用的细胞周期蛋白质A、D和E的表达(Hunter,1994;1995)。对细胞周期中关键环节控制的破坏,会加速基因组的不稳定性并促进DNA扩增(Kohn,1996;Livingston等人,1992)。C-myc过度表达与DHFR介入的基因扩增机制有直接关系(Mai,1994)。这些观察结果提示,由于异常R2表达所致的MAPK途径变化可至少对观察到的药物敏感性和基因组完整性的改变起部分作用。
实施例3证明,针对R1和R2组分的短反义序列具有抗肿瘤活性并对肿瘤细胞有细胞毒性。此外,R2反义序列也可与公知的化疗药物协同作用。极低浓度(无毒性)的短反义序列可降低肿瘤细胞对化疗药物如N-(膦乙酰)-L-天冬氨酸(PALA)、氨甲喋呤和羟脲等的耐药性。正如实施例所示,用含有反义方向的R2序列的载体转染细胞。这些细胞对化疗药物更为敏感。鼠10T1/2耐药细胞经反义方向的R2序列转染后,对化疗药物的耐药性也明显降低(即敏感性增加)。与R2序列互补的合成短反义序列也增加敏感性。
以上讨论为应用针对R2 mRNA反义寡核苷酸和核酶提供了事实依据。本发明应用和所涉及的方法由下面的非限制性实施例和图表所示。通用方法分子生物学通用方法:本领域周知的标准分子生物学技术和未特别叙述的技术通常按以下所述操作:Sambrook等,分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室,纽约(1989,1992);Ausubel等,当代分子生物学方法JohnWiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,分子克隆实践指南,John Wiley&Sons,New York(1988)。多聚酶链反应(PCR)基本按PCR方法:方法和应用指南,Academic Press,San Diego,CA(1990)进行。
用于本发明的载体可由本领域技术人员构建,载体应含有实现期望序列转录所需的所有表达元件。选择这些表达元件以保证仅仅在目的细胞中表达。其它一些有用的特征也可以包含在这些载体中,如以不同形式回收核酸的机制。本领域普通技术人员知晓与特定的细胞类型相适应的表达元件。这些载体能够被以上述本领域周知方法的任何一种导入细胞或组织。免疫学通用方法:本领域已知的标准免疫学方法和未特别叙述的方法通常按以下所述操作:Stites等(编),基础与临床免疫学第8版;Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(编),细胞免疫学中的筛选方法,W.H.Freeman and Co.,纽约(1980)。致癌性及转移性鉴定:按已报道文献所述方法确定癌变潜能[Wright,1989a;Egan等人1987a,1987b;Damen等人,1989;Taylor等人,1992;Stokoe等人,1994]。六至八周龄同系C3H/HeN小鼠(CharlesRiver,Quebec)用于评价细胞的致癌性及转移性。细胞制备自处于对数生长期未生长过盛的细胞,经胰酶/EDTA溶液温和消化收获,用平衡过的盐溶液调整到适当浓度。
对于致癌性(肿瘤潜伏期)鉴定:总体积0.1ml中含1×105细胞,经尾静脉注射于小鼠背部,记录形成经触诊方法可检测肿瘤(2×2mm)所需的时间。肿瘤出现后,通过每天测量肿瘤直径,并计算肿瘤基底面积来评估肿瘤生长(Damen等人,1989)。肿瘤大小通过肿瘤横切面面积相乘确定。21天后从小鼠上分离肿瘤并记录重量。如未见肿瘤形成,注射后持续观察小鼠两月,处死小鼠。
对于转移性(转移潜能的确定)鉴定:总体积0.2ml中含1×105细胞,经尾静脉注射于六至八周龄同系C3H/HeN小鼠,21天后计数肺部肿瘤形成数。处死小鼠,经气管注入Bouin′s液(苦味酸,甲醛,醋酸,15∶5∶1),肺内染色(Egan等人,1987b;Damen等人,1989)。肺部肿瘤在解剖镜下计数。为确证相同数量的试验组及对照组细胞被注射到鼠内,分别用100个细胞接种于含生长培养基的培养皿,每组细胞接种两个培养皿。孵育10天后,用亚甲蓝染色平板计数集落。核糖核苷酸还原酶鉴定:细胞粗提物中制备的核糖核苷酸还原酶活性的鉴定如文献所述(Lewis等人,1978;Hurta和Wright,1992;Hurta等;1995)。酶制品由下述方法获得:经冻融三次,对数生长期细胞裂解于含1mM DTT,1mM蛋白质酶抑制剂AEBSF(Calbiochem,SanFrancisco,CA)的磷酸缓冲盐液,pH7.2;离心后,采用[14C]-CDP(Moravek Biomedical,Brea,C)检测上清中的酶活性,详见(Lewis等人,1978;Hurta和Wright,1992;Fan等人,1996;Choy等人,1988)。Westerb印迹分析:操作程序见报道(Fan等人,1996a;1996b;Choy等人,1988)。简言之,得到细胞提取物后,测定蛋白质总量,部分样本经10%连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。蛋白质转印、封闭后,膜与兔抗R2多克隆抗体孵育。碱性磷酸酶偶联山羊抗兔IgG(Sigma)用于检测蛋白质R2。
实施例一R2与活化癌基因的协同作用
为确定核糖核苷酸还原酶中限速R2组分的失去调节表达致癌变的潜能,研究了用携带R2组分的逆转录病毒表达载体(SH/mR2)稳定感染的细胞的性质。探查了R2与活化癌基因之间的相互作用。材料与方法表达载体:如Fan等所述,构建了带有人Myc表位标记的鼠R2组分SH/mR2的逆转录病毒表达载体并进行包装(1996b)。病毒原液的感染率大于每毫升1×104集落形成单位。表达T-24H-ras和选择性标志neo的质粒pH06Ti被用于癌转化(Egan等人,1987a,1987b;Taylor等人,1992)。活化的Rac-1质粒(V12 Rac-1)由M.Symons惠赠(Stokoe等人,1994)。细胞及细胞培养:鼠细胞系BALB/c3T3、NIH3T3以及由T24H-ras转化10T1/2细胞的四个细胞系称作C1、NR4、r-2和r-3已被用作R2逆转录病毒载体的受体(Fan等人,1996b)。细胞按常规培养于含10%牛血清(FetalcloneⅢ,Hyclone,Logan,UT)α-MEM(Gibco,GrandIsland,NY)。在Polybrene存在下用SH/mR2或对照病毒LXSH感染细胞(Miller等人,1993)。稳定的受感染细胞(>1×104集落)经潮霉素筛选后收集得到(Fan等人,1996b;Miller等人,1993)。细胞***时间、铺板效率以及对羟脲细胞毒性的相对敏感度通过计算相对集落形成效率加以确定,方法如前述(Lewis等人,1978;Egan等人1987,Hards和Wright,1981)。
在含15ml基底琼脂(α-MEM含0.5%Bacto琼脂,10%牛血清),10ml生长琼脂(α-MEM含0.33%琼脂,10%牛血清)的10cm组织培养平皿中评价于软琼脂上的生长。细胞取自未生长过盛的培养物,10-15天后计数形成的集落(Egan等人,1987a,1987b;Hards及Wright,1981)。用SH/mR2或LXSH感染细胞,或者经磷酸钙沉淀法用T-24Ras或V12Rac-1质粒转染细胞后测定转化灶形成对转化进行研究(Taylor等人,1992)。在感染或转染后40小时后,细胞被分配到三个10cm组织培养皿中,每天换20ml新鲜完全培养基(α-MEM,加10%牛血清),持续10-14天,经亚甲蓝染色,计数转化灶(Taylor等人,1992)。在所有实验中都用同一种常规方法确定转染频率,即带有T24H-ras或V12Rac-1的质粒与大肠杆菌β-半乳糖苷酶的哺乳动物表达质粒共转染,随后用X-gal处理细胞,计数兰色细胞(Price等人,1987)。在有些情况下,用遗传霉素筛选T24H-ras质粒转染的平皿,耐药克隆在大约14天后用亚甲蓝染色后计数。致癌性及转移性鉴定:致癌潜能经上述方法确定。蛋白质R2分析:Western印应分析方法如前述,用如抗myc鼠单克隆抗体9E10(ATCC,Rockville,MD)(Fan等,1996b)或兔抗R2多克隆抗体(Chen等,1993)进行。为确定细胞周期中重组蛋白质R2的表达,用如前述9E10异硫氰酸荧光素抗体标记后经流式细胞计数器分析(Blosmanis等,1987;Chadee等,1995)。膜结合Raf-1蛋白质的确定:膜组分按前述方法制备(Qui等,1995),经Bio-Rad标准方法确定蛋白质成分后,用特异于Raf-1蛋白质的多克隆抗体进行Western印迹分析(Santa Craz Biotechnology Inc.,SantaCruz,CA)。Raf-1带经密度仪测定,每一样品中Raf-1蛋白质的量均经过用考马斯兰染色的平行胶上充分分离的带的密度分析加以修正。核糖核苷酸还原酶鉴定:方法如前所述。在一些实验中,对酶的检测采用纯化的重组蛋白质R1[Salem等,1993]与9E10抗体沉淀的蛋白质R2(Hurta和Wright,1992)结合来进行。在此实施例中,20μg9E10抗体和50μ1链球菌蛋白质A-琼脂糖(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)加入1ml经离心的裂解细胞上清液,置于摇振器上4℃混合2小时。链球菌蛋白质A-琼脂糖-免疫复合物用1ml含1mg/1ml牛血清白蛋白的冷磷酸缓冲液洗三遍。免疫复合物随之被用于分析核糖核苷酸还原酶活性(Lewis等,1978;Hurta和Wright,1992;Fan等1996b;Choy等1988)。MAPK活性检测:细胞培养物覆盖达90%时,将细胞收集于无血清培养液中(Stokoe等,1994;Jelinek等,1994)并提取蛋白质,方法如前所述(Alessi等,1995)。用偶联有针对MAPK-2蛋白质非中和抗体的琼脂糖珠将该蛋白质免疫沉淀(Ssnta Cruz Biotechnology,Inc.);免疫复合物的激酶活性通过使用得自Upstate Biotechnbology,Inc.(Lake Placid,NY)的MAPK检测试剂盒测量其磷酸化髓磷脂碱性蛋白质的能力而计算。结果具生物活性的蛋白质R2的表达:为确定核糖核苷酸还原酶中限速R2组分失去调节的表达后的致癌潜能,对用携带R2组分的逆转录病毒表达载体(SH/mR2)稳定地感染的细胞的性质作了研究(Fan等,1996b)。应用此种表达载体能获得高感染率和蛋白质R2的稳定表达。为区分内源性R2和载体基因产物,编码带有甲硫氨酸和10氨基酸的人C-myc表位被加入R2 cDNA的5′末端。Western印迹结果见图1A。该实验使用特异性识别Myc表位序列的抗体9E10检测到在SH/mR2稳定感染的BALB/c3T3和NIH3T3细胞(分别命名为B3/mR2和N3/mR2)样本中约45kDa的R2蛋白质;而对照载体(LXSH)感染的细胞B3/SH或N3/SH样本中未检测到此带。表达载体感染的细胞中,用R2特异性抗体能检测到内源性R2和重组R2两种蛋白质;但在对照载体感染的细胞中,正如所预期的那样,仅检测到内源性蛋白质(图1B)。
流式细胞计数器分析经9E10/异硫氰酸荧光抗体标记,重组蛋白质R2在整个细胞周期中组成性地表达(图1C)。用9E10抗体经间接显微镜观察发现,在B3/mR2和N3/mR2群体中,几乎每个细胞都表达Myc标记的蛋白质R2。
进行了几种实验以证实载体表达的R2具生物活性。首先,在集落形成实验中,与对照细胞B3/SH和N3/SH相比(Fan等,1996b),B3/mR2和N3/mR2细胞对蛋白质R2抑制剂羟脲(Wrught,1989;Wright等,1989)的细胞毒作用有耐药性。其次,在三次检测核糖核苷酸还原酶活性的独立实验中,发现在B3/mR2和N3/mR2细胞中CDP还原酶的活性分别为1.96±0.32和1.71±0.11nmol/mg蛋白质/小时,该检测值分别比从B3/SH和N3/SH细胞所得检测值高2.6倍和2.1倍(分别为0.74±0.14和0.83±0.08nmol/mg/小时)。最后,酶活性检测由纯化的重组蛋白质R1(Salem等,1993)与9E10抗体沉淀的蛋白质R2结合来进行。当B3/mR2和N3/mR2细胞用作Myc标记的R2来源时,检测到具显著水平的活性(15到20nmol/mg/小时);而用B3/SH或N3/SH细胞时,正如预期的那样,没有可检测的活性。借助异常R2基因表达来确定Ras转化潜能:上述结果表明,在具生物活性的蛋白质R2调节下,细胞会发生变化。因而测定改变的R2表达以观测其是否进一步转化像BALB/c3T3或NIH3T3这样的细胞。与对照B3/SH、N3/SH细胞和未受感染的亲代细胞相似,B3/mR2和N3/mR2培养物在组织培养皿中仍保持扁平、非转化的形态学特征并显示出接触和密度抑制生长(数据未发表)。用逆转录病毒SH/mR2载体感染BALB/c3T3或NIH3T3细胞后,未见转化灶形成(图2A,a和b)。
结果表明,R2基因表达的失去调控本身并不转化BALB/c3T3或NIH3T3成纤维细胞。为检验R2失去调控的表达与癌基因系H-ras有协同作用的假设,用含T24H-ras的表达质粒转染来自BALB/c3T3或NIH3T3的预先建立并能表达重组R2的细胞群。与对照N3/SH细胞相比,经H-ras转染N3/mR2细胞形成的转化灶数目有稳定而显著的增加(3.4倍)(图2B,c和d,图2C)。H-ras转染的B3/mR2细胞同B3/SH细胞相比,观察到更为明显的数量增加,约70倍(图4B,a和b,图2C)。采用计数G418筛选的集落和/或在共转染H-ras和大肠杆菌β-半乳糖苷酶表达质粒(Price等人,1987)后计数兰色细胞的方法,发现即使用N3/mR2和B3/mR2的细胞转染效率实际上比用N3/SH和B3/SH细胞低(约50%),上述转化灶数增加的情况仍然发生。借助异常R2基因表达来确定Ras致癌潜能:由于在Ras转染R2表达已发生变化的细胞的转化灶形成实验中观察到,改变的R2基因表达与活化的H-ras有协同作用,因而用逆转录病毒载体SH/mR2感染了四株独立的H-ras转化的10T1/2细胞系,对此基因协同作用做进一步检验。这四株细胞系已被表征,分别名为C1、NR4、r-2和r-3(Egan等人,1987a,1987b;Taylor等人,1992;Stokoe等人,1994)。用潮霉素筛选稳定的感染株,Western印迹分析及酶活性检测证实这些感染株表达具生物活性并带有Myc标记的蛋白质R2。
软琼脂生长实验揭示,含重组R2序列的H-ras转化细胞在半固体生长琼脂中形成集落的效率大大高于未感染的亲代细胞(例如r-3)或对照载体感染的细胞(C1、NR4、r-2)(表1)。且许多用重组R2感染的细胞形成的集落也更大(图3A)。由于在固体表面生长时,每对重组R2表达细胞和对照细胞有几乎相同的生长率(对于CI/SH 12.9小时,对于C1/mR212.2小时;对于r-2/SH 13.5小时,对于r-2/mR2 13.9小时;对于r-3 11.6小时,对于r-3/mR2 11.9小时;对于NR4/SH 14.1小时,对于NR4/mR214.3小时)、铺板效率(对于C1/SH 58%,对于C1/mR2 55%;对于r-2/SH59%,对于r-2/mR2 63%;对于r-3 91%,对于r-3/mR2 88%;对于NR4/SH 73%,对于NR4/mR2 75%)和细胞周期相分布(数据未发表),在软琼脂和转化灶形成实验中所观察到的变化,提示在体内R2失去调节的表达和活化H-ras的联合协同作用可能导致更大的致癌潜能。
因此,用同系C3H/HeN小鼠对C1/mR2和C1/SH细胞的致癌潜能和转移潜能进行了比较。观察到致癌潜能的显著差异。与C1/SH细胞相比,C1/mR2细胞表现出更短的肿瘤潜伏期和更快的肿瘤生长(图3B)。此外,转移实验清楚表明C1/mR2细胞比C1/SH细胞更具转移性,并且肺肿瘤产生的数量也显著增加(图3C)。R2基因表达和癌基因的协同作用:上述结果表明,在体外转化和体内致癌实验中,R2表达的改变与活化的H-ras之间有协同作用。似乎此协同作用本应导致如细胞周期调节的变化,然而并未观察到生长速率或细胞周期有明显差异。因而对以下设想进行检验:失去调节的R2表达与ras的协同作用是否通过提高ras信号传导途径的活性来实现?这一设想应该与先前的研究相符,那些研究揭示了ras表达与致癌潜能之间的直接联系(Egan等人,1987a,1987b;Wright等人,1993;Bradley等人,1986)。在调节基因表达的一条主要Ras途径中涉及Raf-1蛋白质激酶。活化的Ras使Raf补充入质膜,Raf和下游信号传导分子如MAPK等在那里被激活(Stokoe等人,1994;Jelinek等人,1994;Leevers等人,1994)。
用Raf-1特异性抗体检测了六个细胞系中与膜结合的Raf-1水平。这些细胞系源于BALB/c3T3、NIH3T3和10T1/2细胞,均存在失去调节的R2表达,将它们与仅含内源性蛋白质R2的对照细胞比较(图4A)。含失去调节的R2的全部六个细胞系中显示与膜结合的Raf-1均增加,平均增加约30%,具高度显著性差异(p<0.001)。与上述观察一致,失去调节的R2表达细胞系中MAPK-2的活性也呈现稳定、显著地增高,增加约70%(p<0.001)(图4B)。致癌Ras也活化与Raf途径平行的Rac途径,因而在恶性转化中与膜结合Raf-1协同作用组成性地活化Raf-1(Qiu等人,1995)。
在此实施例中,如果因Raf-1在细胞中易位诱导了MAPK的活化并且此活化在R2/ras的协同作用中起重要作用的话,那么异常R2表达就应该在细胞转化中与活化的Rac-1有协同作用,因为前面的结果已揭示了在转化机制中活化的Raf-1与Rac-1有协同作用(Qiu等人,1995)。图4C表明这种推测是正确的,因为已知在转化过程中活化的Rac-1与R2之间有阳性协同作用,其方式与Ras和R2的协同作用类似,如通过计算用活化的V12 Rac-1转染N3/mR2和N3/SH细胞形成的转化灶所得(Qiu等人,1995)。这些观察结果与下面的观点一致,即失去调节的R2基因表达借助于上调Raf易位及MAPK途径活性来实现与如ras和rac等癌基因的协同作用。但这并不排除其它活化Raf可能参与的传导途径也受这种调节的可能性,因为已有证据表明,Raf能通过不依赖MAPK途径调节某些细胞活性(Lenormand等人,1996;Koong等人,1994;Agarwal等人,1995)。
本实施例首次表明:哺乳动物核糖核苷酸还原酶R2组分是一种新的癌变决定因子,它能与活化的癌基因协同作用从而改变致癌潜能。必须指出,在此实施例提出以前,认为在细胞中R2的唯一作用是核糖核苷酸还原酶的一个限速成分。这一实施例证明R2也参与其它一些关键性的细胞功能并通过与癌基因的协同作用直接参与确定癌变潜能。
实施例二
R2基因表达与药物敏感性以及基因组稳定性的改变材料与方法细胞系及培养条件:耐羟脲的鼠细胞系H-2、H-4、LHF和SC2源于鼠L细胞,Choy等(1988)和McClarty等(1986)对细胞特性已有表征。BALB/c3T3细胞用作R2逆转录病毒表达载体的受体细胞(B3/mR2和B3/R2c2细胞系),或用作同一逆转录病毒载体但缺乏R2序列的受体细胞(B3/SH细胞)[Fan等,1996a;1996b]。NIH-3T3也被用作R2逆转录病毒表达载体的受体细胞(N/R2-4细胞系),或同一逆转录病毒载体但缺乏R2序列的受体细胞(N/SH细胞系)(Fan等,1996a;199b)。经用LipofectAmine(Life Technologies,N.Y.)(Damen等,1991)共转染含R2编码序列和含反义方向的R2序列的逆转录病毒载体到受体N/R2+ASR2细胞系。RP3和RP6细胞是用T-24 H-ras基因和一种突变p53基因癌基因转染的10T1/2鼠细胞(Taylor等,1992)。RP3和RP6也被用作受体细胞供用LipsfectAmine试剂由含反义方向的R2编码序列的逆转录病毒载体转染(Fsn等,1996b),从而得到RP3/ASR2和RP6/ASR2细胞。1B细胞为得自胚胎成纤维细胞的p53-/-(Lowe等,1994)。所有细胞在含10%的胎牛血清(Intergen,Purchase,NY)和抗生素(100u/ml青霉素,100μg/ml链霉素)的α-MEM培养基中,置于5%CO2潮湿下37℃培养。药物筛选:500到1-2×105个细胞加入100mm组织培养皿,生长培养液含10%预先透析过的胎牛血清,含有或不含筛选药物(Huang等,1995a;Choy等,1988)。每周更换新鲜培养液一次,共二至三周。经亚甲蓝染色观察存活细胞,计数约50个或更多细胞的集落(Huang等,1995a)。相对集落形成效率定义为:在含药物情况下形成集落的能力除以不含药物时形成集落的能力。基因扩增试验:经酚-氯肪抽提法从对数生长期细胞中分离基因组DNA(Blin和Stafford,1976),经Southern印迹分析确定可能的基因扩增事件,详见(Huang等,1995a;Choy等,1988),所用作探针的cDNA片段见下述。pCAD142质粒带有编码CAD蛋白质复合物的cDNA(Shigesada等,1985),用其获得用作探针的6.3kb HindⅢ片段。含鼠二氢叶酸还原酶基因的pLTRDHFR26质粒(Chang等,1978),提供用作探针的1.3kb BamH1片段。针对核糖核苷酸还原酶R2的1487bpSalⅠ/PstⅠ探针从cDNA克隆10制备(Huang等,1995a;Choy等,1988)。电泳迁移率变动分析(EMSA):EMSA用于确定野生型p53的存在。主要实验步骤如文所述(Price和Calderwood,1993),其中改进的细节如下述。培养于150mm培养皿中的细胞用冰冷磷酸缓冲盐液(PBS)洗一遍后刮入1mlPBS。细胞在4℃经1300g离心10分钟沉淀,储于-80℃。细胞沉淀置冰上,用300μl缓冲液A(20mM HEPES{pH706},20%甘油,10mM NaCl,1.5mM MgCl2,0.2mM EDTA和0.1%Triton X-100)裂解20分钟。缓冲液A还含有1mM苯甲磺酰氟(PMSF)和10mM二硫苏糖醇(DTT)。在4℃,1300g离心10分钟将核分离。加入20-40μl含500mM NaCl、1mM PMSF和10mM DTT的缓冲液A到核沉淀,置冰上20分钟制备核裂解物。后者经4℃,16000g离心沉淀抽提核;吸出上清,一部分用Bio-Rad蛋白质检测法测定蛋白质(Bio-Rad)。
用T4多核苷酸激酶(Boehringer)将[γ-32P]-ATP末端标记于双链p53共有结合序列(GGACATGCCCGGGCATGTCC)(SEQ.ID.NO.:162)。上述核裂解物与过量的标记物孵育。DNA结合反应在含20mMHEPES(pH7.6)、20%甘油、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、1mMPMSF和10mM DTT的缓冲液中进行。每一结合反应含5μl细胞裂解物、10μg双链poly(dI-dC)(Pharmacia)、1.4ng标记的共有探针和100ng单克隆抗体421(SantaCruz),总体积20μl。室温反应30分钟使DNA结合,反应混合物经5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电泳在室温下进行,至示踪剂二甲苯睛蓝泳出凝胶下端,未结合的探针也泳出凝胶。统计学分析:为比较不同组细胞系间的剂量反应数据,进行协同变异分析,显著性水平设于α=0.05(Huang等,1995a)。结果对非选择性药物敏感性降低的羟脲抗性细胞系
H-2、H-4、LHF和SC2为鼠L细胞系中对抗肿瘤药物羟脲的细胞毒作用耐受的细胞系。在集落形成效率实验中,该四株细胞系比其所衍生自的野生型鼠L细胞羟脲的耐受性高出约18(H-2)到30(SC2)倍(Choy等,1998;McClarty等,1988)。其中,核糖核苷酸还原酶的活性水平也增高2.2(H-2)到17(LHF和SC2)倍,这主要归因于核糖核苷酸还原酶中R2组分的增加。因为在增殖的鼠细胞中,R2是该酶活性及细胞***的限速因素。表二显示在集落形成实验中,与亲代野生型鼠L细胞相比,这四株羟脲抗性细胞对PALA和MTX的细胞毒作用也较不敏感。与亲代野生型鼠细胞相比,每一细胞系对药物敏感性的差异都具高度显著性,P值均小于0.0001。
虽然已知对药物的耐受有多种机制(Wright,1989;Kohn1996),但对MTX和PALA的耐药却通常伴有药物所攻击的基因产物增加,分别为二氢叶酸还原酶(DHTR)或CAD(一种具备氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰转移酶和二氢乳清酸酶活性的多功能多肽),这种情况通常由基因扩增机制来实现(Huang等,1995a;Livingston等,1992;Yin等,1992;Mai,1994;Stark,1993)。实际上,鼠细胞对PALA耐受的主要甚至唯一机制是通过CAD基因扩增来实现的(Stark,1993)。因此,在这两种药物正常细胞毒浓度环境下生成的集落被用来检测可能存在的基因扩增事件。图5显示在存在PALA或MTX下增殖的细胞表现出CAD或DHFR基因拷贝数增加。与先前的研究一致(Stark,1993;Huang等,1995b;Otto等,1989;Stark等,1990),所有(10/10)于PALA中增殖且被检测的集落都显示CAD基因扩增。同另一先前的报导(Huang等,1995b)相一致,部分(3/6)而非所有于MTX中的集落显示出DHFR基因扩增。对R2基因表达与药物敏感性降低两者关系的直接测试:因为对羟脲有抗性的鼠细胞除了核糖核苷酸还原酶变化以外,同时伴有其它生化改变(Wright等,1989),故使用含编码鼠R2序列的逆转录病毒表达载体及含同样逆转录病毒载体但缺乏R2序列的细胞对药物的敏感性和R2水平升高的关系作直接测试。由于存在编码R2的逆转录病毒表达载体,故B3/mR2是含增高的蛋白质R2的BALB/C3T3细胞群。B3/SH含对照的空载体,是蛋白质R2仅具野生型水平的细胞群。B3/R2c2是选自B3/mR2R蛋白质增高的克隆系。
与以前的报导显示的R2基因表达增加导致对羟脲的耐受一致,从表三可见,与对照株B3/SH细胞相比,B3/mR2和B3/R2c2细胞对在一定浓度范围内的羟脲细胞毒性作用的耐受性明显增加。这些结果也进一步证明,B3/mR2和B3/R2c2细胞表达有活性的核糖核苷酸还原酶R2组分的水平增高。对作用于非核糖核苷酸还原酶位点的PALA和MTX细胞毒作用,B3/mR2和B3/R2c2细胞的敏感性也显著降低(表3)。对这两种药物的耐受程度从用100nM MTX时约增加10倍,到用大多数不同测试浓度的PALA时超过100倍。
Southern印迹分析进一步表明,从含PALA或MTX培养基中得到的集落,有CAD或DHFR基因的扩增(图6)。尽管对鼠L细胞的观察(图5)和其它研究报导(Hurta和Wright,1992;Hurta等1991)等也显示,并不是所有得自于含MTX培养基的集落都存在DHRF基因扩增。不同与对PALA的耐受,鼠细胞中对MTX耐受可通过多种机制实现(Otto等,1989;Stark等,1990;Flintoff,1989)。
使用含R2表达逆转录病毒载体的NIH-3T3细胞,对含有核糖核苷酸还原酶R2组分水平上升的细胞所显示的对化疗药物敏感性的变化作进一步的测试(表4)。与仅含缺乏R2编码序列的逆转录病毒载体的细胞(N/SH)相比,这些细胞(N/R2-4)对羟脲有耐药性。N/R2-4细胞对MTX的耐受也显著增强。与N/SH细胞相比,N/R2-4细胞对PALA的耐受也有增强的趋势,但这种趋势没有统计学显著性。后一结果显示,在该研究中所用的细胞系,除了R2水平增加外,固有遗传背景差异中的其它因子也影响到对药物的敏感性。
将表达R2反义构建体引入N/R2-4细胞得到N/R2+ASR2细胞群。通过测试在R2水平降低后细胞对药物的敏感程度,就R2水平在决定对药物的敏感性上起重要作用的设想进行验证。图7表明,与对照N/R2-4细胞相比,NR2+ASR2细胞中蛋白质R2水平显著降低,对羟脲PALA和MTX的敏感性则显著增高(表4)。当与含空白载体的对照细胞N/SH相比,表达R2反义序列的细胞对这三种药物的敏感性都显著增高(表4)。
用活化的Ras和p53突变癌基因型所转染的鼠10T/2细胞对化疗药物有很强的耐受(Huang等,1995b)。由于观察到R2反义序列的表达能增加NIH-3T3细胞对羟脲、PALA和MTX的敏感性,使我们对以下可能性进行了试验,即当存在R2反义序列时,含Ras和突变p53的细胞也会表现出降低了的药物耐受性。表五的结果证明这一设想是正确的。与仅含相同载体但不带有反义方向的R2的细胞相比,含R2反义序列的细胞对羟脲、PALA和MTX的敏感性明显增强。这些结果显示,就这些高度转化和恶变的细胞而言,核糖核苷酸还原酶R2的水平至少是药物敏感性决定因子其中之一。R2介导的耐药性和基因扩增并不要求p53功能丢失的证据:p53的失活或活性丢失是肿瘤发展过程中相关的常见事件,在恶性细胞中,则伴随遗传稳定性的降低,包括经历自发基因扩增的能力(Liningston等,1992;Yin等,1992;Takenak等,1995)。因而,我们对如下可能性进行了试验,即:过度产生R2的B3/mR2和B3/R2c2细胞所表现的药物耐受性增强或许其是通过导致野生型p53活性丢失的机制。已证明p53是转录因子,其野生型、而非突变型转录活化作用有序列特异性,并与它结合到共有DNA序列有关(Takenaka等,1995;Kern等,1992;Funk等,1992)。为确定在PALA、MTX或羟脲存在下发育的耐药性的集落其野生型p53功能是否存在,细胞抽提物经电泳迁移率变动分析EMSA实验(Price和Calderwood,1993),检测p53的序列特异性结合活性。图8列出来自过度表达R2细胞的耐药性的集落表现出野生型p53结合活性。这些观察结果与我们用免疫沉淀实验无法检测到耐药集落细胞中突变型p53蛋白质是相符的,该实验中使用对p53突变株共同型检测有特异性的Pab240单克隆抗体。
实施例三针对核糖核苷酸还原酶及对人体肿瘤细胞有细胞毒性的反义脱氧核糖核苷酸序列
如上实施例所述,全长的R2反义构建体影响肿瘤细胞的肿瘤形成和/或转移能力,以及对化疗药物的敏感性。为弄清较短R1和R2的反义构建体对肿瘤细胞的影响,申请者研究了这些反义序列。材料和方法:集落形成效率和用反义构建体处理细胞:
集落形成效率的测定方法如文献所述(Huang和Wright 1994)。用含10%胎牛血清的生长培养基在37℃培养细胞24小时。用5ml,pH7.2的磷酸缓冲盐液洗细胞一次,然后用Lipofectin+/-寡核苷酸处理细胞。
经过测试的寡核苷酸加入含2.5μgDOTMA/DOPE(Lipofectin;Lifetechnologies,inc.)的细胞培养物中处理4小时。除特别指明以外,所用的寡核苷酸量均为0.2μM。对照的培养物只用Lipofectin处理而未用寡核苷酸处理。经4小时后,除去含有寡核苷酸的培养液,用5ml生长培养液洗一次。细胞在含10%胎牛血清的生长培养液中生长7-10天。然后用亚甲蓝染色存活细胞并计数集落。有些实验中会从培养液移走细胞等分样本,用台酚兰外排实验法(Phillips,1973)测定细胞的存活。通过比较实验组与对照组的细胞存活百分数分析结果。结果:
鉴定针对核糖核苷酸还原酶的反义序列。如下所示,这些反义序列对多种人体肿瘤细胞具有毒性作用。发现这些序列还增强对药物抗性肿瘤细胞的药物细胞毒性。这意味着针对核糖核苷酸还原酶的反义序列能以很低的无细胞毒性的浓度增加肿瘤细胞对临床上几种重要的化疗化合物的细胞毒性。
最初研究中,制备和研究了针对R2mRNA的两个反义序列分别由20个核苷酸组成,命名为AS-Ⅱ-336-20和AS-Ⅱ-2229B-20。反义序列AS-Ⅱ-336-20的序列为5′-TCCTGG AAG ATC CTC CTC GC-3′(SEQ.ID.No.1),其对应于人核糖核苷酸还原酶R2mRNA的336-355核苷酸,按照R2核苷酸序号(Pavloffetal.,1992)。AS-Ⅱ-2229B-20的序列为5′-TCCCAC ATA TGA GAA AAC TC-3′(SEQ.ID No.2)其对应于R2mRNA的2229-2248核苷酸。为了保护寡核苷酸不被核酸酶降解,ASⅡ-336-20和ASⅡ-2229B-20寡核苷酸均构建为硫代磷酸酯结构(Anazodo等人,1995)。
如前述测定相对集落形成效率实验,研究了反义构建体AS-Ⅱ-336-20抑制人体肿瘤细胞(Hela)增殖的能力。测定了HelaS3细胞(美国典型培养物保藏中心Rockville,Waryland,ATCC)和Hela细胞系(HelalmM)(见表6),后者对抗肿瘤药物羟脲有耐药性(Wright等.,1987)。用Hela S3细胞进行两次实验。经0.2μM反义构建体AS-Ⅱ-336-20处理四小时后,两次实验中集落形成效率分别抑制了92%和82%。用不同浓度的AS-Ⅱ-336-20反义构建体在Hela lmM细胞系上重复上述实验,所得结果相似(表6)。表明0.2μM是抑制集落形成的有效浓度。
这些数据表明,AS-Ⅱ-336-20是人肿瘤细胞集落形成能力的一种十分有效的抑制剂,它不仅有效地抑制人肿瘤细胞增殖和集落形成能力,还能抑制那些抗其它化疗化合物的人肿瘤细胞的增殖。类似地,如表6所示,用鼠肿瘤细胞系SC2(一种对羟脲有高抗性的鼠L细胞SRI,McClarty等,1988)进行的实验结果也证明,AS-Ⅱ-336-20反义构建体是一种有效的抗肿瘤化合物。
用相对集落形成效率实验检验反义序列AS-Ⅱ-2229B-20抑制人Hela肿瘤细胞增殖的能力,也有类似表6中所示的AS-Ⅱ-336-20结果。用HelaS3细胞和耐药细胞系Hela lmM进行实验,所得结果表明,AS-Ⅱ-2229B-20是一种有效抗肿瘤药物。测试反义构建体AS-Ⅱ-2229B-20抑制人乳腺癌细胞系MDA435的能力,也证实其十分有效(表8)。
测试核糖核苷酸还原酶R2反义构建体AS-Ⅱ-2229B-20是通过比较人的肿瘤细胞和非肿癌细胞群所得结果,以鉴定对肿瘤细胞的细胞毒性作用。用肿瘤细胞Hela S3和正常人非致癌细胞WI38进行实验。结果发现肿瘤细胞比正常非致癌细胞对ASⅡ-2229B-20的细胞毒性作用更为敏感。例如,用AS-Ⅱ-2229B-20处理这两种细胞3天后,取4-8次测定的平均值分析表明,肿瘤细胞对AS-Ⅱ-2229B-20的细胞毒性作用比正常非致癌细胞敏感约5倍。
以上结果表明,短的反义方向的寡聚脱氧核糖核苷酸序列是一种很好的抗癌药物,提示其它针对R2信使反义构建体也有相似的性质。一种最好的抗肿瘤药物应具有下列特点,即有与其互补的模板形成寡核苷酸双链适当的能量相关特性,它自身形成二聚体或自身互补的倾向很低(Anzodo等人,1996)。采用计算机程序(OLIGO,引物分析软件Version3.4)分析R2 mRNA结构,以确定反义序列的融点温度和自由能性质,评估形成自身二聚体的能力和自身互补的性质(Anazodo等人,1996),设计了一系列针对R2mRNA的额外的反义序列(表7,Seq.IDNo.3-102)。表7是带有合适性质的额外的R2反义抑制剂表。
为了检验这些硫代磷酸酯脱氧核糖苷酸序列反义作用,用一系列人体肿瘤细胞系以相对集落形成实验进行检测。不出所料,结果证明其中很多反义序列是人体肿瘤细胞增殖的强烈抑制剂。这些肿瘤细胞分别来自膀胱、***、肺、结肠、胰腺、***、肝和子***等,结果见表12中。另外,表13报导了用AS-Ⅱ-626-20在C3H/HeN鼠中所进行的体内实验结果,表明在反义序列治疗鼠中肿瘤的转移大大地降低。
基于实施例2,用很低浓度的短反义序列处理人肿瘤细胞,检测这些构建体是否能致敏肿瘤细胞对其它化疗药物的抑制作用。如表6所示,这些序列所用的浓度本身无细胞毒性作用。用0.02μM反义构建体AS-Ⅱ-2229B-20处理HelaS3和Hela lmM细胞,从表9所示结果可以看出,提高了这些细胞对N-(膦乙酰)-L-天冬氨酸(PALA)和氨甲喋呤(MTX)的敏感性。这些结果表明针对R2信使的反义化合物能与公知的化疗药物协同作用。
核糖核苷酸还原酶由两种不同的蛋白质亚基组成,不同的基因R1和R2分别编码这两种蛋白质。因此,以上结果也提示,R1信使的结构也可用作合适的靶点来设计具有抗肿瘤活性的短反义分子。为了检验这种可能性,设计了代号为AS-Ⅰ-1395-20的反义构建体,并测定了它的抗肿瘤能力。这个反义构建体是由20个碱基组成的反义方向的脱氧核糖核苷酸硫代磷酸酯序列,其序列为5′ACA GGA ATC TTT GTA GAG CA-3′(Seq.ID.No.103),对应R1信使的1395-1414核苷酸。如表10所列,用Hela S3细胞和抗药细胞Hela 1mM表明,这种反义序列也是肿瘤细胞增殖的一种有效抑制剂。这些结果都证实了设计针对R1信使的反义序列的实用性,并暗示其它的位点也可能有效。因此,为了设计有适当特性的反义脱氧核糖核苷酸序列,分析了R1 mRNA(与上述针对R2 mRNA的方法相同)。表11列出了另一批反义序列,它们也具有抗肿瘤制剂的特性。
实施例四R2反义序列对转化的抑制
采用上述实施例1-3的方法,用R2编码区的R2反义序列处理哺乳动物细胞,研究R2反义序列对转化的抑制作用(Fan等1996b)。用反义方向的R2编码序列或有义方向的R2编码序列分别转染含H-ras肿瘤基因的HIN-3T3鼠细胞。从图9的结果可以看出,与对照细胞相比,存在R2反义构建体时,转化细胞灶减少且软琼脂生长减少(图9,b道)。如实施例1所示,R2编码区可与H-ras协同作用以增强了致癌性,如转化细胞灶数目增加所示(图9,C道)。
此外,如此处所述,在软琼脂上进行集落效率分析也得到相似的结果。对含H-ras肿瘤基因的NIH3T3鼠细胞,引入不同的序列分子后测得的集落形成效率分别为:不含R2反义序列的为15.6±6.73,含R2反义序列的为4.4±2.62,而含R2编码序列的却高达51±12.29。
实施例五用Western印迹分析AS-Ⅱ-626-20对L60鼠肿瘤细胞中核糖核苷还原酶蛋白质R2水平的抑制作用。
用加入Lipofectin但不加反义寡核苷酸(a)或用含0.2μM AS-Ⅱ-626-20 Lipofectin培养基(b)处理细胞4小时。作为加入的对照,肿瘤细胞也用补加Lipofectin和0.2μM杂乱寡核苷酸对照处理4小时,该杂乱寡核苷酸对照含有与AS-Ⅱ-626-20中相同比例的核苷酸但顺序不同,(ACGCAC TCA GCT AGT GAC AC,SEQ.ID.No.164)(c)或用与AS-Ⅱ-626-20相比含4个核苷酸错配突变的0.2μM错配寡核苷酸处理的(d)。(TCGC改变为CTGC)当与对照(a、c和d)相比,注意到用AS-Ⅱ-626-20(b)处理的肿瘤细胞中蛋白质R2的明显减少。用R2反义寡核苷酸变体处理鼠L60肿瘤细胞后如Western印迹分析所测,蛋白质R2水平减少。用含Lipofectin的0.2μM寡核苷酸(b-f)或用含Lipofectin不含寡核苷酸的对照(a)处理细胞4小时。用AS-Ⅱ-667-20处理的细胞(b);用AS-Ⅱ-816-20处理的细胞(c);用AS-Ⅱ-1288-20处理的细胞(d);用AS-Ⅱ-1335-20处理的细胞(e);以及用AS-Ⅱ-1338-20处理的细胞(f)。注意到在用针对R2 mRNA的反义寡核苷酸处理的细胞中蛋白质R2水平减少,与其抑制人肿瘤细胞增殖的能力一致(表12)。
在本申请中,以作者、年和卷号方式引用了包括美国专利和公开的专利申请。文献的全文引用如下所列出。本申请全文引入这些公开文献和专利作为参考以更为全面地描述本发明涉及的现有技术。
本发明已以举例的方式加以描述,应知晓所用的术语意在所描述的词语的本质而不意在限制。
显然,参照上述教导,可以对本发明进行多种修饰和改变。因此,应理解,本发明可以不同于此处所具体描述的方式加以实施,而仍落在后附的权利要求范围之内。表1:含重组R2载体的ras转化细胞在软琼脂上集落的形成增加细胞系 不同细胞接种量在软琼脂上形成的集落(均值±标准误差)a
103 104 105C1/SH 0 4±3 66±9C1/mR2 3±3 28±7 347±45r-2/SH ND 92 105±7r-2/mR2 ND 24±1 298±11NR4/SH 0 3±1 32±4NR4/mR2 2±1 14±2 127±10r-3 7±1 100±11 NDr-3/mR2 31±4 309±17 NDa:这里的集落数是三次独立实验所得的结果,只有来自r-2/SH和r-1/mR2细胞的结果是三个重复培养皿一次实验的结果。ND:没测定。表2:相对集落形成效率(X104)所确定的药物敏感度A:PALA
细胞系药物浓度 W.T. H2 H4 LHF SC220μM 172.3±126.3 406.7±2022 322.5±36.4 233.3±3.6 850.1±325.230μM 50.3±20.5 39.4±16.4 84.0±30.0 78.8±7.9 187.6±46.440μM 15.0±7.0 23.3±10.4 43.3±9.6 46.5±9.9 37.5±8.750μM 3.6±1.1 7.9±1.7 23.2±0.5 25.0±6.8 47.5±35.860μM 1.3±0.4 3.6±0.6 11.1±1.4 10.7±3.0 17.6±1.2B.MTX药物浓度 W.T. H2 H4 LHF SC240nM 11.2±7.2 52.6±25.2 44.2±20.9 143.4±41.3 880.4±147.460nM 12.3±7.2 73.7±16.6 34.7±11.2 63.5±18.6 566.8±66.280nM 2.2±1.6 67.7±20.0 39.3±18.7 68.2±19.2 306.6±61.5100nM 0.8±0.4 75.3±10.0 15.1±8.8 60.8±16.7 261.8±39.7150nM 0.5±0.2 53.3±9.4 32.3±13.7 63.9±16.0 301.6±76.8相对集落形成效率用±标准误差表示,是4-8次测定的平均值。用细胞系H2(p=0.0004)、H4(p≤0.0001)、LHF(p≤0.0001)和SC2(p≤0.0001)所得数据与亲代野生型细胞系(W.T)所得数据比较,有统计学上的显著差异。表3:相对集落形成效率(×10-4)所确定的药物敏感度A.羟脲
细胞系药物浓度 B3/SH B3/mR2 B3/R2c2
0.1mM 3.3±1.4 1310±319.0 830.8±97.0
0.4mM 0.17±0.19 14.6±4.0 33.7±11.0
0.5mM 0.21±0.14 6.5±4.6 26.9±11.9
0.6mM 0.41±0.22 5.2±3.7 12.5±4.6
0.8mM 0.19±0.62 2.6±1.4 13.2±6.4
B.PALA
浓度 B3/SH B3/mR2 B3/R2c2
10μM 17.9±11.0 965.0±529.7 1230.0±97.0
20μM 0.39±0.18 120.1±28.4 55.1±15.6
40μM 0.35±0.01 25.0±4.6 20.2±6.8
50μM 0.24±0.14 27.6±8.9 15.9±4.0
60μM 0.12±0.05 25.0±6.4 18.7±5.3
80μM 0.17±0.08 27.1±6.75 20.0±4.9
C.MTX
浓度 B3/SH B3/mR2 B3/R2c2
20nM 192.6±44.6 1055.0±239.0 382.4±71.3
40nM 15.7±2.9 62.1±8.8 60.8±13.0
60nM 6.1±2.0 76.7±21.6 64.1±20.5
80nM 2.2±0.7 17.5±3.6 20.1±5.5
100nM 1.5±0.5 12.3±2.8 21.0±7.2
150nM 3.0±1.1 23.0±7.6 33.4±14.3相对集落形成效率用+-标准误差表示,是4-12次测定的平均值。在存在羟脲、PALA或MTX时,用B3/mR2或B3/R2c2所得数据与用B3/SH所得数据比较,有统计学上的显著差异,其P值都小于或等于0.0001。表4:相对集落形成效率(×104)所确定的药物敏感度A.羟脲
药物浓度 细胞系
N/SH N/R2-4 N/R2+ASR2
03mM 1.14±0.12 46.1±9.8 0.49±0.34
0.4mM 0.71±0.17 18.0±6.7 0.14±0.14
B.PALA
浓度 N/SH N/R2-4 N/R2+ASR2
10μM 5.28±1.5 6.22±3.3 1.81±0.8
15μM 5.83±27 10.0±5.5 0.58±0.3
20μM 0.30±0.1 1.71±1.2 0.04±0.04
25μM 0.53±0.3 0.8±0.7 0.04±0.04
30μM 0.48±0.08 1.03±0.07 0.12±0.12
40μM 0.27±0.2 0.14±0.08 0.04±0.04
C.MTX
浓度 N/SH N/R2-4 N/R2+ASR2
20nM 655±74.8 540±25.1 423±119
40nM 21±121 147±4.2 3.5±1.9
60nM 3.4±2.2 62.2±30.7 1.9±1.3
80nM 5.0±5.0 50.4±23.9 2.5±1.5
100nM 4.2±2.5 66.1±32.8 1.1±0.6
105nM 1.4±0.9 21.0±11.5 0,n=4相对集落形成效率用+-标准误差表示,是4-6次测定的平均值。这里的0表示每次用1×105细胞测定4次(N=4)所得的数目。在存在PALA下用N/SH所得的数据与存在羟脲时,用N/R2-4或N/R2+ASR2所得的数据进行比较(都为p=0.0001);或存在MTX时,与用N/R2-4或N/R2+ASR2所得的数据加以比较(分别为p=0.0002或0.032),它们在统计学上有显著差异。在存在PALA用N/SH与N/R2+ASR2所得的数据加以比较(p=0.002),统计上有显著差异,与N/R2-4没有显著性差异。表5:相对集落形成效率(×10-4)所确定的药物敏感度A.羟脲
细胞系
药物浓度 RP3/SH RP3/ASR2 RP6/SH RP6/ASR2
0.1mM 263.64±19.3 109.8±43 201.3±27.2 43.8±12.3
0.2mM 53.6±13.7 2.9±3.1 35.5±8.4 8.6±2.5
0.3mM 20.8±7.5 6.6±2.5 12.6±2.4 4.5±1.1
0.4mM 5.8±1.9 1.0±0.2 10.8±4.1 1.2±0.5
0.5mM 4.8±1.9 0.2±0.1 12.1±3.9 1.8±0.9
0.6mM 0.7±0.3 0.3±0.1 6.6±2.9 1.5±0.7
0.8mM 0.8±0.3 0.1±0.05 1.7±1.2 0.4±0.3
B.PALA
浓度 RP3/SH RP3/ASR2 RP6/SH RP6/ASR2
10μM 2569±338 1183±384 4619±648 2083±960
20μM 123.4±19.3 86.1±32.9 1220±255 368±154
30μM 45.2±7.8 19.5±4.7 450±129 316±171
40μM 15.0±4.9 4.7±0.6 271±68 116±54
50μM 9.3±3.6 2.1±0.8 109±23 41.7±23
60μM 3.9±1.6 0.3±0.2 55.5±13 13.2±6.3
C.MTX
浓度 RP3/SH RP3/ASR2 RP6/SH RP6/ASR2
20nM 961.7±134 485.9±165 1856±464 1504±486
40nM 347.1±154 77.8±18 177±41.3 91.5±28.1
60nM 123.8±64 18.1±6.2 77.3±15.6 49.9±14.1
80nM 66.5±37 4.4±0.8 68.7±16.7 36.0±6.0
100nM 34.8±21 0.6±0.06 46.6±5.6 14.4±3.8
150nM 4.7±3 0.2±0.1 11.1±4.4 3.5±0.9相对集落形成效率用+-标准误差表示,是4-10次测定的平均值。在存在羟脲、PALA或MTX时,用RP6/SH与RP6/ASR2所得的数据加以比较(分别为p=0.0001、0.0001和0.0001),在统计学上有显著差异。在存在羟脲、PALA或MTX时,用RP3/SH与用RP3/ASR2所得的数据加以比较(分别为p=0.04,0.0001,0.004),在统计学上有显著性差异。表6:用R2反义构建体处理细胞后集落形成效率降低细胞系:HelaS3AS-Ⅱ-336-20a 抑制% AS-Ⅱ-0009B-20b 抑制%
浓度 浓度
0 - 0 -
0.2μM 92% 0.05μM 50%
0.2μM 82% 0.10μM 80%
0.20μM 95%
0.20μM 97%细胞系:Hela1MmAS-Ⅱ-336-20a 抑制% AS-Ⅱ-0009B-20b 抑制%
浓度 浓度
0 - 0 -
0.01μM 15% 0.01μM 0%
0.05μM 25% 0.02μM 0%
0.10μM 60% 0.03μM 21%
0.20μM 85% 0.04μM 34%
0.05μM 48%
0.05μM 50%
0.10μM 78%
0.20μM 97%
0.20μM 90%细胞系:鼠SC2浓度 AS-Ⅱ-336-20a 抑制%
0 -
0.2μM 95%
表7:针对R2mRNA设计的反义序列
SEQ.ID.No: |
名称 |
序列5′-3′ |
Tm℃ |
dG kDa/mol |
SEQ ID No:3 |
AS-Ⅱ-6-20 |
ACCCTTCCCATTGGCTGCGC |
62.8 |
-45.5 |
SEQ ID No:4 |
AS-Ⅱ-13-20 |
GsCCsTCCGsACCsCTTCsCCsATTsG |
60.1 |
-43.7 |
SEQ ID No:5 |
AS-Ⅱ-14-20 |
TGCCTCCGACCCTTCCCATT |
60.1 |
-43.7 |
SEQ ID No:6 |
AS-Ⅱ-16-18 |
TGCCTCCGACCCTTCCCA |
58.4 |
-40.3 |
SEQ ID No:7 |
AS-Ⅱ-75-20 |
CsGCGsCGCsTCCsCGGsCCCsTTCsC |
72.7 |
-53.7 |
SEQ ID No:8 |
AS-Ⅱ-75-20 |
CGCGCGCTCCCGGCCCTTCC |
72.7 |
-53.7 |
SEQ ID No:9 |
AS-Ⅱ-79-14 |
CGCGCTCCCGGCCC |
59.1 |
-38.8 |
SEQ ID No:10 |
AS-Ⅱ-109-20 |
CsCCCsTCACsTCCsAGCsAGCsCTsT |
57.9 |
-41.8 |
SEQ ID No:11 |
AS-Ⅱ-110-20 |
ACCCCTCACTCCAGCAGCCT |
57.3 |
-41.2 |
SEQ ID No:12 |
AS-Ⅱ-114-20 |
GGCGACCCCTCACTCCAGCA |
61.8 |
-43.2 |
SEQ ID No:13 |
AS-Ⅱ-127-12 |
GCACGGGCGACC |
41.7 |
-28.8 |
SEQ ID No:14 | AS-Ⅱ-130-20 | TGGGACAGGGTGCACGGGCG | 67.6 | -46.7 |
SEQ ID No:15 |
AS-Ⅱ-134-20 |
GACGGCTGGGACAGGGTGCA |
62.6 |
-43.2 |
SEQ ID No:16 |
AS-Ⅱ-151-20 |
GAGCAGCCAGGACAGGACGG |
59.3 |
-41.7 |
SEQ ID No:17 |
AS-Ⅱ-163-20 |
GsCGsAAGsCAGsAGCsGAGsCAGCsC |
62.1 |
-44.3 |
SEQ ID No:18 |
AS-Ⅱ-166-20 |
GCAGCGAAGCAGAGCGAGCA |
61.4 |
-43.1 |
SEQ ID No:19 |
AS-Ⅱ-185-20 |
GGGAGAGCATAGTGGAGGCG |
56.0 |
-40.9 |
SEQ ID No:20 |
AS-Ⅱ-189-20 |
CGGAGGGAGAGCATAGTGGA |
54.1 |
-39.4 |
SEQ ID No:21 |
AS-Ⅱ-201-20 |
GCGAGCGGGACACGGAGGGA |
63.5 |
-45.1 |
SEQ ID No:22 |
AS-Ⅱ-217-20 |
CGGGTCCGTGATGGGCGCGA |
69.5 |
-48.8 |
SEQ ID No:23 |
AS-Ⅱ-225-20 |
AGCTGCTGCGGGTCCGTGAT |
61.4 |
-43.6 |
SEQ ID No:24 |
AS-Ⅱ-253-14 |
CCCCTTCAGCGGCG |
50.8 |
-34.4 |
SEQ ID No:25 |
AS-Ⅱ-280-20 |
CGGCGGCGTGTTCTCCTTGT |
61.8 |
-44.2 |
SEQ ID No:26 |
AS-Ⅱ-288-12 |
CGGCGGCGTGTT |
43.2 |
-29.6 |
SEQ ID No:27 |
AS-Ⅱ-323-20 |
TCCTCGCGGTCTTGCTGGCC |
64.1 |
-45.5 |
SEQ ID No:28 |
AS-Ⅱ-344-20 |
CCGTGGGCTCCTGGAAGATC |
58.0 |
-41.9 |
SEQ ID No:29 |
AS-Ⅱ-362-20 |
CTGCTTTAGTTTTCGGCTCC |
51.2 |
-39.2 |
SEQ ID No:30 |
AS-Ⅱ-391-17 |
CGGCTCATCCTCCACGC |
54.5 |
-37.3 |
SEQ ID No:31 |
AS-Ⅱ-404-20 |
GGTTTTCTCTCAGCAGCGGC |
56.4 |
-41.4 |
SEQ ID No:32 |
AS-Ⅱ-412-20 |
GCGGCGGGGGTTTTCTCTCA |
62.8 |
-45.8 |
SEQ ID No:33 |
AS-Ⅱ-414-20 |
AAGCGGCGGGGGTTTTCTCT |
60.7 |
-45.8 |
SEQ ID No:34 |
AS-Ⅱ-425-20 |
GGAAGATGACAAAGCGGCGG |
59.1 |
-43.0 |
SEQ ID No:35 |
AS-Ⅱ-439-20 |
ATGGTACTCGATGGGGAAGA |
50.8 |
-37.8 |
SEQ ID No:36 |
AS-Ⅱ-472-20 |
AGCCTCTGCCTTCTTATACA |
46.1 |
-35.8 |
SEQ ID No:37 |
AS-Ⅱ-494-20 |
CCTCCTCGGCGGTCCAAAAG |
60.4 |
-44.3 |
SEQ ID No:38 |
AS-Ⅱ-496-16 |
TCCTCGGCGGTCCAAA |
54.8 |
-37.0 |
SEQ ID No:39 |
AS-Ⅱ-549-20 |
TATCTCTCCTCGGGTTTCAG |
48.4 |
-36.7 |
SEQ ID No:40 |
AS-Ⅱ-579-20 |
GCAAAGAAAGCCAGAACATG |
50.0 |
-37.2 |
SEQ ID No:41 |
AS-Ⅱ-619-20 |
TCGCTCCACCAAGTTTTCAT |
52.1 |
-38.3 |
SEQ ID No:42 |
AS-Ⅱ-626-20 |
GGCTAAATCGCTCCACCAAG |
53.9 |
-40.3 |
SEQ ID No:43 |
AS-Ⅱ-634-20 |
AACTTCTTGGCTAAATCGCT |
48.0 |
-37.6 |
SEQ ID No:44 |
AS-Ⅱ-667-20 |
GAAGCCATAGAAACAGCGGG |
53.9 |
-40.3 |
SEQ ID No:45 |
AS-Ⅱ-784-20 |
GACACAAGGCATCGTTTCAA |
50.9 |
-36.8 |
SEQ ID No:46 |
AS-Ⅱ-798-20 |
TCTGCCTTCTTCTTGACACA |
48.0 |
-34.9 |
SEQ ID No:47 |
AS-Ⅱ-816-20 |
ATCCAGCGCAAGGCCCAGTC |
60.9 |
-43.7 |
SEQ ID No:48 |
AS-Ⅱ-861-20 |
GCAAAGGCTACAACACGTTC |
50.0 |
-37.1 |
SEQ ID No:49 |
AS-Ⅱ-890-20 |
AACCGGAAAAGAAAATGCCT |
52.2 |
-40.4 |
SEQ ID No:50 |
AS-Ⅱ-909-20 |
CAGAATATCGACGCAAAAGA |
48.2 |
-36.5 |
SEQ ID No:51 |
AS-Ⅱ-933-20 |
GGCATCAGTCCTCGTTTCTT |
50.8 |
-37.7 |
SEQ ID No:52 |
AS-Ⅱ-981-20 |
TGTAAACCCTCATCTCTGCT |
46.2 |
-35.0 |
SEQ ID No:53 |
AS-Ⅱ-1001-20 |
TCAGGCAAGCAAAATCACAG |
51.3 |
-37.2 |
SEQ ID No:54 |
AS-Ⅱ-1006-20 |
GAACATCAGGCAAGCAAAAT |
49.4 |
-37.1 |
SEQ ID No:55 |
AS-Ⅱ-1023-20 |
TTGTGTACCAGGTGTTTGAA |
45.9 |
-33.9 |
SEQ ID No:56 |
AS-Ⅱ-1040-20 |
CTCTCTCCTCCGATGGTTTG |
51.1 |
-37.7 |
SEQ ID No:57 |
AS-Ⅱ-1048-20 |
TTCTCTTACTCTCTCCTCCG |
45.2 |
-35.0 |
SEQ ID No:58 |
AS-Ⅱ-1144-20 |
GTATTGCTTCATTAGAGTGC |
41.6 |
-33.0 |
SEQ ID No:59 |
AS-Ⅱ-1182-20 |
CCCAGTTCCAGCATAAGTCT |
48.4 |
-36.5 |
SEQ ID No:60 |
AS-Ⅱ-1197-20 |
AAAACCTTGCTAAAACCCAG |
48.3 |
-37.8 |
SEQ ID No:61 |
AS-Ⅱ-1217-20 |
CAAATGGGTTCTCTACTCTG |
43.7 |
-33.8 |
SEQ ID No:62 |
AS-Ⅱ-1224-20 |
ATAAAGTCAAATGGGTTCTC |
42.6 |
-34.0 |
SEQ ID No:63 |
AS-Ⅱ-1254-20 |
TTAGTCTTTCCTTCCAGTGA |
43.8 |
-33.9 |
SEQ ID No:64 |
AS-Ⅱ-1278-20 |
TCGCCTACTCTCTTCTCAAA |
46.8 |
-35.6 |
SEQ ID No:65 |
AS-Ⅱ-1288-20 |
CCTCTGATACTCGCCTACTC |
45.6 |
-35.1 |
SEQ ID No:66 |
AS-Ⅱ-1302-20 |
GACATCACTCCCATCCTCTG |
48.7 |
-35.3 |
SEQ ID No:67 |
AS-Ⅱ-1335-20 |
GCATCCAAGGTAAAAGAATT |
45.6 |
-36.1 |
SEQ ID No:68 |
AS-Ⅱ-1338-20 |
TCAGCATCCAAGGTAAAAGA |
47.4 |
-35.9 |
SEQ ID No:69 |
AS-Ⅱ-1342-20 |
GAAGTCAGCATCCAAGGTAA |
46.7 |
-35.3 |
SEQ ID No:70 |
AS-Ⅱ-1345-20 |
TTAGAAGTCAGCATCCAAGG |
47.0 |
-35.6 |
SEQ ID No:71 |
AS-Ⅱ-1362-20 |
GCACATCTTCAGTTCATTTA |
42.4 |
-32.8 |
SEQ ID No:72 |
AS-Ⅱ-1364-20 |
GGGCACATCTTCAGTTCATT |
48.9 |
-36.2 |
SEQ ID No:73 |
AS-Ⅱ-1381-20 |
AAAAATCAGCCAAGTAAGGG |
48.1 |
-38.0 |
SEQ ID No:74 |
AS-Ⅱ-1390-20 |
ATGGAAAAAAAAAATCAGCC |
48.1 |
-38.0 |
SEQ ID No:75 |
AS-Ⅱ-1438-20 |
TTCATGGTGTGGCTAGTTGG |
50.8 |
-36.8 |
SEQ ID No:76 |
AS-Ⅱ-1499-20 |
AGGACTGGTTGTGAGGTAGC |
48.1 |
-35.7 |
SEQ ID No:77 |
AS-Ⅱ-1517-20 |
CCAGCACTATAAACAGACAG |
42.2 |
-32.8 |
SEQ ID No:78 |
AS-Ⅱ-1538-20 |
TTCTGGCAAAAGGTGATACT |
46.5 |
-35.6 |
SEQ ID No:79 |
AS-Ⅱ-1560-20 |
GTAAGTCACAGCCAGCCAGG |
52.2 |
-37.8 |
SEQ ID No:80 |
AS-Ⅱ-1581-20 |
ACTGCCATTGTCACTGCTAT |
47.0 |
-34.9 |
SEQ ID No:81 |
AS-Ⅱ-1659-20 |
TGGCTGTGCTGGTTAAAGGA |
53.2 |
-38.7 |
SEQ ID No:82 |
AS-Ⅱ-1666-20 |
TTTTAACTGGCTGTGCTGGT |
50.0 |
-37.2 |
SEQ ID No:83 |
AS-Ⅱ-1700-20 |
ATTAAAATCTGCGTTGAAGC |
46.8 |
-36.6 |
SEQ ID No:84 |
AS-Ⅱ-1768-20 |
TATCGCCGCCGTGAGTACAA |
56.5 |
-40.9 |
SEQ ID No:85 |
AS-Ⅱ-1773-20 |
GCTATTATCGCCGCCGTGAG |
57.1 |
-42.6 |
SEQ ID No:86 |
AS-Ⅱ-1775-12 |
ATCGCCGCCGTG |
42.9 |
-29.5 |
SEQ ID No:87 |
AS-Ⅱ-1790-20 |
GAAACCAAATAAATCAAGCT |
43.4 |
-34.9 |
SEQ ID No:88 |
AS-Ⅱ-1819-20 |
TTAGTGGTCAGGAGAATGTA |
41.7 |
-32.5 |
SEQ ID No:89 |
AS-Ⅱ-1976-20 |
TGGCACCAACTGACTAATAT |
44.5 |
-34.2 |
SEQ ID No:90 |
AS-Ⅱ-1989-20 |
CCTGTCTTCTATCTGGCACC |
48.6 |
-36.2 |
SEQ ID No:91 |
AS-Ⅱ-2009-20 |
GCCACAGGATAAAAACACAA |
47.7 |
-35.9 |
SEQ ID No:92 |
AS-Ⅱ-2026-20 |
CCCAGGACACTACACAAGCC |
51.8 |
-37.5 |
SEQ ID No:93 |
AS-Ⅱ-2044-20 |
TCAGAGGGGGCAGAGAATCC |
55.4 |
-40.2 |
SEQ ID No:94 |
AS-Ⅱ-2067-20 |
TCCTTTATCCCACAACACTC |
46.3 |
-35.0 |
SEQ ID No:95 |
AS-Ⅱ-2083-20 |
CCTTGCCCTGAGAGATTCCT |
52.3 |
-39.0 |
SEQ ID No:96 |
AS-Ⅱ-2083-20 |
CsCTsTGsCCsCTsGAsGAsGAsTTsCCsT |
52.3 |
-39.0 |
SEQ ID No:97 |
AS-Ⅱ-2128-20 |
GGCCCAGATCACCCCTAAAT |
54.3 |
-40.9 |
SEQ ID No:98 |
AS-Ⅱ-2151-20 |
AAACGGCTTCTCACACATAT |
46.3 |
-35.4 |
SEQ ID No:99 |
AS-Ⅱ-2164-20 |
GAGAAATAAAATGAAACGGC |
46.2 |
-36.6 |
SEQ IDNo:100 |
AS-Ⅱ-2182-20 |
CGTTGAGGAAAATACAGTGA |
45.1 |
-34.3 |
SEQ IDNo:101 |
AS-Ⅱ-2229A-20 |
GCTCCCACATATGAAAACTC |
46.1 |
-35.2 |
SEQ IDNo:102 |
AS-Ⅱ-2372-20 |
CACACAACCTACTTACACCA |
42.7 |
-32.3 |
表7脚注:AS=反义序列Ⅱ=R2第一组数字代表R2mRAN序列上的第一个核苷酸的位置第二组数字代表序列片段的长度表中序列AS-Ⅱ-2229A与文中所述的AS-Ⅱ-2229B为不同序列,2229A选自Genebank(Parloff提供)的R2序列,而2229B选自Pavoloff等,DNA测序和图谱杂志(J.DNA Sequencing and Mapping)2:227-234,1992发表的序列。除特别指明是部分硫代的序列外,序列都是完全硫代的。
1TM℃=形成的寡核苷酸双链的解链温度
2dG=形成寡核苷酸互补双链的自由能值除以上的分析外,还可获得其它评价数据,例如:二聚体形成能力(D),自身互补相互作用能力(H),与靶序列以外的R2mRNA其它序列结合的能力(B)。上述分析和评价数据都由计算机模拟程序OLIGO引物分析软件获得(版本:3.40由National BioSeience发布)。这个程序可以测定TM℃和dG值,也用作定性地评价D、H和B等参数,表示为“不可能”,“有一定可能”或“基本上完全可能”等。在选择寡核苷酸序列时,优先选择那些表现出高TM℃和dG值的,这对于反义分子和其互补链的紧密结合十分重要,也优先选择那些D、H和B被评价为“不可能”的序列。这三个参数(D、H、B)中最重要的是D和H,因为B(即:与除精确的靶序列外的R2mRNA的其它区域结合)不会降低,反而会提高反义序列的活性。表7中的绝大多数序列在D和H标准上均为不可能。某些序列在D和H上表现为“有一定可能”,但是在肿瘤细胞生长抑制的研究中证实是有效的(表12),因此也列在表7中。我们发现,用这种方法筛选反义寡核苷酸抑制剂是十分有效的。在表12所示的结果中,绝大部分所选序列都具有抗肿瘤的性质。表8:用一种R2反义构建体处理细胞的结果反义构建体 浓度(μM) MDA435的集落形成抑制AS-Ⅱ-2229B-20 0.02 25%
0.03 56%
0.05 78%
0.10 94%
0.20 99%表9:AS-Ⅱ2229B-20反义构建体的协同作用细胞 药物 药物浓度 AS-Ⅱ2229B-20a 相对集落形成效率C
0.02-MHela S3 PALAa 20μM - 30±50
PALA 20μM + 90±10Hela S3 MTXa 40μM - 118±32
MTX 60μM - 116±13
MTX 40μM + 25±5
MTX 60μM + 0Hela 1mM PALA 20μM - 377±21
PALA 30μM - 311±9.5
PALA 20μM + 108±7.5
PALA 30μM + 101±2.0Hela 1mM MTX 40μM - 28±1.0
MTX 60μM - 12±0.5
MTX 40μM + 65±5.5
MTX 60μM + 3.5±0.5APALA=N-(膦乙酰)-L-天冬氨酸AMTX=氨甲喋呤b-=未处理b+=进行处理c值为两次实验的平均值表10:用R1反义构建体处理后集落形成效率减少细胞系:HelaS3
AS-Ⅰ-1395-20浓度α 抑制%
0 -
0.2μM 75%(实验1)
0.2μM 77%(实验2)细胞系:Hela1mM
AS-Ⅰ-1395-20浓度a 抑制%
0 -
0.01μM 0
0.05μM 30%
0.10μM 60%细胞系:鼠SC2
AS-Ⅰ-1395-20a浓度 抑制%
0 -
0.2μM 76%
表11:针对R1信使所设计的反义序列
SEQ.ID.No: |
名称 |
序列5′-3′ |
Tm℃ |
dG kDa/mol |
SEQ ID No:104 |
AS-Ⅰ-35-20 |
GTT CCA GCC AGA CAG CAC TT |
51.7 |
-37.3 |
SEQ TD No:105 |
AS-Ⅰ-37-20 |
GAG TTC CAG CCA GAC AGC AC |
52.0 |
-37.0 |
SEQ ID No:106 |
AS-Ⅰ-85-20 |
CAG AGT GGG AAG GGT TAG GT |
49.7 |
-37.5 |
SEQ ID No:107 |
AS-Ⅰ-91-20 |
AGG TGA CAG AGT GGG AAG GG |
52.7 |
-38.2 |
SEQ IDNo:108 |
AS-Ⅰ-129-20 |
GAC TGG ACT GCG GCT CTA AA |
52.1 |
-38.3 |
SEQ ID No:109 |
AS-Ⅰ-203-20 |
ATG ACT CGT TCT TGG CGG CC |
58.6 |
-42.4 |
SEQ ID No:110 |
AS-Ⅰ-239-20 |
CAA AGC TTC TGG ATT CGA GA |
49.6 |
-37.1 |
SEQ ID No:111 |
AS-Ⅰ-287-20 |
TTC ATG GTG ATC TGA GCA GG |
50.6 |
-36.2 |
SEQ ID No:112 |
AS-Ⅰ-300-20 |
GCC TTG GAT TAC TTT CAT GG |
48.9 |
-37.3 |
SEQ ID No:113 |
AS-Ⅰ-348-20 |
TTC AGC AGC CAA AGT ATC TA |
45.4 |
-34.9 |
SEQ ID No:114 |
AS-Ⅰ-395-20 |
GCC AGG ATA GCA TAG TCA GG |
48.9 |
-36.9 |
SEQ ID No:115 |
AS-Ⅰ-439-20 |
CTT TCT TTG TTT CTT TGT GC |
44.5 |
-34.6 |
SEQ ID No:116 |
AS-Ⅰ-504-20 |
GGG AGA GTG TTT GCC ATT AT |
48.2 |
-36.7 |
SEQ ID No:117 |
AS-Ⅰ-520-20 |
TTG ACT TGG CCA CCA TGG GA |
58.2 |
-40.8 |
SEQ ID No:118 |
AS-Ⅰ-540-20 |
GGC CAG AAC AAT ATC CAA TG |
49.5 |
-37.2 |
SEQ ID No:119 |
AS-Ⅰ-556-20 |
TCA GGC GAT CTT TAT TGG CC |
54.2 |
-40.5 |
SEQ ID No:120 |
AS-Ⅰ-635-20 |
TTC AAC AAA TAA GAC CGC TC |
47.2 |
-36.1 |
SEQ ID No:121 |
AS-Ⅰ-658-20 |
TTT CAG CCA CTT TTC CAT TG |
50.3 |
-37.5 |
SEQ ID No:122 |
AS-Ⅰ-662-20 |
GGT CTT TCA GCC ACT TTT CC |
50.4 |
-37.9 |
SEQ ID No:123 |
AS-Ⅰ-782-20 |
TTG AAG AGA GTG GGC GAA GC |
54.4 |
-39.6 |
SEQ ID No:124 |
AS-Ⅰ-786-20 |
AGC ATT GAA GAG AGT GGG CG |
54.3 |
-39.5 |
SEQ ID No:125 |
AS-Ⅰ-809-20 |
GAA AGT TGC GGG CGG TTG GT |
60.6 |
-44.3 |
SEQ ID No:126 |
AS-Ⅰ-843-20 |
GCT GTC ATC TTT CAT ACT CA |
41.9 |
-32.2 |
SEQ ID No:127 |
AS-Ⅰ-908-20 |
CCA ATT CCT CCA GCA GAC TT |
50.8 |
-37.8 |
SEQ ID No:128 |
AS-Ⅰ-923-20 |
CAA CTC ACA GCA ACA CCA AT |
48.1 |
-34.8 |
SEQ ID No:129 |
AS-Ⅰ-932-20 |
GCC CGA ATA CAA CTC ACA GC |
52.2 |
-38.2 |
SEQ ID No:130 |
AS-Ⅰ-967-20 |
AAT TGC CAT TAG TCC CAG CA |
52.2 |
-38.8 |
SEQ ID No:131 |
AS-Ⅰ-1051-20 |
ATG CCC CAG GAC GCT TGT TC |
58.5 |
-42.2 |
SEQ ID No:132 |
AS-Ⅰ-1074-20 |
CCA AGG CTC CAG GTA AAT AG |
48.4 |
-37.6 |
SEQ ID No:133 |
AS-Ⅰ-1134-20 |
ACG CTG CTC TTC CTT TCC TG |
53.7 |
-39.6 |
SEQ ID No:134 |
AS-Ⅰ-1162-20 |
TCC AAA GAG CAA AGA AAA GA |
47.0 |
-36.1 |
SEQ ID No:135 |
AS-Ⅰ-1258-20 |
CCT CTC CCC AAA CCT CAT CC |
54.7 |
-40.2 |
SEQ ID No:136 |
AS-Ⅰ-1311-20 |
AAC TTT GCG GAC ACG ACC TT |
53.7 |
-39.5 |
SEQ ID No:137 |
AS-Ⅰ-1370-20 |
GGG GTG CCT GTT TCC GTC TG |
58.9 |
-42.0 |
SEQ ID No:138 |
AS-Ⅰ-1418-20 |
TTC TGC TGG TTG CTC TTT CG |
53.1 |
-38.7 |
SEQ ID No:139 |
AS-Ⅰ-1421-20 |
AGG TTC TGC TGG TTG CTC TT |
50.6 |
-37.6 |
SEQ ID No:140 |
AS-Ⅰ-1513-20 |
GGG CCA GGG AAG CCA AAT TA |
57.6 |
-43.4 |
SEQ ID No:141 |
AS-Ⅰ-1662-20 |
GGG GCG ATG GCG TTT ATT TG |
58.8 |
-44.0 |
SEQ ID No:142 |
AS-Ⅰ-1666-20 |
CAA TGG GGC GAT GGC GTT TA |
60.1 |
-44.0 |
SEQ ID No:143 |
AS-Ⅰ-1785-20 |
TTC CAG AGC ACC ATA ATA AA |
45.1 |
-35.1 |
SEQ ID No:144 |
AS-Ⅰ-1818-20 |
TGG GCC CTG CTC CTT GGC AA |
64.3 |
-45.7 |
SEQ ID No:145 |
AS-Ⅰ-1970-20 |
GGC ATC GGG GCA ATA AGT AA |
54.1 |
-41.0 |
SEQ ID No:146 |
AS-Ⅰ-1976-20 |
GCT GTA GGC ATC GGG GCA AT |
58.5 |
-42.9 |
SEQ ID No:147 |
AS-Ⅰ-2119-20 |
CAT GCC ATA GGC CCC GCT CG |
64.0 |
-46.4 |
SEQ ID No:148 |
AS-Ⅰ-2198-20 |
AGT TGC TTC AGG TCA TCA GG |
49.0 |
-36.0 |
SEQ ID No:149 |
AS-Ⅰ-2251-20 |
CAG CTG CCA TCT TGA GAA CA |
51.1 |
-36.6 |
SEQ ID No:150 |
AS-Ⅰ-2304-20 |
CTC AGC AAT GTG GAT GTT CA |
48.9 |
-35.0 |
SEQ ID No:151 |
AS-Ⅰ-2364-20 |
AGT CTT CAA ACC CTG CTT CC |
50.0 |
-37.6 |
SEQ ID No:152 |
AS-Ⅰ-2370-20 |
CAT CCC AGT CTT CAA ACC CT |
50.4 |
-37.5 |
SEQ ID No:153 |
AS-Ⅰ-2414-20 |
GTG AAC TGG ATT GGA TTA GC |
46.1 |
-35.2 |
SEQ ID No:154 |
AS-Ⅰ-2491-20 |
TGG CTG CTG TGT TCC TCT CC |
55.0 |
-38.8 |
SEQ ID No:155 |
AS-Ⅰ-2556-20 |
CTT CCA AGT CTT TCC TCA GG |
48.0 |
-36.4 |
SEQ ID No:156 |
AS-Ⅰ-2629-20 |
TAC CAC CTC AAG CAA ACC CA |
52.9 |
-38.4 |
SEQ ID No:157 |
AS-Ⅰ-2650-20 |
CAA CAG GGT CCA GCA AAG CC |
56.8 |
-40.9 |
SEQ ID No:158 |
AS-Ⅰ-2769-20 |
TCC GTT TTT TTT TTC TTT TT |
46.2 |
-37.5 |
SEQ ID No:159 |
AS-Ⅰ-2863-20 |
TGC TAA ATG GGT GAT GAA AC |
47.5 |
-35.8 |
SEQ ID No:160 |
AS-Ⅰ-2922-20 |
CCC ACC AGT CAA AGC AGT AA |
50.2 |
-36.9 |
SEQ ID No:161 |
AS-Ⅰ-2594-20 |
CTC AAG AAG TAG TTT GGC TA-3′ |
41.6 |
-33.2 |
表11注:AS=反义Ⅰ=R1第一个数字表示在R1 mRNA序列中第一个核苷酸的位置第二个数字表示该序列片段的长度1TM℃=形成寡核苷酸双链的解链温度2dG=寡核苷酸互补二聚体形成的自由能值除上面的分析以外,还获得了评价形成二聚体的能力(D)、自身互补相互作用的能力(H)和与靶序列以外的R1信使结合的能力(B)等参数。采用表7注中同样的方法进行分析。表11中所示序列选择的原则与表7注所述相同。
表12:用0.2μM的多种针对R2信使的反义寡聚脱氧核糖核苷酸硫
代磷酸酯处理人体肿瘤细胞后,集落形成效率降低。表中数据
为抑制百分数(%)。
名称(Re) |
T24 |
HCT116 |
A549 |
MDA-MB-231 |
MIAPaCa-2 |
PC-3 |
HepG2 |
HelaS3 |
T-47D |
H596 |
Colo320 |
AS-Ⅱ-6-20 |
73.85 |
ND |
ND |
88.40 |
95.15 |
89.21 |
97.89 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-13-20* |
18.99 |
6.95 |
32.30 |
45.45 |
ND |
52.38 |
24.11 |
19.85 |
15.33 |
19.68 |
ND |
A8-Ⅱ-14-20 |
77.59 |
ND |
ND |
91.24 |
47.93 |
92.76 |
88.40 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-16-18 |
25.74 |
78.57 |
81.10 |
62.59 |
ND |
89.48 |
75.89 |
68.70 |
7.13 |
34.50 |
ND |
AS-Ⅱ-75-20* |
73.42 |
44.40 |
60.08 |
49.30 |
97.38 |
68.25 |
35.40 |
93.01 |
32.95 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-75-20 |
95.83 |
ND |
ND |
95.14 |
52.07 |
83.46 |
97.89 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-79-14 |
38.40 |
45.56 |
79.17 |
48.60 |
38.89 |
85.32 |
70.81 |
28.64 |
70.81 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-109-20* |
24.89 |
6.76 |
15.14 |
22.38 |
54.24 |
61.51 |
18.08 |
46.83 |
20.63 |
7.28 |
ND |
AS-Ⅱ-110-20 |
87.78 |
71.69 |
89.38 |
90.92 |
47.51 |
92.06 |
97.14 |
53.98 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-114-20 |
87.45 |
86.10 |
83.51 |
76.22 |
90.05 |
92.66 |
78.72 |
79.25 |
90.83 |
46.30 |
ND |
AS-Ⅱ-127-12 |
50.63 |
54.34 |
69.33 |
38.46 |
53.24 |
79.56 |
71.75 |
86.45 |
3754 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-130-20 |
51.94 |
57.98 |
86.48 |
ND |
82.11 |
74.66 |
94.28 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-134-20 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
77.51 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-151-20 |
ND |
78.09 |
84.28 |
41.64 |
75.38 |
85.68 |
89.58 |
66.75 |
95.89 |
69.12 |
90.12 |
AS-Ⅱ-163-20* |
5.49 |
29.05 |
37.13 |
22.73 |
9.88 |
7.14 |
18.64 |
45.80 |
9.81 |
32.09 |
ND |
AS-Ⅱ-166-20 |
68.99 |
73.84 |
81.10 |
29.02 |
91.36 |
74.11 |
78.72 |
80.10 |
91.40 |
61.99 |
ND |
表12(续)
名称(Re) |
T24 |
HCT116 |
A549 |
MDA-MB-231 |
MIAPaCa-2 |
PC-3 |
HepG2 |
HelaS3 |
T-47D |
H596 |
Colo320 |
AS-Ⅱ-185-20 |
21.94 |
ND |
71.51 |
17.40 |
29.32 |
4.37 |
53.44 |
19.38 |
94.52 |
24.53 |
ND |
AS-Ⅱ-189-20 |
18.57 |
86.78 |
76.57 |
39.86 |
70.52 |
73.12 |
57.86 |
76.67 |
96.63 |
26.15 |
ND |
AS-Ⅱ-201-20 |
96.20 |
45.56 |
90.55 |
25.17 |
70.22 |
65.08 |
59.32 |
90.87 |
98.53 |
49.60 |
ND |
AS-Ⅱ-217-20 |
65.02 |
61.85 |
ND |
52.70 |
87.38 |
87.41 |
99.55 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-225-20 |
73.23 |
59.50 |
92.90 |
ND |
95.44 |
80.06 |
ND |
96.99 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-253-14 |
19.41 |
53.28 |
61.62 |
45.37 |
ND |
67.26 |
42.00 |
65.18 |
27.09 |
0.81 |
ND |
AS-Ⅱ-280-20 |
90.56 |
69.42 |
61.81 |
79.14 |
53.94 |
77.51 |
97.14 |
41.79 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-288-12 |
30.38 |
67.57 |
70.49 |
52.10 |
30.09 |
74.01 |
65.89 |
57.63 |
ND |
12.67 |
ND |
AS-Ⅱ-323-20 |
ND |
55.80 |
91.24 |
ND |
97.55 |
79.76 |
96.39 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-344-20 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
80.06 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-362-20 |
89.63 |
62.81 |
61.81 |
85.83 |
34.20 |
75.78 |
95.78 |
45.69 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-391-17 |
ND |
ND |
ND |
ND |
26.35 |
93.25 |
60.64 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-404-20 |
84.26 |
ND |
52.17 |
85.83 |
17.84 |
77.08 |
84.79 |
58.37 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-412-20 |
22.20 |
27.98 |
43.78 |
ND |
55.25 |
73.96 |
26.23 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-414-20 |
11.67 |
19.10 |
12.44 |
ND |
36.11 |
60.94 |
30.89 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-425-20 |
90.37 |
ND |
57.38 |
89.75 |
65.20 |
75.65 |
97.89 |
63.09 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-439-20 |
67.84 |
64.70 |
76.46 |
ND |
92.69 |
77.66 |
73.04 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-472-20 |
69.26 |
67.23 |
96.99 |
ND |
97.13 |
90.70 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
表12(续)
名称(Re) |
T24 |
HCT116 |
A549 |
MDA-MB-231 |
MIAPaCa-2 |
PC-3 |
HepG2 |
HelaS3 |
T-47D |
H596 |
Colo320 |
AS-Ⅱ-494-20 |
54.23 |
50.28 |
33.85 |
54.78 |
25.31 |
80.60 |
93.37 |
48.62 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-496-16 |
78.48 |
70.85 |
74.45 |
45.80 |
ND |
88.84 |
54.80 |
52.21 |
10.79 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-549-20 |
45.46 |
47.83 |
30.57 |
40.13 |
17.01 |
ND |
84.04 |
27.80 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-579-20 |
76.68 |
69.08 |
95.49 |
66.89 |
97.55 |
88.16 |
94.28 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-619-20 |
86.30 |
ND |
65.67 |
91.08 |
39.83 |
88.01 |
92.02 |
31.22 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-626-20 |
76.79 |
70.46 |
95.14 |
90.21 |
75.62 |
83.23 |
75.89 |
67.92 |
66.12 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-634-20 |
83.52 |
ND |
57.76 |
92.44 |
ND |
77.86 |
95.78 |
48.94 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-667-20 |
70.48 |
76.90 |
70.30 |
ND |
85.26 |
91.80 |
88.23 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-784-20 |
87.23 |
78.09 |
83.80 |
33.92 |
62.04 |
88.99 |
80.89 |
81.48 |
85.39 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-798-20 |
84.72 |
64.46 |
70.49 |
83.92 |
34.65 |
83.21 |
89.46 |
56.42 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-816-20 |
73.91 |
88.22 |
78.40 |
ND |
93.21 |
94.08 |
93.08 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-861-20 |
73.50 |
74.20 |
95.78 |
89.98 |
97.30 |
87.33 |
96.08 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-890-20 |
82.07 |
ND |
81.60 |
88.20 |
66.02 |
87.93 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-909-20 |
78.57 |
ND |
78.68 |
45.96 |
46.13 |
84.86 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-933-20 |
64.84 |
67.24 |
53.52 |
64.89 |
35.68 |
86.91 |
79.97 |
26.86 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-981-20 |
86.30 |
66.84 |
74.25 |
91.48 |
ND |
85.16 |
95.03 |
69.43 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1001-20 |
86.11 |
55.58 |
71.36 |
82.17 |
64.21 |
85.94 |
90.36 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1006-20 |
61.49 |
45.56 |
61.62 |
ND |
47.93 |
92.58 |
89.31 |
41.79 |
ND |
ND |
ND |
表12(续)
名称(Re) |
T24 |
HCT116 |
A549 |
MDA-MB-231 |
MIAPaCa-2 |
PC-3 |
HepG2 |
HelaS3 |
T-47D |
H596 |
Colo320 |
AS-Ⅱ-1023-20 |
58.26 |
ND |
34.52 |
ND |
42.82 |
87.63 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1040-20 |
59.49 |
70.08 |
85.82 |
ND |
43.52 |
40.08 |
77.78 |
71.87 |
64.76 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1048-20 |
40.32 |
42.63 |
65.67 |
66.88 |
33.40 |
84.38 |
77.56 |
39.19 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1144-20 |
63.90 |
54.25 |
61.81 |
ND |
46.89 |
80.21 |
92.17 |
50.57 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1182-20 |
94.51 |
88.13 |
80.06 |
ND |
84.72 |
92.76 |
92.23 |
90.61 |
92.41 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1197-20 |
90.30 |
84.85 |
89.15 |
50.35 |
70.68 |
74.40 |
76.32 |
82.68 |
81.95 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1217-20 |
66.36 |
68.68 |
91.49 |
ND |
34.85 |
81.03 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1224-20 |
38.31 |
41.78 |
55.06 |
ND |
17.22 |
80.66 |
76.05 |
14.80 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1254-20 |
41.53 |
28.54 |
36.74 |
ND |
3.32 |
73.31 |
83.28 |
7.64 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1278-20 |
65.42 |
ND |
ND |
90.68 |
57.05 |
85.31 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1288-20 |
56.75 |
66.43 |
61.04 |
ND |
80.71 |
93.55 |
80.41 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1302-20 |
70.56 |
71.98 |
93.17 |
92.20 |
23.86 |
79.01 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1335-20 |
59.95 |
67.87 |
78.59 |
ND |
78.78 |
90.04 |
72.98 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1338-20 |
63.16 |
74.73 |
63.93 |
ND |
79.17 |
93.75 |
80.41 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1342-20 |
59.76 |
73.74 |
65.67 |
ND |
73.77 |
89.84 |
82.20 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1345-20 |
51.26 |
65.70 |
73.10 |
94.11 |
77.39 |
89.58 |
75.42 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1362-20 |
ND |
78.47 |
83.90 |
70.22 |
44.14 |
77.38 |
80.41 |
ND |
ND |
ND |
ND |
表12(续)
名称(Re) |
T24 |
HCT116 |
A549 |
MDA-MB-231 |
MIAPaCa-2 |
PC-3 |
HepG2 |
HelaS3 |
T-47D |
H596 |
Colo320 |
AS-Ⅱ-1364-20 |
66.59 |
77.29 |
95.59 |
93.87 |
59.34 |
79.01 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1381-20 |
71.37 |
89.48 |
86.02 |
44.41 |
73.77 |
75.00 |
62.34 |
80.53 |
93.62 |
45.20 |
ND |
AS-Ⅱ-1390-20 |
61.13 |
62.18 |
88.31 |
66.89 |
82.77 |
76.76 |
90.21 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1438-20 |
43.70 |
ND |
51.27 |
69.06 |
42.13 |
83.96 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1499-20 |
82.81 |
83.01 |
87.80 |
41.26 |
81.17 |
77.28 |
77.50 |
87.56 |
96.67 |
78.30 |
ND |
AS-Ⅱ-1517-20 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
91.75 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1538-20 |
67.29 |
51.28 |
90.34 |
ND |
50.62 |
84.71 |
96.84 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1560-20 |
32.29 |
85.81 |
84.19 |
46.15 |
83.80 |
78.37 |
73.63 |
82.16 |
86.60 |
71.16 |
ND |
AS-Ⅱ-1581-20 |
68.22 |
66.85 |
90.55 |
ND |
24.07 |
85.83 |
93.07 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1659-20 |
74.09 |
ND |
54.70 |
42.86 |
42.54 |
81.56 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1666-20 |
71.71 |
ND |
54.82 |
26.71 |
49.72 |
86.06 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1700-20 |
70.94 |
ND |
77.28 |
30.75 |
34.52 |
90.63 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1768-20 |
74.56 |
ND |
86.80 |
91.56 |
60.36 |
86.36 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1773-20 |
15.19 |
75.58 |
70.11 |
44.76 |
45.68 |
70.04 |
58.19 |
80.27 |
84.38 |
66.04 |
ND |
AS-Ⅱ-1775-12 |
85.54 |
54.44 |
63.55 |
48.60 |
27.78 |
78.17 |
43.97 |
68.61 |
ND |
18.60 |
ND |
AS-Ⅱ-1790-20 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
87.86 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1819-20 |
53.74 |
ND
|
ND |
90.68 |
20.02 |
85.46 |
83.89 |
ND |
ND |
ND |
ND |
表12(续)
名称(Re) |
T24 |
HCT116 |
A549 |
MDA-MB-231 |
MIAPaCa-2 |
PC-3 |
HepG2 |
HelaS3 |
T-47D |
H596 |
Colo320 |
AS-Ⅱ-1976-20 |
ND |
ND |
ND |
89.60 |
ND |
88.16 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-1989-20 |
77.43 |
78.47 |
83.90 |
54.90 |
70.22 |
77.38 |
80.70 |
61.41 |
90.83 |
56.33 |
ND |
AS-Ⅱ-2009-20 |
61.84 |
69.92 |
93.32 |
96.25 |
93.74 |
83.36 |
96.99 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2026-20 |
95.46 |
81.47 |
88.81 |
77.10 |
87.65 |
95.29 |
94.54 |
83.79 |
93.41 |
84.16 |
ND |
AS-Ⅱ-2044-20 |
53.63 |
49.34 |
25.55 |
19.11 |
24.48 |
74.48 |
62.35 |
24.55 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2067-20 |
49.60 |
47.16 |
64.71 |
49.68 |
41.08 |
85.94 |
90.36 |
24.88 |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2083-20 |
82.43 |
87.46 |
90.65 |
68.88 |
71.00 |
ND |
93.64 |
84.58 |
89.32 |
82.98 |
87.28 |
AS-Ⅱ-3083-20* |
9.52 |
41.16 |
31.73 |
ND |
ND |
82.03 |
46.14 |
6.96 |
48.61 |
49.87 |
52.54 |
AS-Ⅱ-2128-20 |
83.74 |
ND |
87.31 |
91.30 |
39.23 |
88.89 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2151-20 |
79.83 |
ND |
79.19 |
95.14 |
62.15 |
84.86 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2164-20 |
61.84 |
50.08 |
91.15 |
69.03 |
89.36 |
83.36 |
93.07 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2182-20 |
67.76 |
77.66 |
90.97 |
84.95 |
56.43 |
85.91 |
95.48 |
ND |
ND |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2229A-20 |
50.34 |
93.01 |
69.72 |
ND |
33.61 |
89.58 |
73.26 |
63.15 |
58.82 |
ND |
ND |
AS-Ⅱ-2372-20 |
61.13 |
64.70 |
96.41 |
90.09 |
94.36 |
86.06 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
表12注:-如表7所示,除特别指明以外(*),所有反义寡核苷酸均为完全硫代的。-相对集落形成效率为2-8次测定的平均值。-多种细胞系均来自美国典型培养物保藏中心Rockville,Maryland-ND=没测定人体肿瘤细胞的有关资料:T24 =膀胱细胞癌HCT116 =结肠细胞癌A549 =肺细胞癌MDA-MB-231 =乳腺细胞癌MIA PaCa-2 =胰细胞癌PC-3 =***细胞癌HepG2 =肝细胞癌Hela S3 =分离自子***的细胞T-47D =乳腺管细胞癌H596 =肺鳞状腺细胞癌Colo320 =结肠腺细胞癌表13:用反义寡核苷酸AS-Ⅱ-626-20处理后在同系R-3鼠10T1/2肿瘤细胞中的转移特性寡核苷酸处理* 鼠肿瘤发生率 肺肿瘤数目(平均值±标准误差)无 4/4 6.0±1.580.2μM 1/4 0.25±0.25*用Lipofectin不补加寡核苷酸(无)和用Lipofectin加上0.2μM MAS-626-20培养液分别处理10
5细胞,静脉注射(尾静脉)到C3H/HeN同系鼠中,按文献(Damen,J.E.,Greenberg,A.H.和Wright J.A.生物化学生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)1097:103-110,1991)所述方法分析肺肿瘤。R-3细胞系高度致癌且已有描述(Tayler,W.R.,Egan,S.E.,Mowat,M.,Greenberg,A.H.和Wright,J.A.癌基因(Oncogene),7:1383-1390,1992)。
参考文献Agrawal,1996.反义寡核苷酸的临床试验,TIBECH,14:376。Agarwal等人,1995.癌基因(Oncogen)11:427-438。Akhter等人,1991.反义DNA寡核苷酸类似物与磷脂膜(脂质体)的相互作用,Nuc.Res.19:5551-5559。Alessi等人,1995.酶学方法(Meth.Enzymol.)255:279-290。Amara等人,1994.哺乳动物核糖核苷酸还原酶R2mRNA3′非翻译区的一种新型胞质蛋白质结合活性的佛波酯调节及其在信使稳定中的作用,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269:6709-7071。Amara等人,1995B.在哺乳动物核糖核苷酸还原酶R2组分mRNA3′-非翻译区中一种新顺式元件的确定:在转化生长因子诱导的mRNA稳定性中的作用,核酸研究(Nucleic Acids Res.)23:1461-1467。Amara等人,1996.在哺乳动物核糖核苷酸还原酶R2组分mRNA的3′非翻译区中新顺式元件的确定:顺反相互作用和信使稳定性,生物化学杂志271:20126-20131。Anazodo等人,1995.针对人免疫缺陷病毒Ⅰ型基因组非调节区的新反义寡聚脱氧核糖苷酸硫代磷酸酯对基因表达的序列特异性抑制,病毒学杂志(J.Virol.)69:1794-1801。Anazodo等人,1996.针对HIV-1gag基因组+1129至+1268核苷酸的不同20mer反义寡核苷酸序列对p24基因表达的相对抑制水平:一种分析机制,生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)229:305-309Ashihara and 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