ES2222577T3 - Supresion de la malignidad utilizando la ribonucleotido reductasa r1. - Google Patents

Supresion de la malignidad utilizando la ribonucleotido reductasa r1.

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ES2222577T3 ES98910553T ES98910553T ES2222577T3 ES 2222577 T3 ES2222577 T3 ES 2222577T3 ES 98910553 T ES98910553 T ES 98910553T ES 98910553 T ES98910553 T ES 98910553T ES 2222577 T3 ES2222577 T3 ES 2222577T3
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Abstract

La invención suministra un procedimiento para modular las propiedades malignas de una célula en un humano u otro mamífero mediante la puesta en contacto ce una célula neoplástica con una cantidad moduladora del crecimiento de una secuencia expresable de ácido nucleico para la ribonucleótido-reductasa R1 del mamífero. La invención también suministra y utiliza una cantidad moduladora del crecimiento de la proteína R1 de la ribonucleótido-reductasa o de un péptido biológicamente activo para modular las propiedades malignas de una célula en un humano u otro mamífero. El procedimiento suministra una expresión generalmente elevada del componente R1 de la ribonucleótido- reductasa de los mamíferos. La secuencia expresable de ácido nucleico puede tener la forma de un vector para terapia génica.

Description

Supresión de la malignidad utilizando la ribonucleótido reductasa R1.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a ácidos nucleicos y a proteínas y péptidos para su uso en la modulación del crecimiento de células malignas y a vectores que comprenden estos ácidos nucleicos y a composiciones farmacéuticas que comprenden los ácidos nucleicos, las proteínas y los péptidos, y los vectores.
Más específicamente se refiere al uso de la secuencia genética R1 de ribonucleótido reductasa, el producto genético y derivados y análogos.
2. Descripción de la técnica relacionada
La primera y única fase que conduce a la síntesis del ADN es la conversión de los ribonucleótidos en sus correspondientes desoxirribonucleótidos, una reacción que es catalizada de manera específica en un ciclo celular por la ribonucleótido reductasa del gen de mantenimiento [Lewis et al., 1978; Reichard, 1993; Wright, 1989a; Wright et al., 1990a; Stubbe, 1989]. La enzima mamífera está compuesta por dos componentes de proteínas diméricas diferentes a menudo llamados R1 y R2, que están codificados por dos genes diferentes localizados en cromosomas diferentes [Björklund et al., 1993; Tonin et al., 1987]. La proteína mamífera R1 es una estructura homodimérica y tiene sitios del substrato y sitios efectores alostéricos que controlan la actividad enzimática y la especificidad del substrato [Wright, 1989b; Thelander et al., 1980; Caras et al., 1985; Wright et al., 1990a]. La proteína R2 es un homodímero y forma dos centros dinucleares de hierro equivalentes, la cual estabiliza un radical tirosilo libre necesario para la catálisis [Wright et al., 1990a; Thelander et al., 1985; McClarty et al., 1990]. Las proteínas R1 y R2 interactúan en sus extremos C-terminales para formar una holoenzima activa [Reichard, 1993; Wright et al., 1990a; Davis et al., 1994]. La ribonucleótido reductasa tiene otras funciones biológicas además de la de proporcionar substratos para la replicación del ADN. Por ejemplo, su actividad puede ser inducida fuera de la fase S por agentes de reticulación del ADN como clorambucilo e irradiación UV, indicando un papel para la enzima en el proceso de reparación del DNA [Hurta and Wright, 1992].
R1 y R2 se regulan de modo diferente durante el ciclo celular. Existe un aumento correlacionado de la fase S en la proteína R2 que resulta de su síntesis de novo [Lewis et al., 1978; Mann et al, 1988]. La actividad de la ribonucleótido reductasa y, en consecuencia, la síntesis del ADN y la proliferación celular, se controlan en las células de proliferación durante el ciclo celular mediante la síntesis y la degradación del componente R2 [Eriksson et al., 1984; Choy
et al, 1988]. El componente limitante R2 es una fosfoproteína capaz de ser fosforilada por los mediadores de proteína quinasa CDC2 y CDK2 de la progresión del ciclo celular [Chan et al., 1993], y contiene hierro no hemo que estabiliza un único radical tirosilo libre necesario para la actividad enzimática [Aeichard, 1993; McClarty et al., 1990].
Los niveles de la proteína R1 no parecen cambiar sustancialmente durante el ciclo celular de las células de proliferación y pueden ser detectados en todo el ciclo celular. La síntesis del ARNm de R1, así como del ARNm de R2, parece producirse principalmente durante la fase S [Eriksson et al., 1984; Choy et al., 1988; Mann et al., 1988]. La distribución más amplia de la proteína R1 durante el ciclo celular se atribuye a su vida media más larga en comparación con la proteína R2 [Choy et al., 1988; Mann et al., 1988].
La regulación de la ribonucleótido reductasa, y particularmente del componente R2, está marcadamente alterada en las células malignas expuestas a promotores tumorales o al factor de crecimiento TGF-\beta [Amara, et al., 1994; Chen et al., 1993; Amara et al., 1995b; Hurta and Wright, 1995; Hurta et al., 1991]. Una eliminación de la R1 puede detectarse en algunos carcinomas colorectales humanos [Glenney, 1986]. Se han observado niveles más elevados de actividad enzimática en células malignas cultivadas en comparación con células no malignas [Weben, 1983; Takeda and Weber, 1981; Wright et al., 1989a], y se ha descubierto un aumento en los niveles de la proteína R2 y del ARNm de la R2 en tejidos pre-malignos y malignos en comparación con muestras normales de tejido de control [Saeki
et al., 1995; Jensen et al., 1994]. La regulación de la ribonucleótido reductasa, y en particular del componente R2, aumenta significativamente en células transformadas expuestas a promotores tumorales o al factor de crecimiento de transformación \beta en mecanismos de progresión tumoral mediados por el factor de crecimiento [Amara et al., 1996; Chen et al., 1993; Amara et al, 1995b].
Compuestos quimioterapéuticos actuales, como la hidroxiurea, inhiben la actividad ribonucleótido reductasa desestabilizando el centro de hierro de la proteína R2, lo que provoca la destrucción del radical tirosilo libre [McClarty et al., 1990] e impide que las células pasen a la fase S del ciclo celular [Ashihara and Baserga, 1979]. Este tipo de fármacos tienen una utilidad limitada en el tratamiento del cáncer en humanos y, en consecuencia, son necesarios otros enfoques centrados en la ribonucleótido reductasa.
Los importantes avances de la biología molecular y el proyecto del genoma humano han abierto posibilidades antes imprevisibles para la intervención dirigida con la expresión de genes mamíferos [Blaese, 1997; Felgner, 1997]. Se incluyen enfoques como la terapia genética para introducir secuencias genéticas de control y proteínas específicas en las células neoplásticas con el fin de matar las células de proliferación. Resultaría útil utilizar este enfoque para modificar la expresión de la ribonucleótido reductasa en células en las que el crecimiento debe ser controlado, como por ej. células neoplásticas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un ácido nucleico expresable para su uso en la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde el ácido nucleico es (a) un ácido nucleico que codifica una ribonucleótido reductasa R1 mamífera o (b) un ácido nucleico como (a) que está modificado para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1. El ácido nucleico según (a) puede comprender una secuencia como la presentada en la SEC ID Nº 1 o puede comprender la secuencia que codifica la ribonucleótido reductasa R1 como la presentada en la SEC ID Nº 1, o puede haber sido modificada para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de esta ribonucleótido reductasa R1.
La presente invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de la invención y una composición farmacéutica que comprende un soporte o diluyente farmacéutica y fisiológicamente aceptable y un ácido nucleico o un vector de la invención.
La presente invención proporciona además una proteína o un péptido para su uso en la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde dicha proteína o péptido es (a) una ribonucleótido reductasa R1 mamífera o (b) un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1 de (a). La proteína o el péptido puede producirse por recombinación. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína o un péptido de la invención y un soporte o diluyente farmacéutica y fisiológicamente aceptable.
La presente invención también proporciona el uso de un ácido nucleico o un vector o una proteína o un péptido de la presente invención en la producción de un medicamento para la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero.
También se proporciona el uso de un ácido nucleico según la invención para la producción de un vector.
La invención también proporciona un método para la modulación de la tumorigenicidad, el potencial metastático o el crecimiento de células neoplásticas aisladas de un mamífero, que comprende la puesta en contacto de dicha célula neoplástica in vitro con una cantidad de modulación del crecimiento de una secuencia de ácido nucleico expresable para una ribonucleótido R1 mamífera de un mamífero.
La modulación del crecimiento de células malignas puede realizarse mediante la inhibición del crecimiento de las células neoplásticas o mediante la modulación de la tumorigenicidad. La modulación del crecimiento de células malignas comprende preferiblemente la puesta en contacto de las células neoplásticas del mamífero con el ácido nucleico o la proteína o el péptido. El ácido nucleico puede ser entregado para la terapia genética por medio de un vehículo de entrega de genes que puede ser en forma de un vector. La proteína o el péptido pueden ser en forma de una composición farmacéutica que pueda ser entregada a la célula que debe ser controlada. La célula neoplástica puede ser puesta en contacto con una cantidad de modulación del crecimiento de una secuencia de ácido nucleico expresable para la ribonucleótido reductasa R1 del mamífero y, en una forma de realización para seres humanos, puede ser la SEC ID Nº 1 o la secuencia derivada específica que codifica la R1.
El uso de los ácidos nucleicos, las proteínas y péptidos, los vectores y las composiciones farmacéuticas de la invención proporciona una expresión generalmente elevada del componente R1 de la ribonucleótido reductasa mamífera en una célula que debe ser controlada.
Descripción de los dibujos
Otras ventajas de la presente invención se apreciarán fácilmente cuando la misma se entienda mejor en referencia a la siguiente descripción detallada teniendo en cuenta los dibujos anexos, en los que:
Las Figuras 1A-B son fotografías que muestran un análisis de la expresión de R1 marcada con un epítopo Myc [Fan et al, 1996b] de células BHK transfectadas transitoriamente por pSHD/mR1 mediante el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (A), y de la línea celular PA/mR1 de empaquetamiento retrovírico estable por radioimmunoprecipitación (B). Se usó el anticuerpo 9E10 de epítopo anti-Myc en ambos ensayos.
La Figura 2 es un diagrama de barras que muestra una eficiencia reducida del crecimiento en agar blando con células de expresión de R1 recombinantes. Las líneas celulares infectadas de modo estable con el vector vírico de R1 fueron comparadas con líneas celulares de control apropiadas infectadas con un vector vacío (Tabla 1). Los datos presentados se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes, cada uno consistiendo en placas triplicadas por línea celular. Las dimensiones del inóculo (células/placa) fueron las siguientes: 5 x 10^{5} para células C1/SHD y C1/mR1, 1 x 10^{5} para células C1/mR2 y C1/mR2/mR1, 1 x 10^{4} para células C1/mR2a/SHD y C1/mR2a/mR1, células ras-3/SHD y ras-3/mR1, y 1 x 10^{3} para células Colo/SHD y Colo/mR1. En todos los casos, la diferencia, en número de colonias formadas, entre las células que expresan la R1 recombinante y las células de control fue estadísticamente significativa (p <0.001).
La Figura 3 son fotografías de placas que muestran una eficiencia mayor de la formación de colonias en agar blando con células N/ras&ASR1 (B) en comparación con las células N/ras de control (A). Cada placa fue inoculada con 1 x 10^{4} células. Las células N/ras&ASR1 formaron al menos cuatro veces más colonias, las cuales generalmente fueron más grandes que las formadas por las células N/ras. Las colonias mostradas en (A) se desarrollaron después de 3 semanas y las mostradas en (B) se desarrollaron después de 2 semanas de incubación. Al analizar los datos de seis experimentos, cada uno consistiendo en cuatro placas por línea celular, la diferencia en cuanto a la eficiencia de formación de colonias presentada por ambas líneas celulares fue muy importante (p < 0.0001).
La Figura 4 son fotografías que muestran los resultados de: (A) análisis de transferencia Western que muestran la proteína R1 reducida en N/3ras&ASR1 (b) en comparación con las células de control N/ras (a) y (B) la coloración con tinta china de la membrana de nitrocelulosa [Wright and Anazodo, 1996] mostrada en (A), que demuestra una carga aproximadamente igual de extractos celulares.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la modulación, incluyendo la supresión tumoral, de las propiedades malignas de una célula en un ser humano u otro mamífero mediante el aumento de la expresión de la ribonucleótido reductasa R1 en la célula usando medios farmacológicos o de terapia genética. Por ejemplo, una célula neoplástica puede ser puesta en contacto con una cantidad de modulación del crecimiento de una secuencia de ácido nucleico expresable de ribonucleótido reductasa R1 (para seres humanos ver SEC ID Nº 1) de mamífero, lo que proporciona una expresión generalmente elevada del componente R1 de la ribonucleótido reductasa mamífera. De forma alternativa, la célula puede ser puesta en contacto con la proteína de ribonucleótido reductasa R1 o análogos o derivados biológicamente activos. La secuencia de ácido nucleico expresable está prevista para la terapia genética generalmente en un vehículo de entrega de genes que puede ser en forma de un vector.
En consecuencia, la presente invención proporciona los aspectos de la invención ya presentados más arriba.
Se proporciona el uso de un ácido nucleico expresable para la producción de un medicamento para la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde el ácido nucleico es (a) un ácido nucleico que codifica una ribonucleótido reductasa R1 mamífera o (b) un ácido nucleico como en (a) que está modificado para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1. El ácido nucleico (a) puede comprender una secuencia como la presentada en la SEC ID Nº 1 o puede comprender la secuencia que codifica la ribonucleótido reductasa R1 como la presentada en la SEC ID Nº 1 o puede haber sido modificado para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de esta ribonucleótido reductasa R1. También se proporciona el uso de una proteína o un péptido en la producción de un medicamento para la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde dicha proteína o péptido es: (a) una ribonucleótido reductasa R1 mamífera o (b) un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1 de (a).
Una composición farmacéutica de la invención para la modulación del crecimiento de células malignas en un ser humano u otro mamífero puede consistir en una cantidad eficaz de una secuencia de ácido nucleico expresable para la ribonucleótido reductasa R1 de mamífero o análogos derivados, que puede ser en forma de un vector y un soporte o diluyente farmacéutica y fisiológicamente aceptable. Una composición farmacéutica para la modulación del crecimiento de células malignas en un humano u otro mamífero puede consistir en una cantidad eficaz de una proteína ribonucleótido reductasa R1 de mamífero o análogos o derivados biológicamente activos y un soporte o diluyente farmacéutica y fisiológicamente aceptable.
Además, la célula puede ser tratada farmacológicamente para aumentar la expresión de R1 de la forma conocida en la técnica, por ejemplo con fármacos que aumentan la expresión mediante la activación de vías apropiadas o que aumentan la estabilidad del ARNm. Por ejemplo, la estimulación de la síntesis de AMPc aumenta la expresión de R1 en células en las que existe un gen funcional que usa la forskolina o la toxina del cólera [Hurta and Wright, 1994]. Otro agente que puede ser usado puede ser 3-isobutil-1-metilxantano (un inhibidor de la degradación de AMPc). La expresión del ARNm de R1 se regula por una vía de proteína quinasa C, por tanto los fármacos que aumentan la estabilidad del mensaje en esta vía aumentarán la disponibilidad del ARNm de R1 [Chen et al, 1994A].
Por modulación se entiende la supresión de las características de la transformación celular, como el crecimiento independiente de anclaje y otras características conocidas en la técnica y que se ejemplifican en la presente en los Ejemplos. La modulación abarca la actividad de supresión tumoral y la actividad que ralentiza el crecimiento tumoral y/o causa la regresión tumoral y la reducción de la tumorigenicidad y el potencial metastático. La modulación puede incluir la inhibición de cualquier crecimiento o proliferación anormal de células o tejidos y puede incluir el regreso de una célula a un fenotipo normal.
La cantidad de modulación del crecimiento de una secuencia de ácido nucleico expresable de ribonucleótido reductasa, que puede ser en forma de un vector de terapia genética, o el propio producto genético de R1 o análogos o derivados, se administra y se dosifica de acuerdo con la buena práctica médica, teniendo en cuenta la condición clínica de cada paciente individual, el sitio y el método de administración, la planificación de la administración, la edad del paciente, el sexo, el peso corporal y otros factores conocidos por los médicos profesionales. La "cantidad farmacéuticamente eficaz" para los presentes objetivos se determina por lo tanto según estas consideraciones, de la forma conocida en la técnica. La cantidad debe ser eficaz para conseguir la mejora del encogimiento tumoral, sin descartar otros, y para mejorar el nivel de supervivencia o una recuperación más rápida, o para mejorar o eliminar los síntomas y otros indicadores seleccionados como medidas apropiadas por los expertos en la técnica.
La terapia genética, tal y como se utiliza en la presente, se refiere a la transferencia de material genético (p. ej. ADN o ARN) de interés en un huésped con el fin de tratar o prevenir un fenotipo de una enfermedad o condición genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (p. ej. proteína, polipéptido, péptido o ARN funcional) del cual se desea su producción in vivo. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar una hormona, un receptor, una enzima, un polipéptido o un péptido de valor terapéutico. Para una revisión ver, en general, el texto "Gene Therapy" (Advances in Pharmacology 40, Academic Press, 1997).
Se han desarrollado dos planteamientos básicos para la terapia genética: terapia genética (1) ex vivo y (2) in vivo. En la terapia genética ex vivo, se extraen las células de un paciente y se tratan in vitro al ser cultivadas. Generalmente, un gen de sustitución funcional es introducido en la célula por medio de un vehículo/método de entrega de genes apropiado (transfección, transducción, recombinación homóloga, etc.) y un sistema de expresión, según la necesidad y, entonces, las células modificadas son expandidas en cultivo y devueltas al huésped/paciente. Se ha demostrado que estas células genéticamente reimplantadas producen el producto genético transfectado in situ.
En la terapia genética in vivo, las células objetivo no son extraídas del individuo, sino que el gen que va a ser transferido es introducido en las células del organismo receptor in situ, es decir dentro del receptor. De forma alternativa, si el gen huésped es defectuoso, el gen es reparado in situ [Culver, 1998]. Se ha demostrado que estas células genéticamente alteradas producen el producto genético transfectado in situ.
El vehículo de expresión genética es capaz de entregar/transferir un ácido nucleico heterólogo en una célula huésped. El vehículo de expresión puede incluir elementos para controlar la dirección, expresión y transcripción del ácido nucleico en una célula de manera selectiva, tal y como se conoce en la técnica. Debe tenerse en cuenta que a menudo 5'UTR y/o 3'UTR del gen pueden ser reemplazadas por 5'UTR y/o 3'UTR del vehículo de expresión. En consecuencia, tal y como se utiliza aquí, el vehículo de expresión puede, en caso necesario, no incluir 5'UTR y/o 3'UTR mostradas en la SEC ID Nº 1 e incluir sólo la zona de codificación del aminoácido específica para R1, un péptido de R1 o bien esta zona de codificación puede ser modificada para producir un análogo o derivado de R1.
El vehículo de expresión puede incluir un promotor para controlar la transcripción del material heterólogo, y puede tratarse de un promotor constitutivo o inducible para permitir la transcripción selectiva. Opcionalmente pueden incluirse intensificadores que pueden ser necesarios para obtener los niveles de transcripción necesarios. Los intensificadores son generalmente cualquier secuencia de ADN no traducida que trabaja contiguamente con la secuencia de codificación (en cis) para cambiar el nivel de transcripción basal dictado por el promotor. El vehículo de expresión puede también comprender un gen de selección como se describe posteriormente en la presente invención.
Los vectores son un medio de un vehículo de entrega de genes y pueden ser introducidos en células o tejidos por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos pueden encontrarse descritos de forma general en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988) y Gilboa et al (1986) y pueden incluir, por ejemplo la transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores víricos recombinantes. Además, ver la patente estadounidense 4,866,042 para vectores que tienen que ver con el sistema nervioso central y también las patentes estadounidenses 5,464,764 y 5,487,992 para métodos de selección positivo-negativo, así como las patentes estadounidenses 5,698,443; 5,686,278; 5,538,885; 5,691,176; 5,585,254; 5,614,396; 5,670,488; 5,599,712; 5,645,829; 5,641,680 y 5,688,773.
La introducción de ácidos nucleicos mediante infección ofrece varias ventajas sobre los otros métodos mencionados. Se puede obtener una eficiencia más alta debido a su naturaleza infecciosa. Además, los virus son muy especializados y normalmente infectan y se propagan en tipos específicos de células. Así, su especificidad natural puede utilizarse para dirigir los vectores hacia tipos de células específicas in vivo o en un tejido o un cultivo mezclado de células. Los vectores víricos pueden también ser modificados con receptores o ligandos específicos para alterar la especificidad al objetivo a través de eventos mediados por receptores.
Un ejemplo específico de un vector vírico de ADN para introducir y expresar secuencias recombinantes es el vector derivado del adenovirus Adenop53TK. Este vector expresa un gen timidina quinasa (TK) del virus del herpes para la selección positiva o negativa, y un cassette de expresión para las secuencias recombinantes deseadas. Este vector puede ser utilizado para infectar células que tienen un receptor de adenovirus, el cual incluye la mayoría de los cánceres de origen epitelial junto con otros. Este vector, así como otros que exhiben funciones deseadas similares, puede utilizarse para tratar una población mezclada de células y puede incluir, por ejemplo, un cultivo in vitro o ex vivo de células, un tejido o un individuo humano (ver por ejemplo las patentes estadounidenses 5,691,176; 5,585,254; 5,670,488; 5,681,731).
Se pueden añadir características adicionales al vector para asegurar su seguridad y/o aumentar su eficacia terapéutica. Estas características comprenden, por ejemplo, marcadores que pueden usarse para seleccionar negativamente las células infectadas con el virus recombinante. Un ejemplo de este tipo de marcador de selección negativa es el gen TK anteriormente descrito, que confiere sensibilidad al antibiótico ganciclovir. Por tanto, la selección negativa es un medio mediante el cual la infección puede ser controlada debido a que proporciona un suicidio inducible mediante la adición de un antibiótico.
Además, los vectores víricos recombinantes son útiles para la expresión in vivo de un ácido nucleico deseado debido a que ofrecen ventajas como infección lateral y especificidad en la dirección. La infección lateral es inherente en el ciclo de vida de, por ejemplo, los retrovirus y es el proceso mediante el cual una única célula infectada produce muchos viriones descendientes que brotan hacia fuera e infectan las células limítrofes. El resultado es la rápida infección de una gran área, la mayor parte de la cual no había sido infectada inicialmente por las partículas víricas originales. Esto contrasta con el tipo de infección vertical en la que los agentes infecciosos se esparcen sólo a través de los descendientes hembra. También pueden producirse vectores víricos incapaces de esparcirse lateralmente. Esta característica puede ser útil si el objetivo deseado es introducir un gen especifico en sólo un número localizado de células objetivo.
Como se ha descrito anteriormente, los virus son agentes infecciosos muy especializados que se han desarrollado en muchos casos con el fin de eludir los mecanismos de defensa del huésped. Normalmente, los virus infectan y se propagan en tipos específicos de células. La especificidad en la dirección de los vectores víricos utiliza su especificidad natural para apuntar a tipos de células específicas predeterminadas y, de este modo, introducir un gen recombinante en la célula infectada. El vector que va a usarse en los métodos de la invención dependerá del tipo de célula objetivo deseado y será conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, si va a tratarse el cáncer de mama, entonces se usará un vector específico para este tipo de células epiteliales. Asimismo, si van a tratarse enfermedades o condiciones patológicas del sistema hematopoyético, entonces se usará un vector vírico específico de los glóbulos rojos y sus precursores, preferiblemente para el tipo específico de célula hematopoyética.
Los vectores retrovíricos pueden construirse tanto para funcionar como partículas infecciosas como para pasar sólo por un único ciclo inicial de infección. En el primer caso, el genoma del virus es modificado de tal manera que mantenga todos los genes, las secuencias reguladoras y las señales de empaquetado necesarias para sintetizar nuevas proteínas víricas y el ARN. Una vez que estas moléculas han sido sintetizadas, la célula huésped empaqueta el ARN en nuevas partículas víricas que son capaces de llevar a cabo otros ciclos de infección. El genoma del vector también es tratado por ingeniería genética para codificar y expresar los genes recombinantes deseados. En el caso de vectores víricos no infecciosos, el genoma del vector es normalmente mutado para destruir la señal de empaquetado vírico necesaria para encapsular el ARN en partículas víricas. Sin este tipo de señal, ninguna partícula formada pasará a los ciclos posteriores de infección. El tipo específico de vector dependerá de la aplicación destinada. Los vectores reales también se conocen y son fácilmente disponibles en la técnica o pueden ser construidos por los expertos en la técnica usando una metodología bien conocida.
El vector recombinante puede ser administrado de diferentes modos. Si se usan vectores víricos, por ejemplo, el procedimiento puede sacar provecho de su especificidad al objetivo y, en consecuencia, no deben ser administrados localmente en el sitio de la enfermedad. No obstante, la administración local puede proporcionar un tratamiento más rápido y más eficaz, la administración puede también realizarse, por ejemplo, por inyección intravenosa o subcutánea en el sujeto. La inyección de los vectores víricos en un líquido cefalorraquídeo también puede usarse como modo de administración, especialmente en el caso de enfermedades neurodegenerativas. Tras la inyección, los vectores víricos circularán hasta que reconozcan las células huéspedes con la especificidad objetivo apropiada para la infección.
Un modo distinto de administración puede ser por inoculación directa localmente en el sitio de la enfermedad o condición patológica, o por inoculación en el sistema vascular suministrando nutrientes en el sitio o en el líquido cefalorraquídeo. La administración local es ventajosa porque no se produce el efecto de dilución y, en consecuencia, se requiere una dosis inferior para conseguir la expresión en la mayoría de las células objetivo. Además, la inoculación local puede aliviar el requisito de selección del objetivo necesario en otras formas de administración, puesto que puede usarse un vector que infecte todas las células del área inoculada. Si se desea la expresión en sólo un subconjunto específico de células dentro del área inoculada, entonces para alcanzar esta finalidad pueden usarse elementos promotores y reguladores específicos del subconjunto deseado. Este tipo de vectores no objetivo pueden ser, por ejemplo, vectores víricos, genoma vírico, plásmidos, fagémidos y similares.
Los vehículos de transfección como los liposomas pueden también usarse para introducir los vectores no víricos anteriormente descritos en las células eceptoras en el área inoculada. Estos vehículos de transfección son conocidos por los expertos en la técnica.
Por "análogo" como se utiliza aquí se entiende una variante (de forma alternativa pueden usarse los términos alteración, alteración de la secuencia de aminoácidos y variante de la secuencia de aminoácidos) con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos nativa de la ribonucleótido reductasa R1. Comúnmente, el análogo será generalmente al menos un 70% homólogo con respecto a cualquier parte funcionalmente relevante. En formas de realización más preferidas, la homología será al menos de un 80% y puede aproximarse a una homología del 95% de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos o nucleótidos de un análogo puede diferir de la proteína ribonucleótido reductasa R1 cuando al menos un residuo sea eliminado, insertado o sustituido, pero la proteína permanezca funcional, es decir biológicamente activa. Las diferencias en la glicosilación pueden proporcionar análogos.
Por "derivado" como se utiliza aquí puede entenderse un fragmento peptídico de la proteína ribonucleótido reductasa R1 que proporciona la misma actividad biológica o una actividad biológica similar, tal y como se muestra en la presente invención en los Ejemplos. Se entiende que el fragmento peptídico puede no ser tan eficaz como la molécula de la proteína completa, pero que todavía puede proporcionar actividad biológica, como se determina en la presente invención en los Ejemplos. No obstante, el fragmento peptídico puede proporcionar mejores parámetros farmacinéticos que la proteína completa para varios sistemas de entrega y, en consecuencia, constituir una alternativa. La región de codificación específica de aminoácidos para R1 puede ser modificada para producir un derivado del péptido de R1 biológicamente activo para su uso en la terapia genética, tal y como se ha descrito anteriormente aquí. Los derivados pueden referirse además a modificaciones farmacéuticamente aceptables de la proteína o el péptido de la forma conocida en la técnica con el fin de mejorar la fluidez y la solubilidad sin cambiar significativamente la actividad biológica.
"Biológicamente activo" se refiere a la propiedad biológica de la molécula, análogo o derivado, y en este contexto se refiere a un efector o actividad in vivo realizada directa o indirectamente por una ribonucleótido reductasa R1 de origen natural (nativa), particularmente como se determina y define en los Ejemplos. Las funciones efectoras incluyen, pero sin limitarse, la unión de receptores, cualquier actividad enzimática o actividad enzimática modulatoria, cualquier actividad de unión de soportes, cualquier actividad hormonal, cualquier actividad para la promoción o inhibición de la adhesión de células a la matriz extracelular o a moléculas superficiales de las células, o cualquier papel estructural. La actividad biológica de los análogos o derivados puede determinarse como se describe en los Ejemplos de la forma conocida por los expertos en la técnica.
La proteína ribonucleótido reductasa R1, o análogos o derivados biológicamente activos, puede ser preparada mediante la síntesis de la proteína o el péptido basándose en la secuencia, o de forma recombinante mediante técnicas de clonación, o bien el producto genético natural y/o partes derivadas pueden aislarse y usarse de la forma conocida en la técnica.
En la administración de la ribonucleótido reductasa R1 y sus análogos o derivados biológicamente activos, las dosis pueden ser dosis únicas o múltiples durante un período desde varios días a varios meses o hasta conseguir la disminución de la enfermedad. El tratamiento generalmente tiene una longitud proporcional a la longitud del proceso de la enfermedad y a la eficacia del fármaco y la especie del paciente tratado. Una planificación óptima de la dosificación puede calcularse usando las medidas de acumulación del fármaco en el cuerpo. Los profesionales en la materia pueden determinar rápidamente dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación, y niveles de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de la ribonucleótido reductasa R1, los análogos y derivados biológicamente activos, y pueden determinarse generalmente basándose en valores ED_{50} en estudios animales y estudios clínicos in vitro y in vivo.
La ribonucleótido reductasa R1 y sus análogos o derivados biológicamente activos pueden ser el ingrediente activo en combinación con soportes, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables en una composición farmacéutica. La composición puede ser administrada por administración oral, subcutánea, tópica o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal e intranasal, así como por administración intratecal y técnicas de infusión. También son útiles los supositorios y los implantes de los compuestos. El paciente tratado es un animal de sangre caliente y, en particular, mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los soportes, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, así como los soportes de implante, generalmente se refieren a productos de relleno sólidos o líquidos, inertes y no tóxicos, diluyentes o material de encapsulación que no reaccionan con los ingredientes activos de la invención.
En la administración parenteral, la composición farmacéutica de la presente invención estará formulada generalmente en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión). Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. El soporte puede ser un medio solvente o un medio de dispersión incluyendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido, y similares), mezclas derivadas adecuadas y aceites vegetales.
La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de agentes tensioactivos. Los vehículos no acuosos, como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de girasol o aceite de cacahuete y ésteres, como el miristato de isopropilo, también pueden usarse como sistemas solventes para las composiciones del compuesto. Además, pueden añadirse varios aditivos que aumentan la estabilidad, la esterilidad y la isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse mediante varios agentes antibacterianos y antifungicidas, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse usando agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Según la presente invención, no obstante, cualquier vehículo, diluyente o aditivo usado debería ser compatible con los compuestos.
La soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los compuestos utilizados en la práctica de la presente invención en una cantidad necesaria de un solvente apropiado, junto con varios del resto de ingredientes, de la manera deseada.
La administración tópica puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la incorporación de la composición farmacéutica en cremas, pomadas o parches transdérmicos.
Una formulación farmacológica puede administrarse a un paciente en una formulación inyectable que contiene cualquier soporte compatible, como varios vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes; o bien los compuestos utilizados en la presente invención pueden administrarse por vía parenteral a un paciente en forma de implantes subcutáneos de liberación lenta o sistemas de entrega dirigidos como anticuerpos monoclonales, entrega en vectores, iontoforéticos, matrices polímericas, liposomas y microesferas. Ejemplos de sistemas de entrega útiles en la presente invención incluyen: las patentes estadounidenses números 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196; y 4,475,1 96. Muchos otros implantes, sistemas de entrega y módulos de este tipo son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Una formulación farmacológica utilizada en la presente invención puede administrarse por vía oral al paciente. Pueden utilizarse los métodos convencionales como la administración de los compuestos en comprimidos, suspensiones, soluciones, emulsiones, cápsulas, polvos, jarabes y similares.
Se prefieren las técnicas conocidas de entrega por administración oral, subcutánea o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal e intranasal, así como intratecal y técnicas de infusión, las cuales retienen la actividad biológica.
Para la entrega dentro del SNC, puede usarse la entrega intratecal por ejemplo con un depósito Ommaya. La patente estadounidense 5,455,044 describe el uso de un sistema de dispersión para la entrega en el SNC, o ver la patente estadounidense 5,558,852 para una discusión sobre la entrega en el SNC. Además, pueden administrarse formulaciones farmacológicas que cruzan la barrera hematoencefálica. [Betz et al., 1994; Brem et un., 1993] Este tipo de formulaciones pueden beneficiarse de métodos ahora disponibles para producir péptidos quiméricos en los que la presente invención está acoplada a un vector de transporte del cerebro que permite el transporte a través de la barrera [Pardridge, et al., 1992; Pardridge, 1992; Bickel, et al., 1993]. Además, en casos apropiados puede utilizarse la ruptura de la barrera hematoencefálica [Neuwelt et al., 1980].
Los resultados obtenidos en los Ejemplos posteriores en la presente invención demuestran por primera vez que una expresión elevada del componente R1 de ribonucleótido reductasa mamífera puede suprimir características de transformación celular, por ejemplo el crecimiento independiente del anclaje. En concordancia con estos resultados fue la observación de que la expresión de la secuencia de R1 en la orientación antisentido condujo a una disminución de la proteína R1 y a un aumento de la transformación celular, como se indica por una elevación marcada en la capacidad del crecimiento independiente del anclaje. De modo similar a las líneas celulares de ratón usadas en este estudio, la sobreexpresión de R1 en la línea celular Colo 320HSR de tumor humano también dio como resultado una disminución del crecimiento independiente del anclaje, lo que indica que R1 puede ejercer también una función de supresión en células humanas. Evidentemente, los niveles de expresión de genes de R1 son importantes para determinar el potencial maligno, y una disminución de la expresión puede aumentar las características relacionadas con la malignidad.
La expresión de R1 también fue capaz de suprimir la tumorigenicidad y el potencial maligno in vivo, tal y como se muestra en los Ejemplos. Tres de las cuatro líneas celulares evaluadas presentó un aumento de la latencia tumoral y una disminución de las propiedades del crecimiento tumoral en animales en presencia de una expresión aumentada de R1.
De modo interesante, previamente se había demostrado que la sobreexpresión de R2 tiene un efecto opuesto en las propiedades de transformación, tumorigénicas y malignas de las células. La sobreexpresión de R2 coopera con oncogenes activados para promover la progresión tumoral, y este proceso parece ser mediado al menos parcialmente a través de cambios en la vía MAPK [Fan, et al., 1996a]. El trabajo precedente [Fan, et al., 1996a] y el presente estudio demuestran que las dos proteínas diferentes, R1 y R2, necesarias para la reducción del ribonucleótido, una actividad clave en la limitación de los niveles en la síntesis del ADN [Reichard, 1993; Wright, 1989a], tienen efectos opuestos y muy espectaculares en relación con la malignidad cuando se sobreexpresan en células tumorales. Puede sugerirse que existe un delicado equilibrio entre los niveles de R1 y R2 en las células, y que la derogación de este equilibrio modifica significativamente el potencial maligno de las células tumorales. Como se muestra en los Ejemplos posteriores de la presente invención, al cambiar la expresión reguladora de R1, la expresión puede actuar como un nuevo supresor de la malignidad.
La discusión anterior proporciona una base de hecho para el uso de R1 como un supresor de la malignidad. Los métodos usados y la utilidad de la presente invención pueden mostrarse en los siguientes ejemplos no limitativos y en las figuras anexas.
Ejemplos Métodos generales Métodos generales en biología molecular
Se siguieron en general las técnicas estándares de biología molecular conocidas en la técnica y que no se describen específicamente, como en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989,1992); en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); y en Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó generalmente como en PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Vectores: Los vectores pueden ser construidos para la presente invención por los expertos en la técnica y deberían contener todos los elementos de expresión necesarios para conseguir la transcripción deseada de las secuencias. Los elementos de expresión pueden ser seleccionados para permitir la expresión sólo en la célula objetivo. Otras características beneficiosas pueden también estar incluidas dentro de los vectores, como mecanismos para la recuperación de ácidos nucleicos de una forma diferente. Todo experto en la materia conocerá qué elementos de expresión son compatibles con un tipo de célula particular. Los vectores pueden introducirse en células o tejidos por cualquier método entre una variedad de métodos conocidos en la técnica, tal y como se describe aquí.
Vectores de expresión. El ADNc de R1 de ratón marcado con el epítopo de Myc humano [Fan et al, 1996b] se obtuvo por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cebador 5' ACCGCTCGAGCCACC ATGGAA
CAAAAGCTTATTTCTGAAGAAGACTTG ATGCATGTG ATCAAGCGAGA (SEC ID No:2; donde la secuencia Kozak, una posible señal de unión ribosomal [Kozak, 1987], se encuentra en cursiva; la secuencia que codifica el epítopo de Myc humano está subrayada; y el codón de iniciación natural ATG se encuentra en negrita), y el cebador 3' CCGCTCGAATCAGGATCCACACATCAG (SEC ID No:3; donde el codón de terminación se encuentra en negrita), y el plásmido pcD-M1 templado [Thelander and Berg, 1986]. El producto de la PCR fue tratado con proteinasa K, digerido con Xho1, purificado con gel y ligado al plásmido pLXSHD desfosforilado digerido con Xho1 [Miller, et al., 1993; Fan, et al., 1996c], para generar el vector retrovírico pSHD/ mR1. El empaquetado del vector retrovírico y la preparación de la reserva vírica se realizaron usando las líneas celulares \Psi2 y PA317, como hemos descrito previamente [Fan, et al., 1996a; 1996b], excepto porque las líneas de empaquetado estables derivadas de PA317 se obtuvieron por selección con histidinol durante 15 días. Para obtener un vector de expresión para R1 en la orientación antisentido, el ADNc de R1 de ratón fue preparado por PCR usando los cebadores GCCTCGAGCTGA
CAGTCGTCTCTGTCCCT (SEC I D Nº 4) y TAAAGCTTATCACTTAGAAATGTTTATTTCAAAAT (SEC ID Nº 5), digeridos con Xho1 y HindIII, e insertados en el plásmido de expresión mamífero pcDNA3 (Invitrogen Corp.), para dar el plásmido pASR1. La construcción de ambos, pSHD/mR1 y pASR1, fue confirmada por el análisis de secuenciación así como por la restricción mediante digestiones de endonucleasa.
Líneas celulares y cultivo celular. Las líneas celulares usadas en este estudio e información relacionada se muestran en la Tabla 1. Las células fueron cultivadas rutinariamente en un medio esencial \alpha-mínimo (MEM) complementado con un 8% de suero de ternero (Fetalclone III, Hyclone). Para generar células que expresan la R1 recombinante, las células fueron infectadas con reserva vírica de SHD/mR1, preparadas a partir de la línea de empaquetado estable PA/mR1, en presencia de polibreno [Fan, et al., 1996a; Miller, et al., 1993]. Los infectantes estables (\geq500 clones) se obtuvieron por selección con 4-15 mM de histidinol, dependiendo de las líneas celulares, y fueron agrupados y expandidos. Las líneas celulares de control fueron generadas en paralelo usando el virus LXSHD, que carece de la secuencia de la R1. Las células de expresión antisentido R1 fueron generadas por transfección de células NIH 3T3 usando un equipo LipofectAmine (Life Technologies) seguido de la selección con G418 [Egan, et al., 1987a; Taylor, et al., 1992]. Los índices de crecimiento celular fueron evaluados midiendo la absorbencia a 260 nm en extractos celulares preparados en 1.0 N de NaOH [Kempe, et al., 1976], y/o contando las células en diferentes momentos después del cultivo [Egan, et al., 1987a]. El crecimiento en agar blando se estimó en placas de cultivo de tejidos de 10 cm que contenían 15 ml de agar de base (0.5% de agar Bacto en MEM con un contenido de un 10% de suero de ternero), y 10 ml de agar de crecimiento (0.33% de agar en MEM con un contenido de un 10% de suero de ternero). Las células se obtuvieron de los cultivos subconfluentes y las colonias se puntuaron 14-21 días después [Fan, et al., 1996a; 1996b; Taylor, et al., 1992].
Ensayos de tumorigenicidad y metástasis. En estos ensayos se usaron ratones singénicos C3H/HeN (Charles River Breeding Laboratories, Quebec) tal como se ha descrito anteriormente [Fan, et al., 1996a; Egan, et al., 1987b]. Las células fueron preparadas a partir de cultivos subconfluentes logarítmicamente crecientes, recogidas mediante un tratamiento suave con una solución de tripsina/EDTA y ajustadas a una concentración apropiada. La latencia de tumores fue determinada mediante la inyección de células por vía subcutánea y el registro del tiempo requerido hasta la formación de un tumor (2 X 2 mm) detestable por palpamiento. Los tumores fueron extraídos de los ratones y el peso del tumor fue registrado tras 21 días. En el caso de no formarse ningún tumor, los ratones se mantuvieron durante 2 meses después de la inyección y entonces se sacrificaron. Para los ensayos de la metástasis, las células fueron inyectadas en las venas de la cola de ratones singénicos C3H/HeN de 6-8 semanas y 21 días después se realizó una estimación del número de tumores de pulmón, como se describe en [Fan, et al., 1996a; Egan, et al., 1987b]. Para confirmar que se inyectaron igual número de células de prueba y células de control, se inocularon placas de cultivo duplicadas que contenían el medio de crecimiento con 100 células por placa. Después de 10 días en cultivo, las placas fueron coloreadas con azul de metileno y las colonias puntuadas.
Detección de la expresión de la proteína R1 recombinante. Para detectar la expresión transitoria de la proteína R1 recombinante en células BHK se usó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta [Fan et al, 1996a,b]. El setenta por ciento de las células confluentes que crecen en las cubiertas de tapa fue transfectado con el plásmido pSHD/mR1 usando un reactivo LipofectAmine. Veinte horas después de la transfección, las células fueron fijadas con un 3% de formaldehído preparado en suero salino tamponado con fosfato, pH 7.2 (PBS), permeabilizadas con un 0.1% de Triton X-100 (en PBS), incubadas con el anticuerpo 9E10 monoclonal de epítopo anti-Myc (American Type Culture Collection), lavadas, hechas reaccionar con el conjugado FITC de IgG de cabra anti-ratón (molécula completa) (Sigma), lavadas de nuevo y finalmente examinadas bajo un microscopio de fluorescencia [Leonhardt, et al]. La inmunoprecipitación de la R1 recombinante, por el anticuerpo 9E10, de las células marcadas con [^{35}S]metionina/cisteína, se realizó usando los procedimientos previamente descritos [McClarty, et al, 1990; Goding, 1978]. En algunos experimentos, los niveles de la proteína R1 se determinaron por análisis de transferencia Western usando el anticuerpo monoclónico anti-R1, AD203, como se ha descrito previamente [McClarty, et al, 1990; Fan, et al., 1996a].
Ensayo de la ribonucleótido reductasa. La actividad ribonucleótido reductasa en extractos crudos preparados a partir de las líneas celulares SC2/mR1 y las líneas celulares de control SC2/SHD fue evaluada tal como se ha descrito anteriormente [Lewis, 1978; Hurta and Wright, 1992; Hurta, et al., 1991]. En algunos experimentos, los ensayos enzimáticos se realizaron por combinación de la proteína R2 recombinante purificada con la proteína R1 precipitada por el anticuerpo 9E10. Las células Pansorbin (Estafilococos fijados con formaldehído, Calbiochem, La Jolla, CA) que llevan proteína A superficial y IgG de conejo anti-ratón se prepararon como se describe en [Coding, 1978]. Este conjugado fue adicionalmente incubado con una cantidad en exceso de anticuerpo 9E10 y lavado cinco veces. Se añadieron 20 \mul de este complejo (suspensión 10%) a 1.0 ml de extracto preparado a partir de 5 x 10^{7} células y se colocó en un rocker a 4ºC durante 2 horas, fue lavado tres veces con PBS con un contenido de 10 mg/ml de albúmina de suero bovino, y evaluados según la actividad de la ribonucleótido reductasa tras la adición de 1.0 g de proteína R2 recombinante purificada [Hurta and Wright, 1992; Fan, et al., 1996a; Mann, et al., 1991].
Ejemplo 1 Expresión de la R1 recombinante
Para sobreexpresar la proteína R1 en células se construyó un vector de expresión mamífero pSHD/mR1. En este vector, la expresión del ADNc de R1 marcado con el epítopo de Myc humano se encuentra bajo el control de un promotor retrovírico, una secuencia de repetición terminal larga [Miller, et al., 1993]. La expresión de la R1 recombinante fue analizada primero en células BHK tras la transfección transitoria. Un ensayo de inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos 9E10 monoclonales anti-Myc reveló la expresión citoplásmica de la proteína R1 recombinante en células transfectadas con pSHD/mR1 (Figura 1 A). Como control, las células no transfectadas o transfectadas por el vector pLXSHD vacío no mostraron fluorescencia específica. Una vez demostrado que la proteína R1 recombinante puede ser expresada en células mamíferas, entonces convertimos el ADN expresable en un virus infeccioso, pero con vector de replicación deficiente, el cual tiene una alta eficiencia de entrega, usando células de empaquetado retrovíricas. La expresión de la R1 recombinante en la línea de empaquetado estable PA/mR1 fue analizada de nuevo. La inmunoprecipitación usando el anticuerpo 9E10 detectó una única proteína de aproximadamente 88 kDa en el extracto preparado a partir de células PA/mR1 (Tabla 1), que fue metabólicamente marcada con [^{35}S]metionina/cisteína (Figura 1 B). Tal y como se esperaba, ninguna proteína fue precipitada de la línea celular estable PA/SHD de empaquetado de virus de control (Figura 1B). Estos resultados indicaron que era posible la expresión estable de la proteína R1 recombinante.
Entonces se determinó si la R1 recombinante expresada en células es biológicamente activa. Para este estudio, una línea celular de ratón L resistente a la hidroxiurea, SC2, fue infectada con vectores víricos SHD/mR1 o LXSHD y se usó para seleccionar infectantes estables (Tabla 1). Puesto que las células SC2 expresan más R2 con respecto a la subunidad R1, la expresión de la proteína R1 biológicamente activa en esta línea celular daría como resultado un aumento de la actividad ribonucleótido reductasa [McClarty, et al, 1990]. En cuatro experimentos, la actividad reductasa CDP en el extracto crudo preparado a partir de células SC2/mR1 fue de 13.2+ 0.7 nmoles/mg de proteína/hr, que es aproximadamente un 30% superior a la del extracto preparado a partir de células SC2/SHD de control (10.1 \pm 0.2 nmoles/mg/hr). Además, la R1 recombinante de las células C1/mR1 fue inmunoprecipitada usando el anticuerpo 9E10, y fue usada para evaluar la actividad ribonucleótido reductasa combinando el inmunoprecipitado lavado con la proteína R2 recombinante purificada [Hurta and Wright, 1992; Fan, et al., 1996a; Mann, et al., 1991]. En tres experimentos independientes, se detectó una actividad enzimática de 15.4 \pm 2.0 pmoles/mg/hr al usar las células C1/mR1 (Tabla 1) como fuente de R1 recombinante y, como se esperaba, no se encontró actividad cuando se usaron las células C1/SHD de control (Tabla 1).
Ejemplo 2 Independencia de anclaje reducida por células que sobreexpresan R1
La transformación celular está acompañada frecuentemente por el crecimiento independiente del anclaje in vitro, lo que a menudo está relacionado con el potencial tumorigénico in vivo, y puede evaluarse según la capacidad para proliferar y formar colonias en un medio con contenido en agar [Fan, et al., 1996a; Egan, et al., 1987a]. Para investigar el papel que puede jugar la R1 en la transformación celular, se infectaron células CIRAS-1 con el vector vírico PA/mR1 o el virus de control vacío LXSHD (Tabla 1). Las células CIRAS-1 eran derivadas de las células 10T½ de ratón del tipo salvaje no malignas mediante la transfección con T24 H-ras oncogénico [Egan, et al., 1987a]. Estudios precedentes han demostrado que se trata de una línea celular moderadamente maligna, y puede servir como un buen modelo para el análisis de las características relacionadas con la transformación y la malignidad [Hurta and Wright, 1995; Fan, et al., 1996a; Egan, et al., 1987a; Wright, et al., 1993]. Los infectantes estables obtenidos tras la selección por histidinol fueron evaluados según su capacidad de crecimiento en agar blando. Se descubrió que la eficiencia en la formación de colonias en agar blando por células C1/mR1 que contenían niveles elevados de R1, disminuyó significativamente en comparación con las células C1/SHD de control (Fig.2). Los efectos de la expresión de R1 también se evaluaron en el crecimiento en agar blando con células que contenían la expresión de la R2 no regulada. C1/mR2 es un derivado de CIRAS-1 que expresa la R2 recombinante y ha adquirido un mayor potencial maligno [Fan, et al., 1996a]. Nuevamente se observó que la eficiencia en la formación de colonias de las células C1/mR2/mR1 con R1 elevada se redujo significativamente, en comparación con las células C1/mR2 de control (Figura 2).
Para excluir la posibilidad (aunque improbable) de que la eficiencia reducida del crecimiento en agar blando observada con células de R1 pueda haberse producido por la selección de células con eficiencias de crecimiento bajas intrínsecamente a partir de una población de células relativamente heterogénea, se aisló un subclón designado C1/mR2a de las células C1/mR2. Dos líneas celulares (C1/mR2a/mR1 y C1mR2a/SHD de control) se derivaron de esta población de subclones (Tabla 1). En concordancia con las observaciones hechas con la línea parental, las células C1/mR2a/mR1 presentaron un reducción similar de la eficiencia del crecimiento en agar blando, en comparación con las células C1/mR2a/SHD de control (Figura 2). Esto muestra que la independencia de anclaje reducida es provocada por la expresión de la R1 recombinante.
Ejemplo 3
Las líneas celulares anteriormente evaluadas son de origen de ratón. Para determinar si la expresión de la R1 recombinante en células tumorales humanas altera también las características de transformación, como se ha demostrado por los cambios en la capacidad del crecimiento en agar blando, se usó la línea celular de adenocarcinoma de colon humano Colo 320HSR [Quinn, et al., 1979]. Estas células fueron infectadas con el vector vírico que contenía la secuencia de R1 para obtener la línea celular Colo/mR1 (Tabla 1). De modo interesante, la eficiencia de crecimiento en agar blando con células Colo/mR1 disminuyó aproximadamente un 50% en comparación con las células Colo/SHD que contenían el vector vacío (Figura 2).
Ejemplo 4 Supresión del potencial tumorigénico y/o metastático in vivo con células que contienen R1 elevada
Para evaluar adicionalmente el papel que las alteraciones en la expresión de la R1 pueden jugar en la progresión maligna, se analizaron las propiedades tumorigénicas y metastáticas de las células C1/mR1 en modelos in vivo. Las células C1/mR1 presentaron una reducción espectacular del potencial maligno en comparación con las células C1/SHD de control (Tabla 2). Mientras que todos los ratones inyectados por vía subcutánea con células C1/SHD desarrollaron tumores en aproximadamente 11 días después de la inyección, ninguno de los animales inyectados con células C1/mR1 formaron tumores detectables incluso dos meses después de la inyección. Además, los ensayos experimentales de la metástasis mostraron que las células C1/mR1 eran mucho menos eficaces en la formación de metástasis de pulmón en comparación con las células C1/SHD de control (Tabla 2). Se realizaron experimentos similares con otra línea celular 10T½ de ratón transfectada con T24 H-ras seleccionada independientemente llamada ras-3, que ha sido descrita previamente [Taylor, et al., 1992]. Aunque la actividad supresora del tumor de la R1 recombinante en células ras-3 no fue tan grande como la observada en las células derivadas de C1RAS-1, la tumorigenicidad con células ras-3/mR1, en comparación con las células ras-3/SHD de control, fue significativamente reducida, como se determinó por una latencia tumoral extendida y unas dimensiones del tumor más pequeñas. De modo similar a las células derivadas de CIRAS-1, las células ras-3/mR1 presentaron un potencial metastático marcadamente reducido en comparación con las células ras-3/SHD de control (Tabla 2).
También se evaluó in vivo el impacto de la expresión de la R1 recombinante en el potencial maligno con células que contenían la expresión de la R2 no regulada. En concordancia con observaciones previas, las células C1/mR2 mostraron un potencial tumorigénico y metastático más alto que las células C1/SHD de control, lo que confirmó la función de promoción de la malignidad de la R2 [Fan, et al., 5 1996a]. También de acuerdo con los datos obtenidos en los experimentos in vitro (Figura 2), las células C1/mR2/mR1, fueron mucho menos malignas que las células de control C1/mR2 (Tabla 2). Además, tanto el potencial tumorigénico como el potencial metastático de las células C1/mR2/mR1 se redujo a niveles significativamente inferiores que el de las células C1/SHD (Tabla 2).
A continuación se evaluó la capacidad potencial de la expresión de R1 recombinante para modificar las propiedades malignas de una línea celular altamente maligna que contiene múltiples alteraciones del oncogén. La línea 10T½ de ratón RMP-6, que ha sido transfectada con una combinación de H-ras activado, c-myc y una forma oncogénica mutada de p53, ya ha sido bien caracterizada [Taylor, et al., 1992; Huang, et al., 1995] y ha sido usada en estos estudios. A diferencia de las líneas celulares de sobreexpresión de la R1 estudiadas arriba, las células RMP/mR1 (Tabla 1) no mostraron cambios en la tumorigenicidad en comparación con las células RMP/SHD de control (Tabla 2). De acuerdo con estos resultados in vivo, se observó que las células RMP/mR1 y RMP/SHD tienen aproximadamente la misma eficiencia en la formación de colonias en experimentos de crecimiento en agar blando. Resulta interesante que, no obstante, las células RMP/mR1 formaron significativamente menos tumores de pulmón en ratones singénicos que las células RMP/SHD de control en ensayos de metástasis experimentales (Tabla 2). En realidad, la diferencia en el número de metástasis de pulmón mostrado en la Tabla 2 puede haber sido subestimado, puesto que los tumores de pulmón eran generalmente más grandes en ratones que habían recibido células RMP/SHD que los que se desarrollaron en los pulmones de ratones inyectados con células RMP/mR1. Estos resultados indican que la sobreexpresión de la R1 en células RMP-6 altamente malignas suprime marcadamente el potencial metastático.
Ejemplo comparativo I
Independencia de anclaje aumentada con células ras-transfectadas oncogénicas que expresan R1 en la orientación antisentido
La expresión de una secuencia antisentido es un planteamiento usado habitualmente para conseguir una expresión genética regulada inferior [Spearman, et al., 1994; Wright and Anazodo, 1996]. Si R1 puede inhibir la transformación celular tal, y como se ha indicado anteriormente, la expresión de una secuencia antisentido de R1 debería reducir los niveles de la proteína R1 y aumentar más las características de transformación. Para comprobar esto, se construyó un vector de expresión en el que la secuencia de R1 se coloca en una orientación antisentido en relación al promotor de vector. Las células NIH 3T3 fueron co-transfectadas con el vector antisentido y el plásmido pHO6Ti que expresa el oncogen T24 H-ras [Egan, et al., 1987a]. La expresión de H-ras transforma las células mamíferas de tal modo que éstas son a menudo capaces de formar colonias en agar blando conteniendo el medio de crecimiento [Fan, et al., 1996a; Egan, et al., 1987a]. Los co-transfectantes estables obtenidos después de la selección con G418 fueron evaluados según el crecimiento de anclaje independiente. De acuerdo con los resultados obtenidos en los experimentos anteriormente descritos, las células N/ras&ASR1, que contenían el antisentido de la R1, presentaron una eficiencia en la formación de colonias en agar blando espectacularmente más alta en comparación con las células N3/ras de control que contenían el oncogén H-ras sin la secuencia antisentido de la R1 (Fig.3). El análisis de transferencia Western (Figura 4) y el análisis de transferencia Northern indicaron, como se esperaba, una expresión inferior de la R1 en las células N/ras&ASR1 que en las células N/ras. Los índices de crecimiento de las células N/ras&ASR1 y N/ras en la superficie de las placas de cultivo de plástico fueron aproximadamente los mismos, con un tiempo doble de 14 a 16 horas.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones, incluyendo patentes estadounidenses, por autor y año y las patentes por número. Las referencias completas de las publicaciones están enumeradas más adelante.
La invención se ha descrito de una manera ilustrativa y debe entenderse que la terminología usada pretende indicar la naturaleza de las palabras como descripción más que como limitación.
Obviamente, a la luz de las indicaciones anteriores son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención. En consecuencia, debe entenderse que dentro del campo de las reivindicaciones anexas, la invención puede ser puesta en práctica de otros modos a los específicamente descritos.
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1
2
3
Referencias
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
\hskip2cm
Wright, Jim A. 
\hskip2cm
Young, Aiping H. 
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Supresión de la malignidad utilizando la ribonucleótido reductasa R1
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
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(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Destinatario: Kohn & Associates
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Calle: 30500 Northwestern Hwy. Suite 410
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Ciudad: Farmington Hills
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Estado: Míchigan
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
País: EEUU
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(F)
Código postal: 48334
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(v)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Tipo de medio: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Ordenador: PC Compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
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(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
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(A)
Número de solicitud:
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(B)
Fecha de depósito:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Clasificación:
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(viii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Nombre: Montgomery, Ilene N.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Número de registro: 38,972
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Número de referencia: 0227.00013
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(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Teléfono: (248) 539-5050
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Telefax: (248) 539-5055
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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 3083 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: No
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(iv)
ANTISENTIDO: No
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
4
5 
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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Descripción: /desc = "cebador"
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(iii)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCGCTCGAG CCACCATGGA ACAAAAGCTT ATTTCTGAAG AAGACTTGAT GCATGTGATC 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCCAG 
\hfill
68 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
descripción: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGCTCGAPT CAGGATCCAC ACAPCA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: OTRO ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Descripción: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTCGAGCT GACACTCGTC TCTGTCCCT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Longitud: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Descripción: /desc= "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAGCTTAT CACTTAGAAA TGTTTATTTC AAAAT 
\hfill
35

Claims (52)

1. Ácido nucleico expresable para su uso en la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde el ácido nucleico es:
(a) un ácido nucleico que codifica una ribonucleótido reductasa R1 mamífera; o
(b) un ácido nucleico como en (a) que está modificado para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico es:
(i) un ácido nucleico como en (a) que comprende una secuencia como la presentada en la SEC ID Nº 1;
(ii) un ácido nucleico como en (a) que comprende la secuencia que codifica la ribonucleótido reductasa R1 como la presentada en la SEC ID Nº 1, o
(iii) un ácido nucleico como en (i) o (ii), que está modificado para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que codifica un derivado como en (b) o (iii) y donde ese derivado es un péptido.
4. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición del crecimiento de las células neoplásticas.
5. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición de la metástasis de las células neoplásticas.
6. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por modulación de la tumorigenicidad de las células neoplásticas.
7. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la terapia genética.
8. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho uso comprende la puesta en contacto de células neoplásticas de dicho mamífero con dicho ácido nucleico.
9. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho mamífero es un humano.
10. Ácido nucleico según la reivindicación 9 donde dicha ribonucleótido reductasa R1 mamífera es una ribonucleótido reductasa R1 humana.
11. Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un soporte o diluyente farmacéutica y fisiológicamente aceptable.
13. Composición farmacéutica que comprende el vector según la reivindicación 11 y un soporte o diluyente farmacéutica y fisiológicamente aceptable.
14. Proteína o péptido para su uso en la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde dicha proteína o péptido es:
(a) una ribonucleótido reductasa R1 mamífera, o
(b) un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1 de (a).
15. Proteína o péptido según la reivindicación 14 que se produce por recombinación.
16. Péptido según la reivindicación 14 ó 15, el cual es un derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1 de (b).
17. Proteína o péptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición del crecimiento de las células neoplásticas.
18. Proteína o péptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición de la metástasis de las células neoplásticas.
19. Proteína o péptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por modulación de la tumorigenicidad de las células neoplásticas.
20. Proteína o péptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde dicho uso comprende la puesta en contacto de células neoplásticas de dicho mamífero con dicha proteína o péptido.
21. Proteína o péptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, donde dicho mamífero es un ser humano.
22. Proteína o péptido según la reivindicación 22 donde dicha ribonucleótido reductasa R1 mamífera es una ribonucleótido reductasa R1 humana.
23. Composición farmacéutica que comprende la proteína o péptido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22 y un soporte o diluyente farmacéutica y fisiológicamente aceptable.
24. Uso de un ácido nucleico expresable en la producción de un medicamento para la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde el ácido nucleico es:
(a) un ácido nucleico que codifica una ribonucleótido reductasa R1 mamífera; o (b) un ácido nucleico como en (a) que está modificado para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1.
25. Uso según la reivindicación 24, donde el ácido nucleico es:
(i) un ácido nucleico como en (a) que comprende una secuencia como la presentada en la SEC ID Nº 1; (ii) un ácido nucleico como en (a) que comprende la secuencia que codifica la ribonucleótido reductasa R1 como la presentada en la SEC ID Nº 1; o (iii) un ácido nucleico como en (i) o (ii), que está modificado para codificar un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1.
26. Uso según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, donde dicho ácido nucleico codifica un derivado como en (b) o (iii) y ese derivado es un péptido.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición del crecimiento de las células neoplásticas.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición de la metástasis de las células neoplásticas.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por modulación de la tumorigenicidad de las células neoplásticas.
30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, donde el medicamento es para ser usado en la terapia genética.
31. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, donde el medicamento es para la puesta en contacto de células neoplásticas de dicho mamífero con dicho ácido nucleico.
32. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, donde dicho mamífero es un ser humano.
33. Uso según la reivindicación 32 donde dicha ribonucleótido reductasa R1 mamífera es una ribonucleótido reductasa R1 humana.
34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33, donde el ácido nucleico se encuentra dentro de un vector.
35. Uso de una proteína o péptido en la producción de un medicamento para la modulación del crecimiento de células malignas en un mamífero, donde dicha proteína o péptido es:
(a) una ribonucleótido reductasa R1 mamífera, o (b) un análogo o derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1 de (a).
36. Uso según la reivindicación 35, donde la proteína o péptido se produce por recombinación.
37. Uso según la reivindicación 35 ó 36, donde el péptido es un derivado biológicamente activo de la ribonucleótido reductasa R1 de (b).
38. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición del crecimiento de las células neoplásticas.
39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por inhibición de la metástasis de las células neoplásticas.
40. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, donde dicha modulación del crecimiento de células malignas es por modulación de la tumorigenicidad de las células neoplásticas.
41. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40, donde el medicamento es para la puesta en contacto de células neoplásticas de dicho mamífero con dicha proteína o péptido.
42. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 41, donde dicho mamífero es un humano.
43. Uso según la reivindicación 39, donde dicha ribonucleótido reductasa R1 mamífera es una ribonucleótido reductasa R1 humana.
44. Uso de un ácido nucleico expresable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la producción de un vector.
45. Método para la modulación de la tumorigenicidad de células neoplásticas aisladas de un mamífero, que comprende la puesta en contacto de dicha célula neoplástica in vitro con una cantidad de modulación del crecimiento de una secuencia de ácido nucleico expresable para una ribonucleótido reductasa R1 mamífera del mamífero.
46. Método para la reducción del potencial metastático de células neoplásticas aisladas de un mamífero, que comprende la puesta en contacto de dichas células neoplásticas in vitro con una cantidad de modulación del crecimiento de una secuencia de ácido nucleico expresable para una ribonucleótido reductasa R1 mamífera.
47. Método para la inhibición del crecimiento de células neoplásticas aisladas de un mamífero, que comprende la puesta en contacto de dichas células neoplásticas in vitro con una cantidad de modulación del crecimiento de una secuencia de ácido nucleico expresable para una ribonucleótido reductasa R1 mamífera.
48. Método según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, donde dichas células neoplásticas son aisladas de un ser humano.
49. Método según la reivindicación 48, donde dicha ribonucleótido reductasa R1 mamífera es una ribonucleótido reductasa R1 humana.
50. Uso según se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 44, donde el medicamento comprende además un fármaco que aumenta la expresión mediante la activación de las vías apropiadas o que aumenta la estabilidad del ARNm.
51. Uso según la reivindicación 50, donde el fármaco es forskolina o la toxina del cólera.
52. Uso según la reivindicación 50, donde el fármaco es un fármaco que aumenta la estabilidad del mensaje en una vía de la proteína quinasa C.
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